Résistance et réponse thérapeutique
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Résistance et réponse thérapeutique
Jacques Le Bras
Centre National de RéférenceChimiosensibilité du Paludisme
Cnrcp
2
Classification des antimalariques selon leur point d’impact
GAMETOCYTOCIDES : Formes sexuées et formes hépatiques
SCHIZONTICIDES : Formes endoérythrocytaires asexuées
- lysosomotropes
- antimétabolites
- inhibiteurs de la respiration parasitaire
- antibiotiquesCnrcp
3
Des médicaments efficaces, sans danger, de faible coût
= la chloroquine et les antifoliniques (proguanil et pyriméthamine) ... jusqu’à ce que la résistance de P. falciparum se soit généralisée dans les années 80 ;
• seules alternatives accessibles en 2003 pour le traitement des résistances : pyriméthamine-sulfadoxine, amodiaquine, artémisinine ;
• urgence : évaluer de nouveaux antipaludiques.
Cnrcp
4
Chimiorésistance : définition• Capacité d’une souche d ’agent pathogène à se multiplier ou à survivre en présence de concentrations d’un médicament qui détruit normalement les parasites de la même espèce ou prévient leur multiplication.
• Résistance de P falciparum aux antipaludiques : toute fièvre après 72h de traitement avec une persistance de la même souche de P. falciparum que la souche initiale.
Cnrcp
5
Pourquoi le paludisme (à falciparum) est chimiorésistant ?
• Production de la chimio-resistance : mutation(s),
• Usage massif des antipaludiques : 2 x 109 cp de chloroquine en 1978 en Afrique,
• Le profil pharmacocinétique individuel d ’un médicament contribue à la sélection des parasites résistants (MQ > QU)
Cnrcp
6
Particularités du génome de Plasmodium falciparum
- Forte divergence du génome nucléaire : utilisation de A/T dans les codons : 82% (P. vivax : 67%).
- Génome mitochondrial conservé : 90% d ’identité entre les espèces plasmodiales.
- Eucaryote à cycle haploïde mais méiose normale (la progénie est distribuée selon Hardy-Weinberg ).
- Polymorphisme de séquences répétées.
Cnrcp
7
Utilisation des antipaludiques
Centres de santéCentres de santé
Quinine Injection Quinine Injection (2 millions)(2 millions)
Sulfadoxine Sulfadoxine -- Pyrimethamine Pyrimethamine (18 millions)(18 millions)
Chloroquine Chloroquine (134 millions)(134 millions)
autoauto--traitementtraitement
? ?
? ?
8
Le profil pharmacocinétique individuel d ’un médicament contribue à la sélection
des parasites résistants
[quinine] [méfloquine]
CI90
CI10
1 2 3 - - - - 7 14 21 jours
Cnrcp
9
Résistance aux médicaments dans le paludisme
• Deux mécanismes de base de résistance ont été
décrits chez P. falciparum :l’altération de l’affinité de liaison des enzymes
du parasite (pyriméthamine).
le transport altéré du médicament (chloroquine),
Cnrcp
10
vacuole digestive
cytoplasme parasitaire
cytosolérythrocytaire
pH 7,4 CQ = 1
pH 6,8 CQ + CQH+ = 5
pH 7,2CQ + CQH+ = 20
pH 5,2 CQ + CQH+ = 600
plasma
noyauPfcrt k76
Pfcrt muté détermine la CQ-R
Accumulation de CQ, inhibition de la digestion de l’hémoglobine
CnrcpCQ
Pfcrt 76t
CQ
11
Voies des Pyrimidines des Plasmodiumhumains
CO2 + aspartate
dihydroorotate
orotate
UDP dUTP
dUDP
dUMP dTMP
GTP
pteridine
dihydropteroate DHF
THF
N5,N10-CH3THF
ubiquinone H2
ubiquinone
cytochrome
cytochrome H2
1/2 O2
H2O
ADN
DHPS
DHFR
TS
DHOD
pABA
sulfadoxine
atovaquone
pyriméthamine, cycloguanilCnrcp
12
Ser108Asn
P. falciparumDi Hydro Folate Reductase
Cys59Arg
Asn51Ile
Ile164LeuAla16Val
Cnrcp
13
Mutations de la DHFR de P. falciparum, performances de l’enzyme et résistances
Mutation Cinétique Kinhib (nM) (Kcat/Km) pyrim. cyclog.
