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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE D’ORAN 1 AHMED BEN BELLA FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE DEPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE ET INDUSTRIELLE Thèse Présenté par TABAK Souhila Pour l’obtention DU DIPLOME DE DOCTORAT Spécialité : Microbiologie Option : Microbiologie Alimentaire Intitulé Devant les membres du jury Mr. BELKHODJA Moulay Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Président Mr. BENSOLTANE Ahmed Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Rapporteur Mr. CHEKROUN Abdellah Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Examinateur Mr. CHIRIGUENE Abderrahim Professeur Université Mostaganem, Algérie Examinateur Mr. GAMEL Ahmed Mohamed Ibrahim Professeur Université du Caire, Egypte Examinateur Mr. NIAR Abdelatif M Professeur Université de Tiaret, Algérie Examinateur Effet des bactéries lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus bulgaricus CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 sur Helicobacter pylori (SAN 158 et 26695) responsable des maladies gastroduodénales (in vitro et in vivo). Année Universitaire: 2014-2015

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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE D’ORAN 1 AHMED BEN BELLA

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE ET INDUSTRIELLE

Thèse

Présenté par

TABAK Souhila

Pour l’obtention

DU DIPLOME DE DOCTORAT

Spécialité : Microbiologie

Option : Microbiologie Alimentaire

Intitulé

Devant les membres du jury

Mr. BELKHODJA Moulay Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Président

Mr. BENSOLTANE Ahmed Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Rapporteur

Mr. CHEKROUN Abdellah Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Examinateur

Mr. CHIRIGUENE Abderrahim Professeur Université Mostaganem, Algérie Examinateur

Mr. GAMEL Ahmed Mohamed Ibrahim Professeur Université du Caire, Egypte Examinateur

Mr. NIAR Abdelatif M Professeur Université de Tiaret, Algérie Examinateur

Effet des bactéries lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus bulgaricus CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 sur

Helicobacter pylori (SAN 158 et 26695) responsable des maladies

gastroduodénales (in vitro et in vivo).

Année Universitaire: 2014-2015

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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE D’ORAN 1 AHMED BEN BELLA

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE ET INDUSTRIELLE

Thèse

Présenté par

TABAK Souhila

Pour l’obtention

DU DIPLOME DE DOCTORAT

Spécialité : Microbiologie

Option : Microbiologie Alimentaire

Intitulé

Devant les membres du jury

Mr. BELKHODJA Moulay Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Président

Mr. BENSOLTANE Ahmed Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Rapporteur

Mr. CHEKROUN Abdellah Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Examinateur

Mr. CHIRIGUENE Abderrahim Professeur Université Mostaganem, Algérie Examinateur

Mr. DJAMEL Ahmed Mohamed Ibrahim Professeur Université du Caire, Egypte Examinateur

Mr. NIAR Abdelatif M Professeur Université de Tiaret, Algérie Examinateur

Effet des bactéries lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus

bulgaricus CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 sur Helicobacter

pylori (SAN 158 et 26695) responsable des maladies gastroduodénales

(in vitro et in vivo).

Année Universitaire: 2014-2015

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Je tiens à remercier vivement ;

Mr le Pr. BenSoltane Ahmed, qui m’a suivi et orienté pendant toute la

période de mon travail. Je le remercie du fond de mon cœur pour ces précieux

conseils et de son soutien moral.

Mr le Pr. Belkhodja qui nous a fait l’honneur de présider le jury et estimer

mon travail.

A Mr le Pr. Chirigen A., Pr. Chegroun A., Pr. Djamel Ibrahim et Pr. Niar

A. qui m’ont fait l’honneur d’examiner ce travail.

Un remerciement particulier pour le Pr. Francis Mégraud et toutes

l‘équipes du Centre National des Campylobacter et Helicobacter-Bordeaux -

France pour leurs précieux aides et conseils.

Je remercie également tous ceux qui ont, de prés ou de loin, contribué à la

réalisation de ce modeste travail.

Mme Tabak Souhila

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Après avoir remercié « ALLAH » le tout puissant qui m’a aidé d’accomplir

mes études, je tiens à dédier ce modeste travail a ceux qui mon aidé à affronter

cette vie, ceux qui je ne réussirais jamais à les remercier, A ceux que je porte

toujours dans mon cœur ;

Mon très cher père, qui m’a soutenu, protégé, et encouragé tout le long de

ma vie. Merci

Ma très chère mère qui m’a donné beaucoup d’affection et d’amour toute au

long de ma vie. Merci

A mon très cher mari qui ma bien soutenue et a mes petites filles Narimane et

Malek.

A mes très chères sœurs Fatima Zohra, Nesrine et Sabrine qui ont veillé sur moi

avec leurs grands cœurs.

A mes très chers frères Abdel Karim, Mohamed El Amine et hichem.

A toute la famille Tabak et Boussaid, Je les remercie pour leur amour et

leur soutien.

A mon âme sœur Doukani koula.

A la famille Doukani et Ouahrani.

A mes très chères collègues.

Mme Tabak Souhila

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Résumé

Abstract

الملخص

Abréviations i

Liste des figures ii

Liste des tableaux ii

Listes des annexes iv

Introduction

Partie Bibliographique

Chapitre I : Revue Bibliographique d’ H. pylori

I-1 Historique d‟ H. pylori……………………………………………………………… 04

I-2 Taxonomie………………………………………………………………………….. 04

I-3 Etude bactériologique……………………………………………………………… 06

I-3-1 Caractères généraux…………………………………………………………… 06

I-3-1-1 Morphologie………………………………………………………….. 06

I-3-1-2 Physiologie…………………………………………………………… 08

I-3-1-3 Culturaux…………………………………………………………….. 09

I-3-1-4 Génétique……………………………………………………………. 09

I-3-2 Propriétés spécifiques de H. pylori ………………………………………….. 09

I-3-2-1 Sensibilité aux antibiotiques…………………………………………. 10

I-3-2-4 Réservoir de H. pylori………………………………………………………. 10

I-4 Epidémiologie………………………………………………………………………. 10

I-4-1 Prévalence de l‟infection à H. pylori…………………………………………. 10

I-4-2 Incidence de l‟infection………………………………………………………. 11

I-4-3 Où se trouve H. pylori?……………………………………………………….. 11

I-4-3-1 Chez l‟homme……………………………………………………….. 11

I-4-3-2 Chez l‟animal………………………………………………………… 12

I-4-3-3 Dans l‟environnement ………………………………………………. 12

I-4-4 Méthode de transmission……………………………………………………… 13

a- Méthode de transmission par voie orale orale…………………………….. 13

b- Méthode de transmission par voie fécale orale……………………………. 14

c- Méthode de transmission par voie gastro orale……………………………. 14

d- Méthode de transmission à partir de liquide gastrique…………………… 14

e- Méthode de transmission par l‟environnement…………………………… 15

f- Méthode de transmission par le risque professionnelle…………………… 15

I-5-1 Les facteurs de colonisation de H. pylori……………………………………... 16

I-5-1-1 Facteurs liée à la bactérie…………………………………………….. 16

I-5-1-2 Facteurs liée à l‟hôte………………………………………………….. 17

I-5-2 Le rôle pathogène de H.pylori………………………………………………... 18

I-5 -2-1Gastrite………………………………………………………………... 18

I-5-2-1-1 Gastrite aigue………………………………………………. 18

I-5-2-1-2 Gastrite chronique………………………………………….. 19

I-5-3 Comment un ulcère se forme-t-il?……………………………………………. 20

I-5-3-1 Ulcère gastrique………………………………………………………. 21

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I-5-3-2 Ulcère duodénal………………………………………………………. 21

I-5-3-3 Dyspepsie non ulcéreuse……………………………………………… 22

I-5-4 Cancer gastrique………………………………………………………………. 22

I-5-5 Lymphome de MALT…………………………………………………………. 23

I-6 Méthode de diagnostique…………………………………………………………… 24

I-6-1Test invasif……………………………………………………………………... 24

I-6-1-1Test rapide à l‟urée.……………………………………………………. 25

I-6-1-2 Examen anatomopathologie………………………………………….. 26

I-6-1-3 Cytologie.……………………………………………………………... 26

I-6-1-4 Mise en culture……………………………………………………….. 27

I-6-1-5 Amplification génétique……………………………………………… 28

I-6-2 Test non invasif……………………………………………………………….. 29

I-6-2-1 Sérologie……………………………………………………………… 29

I-6-2-2 Test respiratoire………………………………………………………. 29

I-6-2-3 Test utilisant la salive………………………………………………… 29

I-6-2-4 Test de l‟urine………………………………………………………… 29

I-6-2-5 Test utilisant les selles………………………………………………… 29

I-7 Traitement…………………………………………………………………………. 30

I-7-1 Eradication de H pylori………………………………………………………... 30

I-7-2 Comment trait ont H-pylori?………………………………………………….. 30

I-7-3 Contrôle de l‟éradication……………………………………………………… 33

I-7-4 Echec de l‟éradication………………………………………………………… 33

I-7-5 Prise en charge des échecs d‟éradication……………………………………… 33

I-7-6 Vaccination contre H. pylori…………………………………………………... 34

Chapitre II : Bactéries lactiques

II-1 Définition…………………………………………………………………………... 35

II-2 Caractéristiques générales des bactéries lactiques…………………………………. 35

II-3 Habitats……………………………………………………………………………. 36

II-4 Taxonomie……………………………………………………………………….. 36

II-4-1 Caractères de classification………………………………………………… 36

II-4-2 Les différents genres des bactéries lactiques…………………………………. 37

II-4-2-1 Genre Streptococcus…………………………………………………. 37

II-4-2-2- Le genre Leuconostoc……………………………………………….. 37

II-4-2-3 Le genre Pediococcus……………………………………………… 38

II-4-2-4 Le genre Lactobacillus……………………………………………….. 38

II-4-2-5 Le genre Bifidobacterium………………………………………….. 40

II-5 Principales propriétés métaboliques des bactéries lactiques……………………….. 42

II-5-1 Les exigences nutritionnelles………………………………………………… 42

II-5-1-1 L‟utilisation des acides aminés libres………………………………. 42

II-5-1-2 L‟utilisation des peptides et des protéines du lait…………………… 42

II-5-1-3 L‟importance des vitamines du lait……….………………………… 42

II-5-2 Le métabolisme des sucres (la fermentation lactique)………………………. 42

II-5-2-1 Définition de la fermentation lactique……………………………... 42

II-5-2-2 Métabolisme du lactose……………………………………………. 42

II-5-2-3 Le bilan énergétique de la fermentation lactique…………………….. 43

II-5-2-4 Métabolisme des autres sucres……………………………………….. 43

II-5-2-5 Métabolisme du citrate et d‟autres substrats carbonés………………. 44

II-5-3 L‟activité protéolytique………………………………….…………………. 44

II-5-4 La production de polysaccharides………………………………………….. 44

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II-5-5 La production de composes antagonistes…………………………………….. 45

II-6 Connaissance en génétique sur les bactéries lactiques…………………………… 45

II-6-1 Les bactériophages lactiques………………………………….……………. 45

II-6-2 Les plasmides résidents des bactéries lactiques……………………………. 45

II-7 Effets bénéfiques des bactéries lactiques sur la santé humaine………………….. 45

II-7-1 Amélioration de la digestion du lactose……………………………………. 46

II-7-2 Effets sur le transit et sur la flore intestinale……………………………….. 46

II-7-3 Effets sur la réponse immunitaire…………………………………………... 46

II-7-4 Rôle anti tumeur (cancérogenèse)…………………………………………... 47

II-7-5 Diminution du cholestérol sérique et déconjugaison des sels biliaires……... 47

II-7-6 Influence sur l‟absorption du calcium et des minéraux…………………….. 47

II-8 Devenir des bactéries lactiques ingérées…………………………………………… 47

Chapitre III: Interactions des bactéries lactiques.

III-1 Les phénomènes de stimulation ou de coopération………………………………... 49

III-2 Les phénomènes d‟antagonisme (d‟inhibition)……………………………………. 50

III-3 Facteurs d‟inhibition des bactéries lactiques………………………………………. 50

III-3-1 Les inhibiteurs non spécifiques………………………………………………. 50

III-3-1-1 Les inhibitions dues à la production d‟acides organiques…………… 50

III-3-1-2 Les inhibitions dues au peroxyde d‟hydrogène…………………….. 51

III-3-1-3 Autres inhibiteurs non spécifiques…………………………………... 51

III-3-2 Les inhibiteurs spécifiques « les bactériocines »…………………………….. 52

III-3-2-1 Définition……………………………………………………………. 52

III-3-2-2 Classification des bactériocines……………………………………... 52

III-3-2-3 Mode d‟action des bactériocines…………………………………….. 54

Partie expérimentale

Chapitre I : Matériel et méthodes……………………………………………………. 57

I-1 But du travail …………………………………….………………………………….. 57

I-2 Lieu et Période du travail……………………………………………………………. 57

I- 3 Matériels …………………………………….……………………………………… 57

I-3-1 Matière biologique ………………………….………………………………… 57

I-3-2 Appareillage et verreries……………………………………………………….. 58

I-3-3 Produits chimiques……………………………………………………………... 58

I-3-4 Indicateurs de couleurs ………………………………………………………… 58

I-3-5 Autres produits……………………………………………………………... … 59

I-3-6 Milieux de culture……………………………………………………………... 59

I-3-7 Matériel utilisés au laboratoire de Zoo technologie……………………………. 60

I-4 Méthodes ……………………………………………………………......................... 61

I-4-1 Protocole expérimentale……………………………………………………….. 61

I-5 Etude bactériologique Helicobacter pylori……………………………………...... 62

I-5-1Isolement d‟H-pylori…………………………………………………………… 62

I-5-2 Examen microbiologique………………………………………………………. 63

I-5-2-1 La culture……………………………………………………………... 63

I-5-2-2 Identification ……………………………………………..…………... 63

I-5-3 Tests biochimique……………………………………………………………… 64

I-5-4 Antibiogramme……………………………………………………………........ 66

I-5-5 Purification…………………………………………………………….............. 66

I-5-6 I-5-6 Détection de Helicobacter pylori et détermination de la résistance à la

clarithromycine par PCR en temps réel………………………………………..

66

I-5-7 Test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1)…………………………….. 68

I-5-8 Conservation des souches……………………………………………………… 69

I-6 Interaction bactérienne…………………………………………………………..... 70

I-6-1 Purification et Conservation……………………………………………………….. 70

I-6-2 Pré identification …………………………………………………………….... 70

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I-6-2-1 Etude morphologique……………………………………………......... 69

I-6-2-2 Etude physiologique………………………………………………...… 70

I-6-2-3 Etude biochimique …………………………………………………… 70

I-6-2-4 La diminution du pH par les bactéries lactiques……………………… 70

I-6-3 Test de l‟antagonisme………………………………………………………….. 71

I-6-3-1 Préparation des prés cultures ………………………………………… 71

I-6-3-2 Détection de l‟activité antagoniste des bactéries lactiques…………… 71

I-6-4 Recherche des agents d‟inhibitions (bactériocines)…………………………… 74

I-7 Etude in vivo……………………………………………………………................... 76

I-7-1 Les étapes de la dissection ………………………………………………......... 77

I-7-2 - Les étapes de la réalisation des coupes histologiques………………………… 79

Chapitre II : Résultats

II-1 Résultats de l’identification d’ Helicobacter Pylori …………………………….

84

II-1-1-Etudes bactériologiques ……………………………………………………… 84

II-1-2 La culture……………………………………………………………...………. 84

II-1-1-1 Aspect macroscopique ……………………………………………… 84

II-1-1-2 Aspect microscopique………………………………………………... 85

II-1-3 Etude Biochimique…………………………………………………………… 86

II-1-4 Antibiogramme …………………………………………………………….... 89

II-1-5 Résultat du test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1)………………… 90

II-1-6 Résultat de la PCR……………………………………………....................... 91

II-2 Résultats de l’interaction bactérienne…………………………………………. 93

II-2-1 Résultats du pré identification des souches lactiques ………………………… 93

II-2-2 Les résultats de la mesure du pH et l‟acidité des bactéries lactiques ………... 97

II-2-3 Dénombrement ……………………………………………………………...... 97

II-2- 4Test de l‟antagonisme ………………………………………………………… 99

II-2- 4-1 Recherche des inhibitions …………………………………………… 99

II-2- 4-1 Recherche de bactériocine ………………………………….............. 101

II-3 Résultats de l’étude in vivo……………………………………………………...... 103

II-3-1 Résultats du Lot A …………………………………………………............... 103

II-3-2 Résultats du Lot B……………………………………………….................... . 107

Chapitre II : Discussion

III-Discussion des résultats…………………………………………………………….

III-1 Isolement et identification des souches de H.pylori…………………………… 111

III-2 Pré identification des bactéries lactiques………………………………………. 112

III-3 Interaction bactériennes………………………………………………………… 113

III-4 Discussion des résultats in vivo………………………………………………… 116

Conclusion……………………………………………………………............................. 119

Perspective……………………………………………………………............................ 121

Références Bibliographiques………………………………………………………….. 122

Annexe

Publication scientifique

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i

Résumé

Helicobacter pylori est une bactérie pathogène reconnu récemment pour ces

implications dans les maladies gastro-duodénales : ulcère duodénal, ulcère gastrique,

lymphome gastrique du MALT et aussi du cancer gastrique. Sachant que les bactéries lactiques

notamment les Bifidobactéries jouent un rôle important dans les domaines biotechnologiques,

médicaux et dans la fabrication de produits alimentaires comme un meilleur conservateur vu

leurs caractéristiques fort intéressantes et leurs propriétés antimicrobiennes.

En se basant sur ces deux critères, nous avons commencé à réaliser l‟interaction

bactérienne entre les bactéries lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ 447,

Lactobacillus bulgaricus CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 et

Helicobacter pylori en passant par trois étapes :

La mise en évidence d‟H.pylori, qui repose sur la réalisation de biopsies gastriques

prélevées sur des patients souffrants de multiples infections gastroduodénales. La culture H.

pylori dans des milieux sélectifs et dans de meilleures conditions de croissance nous a permet

d‟isoler H.pylori. Pour compléter l‟identification de la bactérie, des tests biochimiques étaient

nécessaires en utilisant des galeries classiques API 20. A la fin de cette étape nous avons

réalisé l‟antibiogramme, important pour étudier la réaction d‟Helicobacter pylori vis-à-vis des

antibiotiques utilisés.

Le test de Western blot HELICO BLOT 2.1 a incriminé H. pylori comme agent causal

d‟ulcère chez onze (11) patients sur un totale de seize (16).

La PCR a permis d‟identifier deux souches d‟H.pylori (SAN 158 et 26695)

appartenants à la famille des Helicobacter.

L‟étude microbiologique des bactéries lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ

447, Lactobacillus bulgaricus CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 nous a

montré, que ces bactéries sont des Gram positif. Les tests biochimiques nous ont permis

d‟identifier le capitale enzymatique pour chacune des ces bactéries. La fermentation des sucres

était révélatrice car elle a confirmé l‟utilisation des sucres Glucose, Lactose, Saccharose

comme source d‟énergie par cette bactérie.

L‟interaction entre les bactéries lactiques et Helicobacter pylori a donné des résultats

positifs observés par la présence des zones d‟inhibitions, Bf.bifidum inhibe les souches de

H.pylori avec un diamètre minimal d‟inhibition de 08 mm, pour Lb. Bulgaricus de 05 mm et

pour Sc. Thermophilus de 03 mm. Des tests supplémentaires sont nécessaires pour connaître

la nature exacte de l‟agent inhibiteur. Les résultats ont montré que la sécrétion des acides

organiques et la production de bactériocines-like sont à l‟origine de l‟inhibition. Les résultats

de ces tests nous ont permis de constater la présence des bactériocines produites par Bf.

bifidum en bouillon MRS.

Les résultats des coupes histologiques indiquent que l'alimentation à base de Bf.

bifidums en premier lieu défi a un impact plus significatif sur l'inflammation due à H. pylori,

En fin, ces résultats suggèrent que les bactéries lactiques représentent un bon candidat

utilisé pour prévenir l'infection entérique humain.

Mots clés

Helicobacter pylori – Maladies gastroduodénales- Interaction – Bifidobacterium bifidum -

Biopsies gastriques –Inhibition- Coupe histologique.

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ii

Summary

Helicobacter pylori is a pathogenic bacterium recently recognized for its implications

in gastroduodenal diseases duodenal ulcer, gastric ulcer, gastric MALT lymphoma and gastric

cancer also. Knowing that lactic acid bacteria, including Bifidobacteria play an important role

in biotechnology, medical fields and in the manufacture of food products as a better

conservative seen their very interesting characteristics and antimicrobial properties.

Based on these criteria, we began to realize the interaction between lactic bacteria

Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus bulgaricus and Bifidobacterium

bifidum CNRZ449 CUETM 89/29 and Helicobacter pylori through three stages:

The detection of Helicobacter pylori based on the realization of the gastric biopsies

from patients suffering of multiples‟ gastroduodenal infections. H. pylori culture in selective

media and better conditions of growth allows us to isolate Helicobacter pylori. To complete the

identification of the bacteria, biochemical tests were needed using standard API strips 20. At

the end of this stage, we realized susceptibility testing, important to study the response of

Helicobacter pylori against antibiotics.

The Western blot test HELICO BLOT 2.1 H. Pylori has been implicated as ulcer

causative agents in eleven (11) patients with a total of sixteen (16).

PCR was used to identify two strains of H.pylori (SAN 158 and 26695) apartments for

the family of Helicobacter.

The microbiological study of lactic acid bacteria Sc.thermophilus CNRZ 447,

Lb.bulgaricus and Bf.bifidum CNRZ449 CUETM 89/29 has shown that these bacteria are

gram positive. Biochemical tests allow us to identify the enzyme capital for each of these

bacteria. The fermentation of sugars was revealing because it confirmed the use of glucose

sugars, lactose, and sucrose as an energy source by this bacterium.

The results of the interaction between the lactic acid bacteria and H.pylori revels the

presence of inhibitory zones. H. pylori strains with a minimum diameter of inhibition of 08

mm with Bf. bifidum, Lb. Bulgaricus is 05 mm and for Sc. Thermophilus is 03 mm. Further

tests are needed to determine the exact nature of the inhibitor. The results showed that the

secretion of the organic acids and the production of bacteriocins are responsible for the

inhibition. The results of these tests show the presence of bacteriocins produced by Bf. bifidum

in MRS broth.

The results of histological sections indicate that the feeding of Bf. bifidums first

challenge has a more significant impact on inflammation caused by H. pylori.

In the end, these results suggest that lactic acid bacteria are a good candidate used to

prevent human enteric infection.

Keywords: Helicobacter pylori - Gastrointestinal Diseases - Interaction - Bifidobacterium bifidum -

Gastric biopsies -Inhibition- histological section.

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iii

الملخص

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ريجاارتطل عثبااي ريااع مل اا هيليكوباارت ب بيلااوي م عيااه ةاارت وحرتبياا سااو رياا ماااودو ملسةفرتعاال باا بكة لاارت محااض ملسلبجياا Lactobacillus ريلام ت 22. م Bifidobacterium bifidum ريلام عثباي ت 20ملمدىن لبلا يآلهارت

bulgaricus CNRZ449 ريلام ت 20و Streptococcus thermophilus مهجارتك رتاا وم ريللاهم bacteriocinsرتن ملسألضول مو ةرتج ري ملالعةبرتيمل سةح ل ملسيبيأل ملس ي سل رت ع. م تهآل ملسجةرت ن و آلملز ملممح

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الكلمات المفاتيحية:ب - بيلوي هليكوباكتر B. BIFIDUMS ملفض م ملجلهرتز ريآلملن - - .ملسجايمم ام - ملسبكة لرت ب ملسةفرتعل

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iv

ABREVIATION

A H. pylori: Adhesin H. pylori

ADN : Acide désoxyribonucléique

ACH : Acetycholine

AG : Antigéne

AIF-1: Anti inhibitor factor-1

AINS: Anti-inflammatoire non steroiden

ARN: Acide ribonucléique

AS: Antisécrétoire

BAB : Blood group antigen

Bf: Bifidobactérium

CCK: Coléckcystokinine

CD: Cluster of differentiation

C-G: Cytosine - Guanine.

CSF: Colony stimulating factors

CMH: Complex majeur d‟histocompatibilité

DNU : Dyspepsie non ulcéreuse

E : Escherichia

EGF: Epidermal growth factor.

ET1: Endothéliale

F6PPK: Fructose 6 Phosphate Phosphorylase

GA: Gastrite aigue

GC : Gastrite chronique

GRP : Gastrin Relasing peptide

Halo : zone d‟inhibition

Vac A: Vacuolising associated cytotoxin

Hp-NAP: Helicobacter pylori neutropphile

activating peptide.

H : Helicobacter

HsP : Protéines de stress

IgA: Immulogglobuline A

IgG: Immulogglobuline G

IgM: Immulogglobuline M

La: Lactobacillus

IL8: Interleukine 8

KD: Kilo Dalton

MALT: Mucosa Associated Lymphoid

Tissue

MCP: Monocyte chemoattracant protéine

MIP1: Macrophage inflammatory protein

MRS: De Man Rogosa Sharp

NF: Nuclear factor

NO: Monoxyde

PCR: Plymerase chain reaction

PH: Potential ions Hydrogen

PN : Polynucleaires

REDOX : Orydo-réduction

SM : Souche ensemencée en touché

ST : Souche ensemencée en masse

Sc : Streptococcus

SS : Somatostatine

UD: Ulcère duodénal

UG: Ulcère gastrite

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v

LISTE DES FIGURES

Figure 31 : La déshydratation des tissus dans des bains d‟alcool. 80

Figure 32 : Inclusion a la paraffine. 80

Figure 33 : Préparation des blocs des différentes parties du tube digestif du lapin. 81

Figure 34 : Lames après coloration « hématoxyline-éosine ». 83

Figure 01 : Relation phylogénétique de H.pylori avec certaines bactéries à Gram négatives 05

Figure 02 : La forme H. pylori sur microscope électronique 06

Figure 03 : Gastrique chronique 19

Figure 04 : Différents grades d‟atrophie de la muqueuse gastrique Fundique 20

Figure 05 : Métaplasie intestinale observée par la technique dit du tes- tape 20

Figure 06 : Formation de l‟ulcère 21

Figure 07 : Cancer gastrique superficiel 23

Figure 08 : Lymphome de MALT 24

Figure 09 : Les différents tests pour le diagnostic de H.pylori 25

Figure 10 : Etude anatomopathologique : H. pylori après différents colorations 27

Figure 11 : Aspect macroscopique des colonies d‟ H. Pylori sur Gélose chocolat après 5 jours

d‟incubation à 37°C en atmosphère micro-aérophile

28

Figure 12 : Streptococcus thermophilus sur Microscopie électronique à balayage 38

Figure 13 : Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus 39

Figure 14 : Association du Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus 40

Figure 15 : La symbiose des bactéries du yaourt

Figure 16 : Mode d‟action des bactériocines

50

54

Figure 17 : Lapines dans l‟animalerie 58

Figure 18 : Protocole expérimental 61

Figure 19 : Le protocole expérimental de l‟isolement et identification D‟ Helicobacter pylori 62

Figure 20: L‟étude biochimique sur des galeries (API 20 Campy) 65

Figure 21: Test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1) 69

Figure 22 : Les bandelettes de nitrocellulose 69

Figure 23 : Protocole expérimental de la méthode de diffusion par disques 73

Figure 24 : Schéma représentant la recherche de bactériocines

Figure 25 : Schéma représentant de l‟étude in vivo

75

76

Figure 26 : Fixation et dissection du lapin 77

Figure 27 : Observation du tube digestif 77

Figure 28 : Organisation du tube digestif 78

Figure 29 : Le contenue de l‟Estomac 78

Figure 30 : Un fragment de l‟Estomac 79

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Figure 35 : Incubation de H. pylori dans une jarre a anaérobiose. 84

Figure 36 : Aspect macroscopique des colonies d‟H.pylori après 5 jours d‟incubation à 37°C en

atmosphère micro-aérophile

85

Figure 37 : Aspect microscopique de H.pylori. 85

Figure 38 : Résultat de l‟oxydase 87

Figure 39 : Résultat de catalase 87

Figure 40 : Résultat du teste d‟urée 88

Figure 41 : Résultat de la DNAse 88

Figure 42 : Les résultats de l‟identification biochimique des trois souches isolées de H.pylori

utilisant des API 20 campy.

89

Figure 43 : le Figure 43 : Les Résultats de l‟antibiogramme sur Gélose Mueller Hinton + 5% de sang de mouton 89

Figure 44 : Résultats du test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1 91

Figure 45 : Contrôles de la PCR : 4 témoins (WT, G, C et TNEG) 91

Figure 46 : Résultat positive et sensibilité à la clarithromycine de la PCR de la souche SAN 148 92

Figure 47 : Résultat positive et sensibilité à la clarithromycine de la PCR de la souche 26695 92

Figure 48 : Culture de Lactobacillus bulgaricus sur le milieu MRS agar. 94

Figure 49 : Culture de Streptococcus thermophilus sur le milieu M17 agar 94

Figure 50 : Culture de Bifidobacterium bifidum sur le milieu MRSè Cyst agar. 95

Figure 51 : Aspect microscopique de Lb. bulgaricus après la coloration de Gram (G×100). 96

Figure 52 : Aspect microscopique de Sc. thermophilus après la coloration de Gram (G×100). 96

Figure n° 53 Figure 53 : Aspect microscopique de Bifidobactérium bifidum après la coloration de Gram

(G×100).

96

Figure 5 Figure 54 : La croissance de Bf. bifidum, Lb. Bulgaricus, Sc. Thermophilus et H. pylori 99

Figure 55 : Figure 55 : Méthode de diffusion par disques 100

Figure 56 : Résultats de l‟antagonisme de H. pylori avec les trois bactéries lactique 100

Figure 57 : Résultats de l‟antagonisme de H. pylori avec Bf.bifidum. 101

Figure 58 : La croissance H. pylori en présence de bactériocines – like produite par Bf.bifidum. 102

Figure 59 : Tube digestif d‟un lapin traité par probiotiques 14 jours (Lot A) 103

Figure 60 : Tube digestif d‟un lapin traité par probiotiques 28 jours (Lot A) 103

Figure 61 : Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique pendant 14 J (G×40) (Lot A) 104

Figure 62 : Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique pendant 28 J (G×40) (Lot A) 104

Figure 63 : Tube digestif 14 jours après prise de H. pylori (LotA) 105

Figure 64 : Tube digestif 28 jours après prise de H. pylori (Lot A) 105

Figure 65 : Coupe histologique de l‟estomac avec injection de H. pyloti pendant 4J (G×40) (Lot A) 106

Figure 66 : Coupe histologique de l‟estomac avec injection de H. pyloti pendant 8J (G×40) (Lot A) 106

Figure 67 : Tube digestif 14 jours après prise de H. pylori (Lot B) 107

Figure 68 : Tube digestif 28 jours après prise de H. pylori (Lot B) 107

Figure 69 : Coupe histologique de l‟estomac avec injection de H. pyloti pendant 14 J (G×40) (LOT B) 108

Figure 70 : Coupe histologique de l‟estomac avec injection de H. pyloti pendant 28 J (G×40) (LOT B) 108

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Figure 71 : Caecum irrité (Lot B) 109

Figure 72 : Présence de gaz dans l‟estomac et intestin grêle. (Lot B) 109

Figure 73 : Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique pendant 14J (G×40) (Lot B) 110

Figure 74 : Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique pendant 28 J (G×40) (Lot B) 110

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LISTE DES TABLEAUX

Tableau 01 : Espèce des genres Helicobacter pylori 05

Tableau 02 : Le point actuel sur le réservoir et les sources d'infection 13

Tableau 03 : Sites où H.pylori peut être retrouvé chez l'homme en cas d'infection 13

Tableau 04 : Synthèses des caractéristiques des molécules actives sur H. pylori en monothérapies 31

Tableau 05 : Différentes bases du traitement anti-H. Pylori, dosage et Durée 32

Tableau 06 : Les différents milieux écologiques des BLs 36

Tableau 07: Les différents genres des BLs 38

Tableau 08 : Critères différentiels des 3 groupes de Lactobacillus 39

Tableau 09 : Les différents types des ferments lactiques 43

Tableau 10 : Exemples de bactéries lactiques utilisées dans la fermentation des aliments 44

Tableau 11 : Principaux rôles bénéfiques pour la santé humaine des bactéries lactiques 46

Table Tableau 12 : Pourcentages de survie de quelques bactéries d‟origine alimentaire dans l‟intestin grêle

humain

48

Tableau 13 : Classification des bactériocines de bactéries lactiques

Tableau 14 : Préparation des Mix PCR

53

67

Tableau 15 : Caractérisation biochimique des différentes souches de H. pylori 86

Tableau 16 : Antibiogramme des souches de H. pylori isolées. 90

Tableau 17 : Résultats d‟identification des souches lactiques. 93

T Tableau 18 : Diminution du pH par les deux souches lactiques cultivées dans le bouillon approprié

(MRS ou M17 liquide) pendant 48 h à 37°C.

97

Tableau 19 : Résultats de la densité optique de Bf. bifidum, Lb. blgaricus, Sc. Thermophilus et

H.pylori

97

Tableau 20 : Dénombrements de Bf. bifidum, Lb. blgaricus, Sc. Thermophilus et H.pylori 98

Tableau 21 : Résultats de l‟antagonisme de H. pylori 99

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ix

Liste des Annexes

Annexe I : Caract éristiques biochimiques et culturales de C. jejuni, H. pylori, H. mustelae et W.

succinogènes

I

Annexe II : Sensibilité d‟ H. pylori aux antibiotiques

II

Annexe III : Composition des différents milieux de culture

III

Annexe IV : Technique de la coloration de Gram

IV

Annexe V : Préparation des réactifs et solutions

V

Annexe VI : Sérologie

VI

Annexe VII : Coupe histologique du lapin témoin

VII

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Introduction

2

1- Introduction

Helicobacter pylori est une bactérie fut découverte accidentellement en 1982 par deux

chercheurs australiens, Robin Warren (pathologiste) et Barry Marshall (gastroentérologue),

qui isolaient et cultivaient des organismes à partir d'estomacs humains.

Mais la découverte du rôle d‟H. pylori, dans quelques-unes des maladies

gastroduodénales est venue bouleverser les concepts physiopathologiques jusqu‟alors retenu

(Fagniez, 1995).

Helicobacter pylori est impliqué dans la genèse de la majorité des gastrites chroniques,

dans les maladies ulcéreuses, duodénale ou gastrique, dans la dyspepsie non ulcéreuse ou

indirectement dans la survenue du lymphome ou cancer gastrique (Ferrero et al., 1995), on a

récemment suspecté puis confirmé que H. pylori pouvait contribuer à la survenue de la maladie

de Parkinson et les recherches sont en cours d'approfondissement (Chuan et al., 2005).

C‟est en tout cas un excellent marqueur de ces maladies (Fauchère., et Rosenau.,

1991). Puisque 80 % des ulcères gastro-duodénaux sont causés par des infections de H. pylori,

même si, chez beaucoup d'humains infectés, la maladie reste asymptomatique.

Helicobacter pylori est une bactérie très commune (trouvée chez 50 % des humains).

Elle vit exclusivement dans l'estomac humain et est la seule bactérie connue pouvant survivre

dans un environnement aussi acide. Son enveloppe hélicoïdale pourrait l'aider à se visser dans

le mucus de la paroi stomacale afin de la coloniser et d'y persister.

Mais depuis la découverte des probiotiques, ces dernières suscitent l‟intérêt des

médecins et des nutritionnistes en raison de leur absence en pathogéneicité et de leur réputation

de protection vis à vis des gastro-entérites (Marteau et Seksik., 2005).

Les bactéries lactiques comptent parmi les principaux probiotiques. Leur nom générique

vient du fait qu‟elles produisent de l‟acide lactique. Elles comprennent, notamment, les

lactobacilles (bactéries du genre Lactobacillus), les bifidobactéries (bactéries du genre

Bifidobacterium) et certains streptocoques (bactéries du genre Streptococcus).

Ce sont des bactéries de ce type qui servent généralement à la production du yogourt

(Lb. bulgaricus, Sc. thermophilus), de la choucroute, des légumes lactofermentés et du salami

(Lb. plantarum)

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Introduction

0

Les probiotiques agissent par 3 principaux mécanismes (Penner et al., 2005) :

Le premier consiste à moduler l‟activité du système immunitaire intestinal (Haddad et

al., 2005).

Les probiotiques renforcent l‟immunité lorsqu‟elle est faible, par exemple, au moment

du développement du système immunitaire chez l‟enfant, ou de son vieillissement chez les

personnes âgées.

Ils diminuent également la suractivation du système immunitaire, notamment dans les

cas d‟allergies ou des maladies inflammatoires de l‟intestin. En second lieu, les probiotiques

augmentent la fonction de barrière de la muqueuse intestinale, par exemple en accentuant la

production de mucus ou des anticorps de type IgA.

Finalement, les bactéries lactiques ont des effets antimicrobiens directs, en prenant la

place des bactéries pathogènes (phénomène de compétition) et en empêchant leur adhésion à la

paroi intestinale.

Ces bactéries produisent de l‟acide lactique et de l‟acide acétique qui ont pour effet

d‟abaisser le pH et de limiter la croissance de certains germes pathogènes. (Rasick et

Kurmann, 1983).

La limitation de la croissance de ces dernières est également due à la production par les

bifidobactéries de H2O2 et des bactériocines. Pour cela, de nouvelles stratégies sont mises en

place pour l‟utilisation de ces bactéries pour limiter la croissance de H.pylori dès l‟enfance.

Pour ces raisons citées précèdement nous allons nous s‟intrésser à mettre en évidence

l‟effet probiotique in vitro et in vivo de ces quelques bactéries lactiques sur H .pylori et le

travail sera organisé comme suit :

1-Une revue bibliographique, comprenant trois chapitres

Une étude concernant la bactérie H. pylori où nous avons retenu les aspects

microbiologiques, épidémiologiques, physiopathologiques, thérapeutiques et les tests

diagnostiques.

Une synthèse sur les caractéristiques générales des bactéries lactiques et

principalement le genre Bifidobacterium qui a un intérêt thérapeutique.

Les différents phénomènes l‟interaction bactérienne sont expliqués dans le

dernier chapitre.

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Introduction

0

2- La méthodologie permettant dans un premier temps ;

L‟isolement et Identification d’Helicobacter pylori, responsables de certaines

maladies gastro-duodénale.

Dans un deuxième temps une pré identification des bactéries lactiques

Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus bulgaricus CNRZ449 et

Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 et la réalisation d‟un test d‟antagonisme afin de

démontrer l‟inhibition Helicobacter pylori par les bactéries lactiques.

Dans un troisième temps, nous réalisons in vivo l‟effet probiotique

Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29.

3- Les résultats et la discussion sont présentés dans la troisième partie.

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Revue Bibliographique

d'Helicobacter pylori

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Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori

4

I-1 Historique

La découverte d'H. pylori a commencé en 1981 par Barry Marshall durant son stage de

gastro-entérologie, ou il a rencontré Robin Warren, qui avait un intérêt particulier pour les

bactéries spiralées de l‟estomac, bactérie qu'il avait observé après coloration argentique de

biopsie gastrique dès 1979 (Warren et al., 1983).

Il élabora ainsi le protocole d'une étude endoscopique portant sur 100 patients qui débuta

en avril 1982 et bénéficia d'une mise de culture micro- aérobie systématique des biopsies

gastriques. La survenue d'une épidémie d'infection à staphylocoque résistant mobilisa

cependant toute l'équipe du laboratoire de microbiologie durant le week-end de pâque, qui

abandonna bien involontairement pendant cinq jours les prélèvements dans un incubateur.

Hasard de la recherche, ce temps d'incubation plus prolongé que d'habitude permit la première

culture d‟H. pylori, tout d'abord identifié comme un organisme voisin des campylobacters

«campylobacter like organisme » ou CLO (Marshall., 1996).

Mais l'examen microscopique électronique de ces biopsies et les cultures ont montré que

cette bactérie était au moins une nouvelle espèce et peut être un nouveau genre car elle avait

plusieurs flagelles engainés, à la différence des Campylobacter entériques qui n'avait qu'un

seul flagelle non- engainé (Goodman et al., 1996) ; le nom a été modifié en Campylobacter

pylori et fut définitivement appelé Helicobacter pylori, du fait de ces particularités

génomiques et fonctionnelles notamment enzymatiques. Cette découverte a conduit à admettre

que l‟estomac, jusqu'alors considéré comme peu propice à la multiplication bactérienne en

raison de son pH très acide, pouvait être le siége d'une croissance bactérienne (Wyatt., 1996).

Depuis la première culture en 1982, le nombre de publications a augmenté de manière

exponentielle et a permis de mieux comprendre les nombreux travaux précédents qui ont

concerné la microbiologie, la biochimie et l'histologie de la muqueuse gastrique après un

certain scepticisme de la part des médecins (Lamoulaitte et al., 1992).

I-2 Taxonomie d’ Helicobacter pylori

Le genre Helicobacter a été créé en 1989 avec H.mustelae et H. pylori (Avril, 1988)

bactéries préalablement placées dans le genre Campylobacter. Il fait partie de la famille des

Spérilaçae et du groupe Vibrion (Axon., 1997). Ce groupe réunit les genres : Campylobacter,

Helicobacter, Acrobacter et Wollinella. Depuis une dizaine d‟années, d‟autres espèces ont

été découvertes ou reclassées dans ce genre, la plupart colonisent l‟estomac de différents

animaux. Les dernières espèces identifiées ne sont pas encore officiellement reconnues est ce

sont : H. canis (du chien) et H. hepaticum (chez la souris) (Mégraud et al., 1999) (Tab. 01 et

Fig. 01).

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2

Tableau 01. Espèce des genres Helicobacter pylori d‟après Mégraud et Lamouliatte., 1997

Espèces Niche Ecologique Site D’infection

H.pylori

H.cinaedi

H.fennelliae

H.mustelae

H.felis

H.muridarum

H.nemestrinase

H.acinonyx

H.heilmanu

H.canis

H.hepaticum

Flexispira rappin

Homme

Hamster, Homme Chien, Chat

Furet

Chien, Chat

Souris

Singe macaque

Léopard

Chat, Chien

Chien

Souris

Souris

Estomac Intestin Intestin Estomac Estomac Intestin Estomac Estomac Estomac Intestin Intestin, foie Intestin

Figure 01. Relation phylogénétique de Helicobacter pylori avec certaines bactéries à Gram

négatives d‟après Mégraud et Lamouliatte., 1997

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1

I-3 Etude bactériologique

I-3-1 Caractères généraux

Helicobacter pylori peut être considéré comme le chef d‟un nouveau groupe de bactéries

appelées superfamille VI de bacilles gram négatif. Elle représente le genre H. pylori qui est

distinct du genre Campylobacter et de la famille des Vibrionaceae ; elle fait partie des bactéries

qui colonisent le mucus digestif. Ce genre réunit les genres Campylobacter, Helicobacter,

Arcobacter et Wallinla (Sobhani et al., 1995).

II-3-1-1Caractères morphologiques

Helicobacter pylori développe de petites colonies de 1 à 2 mm de diamètre, transparentes

ou grisâtres, luisantes, discrètement bombées, rondes et régulières (Biomerieux, 1994 ; Cellini et

al., 1995; Sobhani et al., 1995 ; Mégraud et al., 1998). C‟est un bacille à gram négatif de 3 à 5

µm de long et 0.5 à 1 µm de large (Fléjou, 1989 ; Biomerieux., 1994 ; Avril., 1988).

Helicobacter pylori se présente sous forme spiralée, incurvée ou en forme de U ou O

dans les jeunes cultures (Sobhani et al., 1995 ; Fauchère., 1994 ; Fauchère et Rosenau, 1991)

pouvant évoluer vers des formes coccoïdes non cultivables dans les vielles cultures et seraient

pour certains des formes de dégénérescence, pour d‟autres des formes de résistance

(Biomerieux., 1994; Cellini et al., 1994 ; Sobhani et al., 1995 ; Mégraud., 1994 ; Fauchère.,

1994 ; Fauchère et Rosenau., 1991).

C‟est une bactérie non sporulée (Vincent, 1999), mobile par 4 à 6 flagelles unipolaires

engainés, (Sobhani et al., 1995 ; Vincent., 1995 ; Fauchère., 1994 ; Fléjou., 1989) ce qui lui

confère une grande mobilité par frétillement et par des mouvements de rotation caractéristiques

(Sobhani, et al., 1995). Chaque flagelle possédant un bulbe terminal qui le distingue des autres

campylobacters (Fléjou, 1989). (Fig. 02)

Figure 02. La forme Helicobacter pylori sur microscope électronique d‟après Mégraud, 1994

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7

Organisation Interne

Helicobacter pylori a un cytoplasme dense contenant le matériel nucléaire, des ribosomes et

a une structure de paroi des bactérie à Gram négatif avec une membrane externe et une

membrane cytoplasmique séparées par un espace péri plasmique, le tout d'une épaisseur de 3 nm

(Goodwincs., 1989; Jones et al., 1985). En général, elle possède de 4 à 6 flagelles, (Sobhani et

al., 1991) et on observe un bulbe ou un disque à l‟extrémité distale de ses flagelles que l‟on ne

retrouve pas chez les espèces de Compylobacter (Jones., 1985 ; Kaspar., 1989 ; Sobhani et al.,

1991).

L'insertion du flagelle est associée avec une zone translucide mais pas exactement en dessous

: il existe une bande d'une épaisseur de 6 à 8 nm, dense aux électrons, qui se trouve à environ 20

nm sous la membrane cytoplasmique (Lee., 1998) ; c'est ce qu'on appelle la membrane

polaire. L‟association de cette structure avec le complexe basal du flagelle n'est pas clairement

définit, il pourrait s'agir d'une structure spécialisée qui a évalué en tant qu'endroit ou l'énergie

nécessaire à la mobilité ou à la synthèse de la paroi est produite.

la surface de la cellule bactérienne

Des coupes d‟H pylori à la glutaraldehyde et au rouge Ruthénium ou à l'acide tannique

montrent la présence d'une couche externe de glycocalyx (Goodwin et al, 1989). Les

colorations négatives de ces organismes montrent la présence de structures circulaires au

niveau de la paroi qui ont un diamètre déférent (Jones et al., 1985). Quand on traite les cellules

bactériennes par des sacrosaintes, un grand nombre de ces structures circulaires deviennent

visibles ainsi que des disques de 80 nm de diamètre. Le traitement avec la trypsine et la chaleur

conduit à la disparition des structures précédentes suggérant qu‟elles sont de nature protéique.

On pense que ce pourrait être une couche S, un type de glycocalyx définit par Costreton

comme une rangée de glycoprotéine disposée régulièrement à la surface de la cellule ; beaucoup

d'autres bactéries ont des structures de ce type. Hawtin et al., 1995 ont montré que l'uréase d‟H.

pylori purifiée par chromatographie avait des structures similaire de 10 nm diamètre avec une

région centrale. Ils pensaient que ces structures étaient associées à l'uréase, ce ci a été confirmé

par Austan et al, 1979, qui ont conclu que ces structures contenaient un assemblage de

macromolécules d'uréase, molécule ayant une structure similaire : protéine de choc toxique qui

co-purifie avec l'uréase (Kasper., 1989 ; Sobhani et al., 1991).

les flagelles de Helicobacter pylori

Helicobacter pylori est une bactérie très mobile ; cette propriété lui permet une colonisation

rapide de la muqueuse gastrique. Cette bactérie possède un ensemble de flagelles à l'extrémité

des cellules dont la terminaison des flagelles forme un bulbe (Sobhani et al., 1991).

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la gaine des flagelles

Une propriété unique de tous les Helicobacter est la présence d'un flagelle engainé. Cette

gaine est une structure en continu avec la paroi. Son rôle est peut être de protéger les filaments de

flagelline de l'environnement. Cette gaine protége la bactérie contre l'acidité gastrique (Jones et

al., 1985).

La gaine est vue aisément sur les préparations de cellules colorées négativement et sa

continuité avec la paroi est observée dans des sections fines. En outre, les fibres périplasmiques

n'avaient pas été rencontrées chez H. pylori. Ces fibres entourent les bactéries et sont observées

au niveau du périplasmiques.

I-3-1-2 Caractères physiologiques

Les bactéries H. pylori sont micro aérophiles et ont besoin d‟oxygène pour leur

métabolisme, mais à une concentration inférieure à celle présente dans l‟air. La concentration

d‟oxygène optimale est de l‟ordre de 3 à 5% (Mégraud., 2004).

Elles ont un métabolisme respiratoire comme les campylobacters et tirent principalement

leur énergie des réactions de phosphorylation oxydative. Le caractère micro aérophile dépend de

l‟inhibition d‟enzymes comme la lactate déshydrogénase plutôt que celle de la chaîne de

cytochrome (Sobhani et al., 1991).

Le capital enzymatique de H. pylori est important puisqu‟il possède une catalase,

phosphatase alcaline, phosphatase acide, cytochrome oxydase, superoxyde dismutase, DNAase,

gamma glutamique transpeptidase, leucine aminopeptidase, lipase estérase, des amidases, des

protéases, des lipases, des phospholipases, et surtout une uréase extracellulaire en quantité

extrêmement importante (Sobhani et al., 1995 ; Fauchère et Rosenau, 1991 ; Sobhani et al.,

1991 ; Mégraud, 1999) ce qui permet de la différencier des campylobacters (Sobhani et al.,

1991), une NADPH (Cayla et al., 1995) ainsi que l‟opéron hydrogénasse sont aussi présentes

dont l‟importance est considérable dans le métabolisme de H. pylori.

Helicobacter pylori ne réduit pas les nitrates et n‟hydrolyse pas l‟hippurite (Biomerieux.,

1994 ; Mégraud., 1999), il n‟utilise pas les sucres (saccharolytiques) ni par fermentation ni par

oxydation (Mégraud., 2004 ; Sobhani et al., 1991) c‟est à dire qu‟il tire son énergie d‟autres

sources comme les acides aminés (Mégraud., 1995) et les acides organiques (Mégraud., 2004).

Il a été démontré que H. pylori a des voies actives pour la dégradation de plusieurs acides

aminés dont la conséquence est une augmentation de l‟ammoniac produit (Mendes et al., 1996)

qui est éliminé par un cycle catabolique de l‟urée présent chez H. pylori (Monterio et al., 1997).

Cette bactérie possède, de plus, un matériel de surface (glycocalix) abondant à l‟intérieur de la

paroi bactérienne (Goodwin., 1989) contenant la quasi-totalité de l‟activité uréasique da la

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cellule bactérienne (Fauchère., 1994 ; Fauchère et Rosenau., 1991), des adhésives et des

immunogènes majeurs (Bazooli et al., 1998) (Annexe I).

I-3-1-3 Caractères culturaux

Helicobacter pylori est une bactérie relativement fragile, sensible à la dessiccation et

exigeante sur le plan métabolique (Lamouliatte et al., 1992 ; Mégraud et al., 1992).

Elle ne pousse que dans une atmosphère microaérophile humide contenant 5% d‟O2, 10% CO2,

85% d‟N2 (Avril., 1988). Sa culture exige des milieux enrichis tels que des milieux gélosés

additionnés de sang, lysés ou cuits, d‟hémines, du sérum du charbon ou d‟amidon (Fauchère.,

1994 ; Fauchère et Rosenau, 1991), ces milieux sont rendus sélectifs par addition

d‟antibiotiques spécifiques visant à éliminer les contaminants. La température optimale de sa

croissance est de 37°C, (Cellini et al., 1995 ; Le veau et al., 1993) par contre H. pylori perd sa

viabilité à température ambiante et à l‟air (Lamouliatte et al., 1992), dans ces conditions, les

colonies apparaissent en 3 à 7 jours pour une primoculture, ou en 2 à 4 jours pour un repiquage

(Cellini et al., 1995 ; Biomerieux., 1994).

II-3-1-4 Caractères génétiques

Le génome de H. pylori est trois fois plus petit que celui de E. coli et code à peu prés

27000 protéines dont 500 n‟on pas d‟homologue connu dans le monde vivant. A ce jour, la

composition génomique de deux souches de H. pylori est connue « H. pylori J99 » isolée en

Etats-Unis en 1994 ; ces deux génomes contiennent 1 667 867 et 1 643 831 paires de bases pour

les souches à Haemophilus influenzae, leur G+C est de 36 à 37% (Mégraud et Labigne.,

1998). Distincte du groupe du Vibrion (G+C 38 à 51%) ou du genre Wollinella (G+C 46 0 49%)

(Goodwin et al., 1989).

I-3-2 Propriétés spécifiques d’Helicobacter pylori

H. pylori possède 3 propriétés spécifiques qui signent son adaptation à l‟environnement

particulier de l‟estomac, il s‟agit de :

L’uréase : enzyme existe en grande quantité chez cette bactérie. Le but de l‟activité

uréasique est la production d‟ammonium et de bicarbonate à partir de l‟antre. En

hydrolysant l‟urée présente dans l‟estomac en ammoniac, la bactérie tamponne sa poche

environnement et se protège de l‟acidité gastrique.

La mobilité : permet à H. pylori de se mouvoir dans le mucus mieux que d‟autres

bactéries. Elle est non seulement due à sa forme spiralée mais aussi à l‟existence de

gaines autour des flagelles qui résistent à l‟acide et protègent la protéine des flagelles qui

sans cela serait dégradée (Fauchère et Rosenau, 1991 ; Lamouliatte, 1994 ; Monterio

et al, 1998).

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L’adhérence : H. pylori est étroitement adhérente aux membranes de cellules (Fauchère

et Rosenau, 1991 ; Fauchère., 1994). Cette adhérence est due à la présence des

antigènes bactériens (désignés adhésines) comme l‟hémagglutinine capable de se fixer

sur les récepteurs de l‟épithélium comme N-acétyl-neuraminyl lactose (Mégraud et

Labigne., 1998 ; Monterio., 1995).

I-3-2-1 Sensibilité d’ Helicobacter pylori aux antibiotiques

Helicobacter pylori est naturellement sensible à de très nombreuses familles

d‟antibiotiques : macrolides, céphalosporines, quinolones, aminosides …etc). Cependant d‟un

point de vue thérapeutique, seuls certains : (Amoxicilline, Clarithromycine, Métronidazole)

restent actifs dans l‟environnement gastrique.

Il est donc important, comme dans toute infection, de tester la sensibilité à ses

antibiotiques (Mégraud et Labigne., 1998). La méthode utilisée est celle de la diffusion sur

Agar (méthodes des disques) (Fox et al., 2000) (Annexe II).

II-3-2-2 Réservoir d’Helicobacter pylori

Dans l‟état actuel de nos connaissances, l‟estomac humain apparaît donc comme étant le

réservoir essentiel d‟H. pylori où elle vit profondément enfouie dans la couche de mucus qui

tapisse la muqueuse de l‟estomac (Mégraud et al., 2000). Il est possible que la bactérie soit

aussi adaptée à d‟autres niches comme la bouche du sujet infecté ou l‟estomac de certains

animaux domestiques (Mégraud., 1998). Cependant, ces sites secondaires ne semblent ni

constants ni permanent et leur rôle, s‟il existe, est probablement limité (Vincent., 1995).

I-4 Epidémiologie

Connaître l‟épidémiologie d‟une infection et le mode de transmission de son agent est

essentiel pour proposer des mesures de santé publique visant à limiter la diffusion et donc à

maîtriser ses conséquences pathologiques. De nombreuses études de prévalence ont été

réalisées de par le monde. Par contre, les études d‟incidence et les travaux étudiant la

transmission sont difficiles à les mettre en œuvre et peu développés (Vincent., 1999).

I-4-1 Prévalence de l’infection à Helicobacter pylori

La prévalence observée aujourd'hui est la conséquence des conditions socio-

économiques et de l‟environnement (Broutet et al., 1996).

Le facteur de risque principal de l‟acquisition est l‟état socio-économique défavorable

des familles ; on entend, par là, le niveau économique qui détermine la taille du logement et

son niveau sanitaire ainsi que souvent la taille de la famille et le niveau d‟éducation qui peut

retentir sur les pratiques d‟hygiène. Ces conditions sont associées avec un taux d‟acquisition

élevé dans l‟enfance.

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Si on considère les pays de la communauté européenne, la prévalence de l‟infection

augmente avec l‟âge (15 à 20%) à 20 ans jusqu‟à (50%) au-delà de 50 ans (Broutet et al.,

1998). Mais les plus fortes prévalences sont observées dans les pays en voie de développement

comme l‟Amérique latine et l‟Afrique. La prévalence de l‟infection à H. pylori apparaît ainsi

comme un indice de niveau socio-économique qui va en pair avec le niveau de promiscuité

(Malaty et al., 1996).

D‟autre facteurs de risque, possibles de l‟infection ont été étudiés mais sans trouver

d‟effet, comme par exemple « la consommation d‟alcool et de tabac ». Si l‟ethnie semble, à

priori, avoir un rôle, toute fois, les études chez les jumeaux ont montré que la part du terrain

génétique est légèrement supérieure a celle de l‟environnement dans la prévalence de

l‟infection (Malaty et al., 1994).

I-4-2 Incidence de l’infection à Helicobacter pylori

L‟incidence peut se mesurer par des études prospectives de sujets non infectés ou par

déduction à partir des données de prévalence. Peu d‟enquêtes prospectives ont été menées

essentiellement dans la population adulte. Il en ressort que l‟incidence est sans doute inférieure

à 0.5% par an.

Des études d‟incidence ont aussi été réalisées chez les malades infectés traités pour

apprécier le risque de réinfections. La fréquence de réinfections ne semble pas plus importante

que la fréquence de primo-infection.

Les données les plus récentes provenant de la surveillance de cohortes, notamment

durant la grande enfance et l‟adolescence, indique qu‟en fait la prévalence observée a un âge

donné et une variable dynamique résultant de l‟acquisition de l‟infection chez certains sujets et

de pertes de l‟infection chez d‟autres (Malaty et al., 2002).

I-4-3 Où se trouve Helicobacter pylori ?

I-4-3-1 Chez l'homme

Helicobacter pylori est retrouvé essentiellement dans l'estomac, aussi bien dans l'antre

que dans le fundus et on peut l'isoler à partir du liquide gastrique dans les conditions normales

d'acidité (Vincent., 1995). Sa présence dans des conditions habituellement hostiles aux

bactéries est due à sa résistance aux grandes variations de pH (Goold et al., 1995). La

production d'uréase permet en effet à la bactérie de dégrader l'urée du son environnement

immédiat (Goodwin et al., 1989) ; cette bactérie s'implante et se multiplie dans l'épaisseur de

la couche de mucus et à la surface de la muqueuse gastrique (Wyatt., 1996). En dehors de la

muqueuse de type gastrique, la présence de H. pylori est exceptionnelle dans l'œsophage

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normal ; il n'a été isolé que dans quelques cas et toujours en l'absence de réaction

inflammatoire (Vincent., 1995) laissant ainsi supposer qu'il s'agissait d'une migration

transitoire d'origine gastrique sans colonisation de la muqueuse.

Dans la bouche, qui représente un milieu favorable pour les bactéries microaérophiles,

pourrait favoriser la présence de H.pylori. De nombreux travaux ont trouvé des traces

d’H.pylori, par amplification génique ou à l'aide d'anticorps monoclonaux en

immunofluorescence (Husson et al., 1991) ; de plus, bien que dans la plupart des cas, les

cultures effectuées à partir de la cavité buccale restent négatives. L'isolement de H. pylori a été

rapporté : un cas à partir de la plaque dentaire, un cas de salive, ainsi que de la langue, du

palais ou de la joue (Frexinos et al., 1989).

Dans l'intestin, on n'observe pas de colonisation de la muqueuse normale. Celle-ci, en

effet, n'offre pas les récepteurs spécifiques nécessaires ; néanmoins, la question de l'élimination

digestive basse de formes viables d‟H. pylori reste posée (Mégraud et al., 1996) bien que la

bactérie soit inhibée in vitro par les sels biliaires. Sa présence dans le muqueuse gastrique en

zone rectale montre qu'un passage intestinal est possible (Vincent., 1995). Cependant, aucun

élément n‟est disponible pour savoir si ce passage est constant ou s'il ne s'effectue

qu'exceptionnellement dans des conditions particulières (Parsonnet., 2000). (Tab. 02)

I-4-3-2 Chez l'animal

Aucune association n'est connue entre l'infection humaine à H. pylori et le contact avec

les animaux d'élevage ou de compagnie, ou avec le mode d'alimentation carnée (Vincent.,

1995). Des travaux ont suggèré qu'on pouvait trouver cette bactérie à l'état naturel, par exemple

en Chine. Quatre chats ont été trouvés infectés, et la culture étant positive aux Etats-Unis

(Wang et Gibson., 1993). Une culture à été obtenue chez six chats avec identification

complète de l'espèce H. pylori. Des travaux restent donc à faire pour préciser la prévalence de

l'infection féline et sa place dans la transmission à l'homme afin de savoir si l'estomac du chat

est effectivement un réservoir d'infection pour l'homme, ou s'il n‟est qu'un facteur

épidémiologique (Vincent., 1995).