Sirawaraporn, 1997
sauvage 6,8 1,5 2,6
S108N 3,7 13 15
S108N + C59R 0,18 72 82
S108N + C59R + I164L 0,17 383 1141
14
Fitness (potentiel reproducteur)
• Utiliser des antipaludiques qui forcent Plasmodium à accumuler 2 mutations ou plus pour survivre pourrait restreindre le développement de la résistance.
• L’idée d’accumulation progressive de mutations de résistance correspond à ce qu’on observe in vitro mais sa réalité et son intérêt clinique restent à confirmer.
Cnrcp
15
Mortalité du paludisme & chloroquino-résistance
L’émergence de la chloroquino-R dans une zonesous chimio-prophylaxie de masse a un impact démontré
sur la mortalité attribuable au paludisme
Taux de mortalité attribuable au paludismeà Mlomp, Sénégal (Trape et al., 1998)
0
2
4
6
1985-89 1990-92 1993-95
Mortalité du paludisme (pour mille par an)
0-4 ans
5-9 ans
Cnrcp
16
Spread of chloroquine resistance
17
Nécessité de la surveillance de la résistance
Surveiller quoi ? (résistances cliniques, de souche, génétiques)
Surveiller qui ?(malades ou porteurs, résidents ou voyageurs)
Surveiller où ? (Pays, région, ville, quartier)
Surveiller quand ?(périodicité) Cnrcp
18
CHIMIOSENSIBILITE
Tests in vivo
Dosages
Tests de culture in vitro
Tests in silico (PCR)
Cnrcp
19
Tests in vivo OMS 01 : interprétationEchec thérapeutique précoce (ETP) : apparition d'un paludisme grave à J1, 2 ou 3 + parasitémie ; fièvre à J2 avec une parasitémie > à J0 ; fièvre à J3 + parasitémie ; parasitémie J3 = ou > 25% de J0.
Echec parasitologique tardif (EPT) : parasites sans fièvre entre J4 et 14 sans ETP ni ECTRéponse clinique et parasitol. adéquate (RCPA).
Echec thérapeutique tardif (ETT) : paludisme grave + parasitémie entre J4 et 14, sans ETP ; fièvre + parasitémie entre J4 et 14 sans ETP.
Cnrcp
20
Efficacité de la chloroquine en fonction de l ’âge à Madagascar
10 mg/kg en une dose
0
20
40
60
0-5 ans 5-14 ans 15 ans+
N° cas
RCPA
ETT
ETP
Cnrcp
21Cnrcp
22Cnrcp
23
marqueurs génétiques opérationnels de la résistance de P. falciparum
pyriméthamine : Ser -> Asn au codon 108 de la DHFR ;
cycloguanil : Ser -> Asn au niveau du codon 108 + Cys -> Arg au niveau du codon 59 de la DHFR (S108N + C59R) ;
pyriméthamine-sulfadoxine : DHFR S108N + C59R + N51I + mutations en 437 et 540 de la DHPS présentes dans 70% des échecs cliniques à SP ;
chloroquine : K -> T au codon 76 de la CRT (nécessaire mais pas suffisant ; ex. au Mali, diviser par 2,1-2,8 pour prédire la R clinique). Cnrcp
24
Proportions de mutants pyriméthamine-R et chloroquine-R à Dielmo, Sénégal, 1990 - 1999
010203040506070
90 91 92 93 94 95 96 97 98 99
Traitement quinine
Traitement chloroquine puissdx-pyriméthamine
IP & Cnrcp
%S108N%S108N%S108N (%S108N (pyrimpyrim--R)R)
%K76T (CQ%K76T (CQ--R)R)
25
Diversité génétique des populations de P. falciparum
• Les hôtes hébergent souvent plusieurs génotypes plasmodiaux
• Cette complexité est un obstacle important pour le contrôle du paludisme, en particulier pour :– les traitements– les vaccins– l’épidémiologie – les études physio-pathologiques
Cnrcp
26
• sans bénéfice individuel direct,• mettre en évidence l'existence de différents clones de P.
falciparum chez des patients avant la prise de l'antipaludique et au cours du traitement,
• étudier leur évolution à l'aide des techniques de biologie moléculaire adaptées (PCR quantitative).