I-4-3-3 Dans l'environnement

Helicobacter pylori n'a jamais été isolée à partir de l'environnement et notamment à

partir de l'eau où sont retrouvées pourtant de nombreuses espèces voisines comme celles du

genre Champylobacter (Mégraud., 1999). (Tab. 03).

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Tableau 02. Le point actuel sur le réservoir et les sources d'infection d‟après Mégraud., 1996

Tableau 03. Sites où Helicobacter pylori peut être retrouvé chez l'homme en cas d'infection

d‟après Mégraud., 1998

I-4-4 Méthodes de transmissions

a) Transmission par voie orale-orale

A partir de l‟estomac, H. pylori peut coloniser la partie haute du tube digestif. On peut

postuler que le liquide gastrique transporte les organismes viables jusqu‟à l‟œsophage et la

bouche durant la régurgitation (Mégraud., 1995).

Helicobacter pylori a été cultivée à partir de la salive dans plusieurs études. Les

données récentes supportent le rôle prépondérant de la transmission par voie orale- orale.

(Deltenre et Koster, 2000). L‟évidence de la propagation intra familiale de l‟infection entre

parents et enfants, entre les époux ou entre les personnes habitant un même lieu, plaiderait

aussi en faveur de ce mode de transmission (Zehou et al., 2000).

Homme Estomac +++

Bouche ?

Animal Peut être le chat Rôle

marginal ?

Environnement Eau Pas de

confirmation

pour l'intestin (théoriquement possible)

Bouche salive, plaque dentaire, muqueuse Quelque cas

Muqueuse normale Exceptionnelle

Œsophage Endobronchi- œsophage Variable

Estomac Antre, fundus, liquide Constant

Duodénum Métaplasies gastrique Fréquent

Intestin Estropie gastrique uniquement Quelques cas

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b) Transmission par voie fécale-orale

S'il parait maintenant certain que la transmission de H. pylori est inter humaine, la voie

de transmission reste mystérieuse et il n‟y a pas des arguments sérieux pour la voie fécale orale

(Mégraud., 1998). Après largage dans le liquide gastrique, la bactérie ne survira pas a priori,

dans la lumière intestinale ou, outre son inhibition par les sels biliaires, elle se trouve affrontée

à des milliers de bactéries (Mégraud., 1998). La question de l'excrétion de H. pylori sous

forme viable dans les selles des sujets infectés reste posée. Seule une tentative de mise en

culture à partir des selles de nourrissons africains malintentionnés , ayant donc un temps de

transit extrêmement bref (Thomas et Sparling., 1994), mais l'hypothèse d'une excrétion sous

forme viable mais non cultivable ou sous forme morte ou moins dégradée, n'est pas écartée

(Vincent., 1999).

Enfin, la transmission fécale-orale semblerait peu importante dans les pays développés

et plutôt limitée à des zones géographiques (région de Santiago du Chili, par exemple, ou l'on

fertilise les culture de l'engrais humain) (Mégraud et al ., 1999).

c) Transmission par voie gastro-orale

Une autre hypothèse est la transmission lors de vomissements quand ceux-ci

proviennent de sujets infectés (Axon., 1994). H. pylori peut rester viable durant plusieurs

heures, ce qui en fait une source possible d‟infection. L‟hypothèse a été récemment renforcée

en induisant des vomissements chez des volontaires adultes (Parsonnet et al., 1999). Elle est

compatible avec une transmission dans l‟enfance. En effet, les vomissements sont fréquents à

cette période de la vie. Les enfants vivent souvent en communautés et portent les objets à la

bouche.

L‟acquisition de l‟infection par les endoscopies entre dans ce même cadre avant l‟ère de

la protection systématique de ces dernières 20 années ; la prévalence de l‟infection à été élevée

chez les endoscopiques. Il est probable que le contact avec le liquide gastrique était la cause

(Broutet et al., 1996). Ensuite, on a observé que le personnel soignant au service de

réanimation où les sécrétions gastriques sont possibles était plus souvent infecté que celui qui

avait travaillé dans les services non exposés à ce risque (Broutet., 1998).

d) L'infection à partir du liquide gastrique

A ce jour, seule la transmission par du liquide gastrique infecté a pu être mise en

évidence et plusieurs cas de transmission hétérogène dans des séries de sujets participant à des

protocoles d'étude de la sécrétion acide ont été rapportés (Graham et al., 1998). Dans un cas,

la confrontation de l'empreinte génétique des isolats bactériens a permis de confirmer la

transmission de la même souche (Langherandries et al., 1995).

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En dehors de la manipulation du liquide gastrique infecté, on ignore quelles sont dans

la vie courante, les substances qui véhiculent la bactérie sous une forme infectante et en

quantité suffisante, et dans quelles circonstances un individu entre en contact avec la substance.

e) Le risque environnement

Le rôle de l'eau comme vecteur potentiel est actuellement très controversé, ce rôle est

théoriquement possible (Mégraud et al., 1992) mais la bactérie n'a jamais été isolée de l'eau

(Waldbeser et al., 1993). En dehors de l'eau, les viandes qui sont largement impliquées dans

la transmission d'espèces voisines comme les espèces du genre Compylobacter ont été

suspectées (Mégraud., 2004). Un travail récent vient de rapporter que des chats infectés par H

.pylori pouvaient également l'éliminer dans leur salive sous forme viable (Wang, et al, 2000).

De plus, dans les selles, des traces d'ADN de H. pylori étaient retrouvées par amplification

génique dans quatre cas sur cinq (Fox et al., 1995). Ce résultat préliminaire demande à être

confirmé et il reste de nombreuses inconnues sur la prévalence de l'infection chez le chat

(Vincent., 1995).

La primo-infection par H. pylori, qui s'accompagne de vomissements, pourrait aussi

être la première occasion d'éliminer la bactérie et la question du contact des enfants vivant dans

l'entourage, avec les liquides de régurgitation d'un sujet infecté reste posée (Vincent., 1999).

De plus, les auteurs conçoivent, que si les conditions d'hygiène sont mauvaises et notamment

en l'absence d'eau courante, ces contacts sont possibles.

f) Transmission professionnelle

Certaines professions s'accompagnent en effet de contacts rapprochés et fréquents avec

un grand nombre de sujets infectés et selon une étude japonaise, le risque de contamination par

H. pylori lors d'une fibroscopie gastrique est démontré, avec une fréquence de l‟ordre de 1%

(Link et al., 1994 ). Dans une autre étude menée par Broutet et al., 1995, la prévalence était

liée au nombre d'endoscopies pratiquées par les gastro-entérologues ; ce risque souligne

l'importance des mesures des infections du matériel ainsi que celle du port de gants par les

endoscopiques (Mégraud et al., 1998). De plus, la présence de H. pylori dans la bouche

(salive, plaque dentaire) pourrait s'accompagner d'un risque d'infection pour les dentistes

exposés aux aérosols salivaires de leurs patients.

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I-5 Pathologie

I-5-1 Les facteurs de colonisation de Helicobacter pylori

I-5-1-1 Facteurs liés à la bactérie

a- Adaptation à la colonisation de l'estomac

Mobilité et muqueuse gastrique

La mobilité de H. pylori tient d'une part à sa forme spiralée ou hélicoïdale, et d'autre part à

la surface de la bactérie contenant des cils et des flagellés engainés (Marshale., 1996). H.

pylori se déplace rapidement dans un environnement visqueux du mucus et une fois arrivé dans

l'estomac, elle échappe à l'acidité gastrique grâce à cette mobilité particulière qui lui permet de

se déplacer de la lumière vers les cellules épithéliales de surface au travers de la couche de

mucus. L‟importance de la mobilité dans la colonisation de l'estomac a été déterminée lors

d'expériences effectuées chez les porcelets gnoséologiques utilisant des variants immobiles de

H. pylori et en effet ces variantes colonisent plus difficilement que des gènes codant pour la

flagelline majoritaire Fla A la flagelline minoritaire Fla B (Suganuma et al., 2001); ces gènes

clonés et inactivés sous forme de simple mutant ou de double mutant par "génétique reverse"

chez H. pylori (Johnsen et Peura., 1982).

Uréase et acidité gastrique

La plus puissante des barrières gastriques est la production de grandes quantités d'acide

chlorhydrique qui maintient le pH en dessous de 2. Il a fallu que H. pylori développe des

stratégies nouvelles pour survivre à un pH encore plus bas ; il s'agit de l'uréase (Ferrero et al

,1995), enzyme qui a une fonction essentiellement physiologique pour l'utilisation de l'azote de

l'urée (Hwang et al., 2002). Il s'agit de la localisation externe de l'uréase qui doit être

transportée à l'extérieure de la cellule bactérienne (Evans et al, 1990) ce qui n'est pas le cas

pour les autres uréases bactériennes. Quand H. pylori pénètre dans la lumière gastrique, il est

immergé dans le liquide gastrique très acide où sont présentes de petites quantités d'urée qui

diffusent de la paroi (Ferrero et al., 1992). L'ammoniac libéré forme autour de la bactérie un

nuage qui la protège de l'acide (Marshall., 1996) et des données expérimentales, in vitro, sont

en faveur de cette hypothèse. Quand une suspension de H. pylori est placée dans le tube à pH

2, les bactéries sont tuées rapidement ; alors, que si l'on ajoute une concentration d'urée comme

celle présente dans l'estomac, les bactéries sont bien protégées bien que l'uréase soit essentielle

pour la colonisation de l'estomac, elle ne semble pas être nécessaire à la persistance de H.

pylori au niveau de la muqueuse (Ferrerob et al., 1992).

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L'administration d'inhibiteurs puissants d'uréase comme l'acide acétohydroxamique protège

contre la colonisation (Ferrero et al ., 1995).

Adhésines de Helicobacter pylori

Le tropisme tissulaire s'explique par la présence d'adhésines spécifiques, molécules qui sont

complémentaires aux récepteurs présents sur le tissu où se fixe la bactérie. De nombreuses

études ont été menées il y a quelques années dans le but d'identifier ces adhésines. La première

est l‟hémagglutinine qui caractérisée a donné la N-acétyl-neuraminyl- lactose (Evans et al.,

1990). D'autres hémagglutinines ont été ensuite décrites. Enfin, la colonisation est rendue

possible par ces facteurs d'ahésines capables de se fixer sur des récepteurs siadyl-carbo-

hydratés par exemple (Hwang et al., 1999 ; Wadstrom., 1995). On comprend ainsi aisément

qu'en fonction des caractéristiques de l'hôte ou de la bactérie, H pylori puissent entraîner

diverses pathologies.

Micro aérophiles

Helicobacter pylori est une bactérie micro aérophile et une concentration en oxygène

optimale est effectivement présente dans l'environnement de la muqueuse gastrique (Archibalt

et al., 1986). C‟est peut être au niveau des jonctions intercellulaires que l'on trouve les

concentrations gazeuses les plus adéquates (Lee., 1998). Il y a peu de connaissances dans ce

domaine qui est vaste tout à fait ignoré jusqu'à présent.

Les jonctions intercellulaires

La première photographie d‟H. pylori en microscopie électronique a montrait la présence

de cette bactérie dans les espaces entre les cellules gastriques. Hanzell., 1995 a noté une

association d‟H. pylori aux jonctions intercellulaires. Depuis, plusieurs scientifiques ont

montré cette localisation intercellulaire et ont souligné qu‟il s‟agissait de son site préféré de

colonisation et que la bactérie pouvait pénétrer profondément au niveau de cette jonction en la

détruisant. Stojiljkovic., 1994 a suggéré qu'il existait une interférence avec la laminine,

conduisant à un relâchement de la liaison intercellulaire qui permettrait à H.pylori la

pénétration (Stojiljkovic et al., 1994) et la fixation sur la laminine, mais aussi sur d'autres

molécules servant de support aux cellules, comme le collagène de type IV.

I-5-1-2 Facteurs liés à l’hôte

a- Echappement aux défenses de l’hôte

Helicobacter pylori persiste au niveau de la muqueuse gastrique en dépit d‟une réponse

immunitaire locale et générale (Fauchère et Rosenau., 1991 ; Fauchère., 1994). L‟existence

de mécanismes d‟échappement aux effecteurs de l‟immunité ou l‟inefficacité de ces effecteurs

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dans l‟environnement gastrique, ont deux explications possibles (Lamouliattes, et al., 1992,

Fauchère., 1994), l‟obtention d‟une tolérance immunitaire peut également être liée à la

saturation des anticorps (IgG, IgA, IgM) et consécutive à un excès d‟antigènes bactériens

(Fauchèrs et Rosenau., 1991 ; Fauchère., 1994).

b- Induction d’une réponse inflammatoire

La muqueuse infectée par H. pylori est le siège d‟une réaction inflammatoire intense

caractérisée par une infiltration de polynucléaires neutrophiles (Sobhani et al., 1991). Cet

infiltrat est lié à la sécrétion de substances chimiotactiques par H. pylori. Les cellules de

l‟infiltrat inflammatoire peuvent également libérer d‟autres substances chimiotactiques telles

que les cytokines par les macrophages dont les effets sont délétères sur les cellules (Sobhani et

al., 1991).

I-5-2 Le rôle pathogène de Helicobacter pylori

L‟infection a H. pylori est considérée comme chronique elle est acquise essentiellement

dans l‟enfance et persiste durant des décennies, voire toute la vie. Cette bactérie est impliquée

dans la genèse des maladies inflammatoires gastro-duodénales, comme elle est l‟agent

étiologique des gastrites chroniques antrales, mais aussi responsable de l‟évolution au cours du

temps de ces gastrites chroniques antrales vers les maladies ulcéreuses, les lymphomes de

MALT ou l‟atrophie gastrique, précurseur des adénocarcinomes (Fig. 06). Il convient donc

d‟analyser les propriétés bactériennes spécifiques à H. pylori qui permettent de rendre compte

de son succès à coloniser la muqueuse gastrique, à persister en dépit la réponse immunitaire de

l‟hôte et son aptitude à endommager les tissus (Sobhani et al., 1991).

I-5-2-1 La gastrite

La gastrite est un trouble de la digestion qui se manifeste par l‟inflammation de la

muqueuse de l‟estomac (Sobhani et Wyat., 2000). La muqueuse agit comme barrière

protectrice de la paroi de l‟estomac en absorbant les sécrétions acides produites par la digestion

des aliments. Sans cette protection, la paroi de l‟estomac .devient plus sensible et serait vite

attaquée par ces acides ou par d‟autres substances irritantes qui provoqueraient des ulcères.

C‟est ce qui se produit dans le cas de l‟ulcère gastro-duodénal (Malatesta et Graham., 1996).

Mais il arrive aussi que la muqueuse soit elle même irritée, sans que la paroi soit touchée : on

parle alors de gastrite. La gastrite peut être aiguë et se manifester soudainement ou être

chronique et évoluer lentement sur plusieurs années (Mégraud et Wyat., 2000).

I-5-2-1-1 Gastrite aiguë

C‟est une inflammation aiguë de la muqueuse gastrique de durée brève. Elle est

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caractérisée par une inflammation mono et polynuclée, une diminution de la sécrétion acide

gastrique et une légère augmentation de la gastrine (Wyatt., 1996). En l‟absence de guérisons,

la colonisation bactérienne persiste à la surface de la muqueuse entraînant une gastrite

chronique active (présence de polynucléaires neutrophiles au sein d‟un infiltrat mononuclée)

(Wyatt., 1996).

I-5-2-1-2 Gastrite chronique

Définie par l‟existence au sien de la muqueuse gastrique des lésions inflammatoires et

atrophiques plus ou moins étendues (muqueuse antrale et muqueuse fundique) et plus ou moins

sévère (Fig. 03). La gastrite chronique comprend aussi des lésions épithéliales qui

s‟accompagnent de la présence de polynucléaires neutrophiles (Guerre., 1996). Une atrophie

des glandes et une métaplasie intestinale peuvent être présentes et leur fréquence augmente

avec l‟âge, probablement influencée par d‟autres acteurs génétiques et environnementaux

(Mégraud et lamouliatte., 1997).

La gastrite à H. pylori correspond le plus souvent à une gastrite antrale prédominante.

Schématiquement elle se caractérise selon Grouyon et al., 1996 par:

Des signes d‟activité comportant une infiltration du chorion et de l‟épithélium par des

polynucléaires neutrophiles. L‟infiltration peut être légère, modérée ou sévère : elle est

caractéristique de l‟infection par H. pylori.

Des signes d‟atrophie caractérisée par une réduction des glandes gastriques : elle peut être

légère, modérée ou sévère (Fig. 04).

Une métaplasie intestinale ainsi qu‟une fibrose du chorion peuvent se développer et

s‟associer à des signes histologiques de dysplasie qui peut être légère, modérée ou sévère; la

dysplasie sévère est synonyme de cancer, in situ (Sobhani et Waytt., 2000) (Fig. 05).

Figure 03. Gastrique chronique d‟après Wyatt., 1996

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02

Atrophie gastrique

légère

Atrophie gastrique

modérée

Atrophie gastrique

sévère (ou la

métaplasie intestinale

est présente)

Figure 04. Différents grades d‟atrophie de la muqueuse gastrique Fundique d‟après

Eaton et al., 1994

Figure 05. Métaplasie intestinale observée par la technique dit du tes- tape d‟après

Jean pierre dadoune., 1990

A : résultat négatif

B, C, D : Trois stades en métaplasies intestinale

I-5-3 Comment un ulcère se forme- t-il ?

L‟œsophage, l‟estomac et l‟intestin sont revêtus d‟une muqueuse qui constitue une

protection naturelle contre les sucs digestifs comme par exemple le suc gastrique acide, la bile

et la pepsine (Axon., 1997). Une muqueuse saine résiste en règle générale à ces substances

agressives. Toutes fois, une régénération insuffisante de la muqueuse, une irrigation perturbée

C

A

B

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de la paroi gastrique ou une surproduction d‟acide chlorhydrique, de bile ou de pepsine

peuvent provoquer des lésions de la muqueuse qui entraînent à terme des inflammations ou des

ulcères (Mégraud et al., 2001). De récentes découvertes montrent qu‟une bactérie H. pylori

perturbe également la couche protectrice de mucus. La muqueuse sensible est ainsi exposée au

contact avec l‟acide, ce qui peut déclencher la formation d‟un ulcère (Mégraud et

Lamouliatte., 1997) (Fig. 06).

Figure 06. Formation de l‟ulcère d‟après Sobhani et al., 1999

I-5-3-1 Ulcère gastrique

La relation causale, entre l‟infection a H. pylori et la chronique, est aujourd‟hui bien

établie et l‟on considère que cette bactérie est à l‟origine de 90% des gastrites chroniques

(Darra., 1994). En outre, l‟ulcère gastrique est toujours associé à la présence d‟une gastrite

chronique. Parmi les arguments qui confirment l‟association causale entre l‟infection à H.

pylori et l‟ulcère gastrique les plus importants sont les suivants : -Présence de cette bactérie

chez la majorité des malades ayant un ulcère gastrique (Lamireau., 1993). -Existence d‟une

relation temporelle entre l‟apparition de H. pylori et celle d‟un ulcère gastrique montrant que la

présence de cette bactérie précède l‟apparition de l‟ulcère (Marshall., 1996). L‟action toxique

directe ou indirecte exercée par cette bactérie conduit à la destruction de la barrière muqueuse

gastrique et à l‟augmentation de sa perméabilité aux ions H+.

I-5-3-2 Ulcère duodénal

L‟ulcère duodénal est localisé dans la majorité des cas au niveau du bulbe duodénal. Il est

favorisé par une augmentation de l‟acidité (Hwang et al., 2002). L‟ulcère duodénal est une

maladie fréquente 3 à 4 fois plus que l‟ulcère gastrique qui touche environ 8% de la population

active. On le rencontre plus souvent chez des sujets jeunes avec un pic de fréquence entre 40 et

50 ans. L‟incidence de cet ulcère est de 80000 nouveaux cas en Europe par an et sa prévalence

est 8%; la mortalité est de 1% (Mégraud., 1998).

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I-5-3-3 Dyspepsie non ulcéreuse

La dyspepsie est un mot grec qui signifie : une difficile digestion. Cette pathologie est

fonctionnelle ou organique (De Korwin., 1999). La dyspepsie non ulcéreuse (DNU) est

fréquente dans les pays occidentaux puisqu‟elle affecte environ un tiers de la population

générale (Delchier., 1999). La dyspepsie désigne un ensemble de symptômes qui semble avoir

pour origine la partie supérieure du tube digestif (oesophage, estomac, intestin grêle ou le

duodénum) ; elle peut être conçue comme une indigestion chronique (Johnson et Peura,

1982). Le rôle de H. pylori dans la dyspepsie est encore en cour d‟étude et la prévalence de

l‟infection à H. pylori dans la DNU est très variable suivant les études (Atherton et al., 1999).

I-5-4 Cancer gastrique

Le cancer gastrique est une affection multifactorielle (Uemura et al., 2001). H. pylori

occupe la première place parmi les paramètres étiopathogénique (Brenner et al., 2000).

L‟infection a H. pylori provoque une gastrite qui après plusieurs années d‟évolution chronique

peut aboutir au cancer (Mégraud et Waytt., 2002). Les étapes précédant le cancer sont :

l‟atrophie de la muqueuse gastrique, la métaplasie intestinale, le dysplasie et l‟adénocarcinome

(Fléjou., 1989). L‟atrophie est d‟autant plus menaçante qu‟elle touche le fundus

(Wang et al., 2000).

L‟infection a H. pylori a été reconnue carcinogène de type 1 par l‟Agence International de

Recherche sur le Cancer (AIRC) (Mégraud et al., 2001). H. pylori, en induisant une gastrique

atrophique antrofundique, interviendrait à un stade précoce de ce processus. En revanche la

gastrite antrale, non atrophique à H. pylori n‟est pas associée à l‟adénocarcinome gastrique

mais à l‟ulcère duodénal via l‟hypersécrétion acide (Fléjou., 1989). Par ailleurs, la présence

d‟un ulcère gastrique (non pré pylorique) associée à une atrophie gastrique induite par H.

pylori, double le risque de développer un cancer gastrique dans les trois ans (Hussel et al.,

1996).

Le rôle de cette bactérie dans la carcinogène a conduit les experts européens à élargir les

indications de l‟éradication en cas de facteurs de risque associé, notamment les antécédents

familiaux de cancer gastrique car l‟atrophie et surtout la métaplasie intestinale peuvent

persister longtemps après l‟éradication (Cayla., 1996). Cependant cette attitude n‟a pas été

retenue par la conférence de consensus française sur le plan moléculaire : les souches Cag A

positives sont plus souvent associées au cancer gastrique et persistent plus longtemps dans

l‟estomac que les Cag A négatives faisant de la durée d‟infestation un facteur déterminant de la

carcinogenèse (Fig. 07).

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Figure 07. Cancer gastrique superficiel d‟après Wang et al., 2000

I-5-5 Le lymphome de MALT

Le lymphome gastrique du MALT (Tissu lymphoïde associé aux muqueuses) évolue très

progressivement et reste longtemps localisé à l‟estomac. Le développement du lymphome est

directement lié à l‟infection par H. pylori. La bactérie stimule une réaction immunitaire par

l‟intermédiaire des lymphocytes T qui provoquent la prolifération des lymphocytes B.

Pour une raison encore mal comprise, la réaction immunitaire ne permet généralement pas

d‟éliminer la bactérie. La stimulation antigénique persiste et sélectionne des clones de

lymphocytes B, antigène dépendant (Du et al., 1996). Il s‟ensuit une infiltration chronique du

chorion de la muqueuse gastrique par les lymphocytes. La persistance de la prolifération

lymphocytaire clonale pendant plusieurs années favorise l‟apparition de mutations génomiques

dont la plus fréquente concerne deux gènes proapophatiques API2 (Dierlamm et al., 1999).

Ces mutations accélèrent la prolifération qui évolue vers la monoclonaux et le lymphome bien

qu‟elle reste dépendante de la stimulation des lymphocytes T (Hussell et al., 1996 ; Greiner.,

1997). Cette dépendance explique la localisation du lymphome à l‟estomac et sa régression

après éradication. Le lymphome du MALT est donc secondaire à une stimulation excessive et

prolongée des lymphocytes B en réponse à l‟infection à H. pylori. (Fig. 08).

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Figure 08. Lymphome de MALT d‟après Wang et al., 2000

I-6 Méthodes de diagnostics

I-6-1 Tests invasifs (Méthodes directes)

Méthodes utilisant des biopsies gastriques et nécessitent une endoscopie « Trois

biopsies » (Mégraud., 1995). (Fig. 09)

Prélèvement

Il se fera sous endoscopie dans la région antrale à environ 2cm du pylore et du fundus

(Mégraud et Labigne., 1998). Il est souhaitable d‟obtenir deux biopsies pour chaque test à

effectuer. (Mégraud., 1995)

Conditions du transport des échantillons

Les biopsies utilisées pour la culture pouvant être conservées dans un récipient contenant

du sérum physiologique afin d‟éviter la dessiccation et seront maintenues à 4°C (Mégraud.,

1995). Les biopsies destinées à effectuer un examen anatomopathologique sont mises dans du

formol à 10% (Sobhani., 1995).

Lymphome gastrique à petites

cellules

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Figure 09. Les différents tests pour le diagnostic de H.pylori d‟après

Lamouliatte., 1994

I-6-1-1 Test rapide à l’urée

Ce test utilise la propriété exceptionnelle d‟H. pylori de posséder une très forte uréase

(Bruley Des Varennes., 1996). Cette uréase va hydrolyser l‟urée du milieu en ammoniac et

gaz carbonique ; l‟ammoniac libéré entraîne une augmentation du pH qui va provoquer le

changement de couleur d „un indicateur de pH (Mégraud., 1999). Le test consiste à écraser une

Méthode invasives (Endoscopie)

Méthode non invasives

(pas d’endoscopie)

Biopsies Sérodiagnostic

(sérologie) Sur 1 mg de sang

Test Elisa Délai de réponse 4H

Test respiratoire à C13 ou C14 urée sur l’air expiré mesuré

de CO2

Amplification génique par PCR Au laboratoire.

Test Uréase En salle

d’endoscopie Test

commercialisé (CLO ou CU test) Délai de réponse

20 minutes

Bactériologie

Histologie Au laboratoire,

coloration HES ou Giemsa, délai de réponse 2 jours

Culture Méthode de référence Milieu commercialisé

Délai de réponse 5 jours

Culture Méthode de référence Milieu commercialisé

Délai de réponse 5 jours

Antibiogramme

Sujet gastralgique

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biopsie, puis la placer dans un milieu urée indole qui sera incubé à 37°C et observé après 20

minutes, 2 heures et 24 heures. Le passage du jaune au rouge traduit un résultat positif

(Mégraud., 2004).

La sensibilité de ce test est évaluée à 80-85%. Il existe plusieurs tests commercialisés

utilisables dans la salle d‟endoscopie comme le CLO-TEST, qui possède une sensibilité de

78% et une spécificité de 96%. La sensibilité du test est parfois insuffisante puisque elle

nécessite 105

bactéries dans le milieu pour qu‟elle soit positive (Mégraud., 1999).

I-6-1-2 Examen anatomopathologique

Helicobacter pylori a une morphologie et une localisation particulière qui le rend

accessible a un diagnostic lors d‟un examen anatomopathologique. Cet examen doit comporter

une fixation des biopsies dont le formol et adopté à des colorations facilitant la reconnaissance

de la bactérie au microscope. Les bactéries peuvent être recherchées sur les préparations

colorées par la coloration standard d‟Hématine Eosine Safran (ou elles apparaissent roses) ou

d‟autres colorations : Giemsa modifier au Crésyl violet, à l‟acridine orange ou la coloration de

Warthin starry (Mégraud., 2004) Cette recherche a une sensibilité excellente et une spécificité

proche de 95% si elle est effectuée par un observateur entraîné.

Sa limite est la faible reproductibilité interobservateur, un élément fondamental de cet

examen est bien sur la recherche des lésions histologiques de gastrites associées à H .pylori

(Mégraud., 2004) (Fig. 10).

I-6-1-3 Cytologie

Cet examen comporte la recherche de bactéries spiralées sur un frottis coloré par une

coloration de GRAM voir de Giemsa et une coloration nucléaire au bleu (Mégraud et

Raymond., 1999). Le frottis est préparé en écrasant la biopsie du coté mucus sur une lame

porte-objet. Les frottis seront examinés minutieusement d‟abord au faible grossissement pour

repérer les zones plus riches en cellules, puis au fort grossissement pour bien observer les

bactéries incurvées ou spiralées à GRAM négatif qui ont tendance à se trouver nombreuses

dans certaines zones du frottis (Mégraud., 2004).

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Figure 10. Etude anatomopathologique : H. pylori après différents colorations d‟après

Adamek, et al., 1996.

A : Hématéine Eosine Safran; B: Warthin starry; D: Giemsa ; C : Crésyl violet

I-6-1-4 Mise en culture

La biopsie est broyée avec du bouillon nutritif (0,3 ml) dans un Potter. Le broyat est

ensemencée :

Sur une gélose sélective H. pylori (Pyl) (Biomérieux) ; le milieu contient la Vancomycine,

la Cefsulodine et le Cycloheximidine comme agent sélectif.

Sur une gélose Columbia ou Brucella ou Wilkins Chalgrin à 10% de sang de cheval

(Mégraud., 2004). Les boites sont placées en atmosphère micro aérophile (10% de CO2) et

examinées après 4 jours, puis tous les 3-4 jours pendant 15 jours (Avril, et al., 1995) après

une incubation de 2 à 5 jours à 37°C et dans une atmosphère appauvrie en oxygène. La

croissance obtenue sur une gélose enrichie au sang de mouton se traduit par l‟apparition de

colonies translucides, non pigmentées et d‟un diamètre de 1mm (Avril, et al., 1995)

(Fig.11).

Principaux caractères bactériologiques

H. pylori est un petit bacille de 0.5µm de diamètre sur 2µm de longueur, à GRAM

négatif, légèrement incurvé dépourvu de fibre périplasmique, mobile grâce à de multiples

flagelles observés au microscope électronique (Mégraud., 2004). Quelques caractères sont à

rechercher : Catalase+, Oxydase

+, Uréase

+, Gamma GT

+, Pal

+ (API Compylobacter, Bio

Mérieux).

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Figure 11. Aspect macroscopique des colonies d‟ Helicobacter pylori sur Gélose chocolat

après 5 jours d‟incubation à 37°C en atmosphère micro-aérophile d‟après Ghouini., 1996

I-6-1-5 Amplification génique (PCR)

Il est possible d‟amplifier des séquences d‟ADN spécifique de H. pylori en utilisant des

amorces spécifiques. L‟analyse des produits d‟amplification permet d‟affirmer la présence

d‟ADN de H. pylori et donc de cette bactérie avec une grande sensibilité et spécificité .Il n‟est

pas nécessaire que les bactéries soient vivantes. Avant l‟amplification, la biopsie doit être

broyée et/ou lysée à l‟aide d‟un tampon spécifique afin de rendre l‟ADN des bactéries

accessible. Les produits d‟amplification sont ensuite analysés, soit par visualisation d‟une

bande d‟ADN de poids moléculaire donné, spécifique des amorces utilisée, après

électrophorèse, soit par hybridation en milieu liquide et la révélation par DNA-Enzyme

Immuno-Assy (Montério et al., 1998), soit par hybridation en dot. Plusieurs types d‟amorces

ont été proposés pour détecter H. pylori. Les plus utilisées sont issues du gènede l‟uréase ou de

l‟ARN ribosome 16s, gènes dont la fonction est parfaitement connue (Mégraud., 1998).

L‟utilisation avec succès des amorces amplifiant le gène correspondant à un antigène de 26 KD

spécifique de H. pylori ou au gène de l‟uréase A ou C (Mégraud et Labigne., 1998). D‟autres

amorces correspondant à un gène dont le produit n‟est pas connu ont également été proposées.

La sensibilité de la détection de H. pylori par PCR (polymérase chaîne réaction) est

comparable à celle de la culture. La PCR ne s‟est pas développée du fait de l‟absence de kits de

détection et donc de standardisation. L‟utilisation de procédure de PCR « nichée » n‟est pas

recommandée. Un autre intérêt de la PCR est la possibilité de typage moléculaire des souches

soit restriction des fragments obtenus, soit par séquençage. De plus l‟amplification de

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06

séquences au hasard a aussi été appliquée à H. pylori dans un but de typage (RAPD)

(Makristhis et al., 1998).

I-6-2 Tests non invasifs (méthodes indirectes)

I-6-2-1 La sérologie (Méthodes utilisant le sang)

La sérologie est la plus ancienne des tests indirects disponibles. Il est connu depuis

longtemps que l‟infection à H. pylori se traduit presque constamment par une réponse sérique

de type IgG (Cutler et Havestad, 1995). Ces anticorps sont recherchés par des techniques

immuno-enzymatique « ELISA » utilisant des extraits antigéniques semipurifiés ou enrichis

pratiquer sur un échantillon de sérum. Tous les tests ELISA utilisés sont satisfaisant sur le plan

de la sensibilité et de la spécificité (Makristhis et al., 1998). Ces derniers varient selon les kits

commercialisés ; les limites de la méthode constitue à :

IgM ne sont pas détectés.

IgG n‟apparaissent que trois semaines après le début de la maladie.

IgA détectés en absence d‟IgG

I-6-2-2 Test respiratoire (Méthode utilisant l’urée)

Ce test est basé sur la propriété de H. pylori de posséder une uréase très forte (Bruley

Des Varannes., 1996). Il consiste à faire absorber au patient de l‟urée marqué au carbone 13,

puis à rechercher la présence ou l‟absence de l‟isotope dans le gaz carbonique expiré

(Mégraud., 1995). Le carbone 13 absorbée est hydrolysé dans l‟estomac par l‟uréase en

ammoniac et gaz carbonique 13

CO2, qui passe dans le sang puis dans les poumons et se

retrouve enfin dans l‟air expiré. Ce test faible à plus de 98% présente l‟avantage de rechercher

la présence de la bactérie dans la totalité de l‟estomac (Mégraud., 2004).

I-6-2-3 Test utilisant la salive

Cette méthode consiste à rechercher des anticorps anti H. pylori dans la salive. Elle est

moins invasive que la recherche dans le sang mais plusieurs chercheurs ont découvert qu‟il y a

une bonne corrélation entre les IgG spécifique sériques et salivaires (Mégraud., 1998).

I-6-2-4 Test de l’urine

Il existe un test ELISA détecte les IgG spécifiques anti-H. pylori dans l‟urine. La

corrélation des anticorps sérique à été de 95% avec les anticorps urinaires, ce qui permet de

considérer cette méthode comme un diagnostic simple d‟H. pylori (Mégraud., 1998).

I-6-2-5 Test utilisant les selles

Ce test permet une détection directe mais non invasive d‟H. pylori .Il consiste en une

réaction ELISA ou les plaques sont coartées par des anticorps spécifiques d‟H. pylori, les

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02

résultats ont montrés une sensibilité de 96%, une spécificité de 93% et des valeurs périditives

positives de 92% et négatives de 96% (Makristathis et al., 1998).

I-7 Traitement

I-7-1 Eradication d’ Helicobacter pylori

Depuis sa découverte il y a plus de 15 ans, H.pylori a été reconnu responsable de la

grande majorité des ulcères duodénaux, de la majorité des ulcères gastriques et des lymphomes

malins gastriques du MALT. Par contre, son implication dans la dyspepsie non ulcéreuse et

l‟efficacité de son éradication pour en améliorer les symptômes font encore l‟objet de

discussions ne permettant pas de conclure. De ce fait, les indications formelles de l‟éradication

de la bactérie sont des ulcères duodénaux, l‟ulcère gastrique et les lymphomes malins

gastriques du MALT (Cayla., 1996). Cette bactérie pose de difficiles problèmes d‟éradication,

ces difficultés sont liées à plusieurs problèmes (Cayla., 1995).

Diffusion mauvaise ou insuffisante, au site de l‟infection, pour certains antibiotiques

(Caroli et al., 1998).

Inactivation ou réduction d‟activité de certains antibiotiques en pH acide (Graham et

al., 1998).

Capacité élevée de résistance microbienne.

Croissance lente de la bactérie (El-Omar et al., 2000).

I-7-2 Comment traite-t-on Helicobacter pylori ?

Les monothérapies

Le premier modèle d‟étude thérapeutique d‟une infection bactérienne est de tester sa

sensibilité, in vitro, à différents agents antimicrobiens (Adamek et al ., 1996). Bien que H.

pylori soit sensible à de nombreux composés, in vitro, les béta lactamine, les macrolides, et les

nitro-imidazoles…etc avec des CMI90 régulièrement inférieures à 1 mg/l in vivo (Hussell et

al., 1995). Les différentes monothérapies sont inefficaces en termes d‟éradication de H.

pylori (Tab. 04) Après diminution majeure du nombre de bactéries au cours du traitement,

voire une disparition, l‟infection reprend le plus souvent à l‟arrêt du traitement. Il est probable

que les conditions d‟action des molécules en situation clinique soient profondément modifiées

par la localisation de ce micro-organisme au sein de la couche de mucus entourée par un milieu

acide formant ainsi une niche écologique protégée, d‟accès difficile.

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02

Tableau 04. Synthèses des caractéristiques des molécules actives sur Helicobacter pylori en

monothérapies d‟après Adamek et al ., 1996

Dans ces conditions, les deux principaux paramètres qui semblent jouer un rôle sur

l‟éfficacité des molécules sont, d‟une part, l‟activité in vitro à pH neutre et/ou acide et d‟autre

par leur capacité à diffuser de manière active au sein de la couche de mucus. Il existe une

résistance naturelle à certains antibiotiques tels que la vancomycine, le trimethoprine, l‟acide

nalidixique et les sulfamides (Admek et al., 1996). Les monothérapies antibiotiques obtiennent

des taux d‟éradications de 20 à 40%.

Les bithérapies

Confrontés à la difficulté d‟éradiquer la bactérie par de simples monothérapies et à la

moindre éfficacité des antibiotiques en milieu acide les schémas thérapeutiques se sont orientés

vers l‟utilisation de combinaisons thérapeutiques de deux ou trois médicaments associant

antisécrétoire et/ou sels de bismuth et antibiotiques. Parmi les bithérapies, deux ont été

principalement testées associant antisécrétoire « IPP le plus souvent + amoxicilline dont le taux

d‟éradication est de 60% (Berry et al., 1995 ) et antisécrétoire + clarithomycine dont le taux

d‟éradication est de 66% (Devitis et al., 1995 ; Neri et al., 1997 ; Tham et al., 1998). Les

autres combinaisons telles que oméprazole–bismuth et oméprazol-ciprofloxacine se sont

révélées inéfficaces (Labenz et al., 1995). D‟autres bithérapies comme bismuth-imidazolés,

amoxicilline-imidazolés ou tétracycline-imadazolés ont donné des résultats variables mais, en

général moins éfficaces ou non reproductibles (Tham et al., 1998). Il faut noter que la bi-

Molécules CMI90 (mg/l) Sécrétion dans

le mucus

Taux (%) d‟éradication

in vivo

Bismuth

Amoxicilline

Tétracycline

Nitro-imidazole

Macrolides.

Anti-H2

Ipp..

4 à 32

0,06

0,5

2

0,06

>1000

8 à 64

-

+

+ +

+ + +

+ + +

-

-

20

20

<20

20-30

35

0

< 5

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00

antibiothérapie clarithromycine-tinidazole, administrée pendant une semaine, permet d‟obtenir

des taux d‟éradication supérieurs à 60% (Moayyedi et al., 1996).

Trithérapies

Il s‟agit de traiter l‟infection à H. pylori par un inhibiteur de la pompe à protons (IPP), à

double dose et double antibiotique comportant deux des antibiotiques suivants : amoxicilline,

clarithromycine, métronidazole.

IPP+ amoxicilline + clarithromycine ; la dose de amoxicilline généralement utilisé est

de 1g deux fois par jour pendant 07 jours et clarithromycine la dose optimal est de

500 mg (bonne résultat avec 250 mg également) 02 fois pendant 07 jours le taux

d’éradication est de 82 a 94% (Bazzoli et al., 1998).

IPP double dose + amoxicilline + métronidazole on utilise 1g, 2 fois Amoxiciline et

400mg ou 500 mg de métronodazole ; le taux d’éradication est généralement inférieur

à 66% et à 79% (Mégraud., 1999).

Omeprazole 20 mg+ Amoxicilline 2 mg + Tinidazole 1g (taux d’éradication 81-86%)

Lonzoprazole + Amoxicilline + Tinidazole (taux d’éradication 82%) (Bardhan et al.,

2000) (Tab. 05).

Tableau 05. Différentes bases du traitement anti-H.elicobacter pylori, dosage et Durée

d‟après Fagniez., 1995

Type de médicament Dosage Durée du traitement

Anti sécrétoires

Oméprazole

Lansoprazole

Anti-H2

40 mg/j (en 2 prises)

double de la dose

double de la dose

04 semaines

04 semaines

04 semaines

Antibiotiques

Amoxicilline

Metronidazole

Clarithromycine

1 gr 2 fois/j

500 mg 2 fois/j

500 mg 2 fois/j

7 jours

7 jours

7 jours

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00

I-7-3 Contrôle de l’éradication

Un contrôle de l‟éradication est nécessaire lorsque l‟indication est d‟importance vitale

« ulcère complique d‟un lymphome type MALT » ; ce contrôle de l‟éradication se justifie

également lors d‟ulcère d‟évolution sévère sans complication (Byk et al., 2002). Le contrôle de

l‟éradication devrait être effectué, au plus tôt, 4 semaines après l‟arrêt de toute thérapeutique

comprenant des substances anti- microbiennes « antibiotique, bismuth » ou inhibiteur de la

pompe à protons. Des contrôles trop précoces conduisent souvent à des résultats faussement

négatifs. Le contrôle l‟éradication devrait s‟effectuer à l‟aide d‟un test de détection rapide de

l‟uréase lorsqu‟un contrôle endoscopique est indiqué. Cela concerne essentiellement les

contrôles de guérison d‟un ulcère compliqué ou d‟un ulcère gastrique afin d‟exclure la

possibilité d‟une tumeur maligne. Lorsqu‟on renonce à un contrôle endoscopique, un test au

niveau des selles est une alternative intéressante. Les tests sérologiques ne sont pas indiqués

car la disparition des anticorps varie d‟un individu à un autre et peut ne survenir qu‟après des

mois ou des années (Mégrand et al., 2002).

I-7-4 Echec de l’éradication

Les causes des échecs de l‟éradication sont duent aux facteurs suivants :

Le suivi du traitement (Laine et al., 1996).

La résistance des souches bactériennes aux antibiotiques (Laine et al., 1998).

La durée du traitement qui n‟est encore pas clairement établie (7 ou 14 jours)

(Catalano et al., 1998)

La campliance du patient

La récidive de l‟infection

Les effets secondaires des différents antibiotiques (diarrhée à l‟amoxicilline) ;

les troubles du goût (Clarithromycine) et douleurs abdominales Les accidents majeurs, en

particulier à type de colite pseudo membraneuses, restent tout à fait exceptionnels.

I-7-5 Prise en charge des échecs de l’éradication

Après trithérapie comportant du métronidazole ou un imidazole, les taux de résistance

acquise en cas d‟échec thérapeutique semblent particulièrement élevés (43% à 100%) (Laine et

al., 1998).

La situation est plus contrastée pour Clarithromycine, car après trithérapie (IPP+

Amoxicilline + Clarithromycine) ou (IPP+ Métronidazole +Clarithromycine) les taux de

résistance varient de 0% à 45% (Lamarque et al., 1997). Certaines études ont montré des taux

de résistance de 69% à la clarithromycine quand aux double résistance au métronidazole et la

clarithromycine, et rarement mentionnée (Tankovic et al., 2001).

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04

Une étude française récente a confirmé ces résultats après un échec d‟un traitement par

(IPP + Clarythromycine + Amoxicilline) ou (IPP + Métronidazole + Amoxicilline) et a permis

l‟éradication de H. pylori chez 66% des malades sans contrôles de l‟antibiogramme, ces

résultats n‟étaient pas meilleurs chez les malades ayant eu une culture bactérienne avec

antibiogramme.

Ce qui doit permettre de considérer cet examen qu‟en cas d‟échec de ce traitement de

deuxième ligne (Mérgrand et al., 2001). L‟éfficacité, sur H. pylori de nouveaux antibiotiques

en été également prouvée. Les résultats de l‟association de (Oméprazole + Amoxicilline +

Ciprofloxacine) chez des patients ayant une double résistance au métronidazole et à la

Clarithromycine ont été décevants (25% d‟éradication) (Mégrand et al., 2001).

L‟association de Pantoprazole double dose (amoxicilline 1g et 2 fois par jour + 300 mg

de Rifabutine) semble prometteuse (Perri et al., 2000).

Pour certains auteurs, l‟association de ranitidine sous citrate de bismuth +

Clarithromycine + Métrnidazole ou la quadrithérapie (IPP, Bismuth, métronidazole,

clarithromycine) serait une solution aux échecs dus à la résistance à la Clarithromycine ou au

métronidazole.

En cas d‟échec de traitement de première ligne, plusieurs études récentes suggèrent que

la quadrithérapie (IPP+bismuth + 2 antibiotiques) serait la meilleure alternative que le

traitement administré soit de 7- 12 ou 14 jours.

I-7-6 Vaccination contre Helicobacter pylori

La prévention de l‟infection gastrique par vaccination a été réalisée dans plusieurs

modèles animaux. Chez la souris, plusieurs antigènes protecteurs de H. pylori ont été

identifiés. L‟uréase et la protéine de stress (heat shok protein : HSPA) sont les antigènes les

plus prometteurs pour le développement d‟un vaccin humain (Ferrero et al., 1995).

Une vaccination basée sur l‟uréase a notamment été éfficace chez le furet et le chat qui

sont les hôtes naturels respectifs de H.mustelae et de H.Felis.

La sécurité d‟emploi et l‟immunogénicité de l‟uréase ont été récemment confirmées chez

l‟homme. La vaccination anti-Helicobacter chez l‟animal peut entraîner la cure d‟une infection

préexistence (Corthésy et al., 1995). Cette observation initialement faite avec l‟uréase chez la

souris a été confirmée chez le furet et le singe macaque, des modèles d‟infections naturelles.

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Bactéries Lactiques

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02

Les bactéries lactiques ont été utilisées depuis des millénaires par l‟homme dans son

alimentation dont le but été : la fabrication et la conservation des aliments. La découverte de

leur action sur le lait (fermentation) fut probablement accidentelle (Novel., 1993).

C‟est à partir des travaux de Louis Pasteur sur la fermentation en 1857, qu‟un lien a été

établi entre la fermentation lactique et les bactéries (Roux., 1994). La première culture

bactérienne pure était une culture de Lb. lactis obtenue et décrite par Josef Lister en 1873.

Après le savant Ukrainien Metchnikoff prix Nobel en 1908, a isolé le bacillus bulgare nommé

de nos jours « Lb. bulgaricus » présent dans le yaourt et il a développé l‟idée que les bactéries

contenues dans le lait fermenté ont des effets bénéfiques sur la santé humaine (la longévité)

(Pernoud et al ., 2005).

II-1 Définition

D‟après Joffin (2001) et Dupin (1992), les bactéries lactiques sont des bactéries des

fermentations alimentaires qui se caractérisent par une très forte production d‟acide

lactique .Leur fermentation est homolactique si l‟acide lactique est le seul produit formé, et

hétérolactique dans le cas où d‟autres composés sont présents : acide acétique, éthanol, CO2 …

(Novel., 1993).

La plupart de ces bactéries ont des effets bénéfiques assurant la conservation des aliments

et la protection contre les affections intestinales de l‟homme et des animaux (Dellaglio et al.

,1994).

II-2 Caractéristiques générales des bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont des cellules vivantes, procaryotes, hétérotrophes et chimio-

organotrophes (De Roissart., 1986).

Ce sont des bactéries gram positif (+) généralement immobiles, asporulées, catalase

négatif -, oxydase (-) et nitrate réductase (-) (De Roissart et Luquet, 1994).

Elles ont des exigences nutritionnelles complexes pour les acides aminés, les peptides,

les vitamines, les sels, les acides gras et les glucides fermentescibles (Dellaglio, et al .,

1994).

Ce sont des anaérobies facultatifs ou micro-aérophiles, elles ne tolèrent que de très

faibles concentrations d‟oxygène (Canteri., 1997).

Elles ont un effet inhibiteur sur les bactéries indésirables et coagulateur, agissant aussi

sur les qualités organoleptiques des produits (Roux., 1994).

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01

II-3 Habitats

En général, les bactéries lactiques habitent différentes niches écologiques telles que les :

produits laitiers et carnés, les végétaux, les muqueuses de l‟homme et des animaux (Renault et

Corthier, 1998). (Tab. 06)

Tableau 06. Les différents milieux écologiques des BLs

Genre Les milieu Les références

Lactococcus Le lait et les végétaux Novel., 1993.

Streptococcus thermophilus Les produits laitiers : yaourt,

les levains artisanaux.

Jeantet et al., 2007.

Lactobacillus

Surface des plantes, les

produits laitiers, la viande,

l‟eau, la bouche, le tractus

intestinal et le vagin.

Prescott et al., 2003.

Leuconostoc

Les végétaux frais et les

produits carnés.

Dellaglio et al., 1994.

Pediococcus

Les produits carnés fermentés

et le lait.

Larpent., 1996.

II-4 Taxonomie

Les bactéries lactiques forment un groupe très hétérogène (Leveau et Bouix, 1980).

Ce groupe a été défini par ORLA-JENSEN (1919) et réunit plusieurs genres d‟importance

différente (Novel., 1993).

Elles sont soit des cocci : Les Enterococcus, Streptococcus, Lactococcus ; Pediococcus

et Leuconostoc, soit des bacilli : Les Lactobacillus et les Carnobactériums (Larpent, 1996).

A ces genres, a été ajouté récemment le genre Bifidobacterium après leur découverte par

Tissier en 1900 (Romond et Romond, 1993).

II-4-1 Caractères de classification

Les bactéries lactiques sont distinguées par plusieurs caractères tels que :

Caractères morphologiques La forme des cellules microbiennes (sphères ou bâtonnets) le

diamètre cellulaire et la mobilité. (Dellaglio et al., 1994)

Caractères physiologiques parmi ces caractères (Choisy et al ., 1997)

- L‟influence de la température, notamment l‟aptitude à se développer à 10 °C et 45 °C,

la température optimale, la résistance à 60°C pendant 30 minutes ;

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07

- L‟influence de la concentration en NACL à 2,4 et 6,5 % ;

- Le type fermentaire, homo ou hétérolactique ;

- Les sucres fermentés, avec notamment le galactose et les pentoses ;

Caractères biochimiques

- L‟utilisation des sucres, notamment du lactose ;

- Dégradation des protéines et des lipides ;

- L‟activité antagoniste et protéolytique (De Roissart., 1986).

II-4-2 Les différents genres des bactéries lactiques (Tab. 07)

II-4-2-1Genre Streptococcus

Le genre Streptococcus regroupe des coques Gram+, immobiles, généralement groupé en

paires ou en chaines de longueur variable (Guiraud., 1998). La dernière édition du Bergey’s

Manuel (1986) les classent en 6 catégories : les streptocoques pyogènes, les streptocoques

oraux, les Sc. fécaux, les Sc. lactiques, les Sc. anaérobies stricts et les autres streptocoques

(Dellaglio et al., 1994). Les espèces diffèrent principalement entre elles par la présence d‟un

antigène spécifique dit antigène de Lancefield et se composent en fait de deux groupes : les

streptocoques mésophiles possédant l‟antigène de groupe N et l‟espèce thermophile

Streptococcus thermophilus qui ne possède pas d‟antigène de Lancefield (Novel., 1993).

a. Lactococcus (les streptocoques lactiques mésophiles)

Selon Novel (1993), les lactocoques sont des streptocoques lactiques mésophiles capables

de croitre à une température moyenne de 20 à 30°C et une température minimale moins ou

égale 10°C. Ce genre appartient au groupe N de Lancefield (Prescott, et al. ,2003).

b. Streptococcus thermophilus

Selon Larpent (1996), Sc. thermophilus fait parti des levains thermophiles (yaourt,

fromage à pate cuite) qui dégrade plus rapidement la K-caséine que l‟α S1 ou la ß caséine. Ses

cellules de forme ovoïde, se regroupent en longues chaines, sont homofermentaires et

produisent de l‟acide lactique L(+). (De Roissart et Luquet, 1994). Sc. thermophilus se

caractérise par sa température de croissance optimale de 40-45°C, par sa résistance à un

chauffage à 63°C pendant 30 minutes et par son inaptitude à croitre en présence de 4 % de

NACL et à pH 9,6 (Choisy et al. ,1997). (Fig.15)

II-4-2-2 Le genre Leuconostoc

Ce sont les seules bactéries en forme de coques ayant un métabolisme hétérofermentaire;

elles produisent à partir des hexoses, du CO2, de l‟éthanol et de l‟acide lactique D (-). Leur

température optimale de croissance est de 25 à 30°C (Larpent et al., 1997)

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00

II-4-2-3 Le genre Pediococcus

Ces bactéries ont un métabolisme homofermentaire et produisent de l‟acide lactique DL ou

L(+) (Dellaglio et al ., 1994).

Tableau 07. Les différents genres des BLs d‟après Novel., 1993.

GC % : pourcentage molaire de l‟ADN en bases G et C.

Figure 12. Streptococcus thermophilus sur Microscopie électronique à balayage d‟après

©INRA/Micheline Rousseau ANNEE

II-4-2-4 Le genre Lactobacillus

Ce groupe est constitué de bacilles réguliers, souvent allongés, Gram+, parfois groupés

en paires ou en chaines, généralement immobiles et réalisant une fermentation de type lactique

(Guiraud., 1998).

Cellules Fermentation Adn :

GC%

Milieux de

culture Forme Arrangement

-Streptococcus

-Leuconostoc

-Pediococcus

-Lactobacillus

-Bifidobacterium

Coque

Coque

Coque

Bacille

Variée

Chaines

Chaines

Tétrades

Chaines

Variée

Homolactique

Hétérolactique

Homolactique

Homolactique

Hétérolactique

Acétique et lactique

34-46

36-43

34-42

32-53

55-67

M17

MRS, KCA

MRS

MRS

LSD

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06

Certaines espèces sont homolactiques dont l‟espèce souvent utilisée en industrie

alimentaire est Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus pour la production du yaourt en présence de

Streptococcus thermophilus (Gyang., 1984 ; Jeantet et al ., 2007).

Le genre Lactobacillus se subdivise en trois groupes : (Larpent et al ., 1997)

Le groupe I (ex : Thermobacterium) Des homofermentaires se développent à 45°C.

Le groupe II (ex : Streptobacterium) Des hétérofermentaires facultatifs ADH- :

fermentent le glucose et les pentoses sans dégagement de CO2.

Le groupe III (ex : Betabacterium) Hétéromofermentaires ADH+ : dégagement de

CO2. (Fig. 16 et 17) (Tab. 08).

Tableau 08. Critères différentiels des 3 groupes de Lactobacillus d‟après Larpent., 1996

Thermobacterium Streptobacterium Betabacterium

ADH

Glucose (gaz)

Glucosides

Gluconate (gaz)

Aldolase

Pentoses

Thiamine

Acide lactique

G+C %

-

-

+

-

+

-

-

DL ou L

34,7-50,8

+

-

+

+

+

+

-

D ou DL

33-46,4

+

+

-

+

-

+

+

DL

35-53,4

+ : positif

- : négatif.

Figure 13. Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus d‟après ©INRA/Micheline

Rousseau

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42

Figure 14. Association du Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus d‟après

©INRA/Micheline Rousseau

II-4-2-5 Le genre Bifidobacterium

Le genre Bifidobacterium regroupe des bacilles sous forme de bâtonnets réguliers ou

ramifiés qui se développent sur un milieu nécessitant l‟addition d‟un agent réducteur

d‟oxygène telle que la cystéine chlorhydrique. L‟apparence des colories est très variable et

elles donnent sur un milieu gélosé nutritif 3 ou 4 types de colonies de taille et de couleur

différentes (Leveau et Bouix., 1993).

La morphologie des cellules est influencée par les conditions de culture ; l‟apparition de

formes bifides peut être stimulée par l‟addition de carbonates, d‟acétate de sodium, de

chlorures et de nombreux cations monovalents (Kojma et al., 1968).

Le terme de facteur Bifidogène a été employé par Gyoiuy en 1953 (Gibson et al., 1995).

Ces facteurs sont spécifiques à chaque espèce de Bifidobactérie; leurs origines sont diverses

soit : le monde microbien (extrait de levure) soit le monde végétatif (extrait des végétaux)

ainsi que le lait maternel. Ces facteurs jouent un rôle dans la stimulation de la croissance de

Bf. bifidium, Bf. infantis, Bf. longum et Bf. brève (Gibson et al., 1995); ce sont des dérivés

de N-Acétyle glucosamine lactose, des peptides ou des substances semblables aux peptides et

aux vitamines ou bien des oligo saccharides dans le lait humain (Gyorgy et al., 1995). Dans

le lait de vache et dans les laits modifiés, ces facteurs Bifidogène sont absents.

a- Bifidobactérium. Bifidum

Bensoltane et al., 1997 ont démontré que leurs ensemencement sur milieu gélosé, incubée

en anaérobiose donne des colonies sous forme circulaire blanchâtres opaques avec une surface

lisse ou rugueuse et un aspect muqueux; donc c‟est des colonies indiquant une bonne

croissance avec un culot au fond du tube et un éclaircissement de milieu de culture. Leur

température de croissance optimale est de 36°C à 38°C et leur pH optimum est de 6 à 7 de

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42

croissance. La présence du fer et de Magnésium dans le milieu stimule sa croissance

(Archibald., 1986).

b- Bifidobactérium adolescentis

Ce sont des bâtonnets, courts, incurvés, anaérobies et ont des apparences variables; leur

isolement se fait à partir de caries dentaires, du vagin humain et des selles de nourrissons

(Scardovi., 1986). La croissance optimale est obtenue à la température optimale de 35°C à

37°C; la croissance est inhibée à 20°C et 46.5 °C (Bouchaman et al., 1974).

La présence de l‟acide et CO2 stimule l‟utilisation de la voie oxydative des hexoses

mono phosphates qui fermente le gluconate.

c- Bifidobactérium infantis

Ce sont de petites cellules fines, souvent globuleuses ou sphériques qui contiennent des

granulés centraux sous forme d‟un œil. Elles sont les plus prédominantes des espèces de

Bifidobactéries. Elles secrètent des acides aminés après la dégradation de la caséine

(Bensoltane et al., 1997).

d- Bifidobactérium brève

Bensoltane et al., 1997 ont démonté que se sont des cellules épaisses fines de forme

courte en bâtonnets associés et possédant des granulations qui apparaissent après la coloration

de Gram; leurs colonies ont des surfaces lisses ou ondulées entre 2 et 3 mm de diamètre.

e- Bifidobactérium longum

Des cellules de formes irrégulières, frêles, minces très allongées et branchements rares,

bifurques, leur Gram est variable ; les colonies apparaissent avec un aspect renflé. Leur

température de croissance optimale est de 35°C à 37°C. Ils ne fermentent pas le gluconate mais

fermente les pentases (Bellongue., 1993).

f- Bifidobactérium pseudo longum

Ce sont des cellules bactériennes qui ont des formes coccoïde ou incurvées courtes

souvent associées en deux et rarement en chaînes par fois isolées. Elles exigent pour leur

croissance un pH optimale de 6.5 et 7; leur croissance est lente à pH : 6 et inhibée à pH: 8.

Elles ont été isolées à partir de selles de souris, de poulets, de bovins et d‟ovins. (Bensoltane et

al., 1997).

g- Bifidobactérium thermophilum

Leur association se fait en paires avec des jonctions entre deux cellules présentant un

aspect irrégulier ; pas de fermentation de ribose ni de xylose (Bensoltane et al., 1997). Leur

température de croissance optimale est de 46°C avec un pH optimal de croissance de 6.5 à 7.

Elles sont isolées à partir de selles de porc, de poulet et de rognons des bovins.

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h- Bifidobactérium suis

Cette espèce a des cellules en forme de bâtonnets fins et font jusqu‟à 6 mm de long

avec des colonies lisses, blanches. Elles sont anaérobies et circulaires. Elles poussent dans des

conditions optimums de température minimale de 20°C et la température maximale de 44°C,

pas de croissance à 60°C (Bouchaman et al., 1974).

II-5 Principales propriétés métaboliques des bactéries lactiques

II-5-1 Les exigences nutritionnelles

Les bactéries lactiques sont considérées comme un des groupes bactériens les plus

exigeants du point de vue nutritionnel (De Roissart., 1986). (Tab. 08)

II-5-1-1 L’utilisation des acides aminés libres

D‟après Novel (1993), Une bonne croissance des bactéries dans le lait est assurée par sa

trop faible concentration en acides aminés qui constituent leur source d‟azote et par l‟absence

de certains acides comme la méthionine.

II-5-1-2 L’utilisation des peptides et des protéines du lait

Même si tous les acides aminés du milieu sont utilisés, les bactéries lactiques utilisent

aussi les peptides de haut poids moléculaire et les protéines du lait comme source azotée pour

réaliser la fermentation lactique (Desmazeaud., 1997).