Evaluation de la polyclonalité de P.falciparum au cours du traitement de
voyageurs par la quinine
Cnrcp
27
Problématique
1- Pouvoir comparer l’isolat avant et après traitement
2- Pouvoir détecter et quantifier un clone résistant minoritaire ou temporaire
Cnrcp
28
Patients
- 21 adultes fébriles, P.f au retour de pays endémique,
- protocole IMEA, agréé CCPPRB,
- hospitalisation courte,
- quinine 8 mg/kg/8h en IV,
- 10 prélèvements Hi, H2, H4, H12, H24, H36, H48, H60, H72 et H96
- Hi (diagn.) et H2 sont séparés de 6 à 8h
Cnrcp
29
À chaque prélèvement,
• Frottis et goutte épaisse,
• Extraction de l’ADN à partir de 100 µl de culot,
• Amplification msp-2 et analyse de fragments
Cnrcp
30
Ratio du mélange de parasites PfHB3+Pf3D7 : 98/2
HB3 3D7marqueur de taille interne
Analyse quantitative de fragments d ’ADN :electrophorégrammes
98 ± 0.3
2,2 ± 0.44
Ratio du mélange PfHB3/Pf3D7 : 2/98
amorces MSP2
31
Patient 18
0
1
2
3
4
5
6
Heures de prélèvements
Log(
Nbre
de
para
site
s/µl
)
Clone a
Hi H0H4 H24 H48 H72 H96
Camerounais, 3 sem au pays
Réponse thérapeutique à la quinine : infection à 1 clone
Cnrcp
32
Réponse thérapeutique à la quinine : infections à 3 clones
P a tie n t 1 7 : F lu c tu a t io n s d e s c lo n e s
0
1
2
3
4
5
6
He u r e s d e p r é lè v e me n ts
Log
(Nbr
e de
par
asite
s/µl
)
C lo n e a
Clo n e b
Clo n e c
Hi H4 H12 H2 4 H3 6 H4 8 H6 0 H72 H9 6
Ivoirien, 4 sem au paysPatient 13 : Fluctuations des clones
0
1
2
3
4
5
6
Heures de prélèvements
Log(
Nbr
e de
par
asite
s/µl
)
Clone aClone b
Clone c
Hi H2H4 H12 H24 H36 H48 H60 H72 H96
Malien, 2 sem au pays
Patient 15 : Fluctuations des clones
0
1
2
3
4
5
6
Heures de prélèvements
Log(
Nbre
de
para
site
s/µl
) Clone aClone bClone c
Hi H4 H36 H96
Comorien, 2 sem au paysPatient 19 : Fluctuations des clones
0
1
2
3
4
5
6
Heures de prélèvements
Log(
Nbre
de
para
site
s/µl
) Clone aClone bClone c
Hi H4 H24 H96
Camerounais, 2 sem au pays
Cnrcp
33
Patient 10
0
1
2
3
4
5
6
Heures de prélèvements
Log(
Nbr
ede
par
asite
s/µl
)
Hi H4 H24 H48 H96
Clone a : mutant dhfr & crt
H72
Clone b : mutant dhfr & crtClone c : mutant dhfr, sauvage crt
Clone d : sauvage dhfrClone e : sauvage dhfr, sauvage crt
Quantification des fragments MSP2 sous traitement à la quinine : infection ≥ 6 clones
Plasma :chloroq=67ng/mlproguan=0
→
Cnrcp
34
• Le mono-parasitisme est l’exception,• l'inoculation de souches S et R est fréquente,• impossible d’exclure la présence d’une souche
résistante sur le prélèvement avant traitement,• intérêt potentiel d’analyser les parasites résiduels
en cours de traitement,• s’il est démontré que la gravité est liée à la charge
de parasites séquestrés : → la chimioprophylaxie diminue le risque de
gravité si un partie de l’inoculum est sensible
Conclusion 1
Cnrcp
35
• Dans toute l’Afrique tropicale :différences significatives de fréquence et niveaux de résistance
• Dans les forêts d’Asie du Sud-Est et de Papouasie:faible n° d’épisodes par individu et forte
pression médicamenteuse,• En Amérique, en bordure des rivières d’Amazonie,
pas de résistance en Amérique Centrale
Où est le paludisme (à falciparum) chimiorésistant ?
Cnrcp
36
Stratégies
• Vieux méicaments– Rotation ? – Association ?
• nouveaux– Seuls ?– Associés ?