II-5-1-3 L’importance des vitamines du lait

Les bactéries lactiques ont besoin des vitamines pour leur croissance, en particulier : la

riboflavine (B2) ; la niacine (PP) et la pyridoxine (B6) parce que leurs concentrations sont trop

faibles dans le lait et elles sont très sensibles au chauffage (Desmazeaud., 1997).

III-5-2 Le métabolisme des sucres

III-5-2-1- Définition de la fermentation lactique

La fermentation est une méthode de stabilisation biologique utilisée depuis plus de 6 000

ans et parmi les fermentations les plus exploitées est la fermentation lactique. (Jeantet et al.,

2006)

Selon Guiraud (1998), la fermentation lactique est une étape essentielle dans la fabrication

des fromages et des yaourts, possédant un rôle organoleptique (acidification, arôme), de

stabilisation (par la baisse du pH et l‟antibiose) et un rôle sur la qualité alimentaire. (Tab. 09 et

10)

II-5-2-2 Métabolisme du lactose

D‟après Desmazeaud (1997), le sucre fermentescible du lait est le lactose dont la

concentration est voisine de 5%. Une bactérie lactique est capable d‟excréter l‟acide lactique

D(-), L(+) ou DL selon une de 2 voies métaboliques suivantes : (Larpent et al ., 1997)

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Voie d‟Embden-Meyerhof-Parnas, homofermentation dans laquelle l‟acide lactique est le

seul produit du métabolisme excrété.

Voie de Dickens-Horecker, hétérofermentation conduisant à l‟acide lactique et d‟autres

produits : CO2, l‟acide acétique, l‟éthanol.

II-5-2-3 Le bilan énergétique de la fermentation lactique

Selon Novel (1993), le bilan énergétique de la fermentation homolactique est que : chaque

mole de lactose donne 4 molécules de lactate et 5 molécules d‟ATP et pour la fermentation

hétérolactique, la même molécule ne produit que 3 molécules de lactate et 4 molécules d‟ATP.

II-5-2-4 Métabolisme des autres sucres

Certaines espèces de Lactobacillus hétérofermentaire savent utiliser les pentoses et les

pentitols (arabitol, xylitol) : ces composés pénètrent grâce à des perméases spécifiques.

D‟autres espèces homofermentaires utilisent le système PTS pour la perméation du glucose par

exemple chez Lb. helveticus et Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus. (Novel., 1993)

Tableau 09. Les différents types des ferments lactiques d‟après Canteri., 1997

Type levain Nouveau nom Produits

Més

op

hil

es

Lactococcus lactis ssp

cremoris

Lactococcus lactis ssp lactis

L.lactis ssp cremoris

L.lactis ssp lactis

Lc.mesenteroides ssp cremoris

Lc.lactis

L.lactis ssp cremoris

L.lactis ssp lactis

L.lactis ssp lactis diacetylactis

L.lactis ssp cremoris

L.lactis ssp lactis

L.lactis ssp lactis diacetylactis

Lc.mesenteroides ssp cremoris

Lc.lactis

Fromages frais, cheddar

Féta, mimolette

Pâtes molles

Pâtes pressées

Beurre

Beurre

Pâtes molles

Pâtes pressées

Beurre

Th

erm

op

hil

es

Sc.salivarius ssp thermophilus

Lb.delbrueckii ssp bulgaricus

Sc.salivarius ssp thermophilus

Lb.helveticus

Lb.delbrueckii ssp lactis

Yaourt

Emmental

Comté

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Tableau 10. Exemples de bactéries lactiques utilisées dans la fermentation des aliments

Aliments/Produits Bactéries lactiques Références

Produits laitiers

Fromages

Yaourt

Lait fermenté

Beurre

Lactocoques, Lactobacilles…

Sc.salivarius,subsp.thermophiluset

Lb.bulgaricus subsp. delbrueckii

Lb.acidophilus

Lactocoques, Leuconostoc

Singleton., 1999.

Produits carnés et de la pêche

Saucisse sèche

Saucisse semi-sèche

Izushi

Pediocoques,Lb.plantarum, Lb.brevis

Pediocoques

Lc.mesenteroides, Lb.plantarum

Drouault et Corthier.,

2001

Produits végétaux

Olives

Choucroute

Sauce soja

Pédiocoques, Lb.plantarum, Lb.brevis,

Lc.mesenteroide

Lc.mesenteroides

Lb. subsp delbrueckii bulgaricus

Larpent-G et

Sanglier., 1992

Pains spécieux aux levains Lb.plantarum, Lb.brevis, Lb.fermentum,

Lb.sanfrancisco

Desmazeaud., 1996

II-5-2-5 Métabolisme du citrate et d’autres substrats carbonés

D‟après Desmazeaud, (1996), les bactéries lactiques, en plus de leur pouvoir

fondamental d‟acidification ont une capacité aromatisante dont l‟acide citrique est considéré

comme le principal précurseur de l‟arome.

(+) : exigence ; (-) : indépendance ; (S) : stimulation ; (?): non déterminé.

III-5-3 L’activité protéolytique

Le système protéolytique des bactéries lactiques est important : il permet la dégradation

des caséines du lait pour assurer leur nutrition azotée et il intervient au cours de l‟affinage du

fromage (Canteri., 1997).

II-5-4 La production de polysaccharides

Certaines espèces de bactéries lactiques synthétisent des exopolysaccharides (EPS) de

grande importance industrielle par exemple : des souches de Sc. thermophilus et Lb.

delbrueckii subsp bulgaricus considérées comme responsables de la viscosité du yaourt

obtenu (Novel., 1993).

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II-5-5 La production de composés antagonistes

Selon Morisset et al., (2005), les bactéries lactiques sont utilisées depuis longtemps de

façon consciente ou non pour leur activité antimicrobienne. Cette propriété est le résultat de la

production par ces bactéries des substances inhibant la croissance d‟autres micro-organismes

comme les acides organiques (acides lactique et acétique), le peroxyde d‟hydrogène et les

bactériocines.

II-6 Connaissance en génétique sur les bactéries lactiques

La génétique des bactéries lactiques est récente, ces études sont développées notamment sur

Streptococcus thermophilus et quelques espèces de Lactobacillus .Elle s‟intéresse à étudier les

phages et les plasmides des bactéries lactiques, les transferts in vivo et in vitro des gènes et la

mutabilité de ces bactéries (Novel., 1993).

II-6-1 Les Bactériophages lactiques

En 1935, les Néo-Zélandais Whitehead et Cox ont identifié les premiers phages des BLs,

ils sont de si petite taille qu‟on ne peut pas les voir au microscope optique (Amiot et Lapointe-

V, 2002).

Selon Desmazeaud (1998), les phages lactiques sont 2 types : les phages virulents

provoquant la lyse (destruction) des cellules en envahissant les ateliers de fabrication des

levains et les phages tempérés : ils pénètrent dans la cellule, s‟y multiplient mais ne deviennent

lytique qu‟après un certain temps.

II-6-2 Les plasmides résidents des bactéries lactiques

La connaissance des plasmides d‟une souche est très nécessaire, grâce à leur fonction dans

la vie cellulaire (fermentation des sucres, protéolyse…) et dans les relations avec les autres

micro-organismes du milieu (production de composés antagonistes, résistance aux

antibiotiques, aux UV…) (Novel., 1993).

II-7 Effets bénéfiques des bactéries lactiques sur la santé humaine

A partir des travaux de Metchnikoff, en 1908, l‟idée que des bactéries lactiques ingérées

vivantes pouvaient avoir un effet bénéfique a été développée et la notion de « probiotique »

était née (Rambaud et al ., 2004). (Tab.11)

Les bactéries lactiques les plus fréquemment utilisées comme probiotiques sont des

lactobacilles : Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii subsp bulgaricus, Lb. lactis et aussi Sc.

thermophilus et Bf. bifidum (Novel, 1993).

La sélection de souches consiste à identifier les effets santés recherchés. Puis, sur la

connaissance des critères technologiques et physiologiques, comme la viabilité et la survie de

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la souche dans le produit fini et l‟adaptation au milieu dans lequel elle sera utilisée (Pernoud et

al ., 2005).

Tableau 11. Principaux rôles bénéfiques pour la santé humaine des bactéries lactiques d‟après

Desmazeaud, 1996

Effets sur le transit intestinal et sur la flore intestinale :

- amélioration du transit et lutte contre les diarrhées ;

- effets bénéfiques des acides lactiques et acétiques sur la composition de

la flore intestinale (notamment contre les bactéries pathogènes) ;

- effets bénéfiques sur le métabolisme de la flore intestinale

(notamment dégradation des amines) ;

- production de bactériocines, antibiotiques, H2O2.

Le yaourt non chauffé permet l‟absorption du lactose chez les sujets déficients

en lactose intestinale

Les laits fermentés : - stimulent la réponse immunitaire

- ont un rôle anti-tumeurs

- interviendraient dans la minéralisation

- diminueraient la cholestérolémie

II-7-1 Amélioration de la digestion du lactose

Le premier effet démontré avec un haut niveau de preuve a été l‟amélioration de

l‟intolérance au lactose et de la malabsorption de ce sucre par les bactéries lactiques surtout

celles du yaourt (Marteau et Seksik., 2005).

II-7-2 Effets sur le transit et sur la flore intestinale

Selon Desmazeaud (1996), les laits acidifiés ou le yaourt sont souvent utilisés pour lutter

contre les diarrhées, notamment chez les jeunes enfants. L‟ingestion de ferments lactiques

inhibe la prolifération de certaines souches pathogènes par divers mécanismes :

- production de substances (H2O2, acides lactiques et acétiques) ;

- abaissement du pH par les acides produits ;

- détoxification par dégradation des entérotoxines ;

- fixation sur le tube digestif empêchant la colonisation de pathogènes.

II-7-3 Effets sur la réponse immunitaire

Parmi les effets supposés des bactéries lactiques chez l‟homme, la stimulation des

fonctions immunitaires est les plus étudiée. Dont les progrès dans la connaissance de

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l‟immunité intestinale ont permis de montrer que 60 à 70% du nombre totale de nos cellules

immunitaires se trouvent dans la muqueuse de l‟intestin grêle et du colon (Moreau., 2005).

II-7-4 Rôle antitumeur (Cancérogenèse)

La flore colique pourrait être impliquée dans la cancérogenèse par l‟effet des enzymes

bactériennes qui activent des procarcinogènes en carcinogènes. Des études récentes ont montré

que plusieurs bactéries lactiques telles que : Lb.acidophilus et Lb.casei, pouvaient diminuer

les taux d‟enzymes responsables de l‟activation de certains procarcinogènes (Drouault et

Corthier., 2001)

II-7-5 Diminution du cholestérol sérique et déconjugaison des sels biliaires

L‟effet des bactéries lactiques sur le métabolisme du cholestérol reste encore controversé.

Alors que plusieurs études rapportent que la concentration en cholestérol sérique diminue

pendant la consommation de grandes quantités (680 à 5000 ml par jour) de produits laitiers

fermentés (Drouault et Corthier., 2001)

II-7-6 Influence sur l’absorption du calcium et des minéraux

Selon Desmazeaud (1996), les effets étudiés chez l‟homme sont beaucoup plus

contradictoires : une amélioration de l‟absorption des minéraux peut être notée lors d‟un

régime complété par le yaourt.

II-8 Devenir des bactéries lactiques ingérées

Selon Rambaud et al., (2004), la survie des micro-organismes ingérés diffère entre

genres microbiens, espèces et mêmes souches. Certains d‟entre eux sont détruits dés leur

passage dans l‟estomac alors que d‟autres ont une haute capacité de survie jusque dans les

selles.

Les bactéries lactiques sont adaptées à une croissance et à une survie dans du lait ou dans

des milieux dérivés du lait. Dans le tube digestif, les conditions d‟environnement sont très

différentes du produit laitier. Dans l‟estomac, l‟acidité peut être très élevée, dans l‟intestin

grêle : les sels biliaires, les enzymes pancréatiques et des défensives produites par les cellules

de l‟intestin grêle peuvent réduire la viabilité des bactéries lactiques (Corthier., 2006).

Les bactéries du yaourt : Lb. delbrueckii subsp bulgaricus et Sc. thermophilus à titre

d‟exemple, ont une résistance à l‟acide faible et sont rapidement détruites en quelques minutes

à des pH=1.Certains auteurs ont observé la survie de quelques bactéries du yaourt jusqu‟à la

fin de l‟iléon terminal mais jusqu‟ici ils n‟ont pas pu démontré une survie jusque dans les

selles. Mais d‟autres bactéries comme certaines bifidobactéries et Lb. plantarum ont une

survie très importante jusque dans les selles avec des concentrations fécales observées

supérieurs à 108

UFC/g (Marteau et Seksik, 2005). (Tab.12)

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Tableau 12. Pourcentages de survie de quelques bactéries d‟origine alimentaire dans l‟intestin

grêle humain d‟après Drouault et Corthier, 2001

Bactérie lactique % de survie Site de récupération

Lb.plantarum NCIMB 8826

Lb.fermentum KLD

Lb. lactis MG1363

Bf. bifidum

Lb .acidophilus

Bifidobacterium sp

Lb. bulgaricus

Sc. thermophilus

7

0,5

1

37,5

1,5

23,5

>1

>1

Iléon

Iléon

Iléon

Iléon

Iléon

Iléon

Duodénum

Duodénum

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Interactions des bactéries

lactiques

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Interaction bactérienne

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Les interactions entre micro-organismes évoluent en fonction des souches qui sont

associées. De plus, elles sont étroitement dépendantes des conditions de l‟environnement, en

particulier du milieu et des conditions de culture. Cela se comprend aisément, puisque les

principales causes d‟interactions entre micro-organismes dérivent de leurs propriétés

physiologiques, dont l‟expression est étroitement dépendante des conditions de culture

(Juillard et al ., 1998).

Lorsque les bactéries lactiques sont utilisées en culture mixte pour la fermentation du

lait, des interactions entre les différentes souches se manifestent (Grattepanche., 2005).

Selon Choisy et al. (1997), ces interactions sont classées en deux groupes : interactions

positives, qui caractérisent une stimulation du ou des micro-organismes, et interactions

négatives, qui correspondent à une inhibition de la croissance et de l‟activité métabolique.

III-1 Les phénomènes de stimulation ou de coopération

La coopération qui se définit comme une interaction positive entre les souches, est

divisée en plusieurs catégories. On distingue le commensalisme, lorsqu‟une population est

stimulée par la production d‟une substance essentielle ou la destruction d‟un facteur inhibiteur

par une autre population et le mutualisme ou la proto-coopération (exemple de Sc.

thermophilus avec Lb.bulgaricus), lorsque l‟interaction est positive pour chacune des

populations (Gratepanche., 2005).

D‟après Juillard et al. (1998), la coopération entre les bactéries lactiques est réalisée

par :

Production de nutriments azotés : L‟association de Sc. thermophilus et Lb.bulgaricus

pour la fabrication du yaourt est l‟exemple le plus connu et le plus stable. Dans le lait,

Lb.bulgaricus plus protéolytique que Sc. thermophilus, libère des acides aminés à partir de la

caséine dont Sc. thermophilus a besoin pour sa croissance. En retour, la croissance de Sc.

thermophilus en l‟absence ou à faible concentration d‟oxygène produit de l‟acide formique

stimulant le développement de Lb.bulgaricus (Novel., 1993). (Fig. 15)

Par modification des conditions physiologiques du milieu : Le lait n‟est pas un milieu

de culture optimale pour les bactéries lactiques, il est évident que des modifications de

conditions physiologiques peuvent avoir un rôle bénéfique pour les souches. Nous ne

reviendrons pas sur la modification de la teneur en acide aminés du lait, mais nous nous

attacherons aux conséquences de la modification du pH ou à la possibilité d‟élimination des

facteurs inhibiteurs (Juillard et al ., 1998).

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Interaction bactérienne

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Lactobacillus bulgaricus Acides aminés à partir de la caséine

Acide formique utilisé Streptococcus thermophilus

par Lactobacillus bulgaricus utilise ces acides aminés

Figure 15. La symbiose des bactéries du yaourt d‟après Fredot., 2007

III-2 Les phénomènes d’antagonisme (d’inhibition)

Selon Grattepanche (2005), différents agents antimicrobiens ayant la capacité

d‟inhiber le développement de bactéries pathogènes et/ou d‟une flore de dégradation de

l‟aliment sont produits par les bactéries lactiques durant la fermentation du lait. Il s‟agit

notamment des acides organiques issus des mécanismes homos et hétéro fermentaires des

bactéries lactiques, de peroxyde d‟hydrogène et des bactériocines produites par quelques

souches lactiques.

III-3 Facteurs d’inhibition des bactéries lactiques

Les inhibiteurs, produits par les bactéries lactiques peuvent être classés en inhibiteurs

non spécifiques ayant un large spectre d‟action et en inhibiteurs plus spécifiques tels que les

bactériocines (Aboura., 2004).

III-3-1 Les inhibiteurs non spécifiques

III-3-1-1 Les inhibitions dues à la production d’acides organiques

Les acides organiques, produits par fermentation dans les aliments, peuvent agir sur la

flore par abaissement du pH mais aussi par une action inhibitrice spécifique (Mathot et al .,

1996).

Effet de l’acidification

La majorité des espèces bactériennes ne peut pas se développer aux pH inferieurs à 4.

Dans les produits fermentés, la baisse du pH dépend du pouvoir tampon du produit, de la

concentration en substrats fermentescibles et du pH limite tolèré par les ferments. Les pH

atteints dans certains de ces produits (saucissons secs : pH= 4,6 à 5,3 ; choucroute : pH= 4,8 ;

yaourt : pH= 4,0) suffisent à provoquer l‟élimination de certains contaminants.

Effets spécifiques

La nature de l‟acide présent dans le milieu influe sur la résistance des microorganismes

face à l‟acidification. Pour des Salmonelles par exemple, des pH minima de croissance varient

de 4,0 avec l‟acide chlorhydrique et l‟acide citrique à 5,50 pour l‟acide propionique ; avec

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Interaction bactérienne

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l‟acide lactique cette limite s‟établit à 4,40. Cet effet inhibiteur spécifique des acides

organiques est généralement attribué à leur forme non dissociée (Mathot et al ., 1996).

D‟après Desmazeaud (1996), en général, c‟est la forme moléculaire (non dissociée) de

l‟acide lactique qui est le facteur toxique pour les bactéries. L‟acide non dissocié pénètre

librement dans la cellule et comme le milieu intérieur est moins acide, il se dissocie en

augmentant la concentration interne en proton, ce qui perturbe certains échanges entre la

cellule et son environnement : pénétration de nutriments, acides aminés en particulier (Mathot

et al., 1996).

III-3-1-2 Les inhibitions dues au peroxyde d’hydrogène

Les bactéries lactiques sont souvent appelées bactéries anaérobies facultatives, mais ce

terme cache une grande variété de comportements de ces germes vis-à-vis de l‟oxygène. Dans

les conditions d‟aérobiose, chez la plupart des bactéries lactiques, les molécules de NAD

réagissent avec l‟oxygène pour former du peroxyde d‟hydrogène (H2O2) ou une molécule d‟eau

grâce à des NADH : H2O2 ou NADH : H2O oxydases. Ce peroxyde d‟hydrogène est plus ou

moins toxique pour la bactérie lactique productrice, notamment dans le cas du lait, dont il est le

constituant d‟un système inhibiteur naturel devant comporter aussi une lactoperoxydase et du

thiocyanate.

Si le lait contient de l‟oxygène dissous, le peroxyde d‟hydrogène produit va activer

l‟oxydation du thiocyanate par la lactoperoxydase, en un intermédiaire oxydé :

l‟hypothiocyanate (Desmazeaud., 1996).

D‟après Choisy et al (1997), ce dernier est généralement bactéricide pour les bactéries

gram-négatif ou bactériostatiques pour les bactéries gram-positif. Il induit une inhibition des

enzymes de la glycolyse, mais aussi des lésions dans la membrane cytoplasmique, ce qui

favorise des fuites d‟ions K+, d‟acides aminés ou de peptides. Comme il peut être bactéricide

pour certaines bactéries de contamination, voir pathogène, la fédération internationale de

laiterie à proposé d‟utiliser les propriétés de ce système inhibiteur pour améliorer la

conservation temporaire du lait cru dans les pays chauds dépourvus d‟équipement de

réfrigération (Desmazeaud., 1996).

III-3-1-3 Autres inhibiteurs non spécifiques

Le diacétyle

Le diacétyle produit par nombre de bactéries lactiques est un inhibiteur actif contre des

nombreux microorganismes dont l‟action inhibitrice est accrue en milieu acide. Les bactéries

Gram négatives sont plus sensibles que les Gram positives (Mathot et al ., 1996).

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Reutérine

C‟est une substance produite par Lactobacillus reuteri. Son action inhibitrice s‟exerce

sur un large spectre de microorganismes Gram négatifs et positifs (Salmonella, Listeria,

Staphylococci…) (Mathot et al ., 1996).

III-3-2 Les inhibiteurs spécifiques « Les bactériocines »

III-3-2-1 Définition

Les bactériocines sont définies comme étant des molécules de nature protéique,

synthétisées par voie ribosomale par des bactéries et présentant une action antibactérienne

contre des souches distinctes de la souche productrice. Cette dernière est protégée contre les

bactériocines qu‟elle produit par la synthèse d‟une protéine dite d‟immunité (Morisset et al .,

2005).

D‟après Léonil et Lortal (2006), les bactéries lactiques libèrent plusieurs substances de

nature peptidique au cours de la fermentation du lait, grâce à leur équipement enzymatique

constitué de protéases et de peptidases.

Chez les Lactocoques par exemple, c‟est la nisine (produite par certaines souches de

Lactococcus lactis subsp. lactis) qui est la bactériocine la mieux décrite. Elle présente la

caractéristique d‟inhiber différentes bactéries à Gram positif, notamment des Clostridiums et

des Bacillus (Desmazeaud., 1996).

III-3-2-2 Classification des bactériocines

La classification actuelle est fondée sur la taille et le fait que les bactériocines font

l‟objet ou non de modification post-traductionnelles (classification proposée par

Klaenhammer en 1993) (Cenatiempo et al ., 1996). (Tab.13)

Classe I Ŕ Lantibiotiques

Il s‟agit de peptides de taille réduite (< 5 KDa), contenant des acides aminés inhabituels

obtenus par modification post-traductionnelle dont le plus caractéristique est la lanthionine.

Pour souligner la présence de ce type d‟acides aminés, les bactériocines de classe I ont été

nommées Lantibiotiques pour « Lanthionine containing antibiotics ». La structure des

lantibiotiques varie essentiellement en fonction de la localisation de ponts établis entre les

acides aminés modifiés, ce qui permet de distinguer les types A (lantibiotiques linéaires) et B

(lantibiotiques globulaires). La nisine est considérée comme l‟archétype des lantibiotiques de

type A et elle est actuellement le seul peptide antibactérien à être utilisé comme additif

alimentaire, et récemment a été proposée comme alternative aux antibiotiques (Morisset et al .,

2005).

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Classe II Ŕ Peptides de faible poids moléculaire (non antibiotiques)

Cette classe est constituée de petites bactériocines (<10KDa) thermorésistants et sans

modification post-traductionnelle. Ces bactériocines agissent principalement en perméabilisant

la membrane de la cellule cible.

Cette catégorie est la plus largement représentée avec plus de 50 bactériocines

caractérisées, ce qui a conduit à la création de trois sous classes :

La sous-classe IIa regroupe des peptides ayant une structure similaire et généralement

une activité contre Listeria monocytogènes ;

La sous- classe IIb regroupe les bactériocines à deux composants ;

La sous- classe IIc regroupe des peptides variés. (Morisset et al ., 2005).

Classe III Ŕ Peptides de haut poids moléculaire

Ces peptides d‟un poids moléculaire supérieur à 30 KDa se caractérisent par leur faible

thermo résistance. Ils sont en effet détruits par un chauffage de 10 à 15 min à 60°C. Ils sont

produits principalement par des souches de lactobacilles homofermentaires (avec une majorité

de thermophiles). (Mathot et al ., 1996).

Classe IV Ŕ Bactériocines complexes

Les bactériocines de classe IV étaient définies comme des protéines associées à une

composante non protéique, lipidique et/ou oligosaccharidique, nécessaires à leur activité

biologique. Cette classe présentée par Klaenhammer (1993), aujourd‟hui n‟est pas prise en

compte par de nombreux auteurs (non reconnue véritablement) (Morisset et al ., 2005).

Tableau 13. Classification des bactériocines de bactéries lactiques

d‟après Morisset et al ., 2005

Classes Sous-catégories

Classe I : antibiotiques Type A : molécules linéaires

Type B : molécules globulaires

Classe II : bactériocines non-modifiées

thermostables

Classe IIa : anti-Listeria

Classe IIb : bactériocines à deux composants

Classe IIc : autres bactériocines

Classe III : bactériocines de grande taille,

sensibles à la chaleur

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III-3-2-3 Mode d’action des bactériocines

Toutes les bactériocines de bactéries lactiques, dont le mode d‟action a été étudié,

agissent de façon similaire en formant des pores dans la membrane plasmique des cellules

cibles (Cenatiempo et al ., 1996). (Fig.16)

Selon Desmazeaud et al. (1994), le mode d‟action des bactériocines se situe au niveau

membranaire, en modifiant le potentiel de la membrane grâce à une structure alternante

hydrophile et hydrophobe qui permet à ces peptides de s‟insérer dans la membrane des

bactéries cibles et y former des pores. Ce qui entraine des fuites d‟ATP et d‟ions K+ et par

conséquent l‟impossibilité pour ces cellules cibles de maintenir leur pH intracellulaire.

Figure 16. Mode d‟action des bactériocines d‟après Drider., 2005

Les lantibiotiques

Les lantibiotiques interagissent avec la membrane cellulaire par des interactions

électrostatiques ou par liaison à des récepteurs spécifiques tels que le lipide II (undecaprenyl-

pyrophosphoryl-MurNAc-pentapeptides-GlcNAc), un précurseur de peptidoglycanes. Suite à

cette liaison, les lantibiotiques peuvent former des pores larges et non spécifiques dans la

membrane cytoplasmique, ce qui va causer l'efflux rapide des petits composés cytoplasmiques

tels que les ions, les acides aminés, l'ATP, etc. Cette augmentation de la perméabilité

membranaire va conduire à la dissipation des deux composantes de la force proton motrice, à la

cessation rapide des activités cellulaires et à la mort de la cellule. L'interaction avec le lipide II

permet d'augmenter la stabilité des pores formés et de réduire la concentration du lantibiotique

nécessaire à la formation des pores, mais peut également conduire à l'inhibition de la synthèse

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Interaction bactérienne

22

de la paroi cellulaire (McAuliffe et al., 2001 ; Twomey et al., 2002 ; Bauer et al., 2005 ;

Patton et al., 2005).

Les lantibiotiques de type A dissipent la force proton-motrice par formation de pores et

interfèrent avec la synthèse des peptidoglycanes alors que la plupart des lantibiotiques de type

B agissent par inhibition de la synthèse des peptidoglycanes. Néanmoins, certains forment

également des pores dans la membrane des cellules cibles (Bauer et al., 2005; Patton et al.,

2005). La nisine, un lantibiotique de type A, interagit avec le lipide II au niveau du MurNAc

tandis que la mersacidine, un lantibiotique de type B, interagit avec le GlcNAc du lipide II

(Willey et al., 2007).

Les lantibiotiques composés de deux peptides comme la lacticine 3147 agissent

également par formation de pores dans la membrane des cellules cibles (McAuliffe et al.,

2001). La lacticine 3147 a un spectre d'action large. Le peptide A1 a une activité qui est plus

élevée en présence du peptide A2. Il a été récemment proposé que la lacticine 3147 A1 agit en

se liant au lipide II, inhibant la synthèse des peptidoglycanes et permettant à la

lacticine 3147 A2 de former un pore dans la membrane de la cellule cible (Morgan et al.,

2005 ; Wiedemann et al., 2006).

Les bactériocines de classe II

Le mécanisme d'action supposé des bactériocines de classe IIa est l'interaction de la

bactériocine avec la membrane ou un récepteur spécifique, la « mannose perméase », pour

ensuite former un pore dans la membrane de la cellule, ce qui induit la perméabilisation de la

membrane, la dissipation des deux composantes de la force proton motrice et la mort de la

cellule (Bauer et al., 2005). Le mécanisme de formation des pores n'est pas connu, même si

l'hypothèse la plus courante est l'association de différentes molécules de la bactériocine (Diep

et al., 2007).

Les bactériocines de classe IIb ont en général un spectre d'action inhibant une large

gamme de bactéries Gram+. Elles forment des pores et rendent la membrane perméable à

différentes petites molécules, des cations monovalents ou des anions, ce qui dissipe une ou les

deux composantes de la force proton motrice. Les ions transportés sont spécifiques de la

bactériocine (Oppegard., 2007). Le ratio optimal d'activité entre les deux sous-unités est en

général de 1:1 mais il est de 4:1 pour la lactocine 705 (Castellano et al., 2007 ; Oppegard.,

2007). Néanmoins, les mécanismes d'interaction des deux bactériocines entre elles et avec la

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Interaction bactérienne

21

membrane cellulaire ne sont que très peu connus. Il a été montré qu'il n'y avait pas de liaison au

même récepteur que pour les bactériocines de classe IIa (la « mannose perméase ») (Diep et

al., 2007). Castellano et al., (2007) ont récemment montré que les deux peptides composant la

lactocine 705 ont des activités bien spécifiques. La lactocine 705α interagit avec la surface de

la membrane cellulaire et la déshydrate, ce qui permet à la lactocine 705β de former des pores.

Les bactériocines de classe III

Le mode d'action de ces bactériocines diffère complètement des bactériocines des autres

classes. En effet, l'enterolysin A, la zoocin A et la millericin B agissent par l'hydrolyse des

liens peptidiques des peptidoglycanes des cellules sensibles. La zoocin A a un spectre d'action

étroit alors que l'enterolysin A et la millericin B ont un spectre d'action large. L'helveticin J a

un mode d'action bactéricide (Nilsen et al., 2003).

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Matériel et Méthodes

57

I-Matériel et Méthodes

I-1 But de travail

Le but de notre travail expérimental est résumé en trois parties :

Isolement et Identification d’Helicobacter pylori, responsables de certaines maladies

gastro-duodénales.

Pré identification des bactéries lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ 447,

Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum

CUETM 89/29 et la réalisation d‟un test d‟antagonisme in vitro afin de démontrer

l‟inhibition Helicobacter pylori par les bactéries lactiques.

Etudier l‟effet de Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 sur Helicobacter pylori in

vivo.

I-2 Lieu et période de travail

Le travail a été réalisé dans les laboratoires suivants :

Le laboratoire de microbiologie, Université Ibn Khaldoun, Tiaret. Algérie.

Période du 01/03/2011 au 30/05/2011.

Le laboratoire Zootechnique, Université Ibn Khaldoun, Tiaret. Algérie.

Période du 01/03/2013 au 05/06/2013.

Le centre national de référence des campylobacters et Helicobacters, laboratoire de

bactériologie Hôpital Pellegrin Bordeaux 2. France.

Période du 06/02/2010 au 28/02/2010.

Le laboratoire de génétique et biologie moléculaire, Université Bordeaux 2. France

Période du 28/01/2014 au 13/02/2014.

I-3 Matériel

I-3-1 Matière biologique

Les biopsies gastriques

Proviennent du laboratoire de Bayoune de lyon-France Reçu le 05/02/2010 au

laboratoire de bactériologie de l‟hôpital Pellegrin Bordeaux–France.

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Matériel et Méthodes

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Les bactéries lactiques

Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus bulgaricus CNRZ 449 et

Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 sont des souches de références du centre INRA de

Rennes- France.

Lapins

L‟expérimentation a été réalisée sur des lapines de même âge (1-3mois), pesant entre

400-990 g au début de l‟expérimentation. Les animaux mis individuellement dans des cages

métalliques ont été maintenus dans l‟animalerie de la faculté des Science de la Nature et de

la Vie, université IBN KHALDOUN –Tiaret, bien aérée, La nourriture et l‟eau sont

distribuées et le nettoyage des cages est assuré tous les matins voir Fig. 17.

Figure 17. Lapines dans l‟animalerie

I-3-2 Appareillage et verreries

Agitateur magnétique thermique IKA, LAMBO TECHNIK ;

Balance analytique SARTORIUS ;

Bain marie : MEMMERT type WB7;

Bec bunsen ;

Etuve : MEMMERT type 430;

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Matériel et Méthodes

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Microscope optique : Zeiss (west Germany) ;

Spectrophotomètre à UV, BAUSCH & LOMB, Spectronic 70 (λ = 560nm);

PH mètre : MA 5730 (IsKra) ;

Centrifugeuse ;

Autoclave, réfrigérateur, glacière ;

Pipettes graduées, pipettes Pasteur et micropipettes ;

Tubes à essais, boites de pétris, anse de platine, béchers, burette ;

Barreau magnétique, cloche du Durham ;

Lames et lamelles.

I-3-3 Produits chimiques

Ethanol 95% ;

Eau Distillée ;

Eau physiologique, eau peptonée, TSE, eau oxygénée H2O2 ;

Acide chlorhydrique (HCL) concentré ;

Solution de soude NAOH 0,1N.

I-3-4 Indicateurs de couleurs

Bleu de méthylène en solution, violet de gentiane, lugol, fuschine,

BCP (Bromo-crésol-pourpre), phénophtaléine ;

L‟huile à immersion, l‟huile de paraffine.

I-3-5 Autres produits

Les sucres : glucose, saccharose, mannose et lactose

Peptone, NACL, agar

Papier aluminium, papier hygiénique, étiquettes et scotch

Les antibiotiques.

I-3-6 Milieux de culture

Ce travail expérimental a nécessité l‟utilisation de plusieurs milieux de culture :

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Matériel et Méthodes

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Milieu gélose au sang et colombia pour l‟isolement et l‟identification d’Helicobacter

pylori.

Milieu MRS (Selon Man, Rogoza et Sharpe) : milieu nutritif destiné à l‟enrichissement,

la culture et à l‟isolement de toutes les espèces de Lactobacillus

Milieu M17 (Selon Terzaghi et Sandine) : milieu utilisé pour l‟isolement et la culture

des Streptococcus lactiques ;

Milieu de MUELLER HINTON : milieu non sélectif pour l‟étude de la sensibilité ou la

résistance des germes pathogènes envers les antibiotiques et pour l‟étude

du test de l‟antagonisme ;

Gélose nutritive et Bouillon nutritif : utilisé pour la croissance des germes

Milieu citrate de Simmons : milieu synthétique de différenciation des Entérobactériacées

sur la base de leur métabolisme du citrate présent comme source de carbone ;

Mannitol mobilité : milieu de recherche simultanément la mobilité et l‟utilisation du

mannitol ;

Milieu TSI (triple sugar iron.): permet de mettre en évidence la fermentation du lactose ou

de glucose, du saccharose et la production d‟hydrogène sulfuré.

La composition des milieux de culture est indiquée dans l’annexe III.

I-3-7 Matériel utilisés au laboratoire de Zootechnologie

Matériel de dissection

-Scalpel.

-Pince.

-Paire de ciseaux.

-Planche à dissection.

-Epinglse.

-Microtome.

Autre produits

-Hématoxyline.

-Eosine (0.1%).

-Eau gélatinée 0.2%.

-Baume de Canada.

-Lames et lamelles.

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Matériel et Méthodes

12

I-4 Méthodes

I-4-1 Protocole expérimental Globale

Les principales étapes d‟analyse effectuées dans notre étude expérimentale sont

résumées dans un protocole qui est présenté dans la fig. 18.

Figure 18. Protocole expérimental

Bactéries lactiques

référencieés sous formes

lyophilisées

La souche pathogène

H.pylori

Ensemencement dans les

milieux sélectifs

Isolement à partir de

biopsies gastriques (Fig.

24)

Pré identification des bactéries lactiques

Test de l’antagonisme Le pouvoir antimicrobien des souches lactiques isolées sur H.

pylori. Méthode de diffusion par disques sur le milieu Mueller-Hinton

Agar (Fig. 23)

La recherche de bactériocines

(Fig. 24)

Identification biochimiques et

génétique de la bactérie (Fig. 19)

Eude in vivo des effets prébiotique

des bactéries lactiques (Fig. 25)

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Matériel et Méthodes

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I-5 Etude bactériologique Helicobacter pylori

I-5-1 Isolement et identification de Helicobacter pylori

On reçoit les échantillons du laboratoire de Bayoune de lyon-France, sous deux

formes soit la souche bactérienne de H. pylori dans des tubes de gélose soit un fragment de

biopsie gastrique écrasé et dans les deux cas, nous suivons le protocole suivant :

Arrivée des échantillons

La souche dans un tube de gélose un fragment de biopsie écrasée

Repiquage sur milieu TSH avec écouvillon Incubation 10 jours sur

et transférer dans des tubes de Perston milieu Biomérieux

Poussé Observation et dénombrement des colonies

J 1 : et de 3gouttes de suspension de brucella sur un filtre

Abs de poussé Ré incubation 37 °C / 24 h (micro aérobiose)

Poussé repiquage sur milieu pylori et gélose de sang

J 2 :

Abs de poussé Ré incubation 37 °C / 24 h (micro aérobiose)

Poussé faire les tests (Gram, oxydase, catalase, DNAse et

J 3 : antibiogramme)

Abs de poussé Résultat négatif

Lecture des résultats et conservation des souches dans des

J 4 : tubes de glycérolé peptone à 4°C

Conservation des souches pour le light cycler

J 5 : Identification génétiques

Figure 19. Le protocole expérimental de l‟isolement et identification D‟ Helicobacter pylori

d‟après Mégraud., 2004

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Matériel et Méthodes

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I-5-2 Examens bactériologiques

I-5-2-1 La culture

Helicobacter pylori est une bactérie exigeante (Lamouliatte et al., 1992 ; Mégraud.,

1992). Sa culture exige des milieux de cultures enrichis additionnés de sang (Fauchère et

Rosenau., 1991 ; Sobhani et al., 1995).

Pour son isolement la biopsie gastrique des patients est broyée dans 1 ml de bouillon

cœur-cervelle à l‟aide d‟un mortier stérile de manière à libérer les bactéries, puis ensemencer

dans un milieu non sélectif au sang cuit, la gélose pylori et la gélose Colombai (Lamouliatte

et al., 1992 ; Mégraud., 1994). Ce dernier contient un mélange spécifique d‟antibiotique

destiné à inhiber la croissance d‟éventuel contaminant (Fauchère et Rosenau, 1991 ;

Lozniewski., 1996). Notons que, le milieu non sélectif est utilisé en raison d‟une inhibition

possible de H. pylori par le mélange d‟antibiotiques (Lozniewski., 1996).

Les boites sont incubées aussitôt ensemencées dans une jarre en atmosphère

microaérobie (en utilisant les systèmes Campy pack) à 37°C pendant 5 à 7 jours (Mégraud,

1994 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Mégraud., 1996). L‟atmosphère est renouvelée au moins

tous les deux jours pour avoir une croissance optimale (Mégraud., 1989 ; Fauchère et

Rosenau., 1991 ; Mégraud., 1994).

I-5-2-2 Identification

L‟identification est basée sur la détermination des caractères morphologiques et

biochimiques (Mégraud., 1994 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Mégraud., 1996).

a- Examen macroscopique

La morphologie des colonies et leur dimension sont étudiées à partir des cultures

obtenues sur les milieux suivants : la gélose Colombai et la gélose chocolat (Lamouliatte et

al., 1992 ; Fauchère et Rosenau., 1991).

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b- Examen microscopique

Il a été effectué sur un frottis bactérien, préparé à partir des colonies suspectes en

cultures pures, puis fixé et coloré par la méthode de Gram. (Annexe IV)

I-5-3 Tests biochimiques

L‟étude des caractères biochimiques est basée essentiellement sur la recherche

d‟oxydase, de catalase et d‟uréase, car leurs positivités confirment qu‟il s‟agit bien de H.

pylori (Sobhani et al., 1995 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Mégraud., 1992 ; Fauchère et

Rosenau., 1991) et nous avons utilisé des galeries spécifiques, en plus du reste des tests

biochimiques.

Recherche de l’uréase

La recherche d‟une uréase consiste à constater l‟alcalinisation d‟un milieu contenant

de l‟urée par la formation d‟ammoniac. A partir d‟une culture pure sur milieu Mueller-

Hinton, nous avons préparé une suspension dense dans 0,5 ml de milieu urée-indole. La

préparation est ensuite incubée à 37°C sous les conditions de la microaérobiose pendant 24

heures. Le résultat étant positif se traduit par un virage de l‟indicateur du jaune au rouge

violacé ou au rose rouge (Marchall et Goodwing., 1991).

Recherche de la catalase

La catalase a la propriété de décomposer l‟eau oxygénée H2O2 (composé toxique pour

la bactérie) en oxygène (sous forme gazeuse) et en molécule d‟eau (Marshall., 2004).

Le test consiste à déposer sur une lame une goutte d‟eau oxygénée à 10 volumes et à y

dissocier directement un peu de la culture prélevée sur milieu Muller-Hinton (Marshall et al.,

1991). Il est souhaitable de proscrire toute recherche de catalase sur gélose au sang (causes

d‟erreur) du fait de la présence de cette enzyme dans le sang, le dégagement de bulles de gaz

indique la présence de la catalase (Marshall et al., 1991).

Recherche de l’oxydase

Le cytochrome oxydase assure la fixation de l‟oxygène moléculaire sur le cytochrome

réduit. La recherche de cette enzyme est faite en utilisant des disques commercialisés « ox »,

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Matériel et Méthodes

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imprégnés d‟oxalate de N-dimethyl paraphrénie diamine (Diagnostic Pasteur, BioMerieux),

oxydé par le cytochrome C, se transforme en composé violet foncé (Marchall., 1996).

Le disque « ox » est déposé sur une lame propre et imbibé avec une goutte d„eau

distillée stérile. Une colonie est prélevée à partir milieu Muller-Hinton à l‟aide d‟une pipette

pasteur puis déposer sur le disque. La réaction d‟oxydase ne doit pas être recherchée à partir

de cultures sur gélose au sang (oxydase faussement positive). En présence de l‟oxydase (le

cas de bactéries oxydase positive), la coloration violet foncé apparaît immédiatement ou en

quelque secondes, puis noircit (Rose violette puis elle devient brun foncé) (Marchall et

Warren., 1983).

Pour plus de précision dans l‟étude biochimique nous avons utilisé des galeries API

20 Campylo pour H. pylori selon la technique suivante (Fig. 20)

Figure 20. L‟étude biochimique sur des galeries (API 20 Campy)

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Matériel et Méthodes

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I-5-4 Antibiogramme

La culture permet aussi d‟étudier la sensibilité des souches aux antibiotiques (Riachi

et Colin 1995 ; Lozniewski., 1996 ; Mégraud., 1994). Cette sensibilité a été testée par la

méthode de diffusion (méthode de disques) sur milieu Muller-Hunton en utilisant les

antibiotiques suivants : Amoxicilline - Pénicillines Chloramphénicol – Gentamicine -

Furanne - Ac.nalidixique – Sulfamide Trimethoprime – Métronidazole - Erythromycine –

Tobramycine - Tetracyline-Vancomycine - Cefsulodine.

Les boites sont ensemencées par une suspension bactérienne contenant 104 UFC/ml,

ajustée par l‟étalon 4 de Mc Ferland, sur lesquelles sont disposés les disques d‟antibiotiques.

L‟incubation s‟effectue à 37°C pendant 72 heures en micro aérobiose (Lamouliatte et

al., 1992 ; Mégraud., 1992).

La lecture des résultats s‟effectue par la mesure des diamètres de la zone d‟inhibition

apparue.

I-5-5 Purification

Après leur isolement et identification, les colonies obtenues sont repiquées et purifiées

sur le milieu gélose au chocolat, puis incubées à 37°C pendant 72 heures en micro aérobiose.

L‟opération de la purification par stries est répétée deux fois jusqu'à l‟obtention de souches

pures.

IV-5-6 Détection de Helicobacter pylori et détermination de la résistance à la

clarithromycine par PCR en temps réel

Préparation des ADN

L‟extraction d‟ADN selon le type de prélèvements (biopsies gastriques, souche

bactérienne, selles ou LCR) est effectuée en amont. Avant toute manipulation, il faut apporter

les extraits d‟ADN à l‟aide d‟un gant à usage unique jusqu‟à la salle « Dépôt des Acides

Nucléiques », et les mettre dans la boîte notée.

Préparation du Mix PCR

La préparation du mix s‟effectue dans la pièce « Pré-PCR MIX ». Le port d‟une blouse

bleue et de gants est exigé.

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Décontaminer la hotte dédiée pour la bactériologie avec un désinfectant (surfanios).

Mettre un tube vide (pour le mix), un tube d‟eau et un tube de MgCl2 disponibles dans le kit

« LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe » (voir EXT-LAB-066) (congélateur 771,

bac numéro 9) et les laisser ouverts sous UV durant 15 minutes.

Après les 15 minutes de décontamination, réaliser le mix PCR sous la hotte selon le

protocole suivant en fonction du nombre d‟échantillon N :

Le mix FastStart nécessite une préparation au préalable, en mélangeant le tube 1a avec le

tube 1b disponibles dans le kit « LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe ».

Lorsque les amorces et/ou sondes (voir EN-LAB-110) sont réceptionnées, elles sont

généralement sous forme lyophilisée. Les sondes doivent être impérativement conservées à

l‟abri de la lumière.

Tableau 14. Préparation du Mix PCR

Pour reprendre les amorces ou les sondes lyophilisées, il faut au préalable centrifuger

rapidement le tube avant de reprendre les amorces ou la sonde en suspension. Il faut ensuite

utiliser de l‟eau « UltraPure™ DNase⁄RNase-Free Distilled Water » pour reprendre les

amorces en solution à une concentration finale de 100 µM.

Exemple de calcul pour une quantité d‟amorce ou de sonde de 48,7 nmol : pour

obtenir une concentration de 100 µM, ajouter 487 µl d‟eau.

Avant de diluer les amorces ou sondes pour la préparation du mix, bien homogénéiser

la solution mère à l‟aide du Vortex et centrifuger rapidement. Diluer ensuite à 20µM : mettre

10 µl de la solution à 100 µM dans 40 µl d‟eau « UltraPure™ DNase⁄RNase-Free Distilled

Water ». Avant de quitter la salle, décontaminer, mettre la hotte sous UV 30 minutes.

Pour 1 échantillon

(µl)

Pour 9+1 échantillons

(µl)

Eau 4,98 4,98 x 10 = 49,8

MgCl2 25mM 0,66 6,6

Amorce 1 : HPY S 20µM 0,20 2

Amorce 2 : HPY A 20µM 0,20 2

Sonde 1 : Hpy RED 20µM 0,08 0,8

Sonde 2 : Anchor FL 20µM 0,08 0,8

Mix FastStart 10x 0,8 8

Total Mix 7,0 70

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Matériel et Méthodes

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Dépôt des Acides Nucléiques

Décontaminer la paillasse au surfanios. Prendre un bloc réfrigéré et le remplir du nombre

de capillaires nécessaires (suivre l‟ordre des numéros).

Répartir 7µl de mix dans chaque capillaire et boucher immédiatement le témoin

négatif. Déposer 1µL d‟ADN dans les capillaires correspondants (vortexer avant chaque

dépôt) et fermer chaque capillaire. En dernier, déposer les témoins positifs. Des extraits

d‟ADN de biopsies positives pour H. pylori sensible « WT » et résistants « A2142/3G » et

« A2142C » sont disponibles. Décontaminer la paillasse au surfanios.

Amplification par PCR en temps réel

Récupérer un rotor à bague de couleur noire et l‟amener auprès du bloc froid resté à l‟entrée

de la pièce. Disposer les capillaires dans le rotor, et appuyer sur chaque capillaire pour

l‟insertion complète dans le rotor. Poser le rotor dans un carrousel gris.

Centrifuger à l‟aide de la centrifugeuse spécifique. Vérifier ensuite que le volume est

identique dans chaque capillaire.

Utilisation du logiciel

Ouvrir le logiciel Light Cycler version 3.5

I-5-7 Test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1)

Helico Blot 2.1 est un test sérologique de Western Blot de lysat bactérien d‟une

souche d‟H. pylori provoquant des ulcères. Les protéines sont séparées par électrophorèse et

transférées sur bandelette de nitrocellulose. L‟antigène recombinant est également appliqué

sur la membrane. Les bandelettes de nitrocellulose sont incubées individuellement avec les

échantillons dilués de sérum et des contrôles. Les anticorps spécifiques des différents

antigènes s‟ils sont présents dans l‟échantillon, se fixent sur les antigènes de H. pylori

présents sur les bandelettes. Les anticorps fixés spécifiquement sont visualisés grâce à une

série de réactions avec des anticorps anti IgG conjugués de la phosphatase alcaline et le

substrat de BCIP/NBT. Cette méthode permet de différencier la réactivité à chacun des

antigènes de H. pylori. (MP Diagnostique, 2014) (Annexe VI). Ce test a été utilisé pour

confirmer la présence des anticorps dans le sérum chez 16 patients. (Fig. 21 et 22)

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Matériel et Méthodes

16

Figure 21. Test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1)

Figure 22. Les bandelettes de nitrocellulose

I-5-8 Conservation des souches

Etant donné que H. pylori est une bactérie fragile, sa conservation à long terme n‟est

pas possible à 20°C (Mégraud., 1994). Pour cela et selon des données littéraires, la

conservation des souches de H. pylori a été effectuée à court terme (une semaine). Les

souches obtenues sur le milieu gélose au chocolat sont conservées à 4°C sous les conditions

de la micro aérobiose ou dans des épindoff qui contient 0,5 ml de glycérol peptone

(Mégraud., 1989 ; Mégraud., 1994).

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72

I-6 Interaction bactérien

I-6-1 Purification et Conservation

La purification des souches précédentes s‟effectue par 4 repiquages successifs dans les

milieux MRS et M17 solides et liquides.

Les bactéries lactiques purifiées ont été ensemencées dans des tubes de gélose M17et

MRS inclinée, ensuite incubées à 37°C pendant 18h puis conservées à 4°C.

I-6-2 Pré identification

I-6-2-1 Etude morphologique

Etude macroscopique

Consiste à étudier la forme, l‟aspect, le contour, la surface, la couleur des colonies

sur le milieu M17 et le milieu MRS.

Etude microscopique

Coloration de Gram

Les souches lactiques dans notre travail (Sc. thermophilus, Bf. bifidum et Lb.

bulgaricus) ont subi une coloration de Gram, afin de déterminer la morphologie des cellules

bactériennes et leur disposition. Mais aussi pour reconnaître le caractère de Gram positif ou

négatif de ces bactéries.

IV-6-2-2 Etude physiologique

Mobilité

Le test de mobilité a été vérifié dans le milieu Mannitol mobilité, qui permet de

rechercher la mobilité et la fermentation du mannitol par les bactéries.

Sa technique consiste à ensemencer par piqure centrale dans le milieu mannitol

mobilité des colonies à partir d‟une culture en milieu solide ou liquide et d‟incuber 24h à

37°C.

Lecture : Si la bactérie est mobile, elle diffuse à partir de la ligne d‟ensemencement en

créant un trouble du milieu. Si elle est immobile, elle croit uniquement le long de la piqure

(Marchall et Goodwin., 1991).

I-6-2-3 Etude biochimique

Test de catalase

La catalase est une enzyme présente chez la plupart des bactéries aérobies strictes et

anaérobies facultatives. Elle décompose l‟eau oxygénée formée en eau et en oxygène qui se

dégage. Pour mettre en évidence cette enzyme, on émulsionne sur une lame stérile un peu de

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Matériel et Méthodes

72

la colonie suspecte dans une goutte d‟eau oxygénée. Le dégagement de bulles de gaz indique

la présence de la catalase : test catalase + (Delarras., 2007).

Test oxydase

L‟oxydase est une enzyme présente dans certaines chaînes respiratoires

cytochromiques bactériennes. La recherche de cette enzyme consiste à déposer sur une lame

stérile, un disque « Ox » et l‟imbiber avec une goutte d‟eau distillée. Ensuite, prélever une

partie de la colonie à étudier et l‟étaler sur le disque. Une coloration violet foncé apparaît

immédiatement sur le disque puis vire au noir : test oxydase+ (Delarras., 2007).

IV-6-2-4 La diminution du pH par les bactéries lactiques

Afin de démontrer l‟acidité provoquée par les bactéries lactiques, on a suivi la variation

du pH dans les deux milieux MRS et M17 liquide.

Les pH initial et final ont été mesurés à l‟aide d‟un pH mètre type MA 5730.

- Le pH initial correspond au pH du bouillon M17 ou du bouillon MRS sans inoculum (sans

bactérie).

- Le pH final est le pH mesuré après l‟incubation de chacune des souches lactiques cultivée

dans le bouillon M17 ou le bouillon MRS spécifique a sa croissance pendant 48 heures à

37ºC.

I-6-3 Test de l’antagonisme

I-6-3-1 Préparation des prés cultures

Pour réaliser le test d‟antagonisme, il faut avoir des pré cultures des souches lactiques

et la pré culture de la souche indicatrice (pathogène).

Á partir des tubes inclinés de gélose MRS et M17, nous avons ensemencé chacune

des deux souches lactiques isolées dans un tube à essais contenant 5 ml du bouillon approprié

(bouillon MRS ou bouillon M17). Le tube est incubé à 37ºC pendant 18 heures en

anaérobiose.

Alors que la souche indicatrice H. pylori a été ensemencées dans un tube de bouillon

nutritif et incubée à 37ºC pendant 18 heures.

I-6-3-2 Détection de l’activité antagoniste des bactéries lactiques (in vitro)

De nombreuses méthodes de détection de l‟activité antimicrobienne des bactéries

lactiques ont été utilisées. Leur principe est basé sur la diffusion de l‟agent antimicrobien

dans un milieu de culture solide ou semi-solide pour inhiber la croissance d‟un micro-

organisme indicateur sensible (Achemchem et Abrini., 2005). Pour mettre en évidence

l‟activité antimicrobienne des deux souches lactiques isolées, nous avons utilisé la méthode

de diffusion en puits (Schillinger et Lucke, 1987 ; Allouche., 2004).

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Matériel et Méthodes

70

Méthode de diffusion par disques

Un volume du milieu Mueller-Hinton agar au sang est coulé dans des boites de Pétri

vides et stériles. À l‟aide d‟une cloche de Durham préalablement stérilisée, on réalise deux à

trois puits par boites de Pétri d‟environ 5 mm de diamètre avant que le milieu soit très solide.

Après solidification du milieu, les boites sont ensemencées en surface par la suspension de la

souche pathogène H. pylori, puis les disques stériles de Bio Mérieux sont imprégnées par 60

à 80 µl de surnageant filtré (environ 2 gouttes à l‟aide d‟une seringue jetable stérile), obtenu

après centrifugation à 4 000 tours / min pendant 15 min du bouillon MRS ou M17 cultivé

avec la souche lactique appropriée (Sc. thermophilus dans le bouillon M17 et Lb. bulgaricus

et Bf. bifudum dans le bouillon MRS) (Labioui et al ., 2005). (Fig. 23)

La diffusion des agents antimicrobiens dans le milieu gélosé est améliorée par une

incubation des boites à 37°C pendant 24 heures. L‟activité antimicrobienne se révèle par

l‟apparition de zones d‟inhibition autour des puits (Achemchem et Abrini., 2005).

Les diamètres des zones d‟inhibition apparaissant autour des puits seront mesurés, le

résultat est positif si le diamètre de la zone d‟inhibition est supérieur de 2mm (Tabak., 2007).

La mesure du diamètre d‟inhibition Zi est effectuée selon la formule suivante

Dans la majorité du temps les ferments lactiques sont en culture mixte. C‟est-à-dire en

association, comme dans le cas de plusieurs produits laitiers (Yaourt, fromage,…). Pour cette

raison nous avons fait l‟interaction entre le mélange des deux souches lactiques isolées avec

chacune des deux souches pathogènes.

Donc, notre souche pathogène a trois tests d‟antagonisme :

H.pylori + Streptococcus thermophilus

H.pylori + Lactobacillus bulgaricus

H.pylori + Bifidobacterium bifidum

Zi en (mm) = diamètre de la zone d’inhibition obtenue (mm) Ŕ diamètre du disque (6 mm)

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Matériel et Méthodes

70

Les souches lactiques

(Streptococcus thermophilus ,

Bifidobacterium bifidum et

Lactobacillus bulgaricus)

purifiées et conservées.

Ensemencement de Sc.

thermophilus dans le

bouillon M17 et de Lb.

bulgaricus , Bifidobacterium

bifidum dans le bouillon

MRS

Incubation à 37ºC

pendant 18h

Centrifugation 4 000 trs/

min pendant 15 min

Récupération du

surnageant

Culot

La souche pathogène H.pylori

purifiée et conservée.

Préparation de la

suspension bactérienne La

souches pathogène H.pylori

Incubation à 37°C

pendant 18h

Ensemencement en surface de

0,1 ml de la suspension

bactérienne sur le milieu

Mueller Hinton agar contenant

trois puits.

Imprégner les disques

environ 2 gouttes du

surnageant

Incubation à 37ºC

pendant 24h

Apparition de zones

d’inhibition au tour

des puits

Mesure du diamètre des

zones d’inhibition.

Figure 23. Protocole expérimental de la méthode de diffusion par disques

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Matériel et Méthodes

74

I-6-4 Recherche des agents d’inhibitions (bactériocines)

Les bactéries lactiques peuvent produire des substances inhibitrices différentes des

bactériocines. Pour s‟assurer de la présence de ces dernières, nous avons pris une culture

jeune de 18 heures de la souche lactique Bf. bifidum qui a été cultivée ensuite dans 50 ml de

bouillon MRS modifiée approprié et incubée à 37°C pendant 18 h.

Après l‟incubation, les tubes ont été centrifugés à 4 000 tours / min afin de récupérer

le surnageant. Pour éliminer l‟effet des acides organiques notamment des acides lactique et

acétique, le surnageant a été neutralisé à un pH = 7 par l‟ajout d‟une solution de NaOH 0,1 N

en présence d‟une goutte d‟une solution méthanoïque de phénophtaléine à 1% utilisée comme

indicateur coloré (Labioui et al ., 2005).

Un tube de pré culture de la souche pathogène (souche pathogène ensemencée dans le

bouillon nutritif et incubée à 37ºC pendant 18h a été préparée avant. La mesure de la

croissance bactérienne de la souche pathogène est réalisée par la mesure de la densité optique

toutes les deux heures.

Pendant la 6ème heure, on ajoute 1ml du surnageant neutralisé dans le tube et on

termine la mesure de la densité optique jusqu‟à 12 heure (Fig. 24).

La courbe DO = f (t) peut être tracée.

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Matériel et Méthodes

72

Les tubes troublés sont ensemencés (Le bouillon MRS)

Récupération du surnageant

Neutralisation du surnageant à un pH= 7 par une solution de NaOH (0,1N)

Deux tubes de préculture pour chaque souche pathogène sont préparés avant ;

Mesure de la croissance bactérienne des deux souches pathogènes par la mesure de

la densité optique «DO» chaque 2 heures ;

L’ajout du surnageant neutralisé à un des 2 tubes à la 6ème heure ;

La mesure de la DO est suivie jusqu'à la 12ème heure.

Obtention d’une courbe DO= f (T)

Figure 24. Schéma représentant la recherche de bactériocines

NaOH ajouté +

goutte

de

phénophtaléine

Surnagean

t

Incubation à 37°C pendant 18 heures

Centrifugation 4 000 tours /min

pendant 30 min

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Matériel et Méthodes

71

I-7 Etude in vivo Les étapes réalisées sont résumées dans le schéma suivant :

Figure 25. Schéma représentatif de l‟étude in vivo.

Etude in vivo

Période d‟adaptation durée de 7jours, effectif : 20

lapins

10 Lapins Régime standard additionné : Lot A

de yogourt (annexe V) synthétique a base de B.

bf quantité de 5ml/j pendant une durée de 28

jours, avec prise du poids chaque 14 j.

10 Lapins, Régime standard : Lot B

avec un inocolum de H. pylori de

2.108 /j pendant une durée de 28

jours, avec prise du poids chaque

14j.

Faire des coupes histologiques au 14ème

j et 28 ème

j au niveau

de l‟estomac.

Remplace le yogourt par

H. pylori 2.108 /durée 28j

avec prise du poids 14j.

14j.

Remplace H. pylori par le

yogourt /durée 28j avec prise du

poids chaque 14j.

Observation microscopique

Faire les coupes histologiques au 14 ème

j et 28 ème

j

au niveau de l‟estomac.