Cnrcp
37
Antimalariques disponibles face à la résistance• sulfadoxine -pyriméthamine (Fansidar®) 1 • amodiaquine (Camoquin®, Flavoquine®) 2 • méfloquine (Lariam®) 10• artéméther (Paluther®) 10• quinine 50• halofantrine (Halfan®) 300• associations :–méfloquine + artémether (ou artesunate) 10–dapsone+proguanil (ou chlorproguanil-LapDap®) 10–quinine + cycline (ou clindamycin) 100–artémether + luméfantrine (Riamet®,coartem®) 300, 20–atovaquone + proguanil (Malarone®) 300
Cnrcp
38
L’Afrique après la chloroquine :
amodiaquine ousulfadoxine-pyriméthamine (SP, Fansidar®)
• À peine plus coûteuses que la chloroquine,• les autres traitements antipaludiques coûtent plus
que la dépense annuelle en médicament par individu dans beaucoup de pays africains,
• SP première ligne thérapeutique dans 5 pays d ’Afrique de l ’Est,
• seconde ligne dans les autres pays d ’Afrique.
NN
NH2
SN
H
OO
OCH3
OCH3
SULFADOXINE
N
NC l N H 2
NH 2
CH 2C H 3
P Y R IM E T H A M IN E
Cnrcp
39
Amodiaquine-artésunatevs. Amodiaquine chez 941 enfants en Afrique
<0,000128,8%41%70%Kenya J28<0,000117,1%74%91%Kenya J140,04311,4%77%89%Gabon J280,152,3%98%100%Gabon J140,71,8%81%82%Sénégal J280,91-0,3%95%94%Sénégal J14
p∆Amodiaquine*Amodiaquine*-artésunate**
% guérison
Adjuik, Lancet, 2002
*10mg/kg/j x 3j; **4 mg/kg/j x3j
40
atovaquone • Hydroxynaphthoquinone (1982), large spectre
d'activité antiprotozoaire;• biodisponibilité 22%, clairance plus lente dans les populations
africaines (t1/2 73h) que dans les populations asiatiques (t1/231h), action schizonticide lente (TDP 60h) ;
• sélection de mutants résistants très rapide chez P. falciparum: 30% de rechutes, d'autant plus fréquentes que la charge parasitaire était élevée ;
• potentialisation avec le proguanil (indépendamment de l’action de son métabolite) ;
• association atovaquone-proguanil en traitement (1g + 400 mg/jx3) ou prophylaxie (250 mg + 100 mg/j) (Malarone®).
Cl
O
O
O
H
Cnrcp
41
Atovaquone-proguanil (A-P) taux de guérison à J28 ou J35
Halofantrine 100%100%France 95*< 0,02Méfloquine 86%100%Thaïlande
< 0,05Chloroq.-sulfad.-pyrim. 87,5%
100%PhilippinesNSQ-tétrac. 100%98,7%BrésilNSSulfad.-pyrim. 99%100%Zambie
0,02Amodiaquine 72%87%GabonPcomparateurA-PPays
*TDP A-P 63h, H 48h (p=0,02), vomissts A-P > H (p=0,001) Cnrcp
42
artémisinine (=O) → dihydroartémisinine (-OH) → artémether (-OCH3) → artésunate (-O-succinyl)
• Sesquiterpène-lactone (qinghaosu), absorption rapide mais incomplète par voie orale ou IM (biodisponibilité32%); clairance rapide (t1/2 = 3-10h) ;
• dosage d’artémether : 1,5 mg/kg/j IM x 5 (noncuratif chez les non immuns) ;
• action rapide ;• bien tolérée chez l’homme ;• Pas de chimiorésistance demontrée.
CNRCP
43
luméfantrine• Benflumétol (1993). Pas absorbée chez le sujet à jeun
(t1/2 72-120h). La débutyl-luméfantrine, 5 à 8 fois plus active que la molécule parente, est produite par la CYP3A4 des microsomes hépatiques. La cinétique du métabolite n’est pas connue.
• Action similaire à la méfloquine et l’halofantrine (TDP 54h).
• Allongement de l’espace QTc, ne semble pas dose dépendant.
• Association artémether-luméfantrine en traitement 80mg+480mg x2/j x 3 (Riamet®, Coartem®, 2000).
Cnrcp
44
Chimio-prophylaxie des groupes à risque
Cnrcp