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Matériel et Méthodes

77

I-7-1 Les étapes de la dissection

Etape 1 : Fixation du lapin sur la planche et dissection de l‟abdomen du lapin selon

la figure suivante

Figure 26. Fixation et dissection du lapin

Etape 2 : Observation du tube digestif et organisation générale du tube digestif d‟un

lapin. (Fig. 27 et 28)

Figure 27. Observation du tube digestif

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Matériel et Méthodes

70

Figure 28. Organisation du tube digestif

Contenue de l‟estomac du tube digestif d‟un lapin est présenté dans la photo suivante :

Figure 29. Le contenue de l‟Estomac

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Matériel et Méthodes

76

Etape 3 réalisation des la biopsie

Le maintien des tissus prélevés dans un fixateurs « formol ». Après chaque biopsie,

est utilisée pour la préparation des coupes histologiques suivant les quatre étapes :

fixation, inclusion, coloration et montage (Jean Pierre., 1990).

Figure 30. Un fragment d‟Estomac

I-7-2 Ŕ Les étapes de la réalisation des coupes histologiques

Fixation : mètre les parties coupées du tube digestif dans un fixateur, on a utilisé le

formol, pour une journée.

Inclusion

a-Déshydratation : dans des bains d‟alcool à différentes concentrations on met

le tissu : (Fig. 31)

- Un bain avec une concentration de 70° pendant 10minutes.

- Un bain avec une concentration de 80° pendant 10minutes.

- Un bain avec une concentration de 90° pendant 20minutes.

- Un bain avec une concentration de 100° pendant 20minutes.

- Un bain de toluène pendant 20 minutes.

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Matériel et Méthodes

02

Figure 31. La déshydratation des tissus dans des bains d‟alcool

b- Inclusion dans la paraffine (Fig. 32)

- Préparation de la paraffine : fondre la paraffine dans une étuve a une température de 56°.

- Dans des moules on verse notre paraffine et on inclus le tissu, on la fait rentrer dans une

étuve pour une durée d‟une heure trente minutes (afin d‟assurer la pénétration de la

paraffine).

- Verser la paraffine liquide dans le moule constitué par deux barres de LEUKART,

prolonger et placer le tissu selon le plan de coupe désiré.

- Les blocs obtenus sont laissées pour une durée de 24h pour que la paraffine se solidifie

(Jean Pierre., 1990) (Fig . 33)

Figure 32. Inclusion a la paraffine

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Matériel et Méthodes

02

Figure 33. Préparation des blocs des différentes parties du tube digestif du lapin.

Préparation des coupes

- Tailler le bloc obtenu.

- Placer le bloc dans le microtome « LEICA RM 2145» régler a 7µm.

- Le ruban obtenue sera placée sur une lame, ajouter des gouttes d‟eau gélatiné a

0.2% (voir annexe V), puis la mètre sur une platine chauffante pour quelque seconde.

- Faire rentrer des lames dans une étuve réglée à 46° pour assurer un bon séchage des

lames (déparaffinage).

Coloration : elle se fait en 2étapes : (Fig. 34)

a-Hydratation : dans des bains d‟alcool à degré alcoométrique descendant, on met les

lames :

- Deux bains de toluène (tremper la lame pour quelque instant).

- Deux bains avec une concentration de 100° pendant 5minutes.

- Deux bains avec une concentration de 90° pendant 5minutes.

- Deux bains avec une concentration de 80° pendant 5minutes.

- Deux bains avec une concentration de 70° pendant 5minutes.

- Un bain d‟eau distillée (hydratation).

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Matériel et Méthodes

00

b-Coloration

À l‟aide des colorants qui permettent de mettre en évidence les principaux éléments

morphologiques des tissus traités, noyau et les affinités tinctoriales du cytoplasme ainsi

que les différents compartiments extracellulaire :

- Prolonger les lames dans l‟HÉMATOXYLINE DE GROAT (annexe V) pendant 10-

15minutes.

- Rincer les lames dans 3bains successives d‟eau de conduites puis 1 bain d‟eau distillé.

- Recouvrer les lames par une goutte d‟éosine « 0.1% aqueuse » pendant 2 minutes.

- Rincer sous l‟eau de robinet puis dans l‟eau distillé.

Avant de passer au montage, il faut procéder à une déshydratation qui va se réaliser

par une opération inverse a celle de l‟hydratation (bains d‟alcool a degré

alcoométrique ascendant) (Jean Pierre., 1990).

Montage

Les lames déshydratées sont recouvertes par une goutte de Baume de Canada et une lamelle

est déposée sur la coupe, on procède après à l‟observation microscopique. (Jean Pierre.,

1990).

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Matériel et Méthodes

00

Figure 34. Lames après coloration « hématoxyline-éosine ».

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Résultats

04

II-1 Résultat de l’identification d’Helicobacter pylori

II-1-1-Etude bactériologique

Les biopsies sont envoyées pour l‟étude bactériologique, au laboratoire de bactériologie

de (INSERM U853 et Centre National de Référence des Campylobacters et Hélicobacters)

l‟hôpital Pellegrin de Bordeaux 2, France.

II-1-2 La culture

II-1-2-1 Aspect macroscopique

Dans les conditions favorables à la croissance de H. pylori et après une incubation de 2

à 5 jours à 37°C dans une atmosphère appauvrie en oxygène (Fig. 35), les résultats obtenus de

la culture des quatre prélèvements sur une gélose enrichie au sang se traduisent par l‟apparition

de petites colonies de 1 à 2 mm de diamètre. Les colonies ont une coloration grisâtre ou

transparente, luisante : elles sont discrètement bombées, rondes et ont un contour régulier (Fig.

36).

Figure 35. Incubation de Helicobacter pylori dans une jarre a anaérobiose.

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Résultats

02

Figure 36. Aspect macroscopique des colonies d‟Helicobacter pylori après 5 jours

d‟incubation à 37°C en atmosphère micro-aérophile

A : milieux pylori (biomérieux) B : milieux gélose au sang

II-1-2-2 Aspect microscopique

Coloration de Gram

La coloration de Gram, réalisée à partir des colonies apparues, montre la présence de

bactéries Gram négatif. Elles se présentent sous la forme de bacille droit, incurvé, en virgule,

en forme de C, V ou S, aux contours réguliers. Les bactéries évoluent rapidement au cours des

repiquages vers des formes d‟aspect coccoïde (Fig. 37).

Figure 37. Aspect Microscopique de Helicobacter pylori (Groussisement X100)

A B

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Résultats

01

II-1-3 Etude biochimique

L‟identification est complétée par la recherche de caractères biochimiques (catalase,

oxydase et DNAse) et nous avons utilisées des API 20 campy.

Nous avons noté la présence d‟une uréase, oxydase, d‟une catalase et d‟une DNAse très

puissantes chez trois souches isolées d’H. pylori (Fig. 38 au 42). Les résultats sont représentés

dans le Tab.15

Tableau 15. Caractérisation biochimique des différentes souches de Helicobacter pylori

Souches

Test

H.pylori SAN 158

H.pylori 26695

Uréase +

+

Catalase +

+

Oxydase +

+

LDC +

+

ODC +

+

ADH

- -

ONPG

- -

Citrate de simmons +

+

Mannitol +

+

+: Positif - : Négatif

ONPG Ortho-Nitro-Phenyl ß Galactopy

Ranoside

LDC Lysine

ODC Ornithine

ADH Arginine

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Résultats

07

Figure 39. Résultat de catalase

Figure 38. Résultat de l‟oxydase

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Résultats

00

Figure 40. Résultat du teste d‟urée

Figure 41. Résultat de la DNAse

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Résultats

06

Figure 42. Les résultats de l‟identification biochimique des deux souches isolées de

Helicobacter pylori utilisant des API 20 campy.

II-1-4 Antibiogramme

L‟étude de la sensibilité aux antibiotiques sur la croissance de cette bactérie est parfois

très utile dans le choix thérapeutique (Tab. 16) (Fig. 43). L‟étude a montré la sensibilité de H.

pylori aux antibiotiques : la Pénicilline, l‟Amoxicilline, l‟Erythromycine, au Chloramphénicol,

la Tetracyline, la Tobramycine, le Furane et la Metronidazole et une résistance remarquable

vis-à-vis des antibiotiques comme la Vancomycine, la Cefsulodine, la Trimethoprine, l‟acide

nolidixique et les Sulfamides.

B : Antibiotiques sous forme

Bandelette

Figure 43. Les résultats de l‟antibiogramme sur Gélose Mueller Hinton + 5% de sang de

mouton.

A : Antibiotiques sous forme de disque 1er Boite : Lincomycine, Cefazoline. Ciprofloxine,

Cephalotine, Vancomycine

2éme Boite : Ampiciline, Acide fusidique, Cefsulodine.

Tetracyline. Gentamicine Erythromycine.

1er

Amoxyline

Lerofloxacu

m

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Résultats

62

Tableau 16. Antibiogramme des souches de Helicobacter pylori isolées.

II-1-5 Résultats du test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1)

Les criteres d‟interpretation recommandes pour determiner qu‟un echantillon est

seropositif a H. pylori sont l‟une des combinaisons suivantes :

1. 116 kd (cag a) positif, en presence d‟une ou plusieurs des bandes suivantes : 89 kd (vac

a), 37 kd, 30 kd (ure a) et 19.5 kd, ou le marqueur d‟infection active.

2. Présence d‟une des bandes suivantes : 89 kd, 37 kd, 30 kd ou 35 kd, avec ou sans le

marqueur d‟infection active.

3. Présence a la fois des bandes 30 kd et 19.5 kd, avec ou sans le marqueur d‟infection

active.

Sur les seize échantillons de sérum étudies, onze ont eté déclarés positifs en les comparants

avec le contrôle positif et négatif

ANTIBIOTIQUE Abréviation DMI (mm) Hp1 Hp2

Lincomycine

Cefazoline

Ciprofloxine

Cephalotine

Vancomycine

Ampiciline

Acide fusidique

Cefsulodine

Tetracyline

Gentamicine

Erythromycine

Amoxyline

Lerofloxacum

L

CZ

CIP

CF

VA

AM

FA

CFS

TE

GM

E

AC

LE

21

29

23

16

17

15

22

16

19

04

00

14

00

10

S

S

S

S

S

S

S

S

S

R

R

R

R

R

S

S

S

S

S

S

S

S

S

R

R

R

R

R

R : Résistante S : Sensible DMI : Diamètre minimale d‟inhibition

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Résultats

62

Figure 44. Résultats du test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1

II-1-6 Résultat de la PCR

Sur les cinq biopsies gastriques examinées dans le laboratoire nous avons procédé à

l‟extraction Rapide à 100°C de l‟ADN des biopsies gastriques, selon un Protocol adapté à

l‟appareil du light cycler et après séquence du gène ciblé de la ClariRes de H. pylori on a pu

détecté deux souches d‟H. pylori (SAN 158 et 26695) appartements à la famille des

Helicobacter. (Fig.. 45 - 47).

Figure 45. Contrôles de la PCR : 4 témoins (T NEG, WT, G et C)

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Résultats

60

Figure 46. Résultat positif et sensibilité à la clarithromycine de la PCR de la souche SAN 158

Figure 47. Résultat positif et sensibilité à la clarithromycine de la PCR de la souche 26695

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Résultats

60

II-2 Résultats de l’interaction bactérienne

II-2-1 Résultats de la pré identification des souches lactiques

Les résultats des études morphologiques, physiologiques et biochimiques de nos souches

lactiques sont résumés dans le tableau suivant :

Tableau 17. Résultats d‟identification des souches lactiques.

Souche lactique

Tests étudiés

Sc. thermophilus

Lb. bulgaricus

Bf. Bifidum

Etu

de

morp

holo

giq

ue

Aspect

macroscopique

Colonies rondes ou

lenticulaires de

couleur blanche crème

(Fig. 49).

Petites colonies

identiques de couleur

blanche crème

(Fig. 48)

des colonies

blanchâtres et

crémeuses avec un

contour régulier photo

(Fig. 50)

Aspect

microscopique

Des coques Gram

positif (+) groupés en

paires ou en chaines.

(Fig. 52)

Des bacilles Gram

positif (+) groupées en

paires ou en chaines.

(Fig. 51)

Gram positif, sous

forme de bacille droit,

courte, elle présente

des formes bifides en

V en Y. (Fig. 53)

Etu

de

bio

chim

iqu

e Test de catalase Catalase négatif (-) Catalase négatif (-) Catalase négatif (-)

Test d’oxydase Oxydase négatif (-) Oxydase négatif (-) Oxydase négatif (-)

Etu

de

ph

ysi

olo

giq

ue

Test de la

mobilité

Cellules immobiles

Cellules immobiles

Cellules immobiles

+ : Réaction positive. - : Réaction négative

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64

Aspect macroscopique des bactéries lactiques

Figure 48. Culture de Lactobacillus bulgaricus sur le milieu MRS agar.

Figure 49. Culture de Streptococcus thermophilus sur le milieu M17 agar.

37°C

Photo n°26 : Aspect macroscopique des colonies

de Bifidobactérium bifidum sur milieu MRS –Cyst.

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62

Figure 50. Culture de Bifidobacterium bifidum sur le milieu MRS agar.

Aspect microscopique

Figure 51. Aspect microscopique de Lactobacillus bulgaricus après la coloration de Gram

(G×100).

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61

Figure 52. Aspect microscopique de Streptococcus. thermophilus

après la coloration de Gram (G×100).

Figure 53. Aspect microscopique de Bifidobactérium bifidum

après la coloration de Gram (G×100).

(G×100).

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Résultats

67

II-2-2 Les résultats de la mesure du pH et l’acidité des bactéries lactiques

La mesure des pH initial et final montre une diminution du pH dans le milieu contenant

les souches lactiques isolées. Cette diminution est indiquée dans le tableau suivant :

Tableau 18 : Diminution du pH par les deux souches lactiques cultivées dans le bouillon

approprié (MRS ou M17 liquide) pendant 48 h à 37°C.

Souche lactique

Initial

pH Taux d’acidité

° Dorinc

Final

pH Taux d’acidité

° Dorinc

Sc. thermophilus 7,50 24 4,95 49

Lb. bulgaricus 7,13 25 4,92 50

Bf.bifidum 7,23 27 4,97 52

II-2-3 Dénombrement

Les résultats de dénombrement bactérienne par la mesure de la densité optique

montrent que la croissance des bactéries lactiques est plus élevée que celle d‟Helicobacter

pylori, ceci prouve que les bactéries lactiques ont un temps de génération très court, alors que

H. pylori est de 5 jours. Nous avons calculé la croissance à l‟aide de la fonction logarithmique

des valeurs de la densité. (Fig. 54, Tab. 19, 20).

Tableau 19. Dénombrements de Bifidobactérium bifidum, Lactobacillus blgaricus,

Streptococcus thermophilus et Helicobacter pylori

Souches 1er

Boite 2eme

Boite 3eme

Boite

Bf. bifidum >300 >300 >300

Lb. blgaricus >300 >300 >300

Sc. Thermophilus >300 >300 >300

H. pylori 20 79 89

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Résultats

60

Tableau 20. Résultats de la densité optique de B. bifidum, L. blgaricus, Sc. Thermophilus et

H.pylori

Heure

Densité

optique

0

2

4

6

8

16

20

Bf. bifidum 0.155 0.124 0.098 0.076 0.071 0.042 0.018

Lb. blgaricus 0.153 0.129 0.102 0.065 0.058 0.047 0.022

Sc.

thermophilus

0.149 0.127 0.099 0.060 0.056 0.040 0.025

H. pylori 0.150 0.130 0.098 0.059 0.049 0.041 0.019

Les résultats de dénombrement confirment les résultats de la densité optique.

Après l‟incubation nous avons calculé le nombre de colonies UFC en appliquant la

formule suivante :

Cpt 1

N= .

(n1.1) + (n2.0.1) + (n3.0.01) +………+ (nn.10ˉ-(n-1)

) Fd

n : Nombre de boite

Fd : Facteur de dilution

25< Cpt <250

Les résultats sont comme suite : H. pylori = 15.105 UFC

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66

Figure 54. La croissance de Bifidobactérium bifidum, Lactobacillus blgaricus, Streptococcus

thermophilus et Helicobacter pylori

II-2-4 Test de l’antagonisme

II-2-4-1 Recherche des inhibitions

Les résultats de l‟interaction obtenue révèlent la présence de zones claires au tour des

souches d‟H. pylori ensemencée en touches.

Ces résultats indiquent l‟existence des agents d‟inhibitions produits par les bactéries

lactiques et indiquent la nature de ces agents. (Fig. 55, 56 et 58)

Les résultats de l‟antagonisme sont indiqués dans le tab. 21.

Tableau 21. Résultats de l‟antagonisme de Helicobacter pylori

Souche Bf. bifidum Lb. blgaricus Sc. thermophilus

H.pylori + + +

DMI (mm) 08 05 03

- : Absence d‟halo + : Présence d‟halo

0

1

2

3

4

5

6

0 2 4 6 8 16 20

Temps (Heure)

S.thermophilus

L.bulgaricus

B.bifidum

H.pylori

Log Do

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Résultats

222

En observant ce tableau, on remarque que les trois bactéries lactiques on inhibées la

croissance d‟H. pylori par l„activité d‟antagonisme, et on remarque aussi que H. pylori a été la

plus sensible à Bf.bifidum qui se traduit par un diamètre d‟inhibition minimale de 8 mm.

Ensemencement des souches d’H.pylori

Ensemencement des bactéries

Lactiques

Figure 55. Méthode de diffusion par disques

Figure 56. Résultats de l‟antagonisme de Helicobacter pylori avec les trois bactéries

lactique

HAL

O

Bf.bifidum

Sc. thermophilus

Lb. blgaricus

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222

Figure 57. Résultats de l‟antagonisme de Bifidobactérium bifidum et Helicobacter pylori

II-2-4-2 Recherche de bactériocines

Après une incubation à 37°C pendant 20 heures en micro aérobiose, la croissance

bactérienne est suivie par la mesure de la densité optique ; les résultats sont indiqués dans le

tableau 24.Nous avant calculé la croissance bactérienne à l‟aide de la fonction logarithmique

des valeurs de la densité (Log DO) afin de connaître l‟existence de bactériocine et son effet sur

la croissance d‟H. pylori

Les résultats sont traduits par une courbe qui montre une décroissance de la bactérie H.

pylori cultivée dans le milieu gélose pylori qui contient le surnageant, sachant que les

bactéries ont été développées dans un milieu à pH 7 contenant de la catalase. Ces résultats

s‟expliquent par la présence de bactériocines produite par Bf. bifidum. (Fig. 58)

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Résultats

220

Figure 58. La croissance de H. pylori en présence de bactériocine-like produite par Bf.

Bifidum.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 2 4 6 8 16 Temps (Heures)

Log (DO)

H.pylori + 1 ml du surnageant

H.pylori

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Résultats

220

II-3 Résultats de l’étude in vivo

II-3-1 Résultats du Lot A

Traitement N°01

Observation générale des lapins : durant les 8 premiers jours, les lapins avait un bon état

physique avec un poids stable (400-990). (Fig.59 et 60)

Figure 59. Tube digestif d‟un lapin traité par probiotiques 14 jours (Lot A)

Figure 60. Tube digestif d‟un lapin traité par probiotiques 28 jours (Lot A)

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Résultats

224

Durant les huit premiers jours de l‟injection des probiotiques, la structure histologique du

tube digestif, dans tous ces parties, est complète, bien développée « présence de toutes les

couches ». Néanmoins, une augmentation dans les composants lymphoïdes a été observée, les

nodules lymphoïdes des Plaques de Payer sont très volumineux.

Les résultats sont présentés dans les Fig. 61 et 62, qui représentant les coupes histologiques

téVillosi

odules lymphoîdesN

Figure 61. Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique

pendant 14 J (G×40) (Lot A)

Figure 62. Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique

pendant 28 J (G×40) (Lot A)

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222

Traitement N°02

Observation générale après 14 jours de la prise de H. pylori, l‟état des lapins demeura

un peu inquiétant, ils ne mangeaient pas bien, activité physique diminue, chute de poids,

début de gonflement abdominale et présence de diarrhée. Fig. 63 et 64.

Figure 63. Tube digestif 14 jours après prise d'Helicobacter pylori (LotA)

Figure 64. Tube digestif 28 jours après prise d' Helicobacter pylori (Lot A)

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221

Après 4 jours d‟injection de H. pylori, on a vue qu‟un début d‟une inflammation mais avec

un degré très faible et certaines villosités sont devenues atrophiées. La réponse immunitaire

déterminée par le taux élevés des globules blancs colorées en bleu. L‟infection est observable

et très clair avec la disparition de certaines villosités et l‟ouverture au niveau de leurs

extrémités, qui indique que se sont en voie de destruction, les glandes de Liberkuhn

apparaissent comme des invaginations de l‟épithélium

Figure 65. Coupe histologique de l‟estomac avec injection

de Helicobacter pylori pendant 4J (G×40) (Lot A)

Figure 66. Coupe histologique de l‟estomac avec injection de Helicobacter pylori

pendant 8J (G×40) (Lot A)

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Résultats

227

II-3-2 Résultats du lot B

Traitement N° 01

Observation générale : les lapins, durant les 14 premiers jours, étaient en mauvaise état

physique : gonflement abdominale, chute de poids, présence de diarrhée et des cas de décès.

(Fig. 67 et 68).

Figure 67. Tube digestif 14 jours après prise d' Helicobacter pylori (Lot B)

Figure 68. Tube digestif 28 jours après prise d' Helicobacter pylori (Lot B)

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Résultats

220

Après quatre jours, l‟inflammation est très développée, une disparition avec un taux très

élevé des villosités, des nodules lymphoïdes et de certaines couches épithéliales (photo. 69). Et

une augmentation du taux des globules blancs.

Par contre au huitième jour l‟inflammation s‟aggrave, une mauvaise et très forte odeur

apparait au moment de la dissection et un gonflement, irritation de l‟estomac et de l‟intestin.

Le contenu de ces parties était liquide avec la disparition complète des villosités

« muqueuse » et une partie de la musculeuse mucosae. Les nodules lymphatiques deviennent

de petites tailles (Fig. 69 et 70).

Figure 69. Coupe histologique de l‟estomac avec injection d' Helicobacter

pylori pendant 14 J (G×40) (LOT B)

Figure 70. Coupe histologique de l‟estomac avec injection

d'Helicobacter pylori pendant 28 J (G×40) (LOT B)

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Résultats

226

Traitement N°02

1- Observation générale : les lapins durant les 14 premiers jours ont souffrent de diarrhée,

mais le gonflement abdominal disparaît peut a peu. (Fig. 71 et 72).

Figure 71. Caecum irrité (Lot B)

Figure 72. Présence de gaz dans l‟estomac et intestin grêle. (Lot B)

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Résultats

222

Après injection des probiotiques nous avons observé les résultats suivants :

Au quatorzième jour : l‟inflammation persiste encore, les villosités et certaines

couches « muqueuse et sous muqueuse» sont presque introuvables. Les coupes

histologiques effectuées après quatre jours de la prise du traitement montrent une irritation de

l‟appareil digestif. (Fig. 73).

Au 28éme

jour : L‟inflammation prend la voie progressive vers la guérisson avec la

restauration de certaines couches (muqueuse et musculeuse mucosae). Les nodules

lymphatiques rejoignent leur forme et se distribuent d‟une manière organisée au niveau de la

musculeuse mucosae (Fig. 74).

.

Figure 73. Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique

pendant 14J (G×40) (Lot B)

Figure 74. Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique

pendant 28 J (G×40) (Lot B)

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Discussions

222

III-Discussion des résultats

III-1 Isolement et identification des souches de Helicobacter pylori

L'estomac est le seul réservoir de la bactérie H. pylori. Cette dernière s'acquiert dès

l'enfance et se transmet de personne à personne, par la bouche ou les selles. Elle y modifie la

sécrétion acide, neutralise les moyens de défense naturelle, empêche la réparation de la

muqueuse, bref concoure activement à la création et à l'entretien de l'ulcère, mais également à

la survenue de gastrites. Son rôle est même évoqué dans la survenue de cancer de l'estomac.

Selon Mégraud., 2004, H. pylori est responsable de 7 ulcères gastriques sur 10 et 9

ulcères duodénaux sur 10 sont liés à H. pylori.

Les Caractères culturaux de H. pylori montrent qu‟elle croît lentement (3 à 4 jours

minimum) et exige des conditions de culture particulières (micro-aérophile) et des milieux de

culture additionnés de sang, de sérum ou de suppléments d'enrichissement (Flandrois., 1997)

tels que la gélose PYL (sélective pour H.pylori) ou Columbia additionnée de sang.

Pour l‟isolement de la bactérie, il a fallut assurer des conditions favorables pour la

croissance d’H. pylori, soit une atmosphère micro-aérophile et des milieux riches et qui

contiennent différents antibiotiques pour éliminer toute contamination possible (Ghouini.,

1996 ; Sobhani et al., 1991 ; Mégraud., 1994 ; Cellini et al., 1995).

A partir des biopsies gastriques des malades, nous avons pu isoler trois souches d‟H.

pylori. Après cinq jours d‟incubation, des colonies transparentes, luisantes, visqueuses et fines

appairassent sue la gélose colombai et aussi sur la gélose chocolatée, avec un diamètre de 1

mm ou en nappes brillantes et non hémolytiques. Ces caractères culturaux correspondent à

Helicobacter pylori (Avril et al., 1995 ; Guetarni et Bensoltane., 201 3)

L‟observation microscopique sous fort grossissement a montré que H.pylori est un petit

bacille de forme incurvé, mobile grâce à de multiples flagelles qui jouent un rôle important

dans la colonisation de l‟estomac (Brenner, et al., 2000 ; Mégraud., 2004).

La coloration de Gram d‟une colonie prise des boites de pétri des trois souches isolées

d‟H. pylori montre qu‟il agit d‟une bactérie à caractère Gram négatif.

Les résultats biochimiques confirment l‟identification finale des souches isolées

catalase, oxydase et uréase. L'uréase transforme l'urée en dioxyde de carbone et ammoniac

permettant de neutraliser localement l'acidité gastrique et créer ainsi un microenvironnement

favorable au développement bactérien.

L'uréase de H.pylori est composée de deux sous unités :

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Discussions

220

UreA et UreB. Elle correspond à 6 à 10% de la masse totale bactérienne, ce qui montre

le rôle essentiel de cette molécule.

Ces caractères doivent être positifs pour que nous puissions dire que ces souches sont

réellement des souches de H. pylori.

Les résultats obtenus montrent que cette bactérie possède une uréase, une catalase et

une oxydase positives, et donc une activité enzymatique importante. Ils montrent aussi que

cette bactérie utilise les citrates comme source de carbones et n‟utilise pas les substrats sucrés

comme sources de carbones (Medouakh et al., 2006 ; Mégraud, 1995).

L‟étude de la sensibilité de H. pylori aux antibiotiques a montré d‟excellents résultats

par rapport à l‟activité de la plupart des antibiotiques utilisés. Nos résultats ont montré que les

trois souches isolées d‟H.pylori sont sensibles à la Pénicilline, l‟Amoxicilline,

l‟Erythromycine, au Chloramphénicol, la Tetracyline, la Tobramycine, le Furane et la

Metronidazole.

En revanche, les souches de H. pylori montrent une résistance remarquable vis-à-vis

aux antibiotiques comme la Vancomycine, la Cefsulodine, la Trimethoprine, l‟acide

nolidixique et les Sulfamides ; une résistance au Metronidazole a été observé chez la souche

Hp2.

Donc il est important dans toute infection de tester la sensibilité de ses antibiotiques

pour leur utilisation dans le domaine thérapeutiques (Bell et al., 1993 ; Bigard et al., 1995;

Cayla., 1996 ; Cayla et al., 1996 ; Bardhan et al., 2000).

La sérologie révèle la présence des antigènes de H. pylori dans le sérum de onze

patients sur un totale de seize patient souffrants ulcères d‟estomac. Ceci nous a permet d‟isoler

deux souches de H. pylori qui ont été identifiés génétiquement par PCR a temps réel.

III-2 Pré identification des bactéries lactiques

D‟après les études morphologiques, physiologiques et biochimiques des souches

lactiques, on a constaté que :

La souche Sc. thermophilus cultivée sur le milieu M17 solide donne des colonies

rondes ou lenticulaires de couleur blanche crème. L‟étude microscopique d‟un frottis fixé et

coloré à partir des colonies précédentes montre que cette bactérie est sous forme de coques

Gram positif (+) groupés en paires ou en chaines.

La souche Lb. bulgaricus ensemencée sur le milieu MRS solide donne des petites

colonies identiques de couleur blanche crème. L‟observation microscopique de ces colonies

révèle que cette bactérie est sous forme de bacilles Gram positif (+) groupées en paires ou en

chaines.

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Discussions

220

B. bifidum développée sur milieu MRS cystéine solide, nous avons remarqué que les

colonies sont blanchâtres, lisses avec un contour régulier. L‟étude microscopique d‟un frottis

fixé et coloré à partir des colonies de Bf. bifidum montre des bacilles incurvés à contours

réguliers souvent ondulés, avec une extrémité bifurque ou spatulée.

Notre étude a montré également qu‟il a un polymorphisme cellulaire (Bensoltane et al.,

1997 ; Bonaprite, et al., 2001 ; Mahi et al., 2006 ; Hadaji et Bensoltane, 2006). A l‟aide du

microscope, nous avons observé des bacilles Gram négatif, incurvés de forme bifidique

(Danone., 1997 ; Fox., 1982 ; Rasick et kurmann., 1983).

Le test de la catalase utilisé sur les colonies de Bf. bifidum se révèle négatif, et donc

montre l‟anaérobie strict de cette bactérie (Devuyest et Vandamme, 1994). En effet, ce test est

typique aux Bifidobactérium et très utilisé pour leur identification par de nombreux

chercheurs. (Scardovi., 1986)

Ces résultats ont été démontrés par plusieurs auteurs tels que : Larpent (1996),

Dellaglio et al. (1994) et Novel (1993).

Ces bactéries sont :

- Catalase négatif (-) car on n‟a pas observé un dégagement de bulles de gaz (Delarras.,

2007) ;

- Oxydase négatif (-) car le disque «Ox » demeure incolore (Delarras., 2007);

- Immobiles (Guiraud., 1998) parce que leur croissance est uniquement le long de la

piqure ;

- Mannitol négatif (-) expliqué par l‟absence de virage de couleur dans le milieu ;

- Lactose + indiquant la formation d‟acide lactique par les deux souches qui se manifeste

par le virage de couleur du violet vers le jaune ;

- D‟après Larpent et al., (1997), Sc. thermophilus est glucose (+), lactose - saccharose

(+). Alors que, Lb. bulgaricus est glucose (+), Lactose (+) et saccharose (-).

III-3 Interaction bactériennes

L‟abaissement du pH dans les milieux MRS et M17 liquides signifie que chacune des

deux souches lactique possède un effet acidifiant, en produisant des acides organiques, le

principal facteur d‟inhibition selon Mathot et al . (1996), Choisy et al. (1997)

La comparaison entre les graphes du pH et celui de l‟acidité montre que le taux

d‟acidité augmente avec la diminution du pH, la production des acides organiques à pour effet

l‟inhibition de la croissance des souches de H. pylori qui ne peut pas survivre à pH bas (Sheu

et al., 1997 ; Desmaseaud., 1994).

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224

D‟après les courbes tracées qui représentent la variation de la densité optique par le

temps, Nos résultats montrent que la croissance chez H. pylori est lente par apport à celles des

bactéries lactiques et surtout de Bf. bifidum.

Les résultats concernant les tests de l‟antagonisme révèlent l‟inhibition de Helicobacter

pylori par les bactéries lactiques. Cette interaction positive montre une inhibition de la

croissance de H. pylori, par une activité antagonisme élevé traduite par l‟apparition d‟halos

dans les deux souches isolées d‟ H. pylori.

Bf.bifidum inhibe les souches de H. pylori avec un diamètre minimal d‟inhibition de 08

mm pour Lb. Bulgaricus est de 05 mm et pour Sc. thermophilus est de 03 mm. (Biclecka et

al., 1998 ; Devuyest et Vandamme, 1994)

Les résultats du test de l‟antagonisme nous a permis de rechercher les agents

d‟inhibition chez le genre Bf. bifidum (Bouvier et al., 1994).

La présence des halos est due à la production des acides organiques par Bf. bifidum qui

ont un effet de baisser le pH dans le milieu. Aussi, la présence de souches Bf. bifidum et de

H. pylori dans le même milieu de culture qui contient l‟acide provoque une inhibition de la

croissance H .pylori mais pas celles de Bf. bifidum qui continue à croître car s‟est une bactérie

à caractère acidophile (Desmazeaud., 1983 ; Asperger., 1985 ; Eklund., 1989 ; Ballongue.,

1993).

L‟examen de l‟antagonisme explique l‟action des acides, en général sur la membrane

cytoplasmique des bactéries ; ces acides touchent à la maintenance du potentiel membranaire et

inhibent le transfert actif (Bouvier et al., 1994). L‟effet antimicrobien des acides diffère selon

les concentrations molaires des acides produits par les bifidobactéries.

Comme la présence d‟anneau d‟inhibition ne signifie pas forcement production des

acides (Kleanhammer., 1986) des tests supplémentaires sont nécessaires pour connaître la

nature exacte de l‟agent inhibiteur.

Les résultats de ces tests nous ont permis de constater la présence des bactériocines

produites par Bf. bifidum en bouillon MRS.

Des résultats similaires ont été trouvés par Carmen et al., 2000, qui confirment la

présence de bactériocine inhibitrice de H. pylori.

Ces substances ont été caractérisées par d‟autres chercheurs comme étant des molécules

de nature protéique (Delvis-Broughton., 1990) et sont donc sensibles à l‟action des enzymes

protéolytiques variées ou possédant une partie protéique et par conséquent, elles sont inactivées

par ces enzymes (Devuyest et Vandamme., 1994). La souche de Bf. bifidum peut

naturellement produire plus qu‟un bactériocine.

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222

D‟autres études ont été réalisées sur le mode d‟action des bactériocines, ce mode

d‟action se situe au niveau membranaire et modifie le potentiel de la membrane grâce a une

structure alternante hydrophile et hydrophobe (Stil et holzapfel., 1997). Ces bactériocines

peuvent s‟insérer dans la membrane des bactéries sensibles et y former des pores ce qui

entraîne des fuites d‟ATP et d‟ions K+

et par conséquent l‟impossibilité pour les cellules de

maintenir leur pH intracellulaire. (Desmazeaud., 1994)

Par ailleurs, aux Etats-Unis divers chercheurs ont mis en évidence l‟action

conjuguée d‟un chélateur alimentaire (citrate, phosphate, EDTA, EGTA) et la nisine pour

inhiber des bactéries à Gram négatives (Vanema et al., 1995).

De nombreuses études réalisées in vitro, ont montrés l‟effet antagoniste des

bifidobactéries contre différent pathogène tel que Schigella dysentrea, (Kirjavainem et al.,

1998) E. coli (Shah., 1997) et Yersinia enterolitica.

Une étude réalisé par Desmazeaud., 1996 a montré que les effets de la prolifération de

certaines souches pathogènes peuvent être inhibé par l‟ingestion de ferments lactiques, par les

mécanismes suivants :

Sécrétions de certaines substances antimicrobiennes par Bifidobactéries

(H2O2, Acide lactique, Acide acétique);

Abaissement du pH par les acides produits ;

Prévention de la synthèse d‟amines toxiques.

L‟effet d‟une barrière par compétition métabolique ou l‟empêchement de la

colonisation de pathogènes par la fixation sur le tube digestif ;

La dégradation des entéro-toxines par une détoxification.

Certaines souches de Bifidobactéries jouent un rôle de protecteur contre les

entérocolites nécrotiques néonatales (NEC) en évitant le développement de ces derniers par

l‟inhibition de leur croissance tel que Clostrdium (Bouhnik et al., 1996).

Les probiotiques, tels que les bactéries lactiques, sont des cultures bactériennes actives

possédant des caractéristiques uniques qui leur permettent de survivre dans le tractus gastro-

intestinal et de faire concurrence aux autres micro-organismes entériques. Ainsi, ils aident à

maintenir l'équilibre naturel du microbiote et un bon état de santé général (Balakrishnan et

Floch., 2012).

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Discussions

221

Par ailleurs, les probiotiques pourraient promouvoir l'immunomodulation en se fixant

au tissu épithélial de l'intestin, en interagissant avec le système immunitaire et en produisant

des substances antimicrobiennes (Balakrishnan et Floch., 2012).

Les lactobacilles laitiers, consommés dans le cadre d'une alimentation habituelle,

pourraient également moduler les réponses immunitaires innées. De plus, les probiotiques

pourraient inhiber la croissance de bactéries qui transforment les procarcinogènes en

carcinogènes (Kumar., 2010).

Des recherches de Guetarni et al., 2012 et Medouakh et al., 2010 , ont montrée ne

inhibition importante de H. pylori par les souches Sc. thermophilus et Lb. Acidophilus.

III-4 Discussion des résultats in vivo

Des études précédentes sur des animaux ont indiqué que certaines souches probiotiques

commerciaux peuvent augmenter la résistance contre la colonisation et l'infection par des

bactéries entéropathogènes (Boulloche et al., 19944).

Notre étude est donc conçue de tester la capacité des probiotiques utilisées et de

comparer l'impact du challenge d'alimentation probiotique sur la gravité de l'infection gastro-

intestinal par H. pylori.

Nos résultats indiquent que l'alimentation à base de Bf. bifidums en premier lieu défi a

un impact plus significatif sur les inflammations dues à H. pylori, le tractus digestif dans ce cas

est considéré comme immunisé. Ceux qui ont eu comme premier traitement H. pylori

demeurent plus sensibles à l‟atteinte d‟une maladie gastrique en les comparants avec les

précédents.

Nos résultats indiquent aussi que le remplacement H. pylori par les Bf. bifidums génère

une réponse immunitaire au cours du temps, mais dans notre cas l‟inflammation n‟est pas

totalement guérie, et cela est dû à la courte durée du traitement.

De nombreux mécanismes ont été évoques par lequels les probiotiques pourraient

inhiber les entéropathogènes ; la suppression de pathogènes intestinaux par des bactéries

lactiques a été attribuée à leur capacité de modifier le microenvironnement intestinale par les

acides organiques sécrétant, principalement des acides acétique et lactique, conduisant à un pH

intestinal inférieur, et par la production de composés antibactériens (Servin et Connir., 2003).

Par exemple, Ashoor et Heute., (2004) ont montré que la concentration élevée d'acides

organiques à faible pH produite par Bf. Brève, qui colonise l'intestin est inhibe la production

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Discussions

227

de toxine de H. pylori alors que Fuller., 1991, ont montré que les bifidobactéries produisent

un facteur protéique qui inhibe l'adhérence de certaines souches de H. pylori à la molécule de

GA1 in vitro.

La production d'acides organiques et des molécules antimicrobiennes, d'autres

mécanismes peuvent être impliqués dans nos rapports in vivo, dont ont mis l'accent sur la

modulation immunitaire et les preuves s'accumulent que les probiotiques influence locale ou

systémique sur la réponse immunitaire de manière souche-dépendante (Gill., 2003).

Selon Saavedra et al., (1994), l‟augmentation du nombre de cellules caliciformes

inflammatoire, qui est une réponse épithéliales intestinales à l‟inflammation, augmente les

sécrétions pour former un gel visqueux qui piège les microorganismes et les irritants et limite

leur accès à l'épithélium.

Plusieurs études utilisant des modèles animales ont montré que le traitement avec

différentes souches de Lactobacillus réduit la colonisation de H. pylori et une diminution de

l'inflammation gastrique induite par Helicobacter. Chez les souris classiques, le traitement oral

avec le surnageant de culture de la souche Lb. acidophilus LB humain a diminué la densité de

H. pylori, réduit l'activité de l'uréase de H. pylori, et guérit l'inflammation de la muqueuse. La

réduction de la densité de H. pylori et l'inflammation gastrique a également été observée chez

les souris axéniques spécifiques traités avec la souche de Lb. casei. Il a été suggéré que le

degré de suppression de H. pylori ou H. felis dépend de la souche probiotique utilisée. Par

exemple, Lb. salivarius supprimée H. pylori et a réduit la réponse inflammatoire chez les

souris plus efficacement que Lb. acidophilus ou de Lb. casei (Aiba et al., 1998).

Ainsi, il a été montré que le traitement probiotique chez l'animal, même s‟il est

incapable de désactiver H. pylori, est efficace pour réduire l'inflammation de l'estomac associé

à H. pylori.

Certains probiotiques sont utiles pour supprimer l'infection à H. pylori. Telle que Bf.

bifidum YIT 4007, qui peut améliorer la blessure gastrique expérimentale chez les rats et les

stades de la maladie sur la muqueuse gastrique, chez les patients ulcéreux, cette bactérie peut

affecter l'infection H. pylori ou de son activité, la situation de la muqueuse gastrique, et

l'émergence de symptômes gastro-intestinaux supérieurs (Miki et al., 2007).

Shirasawa et al., 2010, ont constaté que la pré-incubation avec Bf. bifidum supprime

l'expression de gènes H. pylori - induites dans les cellules humaines et que la plupart des gènes

affectés sont liés aux voies de signalisation NF -kB . Ces résultats suggèrent que Bf. bifidum

peut affecter le mécanisme de régulation des voies de signalisation NF -kB.

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Discussions

220

En ce qui concerne l'utilisation des probiotiques comme agents fonctionnels, plusieurs

études ont montré qu'il existe une relation directe entre l'ajout de certaines bactéries

probiotiques et inhibition in vitro de H. pylori ; cependant les études in vivo montrant une

activité de bifidobactéries contre H. pylori restent rares.

Dans l‟étude faite par Chenoll et al., 2011, une souche de Bf. bifidum est révélé actif in

vitro contre H. pylori avec des niveaux d'inhibition prmet attiendre 81,94 % dans le cas du

surnageant et même 94,77 % d'inhibition de surnageant purifié et démontrent que Bf. bifidum

CECT 7366 peut être considéré comme un probiotique capable d'inhiber H. pylori in vitro et in

vivo.

Une revue systématique et méta-analyse d'études randomisées datant de 2009 a évaluée

l'effet des produits laitiers fermentés enrichis en probiotiques sur les infections à Helicobacter

pylori. Un total de 10 études admissibles, qui regroupaient 963 adultes et enfants, ont été

évaluées. Il a été démontré que les préparations laitières fermentées enrichies en probiotiques

réduisent les taux d'infection à H. pylori d'environ 5 à 15 % (Sachdeva et Nagpal., 2009).

Une étude prospective publiée en 2012 a examiné l'effet d‟un yogourt enrichi en

probiotiques sur la réponse immunitaire systémique auprès de 38 enfants atteints d'une

infection à Helicobacter pylori. Les auteurs de l‟étude ont conclu que chez les enfants qui

consomment régulièrement du yogourt, l'équilibre du microbiote de l'intestin peut être

préservé, et l'immunité humorale et à médiation cellulaire peut être stimulée (Yang et Sheu.,

2012).

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Conclusion

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Conclusion

226

Helicobacter pylori est définitivement admis pour sont rôle causal dans certaines

affections gastro-duodénales les plus fréquentes et qui constituent un problème important à la

santé publique en raison de leur prévalence élevée en Algérie (70% à 90%).

Tout diagnostic d‟une pathologie gastro-duodénale doit conduire à la recherche d‟une

infection à H. pylori par la réalisation des méthodes permettant la mise en évidence d‟H. pylori

par une culture, ou de son génome PCR ou d'anticorps spécifiques (sérologie). Ces méthodes

sont soit invasives et nécessitent une endoscopie digestive et des biopsies : culture, histologie,

cytologie, PCR, le test rapide à l'uréase soit non invasives : sérologie test respiratoire à l'urée.

Dans ce travail, le but a été de confirme la production d‟une bactériocine par la souche

Bf. bifidum, nous avons essayé de faire co-exister ces déférentes protocole expérimentale.

Nous avons isolé et identifie H. pylori, germe responsable de la pathologie gastro

duodénale par des examens biochimiques et un examen d‟antibiogramme afin d‟étudier la

sensibilité d‟ H. pylori aux antibiotiques pour nous conduire a un traitement efficace afin

d‟éradiquer H. pylori.

Une étude macroscopique, microscopique montre que des bactéries lactiques Bf.

bifidum, Sc. thermophilus et Lb. bulgaricus à Gram positif, catalase négative et le profil

fermentaire qui nous a permit d‟identifier.

Notre étude de la cinétique bactérienne montre une diminution importante de pH due à

la production d‟acide organique, et que Bf. bifidum est la bactérie la plus acidophile.

Le test de l‟antagonisme a montré l‟effet inhibiteur de notre souche de Bf. bifidum vis-

à-vis d‟ H. pylori cette interaction positive confirme l‟inhibition de la croissance de H. pylori

qui est traduite par l‟apparition des halos dans les cas des trois souches H. pylori isolées.

Les résultats des coupes histologiques montrent que l‟apport de probiotiques dans

l‟alimentation des lapins génère une protection contre les infections. En fin, ces résultats

suggèrent que les probiotiques représentent un bon candidat utilisé pour prévenir contre les

infections gastroduodénales.

Des données suggèrent que les produits laitiers probiotiques favorisent la santé

digestive et une bonne santé générale en améliorant le microbiote intestinal et en favorisant

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Conclusion

202

l'immunité. Ils pourraient jouer un rôle bénéfique dans l'infection à Helicobacter pylori et le

syndrome du côlon irritable, et pourraient prévenir les diarrhées associées à la prise

d‟antibiotiques.

D'autres recherches, y compris des études randomisées à grande échelle et des études de

cohorte à long terme, sont nécessaires pour confirmer ces conclusions. De plus, davantage de

recherche est requise afin d'élucider le rôle des produits laitiers probiotiques dans l'intolérance

au lactose et le cancer de l'estomac.

Ceci fait qu‟aujourd‟hui les Bifidobacterium occupent un domaine vaste pour la

réalisation de nombreuses études sur le plan taxonomique, écologique et sur le plan médical.

Les futures indications des germes Bifidobactérium dans le domaine agro-alimentaire

et médical sont certainement apportées par une meilleure connaissance de ces bactéries.

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Perspective

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Perspective

202

Recherches en cours

Tester l‟effet probiotique de Lb. helveticus Rosell 52 sur H. pylori SAN

158 et 26695 et Staphylococcus aureus in vitro et in vivo. (en

collaboration avec le CNRCH, université de bordeaux 2).

Etude épidémilogique de H. pylori dans la région de Tiaret.

Effet de certaines plantes médicinales sur la croissance H. pylori.

Perspective

L‟identification des bactériocines produits par les Bifidobactéria.

Amélioration de l‟industrie laitiére comme le lait fermenté (Yaourt),

beurre, le fromage en utilisant des Bifidobactéria comme bactéries

lactiques actives métaboliquement et pouvant être bénéfiques pour les

consomateurs et leur santé.

Application du génie génétique pour la sélection des souches améliorées

afin de produire des cultures probiotiques à usage thérapeutique.

Réaliser une enquête nutritionnelle sur la prise des probiotiques par une

population souffrant de maladies gastroduodénales.

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Références

Biblioigraphiques

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Annexe

I

Caractéristiques C.jejuni

H.pylori H.mustelae W.succinogenes

Oxydase + + + +

Catalase + + + -

Uréase - + + -

Hydrolyse de l‟hippurate + - - -

Réduction de nitrate (microaérophilique) + - + +

Production de H2S dans TSI - - - F

Gamma- glutmyltranspeptidase - + + -

Alcaline phosphatase F + + -

Motilité dans le bouillon cœur-cervelle + + + +

Motilité sur les milieux gélosés + - - -

Croissance en anaérobiose à 37°C + - F +

Croissance sur la gélose au sang

contenant 3.5% NaCl

- - - -

Croissance sur 0.5% de glycine + + + -

Croissance sur 1% de glycine + - + -

Croissance sur 1% de bile + - - +

Sensibilité à l‟acide nalidixique (30µg) S R S R

Sensibilité à la céphalothine (30µg) R S R R

Sensibilité au métronidazole (5µg) R S S S

Annexe I

Caractéristiques biochimiques et culturales de C. jejuni, H. pylori, H. mustelae et W.

succinogènes d‟après Goodwin et al., 1989.

R : Résistant

S : Sensible

F : Faible

- : Négatif

+ : Positif

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Annexe

II

Sensibilité d‟ H. pylori aux antibiotiques d‟après Mégraud, et Lamouliatte., 1997.

AGENT VALEURS

EXTREMES

50% CMI

(mg/l)

90% CMI (mg/l)

Pénicilline 0,015-0,12 0,06 0,12

Ampicilline <0,003-0,3 0,015 0,03

Acide clavulanique <0,01-0,64 0,16 0,64

Amoxicilline+Acide

clavula99nique

<0,01-0,02 <0,01 0,01

Céfalotine 0,023-0,4 0,2 0,2

Céfotaxine 0,01-0,16 0,04 0,08

Cefsulodine 5,12-41 20,5 41

Streptomycine 0,04-1.28 0,32 0,64

Kanamycine 0,04-0,64 0,16 0,32

To bramycine 0,04-0,64 0,08 0,16

Gentamycine 0,04-0,32 0,08 0,16

Erythromycine 0,1-0,8 0,2 0,4

Josamycine 0,4-1,6 0,8 0,8

Lincomycine 3,2-12,8 6,4 12,8

Chloramphénicol 2,0-8,0 2,0 4,0

Tétracycline 0,01-0,16 0,08 0,16

Rifampicine 0,5-2,0 1,0 1,0

Péfloxacine 1,0-8,0 4,0 8,0

Colistine 2,0-64 8,0 32,0

Vancomycine 50,0->100 >100 >100

Annexe II

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Annexe

III

Composition des différents milieux de culture

Gélose au sang (Gélose chocolat) :

PH = 7. 2

Polypetone 15g

Amidon de mais 1g

Phosphate dipotassique 4g

Phosphate mono potassique 1g

Chlorure de Sodium 5g

Hémoglobine 10g

Gélose 10g

Milieu Mueller Hinton (g/l) :

C‟est un milieu utilisé pour l‟isolement des bactéries et l‟antibiogramme.

PH = 7. 4

Infusion de viande de bœuf 300.30g

Hydrolysat de caséine 17.50g

Amidon 1.50g

Gélose 17.00g

Milieu MRS modifié (g/l)

PH = 6. 2

Milieu MRS (g/l) (Robinson et samona, 1991)

PH = 7 Extrait de levure 5g

Tryptone 10g

Lactose 10g

Tween 80 1g

KH2PO4 3g

MgSO4 0.575g

MnSO4 0.12g

Citrate d‟ammonium 2g

Sulfate ferrique 0.34g

Cystéine -Hcl 0.3g

Lithium chlorite 1.2g

Propionate de sodium 6g

Extrait de levure 10g

Poly peptone ou peptone 10g

Trypsine de caséine 10g

Acétate de sodium 5g

Citrate d‟ammonium 2g

Glucose 2g

KH2PO4 2g

MgSO4 0.25g

MnSO4 0.5g

Agar agar 2g

Li cl 3g

Cysteine 0.5g

Sel biliaire 0.5g

Tween 80 1ml

Eau distillée 1000ml

Annexe III

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Annexe

IV

Sulfate néomycine 0.08g

Sulfate paronomycine 0.02g

Eau distillée 1000ml

Milieu RCPB (g/l) (Ghoddusi et Robinson, 1996)

PH = 6. 8

LAB- Lemco 10g

Extrait de levure 3g

Peptone 10g

Glucose 5g

Amidon 1g

Sodium d‟acétate 3g

Chlorure de sodium 5g

Cystiène-Hcl 0.5g

Prussien bleu 0.3g

Eau distillée 1000ml

Milieu LP (g/l) (Lappiere et al., 1992)

PH = 6. 7

Bouillon Glucose Tamponne :

PH = 6. 9

Bacto-peptone 10g

Liverdigest 35g

Lactose 10g

Chlorite 0.2g

Propionate de sodium 0.3g

Eau distillée 1000ml

Tryptose 20g

Glucose 5g

Phosphate dis potassique 4g

Phosphate mono potassique 1.5g

Chlorure de sodium 5g

Acide de sodium 0.5g

Pourpre de bromocrésol 0.015g

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Annexe

V

e de la colorationTechniqu

La coloration de Gram

1- Réaliser un frotti en étalant sur une lame stérile un peu de l‟échantillon à analyser

(yaourt agité ou une colonie de bactérie), puis sécher soigneusement ;

2- Recouvrir la lame par violet de gentiane pendant 1 minute ;

3- Recouvrir la lame par Lugol pendant 30 secondes ;

4- Rincer bien à l‟eau distillée ;

5- Recouvrir la lame par l‟éthanol 95% pendant 10 secondes ;

6- Laver rapidement et recouvrir la lame par la fuschine pendant 10 secondes à 1 minute ;

7- Sécher la lame à l‟air libre ;

8- Observer la lame, en ajoutant l‟huile à immersion pour le fort grossissement (100 et

plus).

la coloration au bleu de méthylène

Á l‟aide d‟un ose bouclé stérile prélevé un peu de l‟échantillon à analyser et le déposer

sur une lame stérile (à 1cm du bord) ;

Ajouter une goutte d‟eau distillée et mélanger le tout pour obtenir une solution

homogène ;

Avec une lame à étalement réaliser un frottis et le fixer sur la flamme ;

Recouvrir la lame par le bleu de méthylène ;

Apres une minute rincer la lame à l‟eau distillée ;

Laisser la lame pour se sécher ;

Déposer sur la lame une lamelle stérile ;

Observer sous un microscope photonique.

Annexe IV

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Annexe

VI

Préparation des réactifs et solutions

Préparation du yaourt synthétique :

Le yaourt est préparé au laboratoire comme suite : 120g de poudre de lait entier

(LAHDA) est dissoute dans un litre d‟eau distillée et stérile. A ce lait, 80g de sucre et 3%

d‟inoculum (ferment lactique raison de 3g) sont additionnées. L‟incubation est durée 3 heures a

44°C. La multiplication des ferments lactiques est stoppée par le froid a 4°C.

Annexe n°04

Préparation des dilutions d’alcool

Le taux d‟alcool se mesure de la manière la plus facile avec un alcoomètre. C‟est un

instrument en verre ayant la forme d‟une ampoule lestée dans le fond surmontée d‟un tube

scellé hermétiquement et muni d‟une échelle graduée.

Il faut prolonger l‟alcoomètre dans une solution alcoolique (dont il doit flotté) Il suffit

donc de lire la graduation au niveau du liquide.

Pour 90° : on ajoute, à une alcool de 100°, 7.73ml d‟eau distillée.

Pour 85° : on ajoute, à un alcool de 100°, 14.73 ml d‟eau distillée.

Pour 80° : on ajoute, à un alcool de 100° ,22.45 ml d‟eau distillée.

Pour 70° : on ajoute, à un alcool de 100°, 40.85 ml d‟eau distillée.

Préparation des colorants

A-Hématoxyline de GROAT:

Solution A : Mélanger 1g de la poudre d‟hématoxyline avec 100ml d‟éthanol

Solution B : mélanger 1.6 d‟acide sulfurique avec 100ml d‟eau distillé, ajouter 2g d‟Alun de

fer puis on procède a une filtration.

On mélange la solution A et B.

B-Eosine aqueux 0.1%

On mélange 0.1g de poudre d‟éosine Y( (C20H6Br4na2O5) C.I.45380)dans 100ml

d‟eau distillé .

C-Eau gélatinée a 0.2%

Dans un bêcher, mélanger 0.2g de gélatine avec 100ml d‟eau distillé (utilisation

immédiate ou bien garder au congélateur).

Annexe V

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Annexe

VII

Annexe VI

Sérologie

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Annexe

VIII

Annexe VII

Témoin

Coupe Histologique d‟un estomac d‟un lapin témoin

(Sans aucun traitement et en bonne santé)

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Publication scientifique

202

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Résumé

Helicobacter pylori est une bactérie pathogène reconnu récemment pour ces implications dans les maladies gastro-

duodénales : ulcère duodénal, ulcère gastrique, lymphome gastrique du MALT et aussi du cancer gastrique. Sachant que les

bactéries lactiques notamment les Bifidobactéries jouent un rôle important dans les domaines biotechnologiques, médicaux et

dans la fabrication de produits alimentaires comme un meilleur conservateur vu leurs caractéristiques fort intéressantes et leurs

propriétés antimicrobiennes.

En se basant sur ces deux critères, nous avons commencé à réaliser l‟interaction bactérienne entre les bactéries

lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus bulgaricus CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum CUETM

89/29 et Helicobacter pylori en passant par trois étapes :

La mise en évidence d‟H.pylori, qui repose sur la réalisation de biopsies gastriques prélevées sur des patients

souffrants de multiples infections gastroduodénales. La culture H. pylori dans des milieux sélectifs et dans de meilleures

conditions de croissance nous a permet d‟isoler H.pylori. Pour compléter l‟identification de la bactérie, des tests biochimiques

étaient nécessaires en utilisant des galeries classiques API 20. A la fin de cette étape nous avons réalisé l‟antibiogramme,

important pour étudier la réaction d‟Helicobacter pylori vis-à-vis des antibiotiques utilisés.

Le test de Western blot HELICO BLOT 2.1 a incriminé H. pylori comme agent causal d‟ulcère chez onze (11)

patients sur un totale de seize (16).

La PCR a permis d‟identifier deux souches d‟H.pylori (SAN 158 et 26695) appartenants à la famille des Helicobacter.

L‟étude microbiologique des bactéries lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus bulgaricus

CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 nous a montré, que ces bactéries sont des Gram positif. Les tests

biochimiques nous ont permis d‟identifier le capitale enzymatique pour chacune des ces bactéries. La fermentation des sucres

était révélatrice car elle a confirmé l‟utilisation des sucres Glucose, Lactose, Saccharose comme source d‟énergie par cette

bactérie.

L‟interaction entre les bactéries lactiques et Helicobacter pylori a donné des résultats positifs observés par la

présence des zones d‟inhibitions, Bf.bifidum inhibe les souches de H.pylori avec un diamètre minimal d‟inhibition de 08 mm,

pour Lb. Bulgaricus de 05 mm et pour Sc. Thermophilus de 03 mm. Des tests supplémentaires sont nécessaires pour connaître

la nature exacte de l‟agent inhibiteur. Les résultats ont montré que la sécrétion des acides organiques et la production de

bactériocines-like sont à l‟origine de l‟inhibition. Les résultats de ces tests nous ont permis de constater la présence des

bactériocines produites par Bf. bifidum en bouillon MRS.

Les résultats des coupes histologiques indiquent que l'alimentation à base de Bf. bifidums en premier lieu défi a un

impact plus significatif sur l'inflammation due à H. pylori,

En fin, ces résultats suggèrent que les bactéries lactiques représentent un bon candidat utilisé pour prévenir l'infection

entérique humain.

Mots clés : Helicobacter pylori – Maladies gastroduodénales- Interaction - Bifidobacterium bifidum Biopsies gastriques –

Inhibition- Coupe histologique.

Summary

Helicobacter pylori is a pathogenic bacterium recently recognized for its implications in gastroduodenal diseases

duodenal ulcer, gastric ulcer, gastric MALT lymphoma and gastric cancer also. Knowing that lactic acid bacteria, including

Bifidobacteria play an important role in biotechnology, medical fields and in the manufacture of food products as a better

conservative seen their very interesting characteristics and antimicrobial properties.

Based on these criteria, we began to realize the interaction between lactic bacteria Streptococcus thermophilus CNRZ

447, Lactobacillus delbrueckii bulgaricus and Bifidobacterium bifidum CNRZ449 CUETM 89/29 and Helicobacter pylori

through three stages:

The detection of Helicobacter pylori based on the realization of the gastric biopsies from patients suffering of

multiples‟ gastroduodenal infections. H. pylori culture in selective media and better conditions of growth allows us to isolate

Helicobacter pylori. To complete the identification of the bacteria, biochemical tests were needed using standard API strips 20.

At the end of this stage we realized susceptibility testing, important to study the response of Helicobacter pylori against

antibiotics.

The Western blot test HELICO BLOT 2.1 H. Pylori has been implicated as ulcer causative agents in eleven (11)

patients with a total of sixteen (16).

PCR was used to identify two strains of Helicobacter pylori (SAN 158 and 26695) apartments for the family of

Helicobacter.

The microbiological study of lactic acid bacteria Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus delbrueckii

bulgaricus and Bifidobacterium bifidum CNRZ449 CUETM 89/29 has shown that these bacteria are gram positive.

Biochemical tests allow us to identify the enzyme capital for each of these bacteria. The fermentation of sugars was revealing

because it confirmed the use of glucose sugars, lactose, sucrose as an energy source by this bacterium.

The results of the interaction between the lactic acid bacteria and Helicobacter pylori revels the presence of

inhibitory zones. H. pylori strains with a minimum diameter of inhibition of 08 mm with Bf. bifidum, Lb. Bulgaricus is 05 mm

and for Sc. Thermophilus is 03 mm. Further tests are needed to determine the exact nature of the inhibitor. The results showed

that the secretion of the organic acids and the production of bacteriocins are responsible for the inhibition. The results of these

tests show the presence of bacteriocins produced by B. bifidum in MRS broth.

The results of histological sections indicate that the feeding of B. bifidums first challenge has a more significant

impact on inflammation caused by H. pylori.

In the end, these results suggest that lactic acid bacteria are a good candidate used to prevent human enteric infection.

Keywords: Helicobacter pylori - Gastrointestinal Diseases - Interaction - Bifidobacterium bifidum -Gastric biopsies -

Inhibition- histological section.