REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE … · A mes très chers frères Abdel Karim,...
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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE D’ORAN 1 AHMED BEN BELLA
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
DEPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE ET INDUSTRIELLE
Thèse
Présenté par
TABAK Souhila
Pour l’obtention
DU DIPLOME DE DOCTORAT
Spécialité : Microbiologie
Option : Microbiologie Alimentaire
Intitulé
Devant les membres du jury
Mr. BELKHODJA Moulay Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Président
Mr. BENSOLTANE Ahmed Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Rapporteur
Mr. CHEKROUN Abdellah Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Examinateur
Mr. CHIRIGUENE Abderrahim Professeur Université Mostaganem, Algérie Examinateur
Mr. GAMEL Ahmed Mohamed Ibrahim Professeur Université du Caire, Egypte Examinateur
Mr. NIAR Abdelatif M Professeur Université de Tiaret, Algérie Examinateur
Effet des bactéries lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus bulgaricus CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 sur
Helicobacter pylori (SAN 158 et 26695) responsable des maladies
gastroduodénales (in vitro et in vivo).
Année Universitaire: 2014-2015
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE D’ORAN 1 AHMED BEN BELLA
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
DEPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE ET INDUSTRIELLE
Thèse
Présenté par
TABAK Souhila
Pour l’obtention
DU DIPLOME DE DOCTORAT
Spécialité : Microbiologie
Option : Microbiologie Alimentaire
Intitulé
Devant les membres du jury
Mr. BELKHODJA Moulay Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Président
Mr. BENSOLTANE Ahmed Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Rapporteur
Mr. CHEKROUN Abdellah Professeur Université d‟Oran, Es-Sénia, Algérie Examinateur
Mr. CHIRIGUENE Abderrahim Professeur Université Mostaganem, Algérie Examinateur
Mr. DJAMEL Ahmed Mohamed Ibrahim Professeur Université du Caire, Egypte Examinateur
Mr. NIAR Abdelatif M Professeur Université de Tiaret, Algérie Examinateur
Effet des bactéries lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus
bulgaricus CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 sur Helicobacter
pylori (SAN 158 et 26695) responsable des maladies gastroduodénales
(in vitro et in vivo).
Année Universitaire: 2014-2015
Je tiens à remercier vivement ;
Mr le Pr. BenSoltane Ahmed, qui m’a suivi et orienté pendant toute la
période de mon travail. Je le remercie du fond de mon cœur pour ces précieux
conseils et de son soutien moral.
Mr le Pr. Belkhodja qui nous a fait l’honneur de présider le jury et estimer
mon travail.
A Mr le Pr. Chirigen A., Pr. Chegroun A., Pr. Djamel Ibrahim et Pr. Niar
A. qui m’ont fait l’honneur d’examiner ce travail.
Un remerciement particulier pour le Pr. Francis Mégraud et toutes
l‘équipes du Centre National des Campylobacter et Helicobacter-Bordeaux -
France pour leurs précieux aides et conseils.
Je remercie également tous ceux qui ont, de prés ou de loin, contribué à la
réalisation de ce modeste travail.
Mme Tabak Souhila
Après avoir remercié « ALLAH » le tout puissant qui m’a aidé d’accomplir
mes études, je tiens à dédier ce modeste travail a ceux qui mon aidé à affronter
cette vie, ceux qui je ne réussirais jamais à les remercier, A ceux que je porte
toujours dans mon cœur ;
Mon très cher père, qui m’a soutenu, protégé, et encouragé tout le long de
ma vie. Merci
Ma très chère mère qui m’a donné beaucoup d’affection et d’amour toute au
long de ma vie. Merci
A mon très cher mari qui ma bien soutenue et a mes petites filles Narimane et
Malek.
A mes très chères sœurs Fatima Zohra, Nesrine et Sabrine qui ont veillé sur moi
avec leurs grands cœurs.
A mes très chers frères Abdel Karim, Mohamed El Amine et hichem.
A toute la famille Tabak et Boussaid, Je les remercie pour leur amour et
leur soutien.
A mon âme sœur Doukani koula.
A la famille Doukani et Ouahrani.
A mes très chères collègues.
Mme Tabak Souhila
Résumé
Abstract
الملخص
Abréviations i
Liste des figures ii
Liste des tableaux ii
Listes des annexes iv
Introduction
Partie Bibliographique
Chapitre I : Revue Bibliographique d’ H. pylori
I-1 Historique d‟ H. pylori……………………………………………………………… 04
I-2 Taxonomie………………………………………………………………………….. 04
I-3 Etude bactériologique……………………………………………………………… 06
I-3-1 Caractères généraux…………………………………………………………… 06
I-3-1-1 Morphologie………………………………………………………….. 06
I-3-1-2 Physiologie…………………………………………………………… 08
I-3-1-3 Culturaux…………………………………………………………….. 09
I-3-1-4 Génétique……………………………………………………………. 09
I-3-2 Propriétés spécifiques de H. pylori ………………………………………….. 09
I-3-2-1 Sensibilité aux antibiotiques…………………………………………. 10
I-3-2-4 Réservoir de H. pylori………………………………………………………. 10
I-4 Epidémiologie………………………………………………………………………. 10
I-4-1 Prévalence de l‟infection à H. pylori…………………………………………. 10
I-4-2 Incidence de l‟infection………………………………………………………. 11
I-4-3 Où se trouve H. pylori?……………………………………………………….. 11
I-4-3-1 Chez l‟homme……………………………………………………….. 11
I-4-3-2 Chez l‟animal………………………………………………………… 12
I-4-3-3 Dans l‟environnement ………………………………………………. 12
I-4-4 Méthode de transmission……………………………………………………… 13
a- Méthode de transmission par voie orale orale…………………………….. 13
b- Méthode de transmission par voie fécale orale……………………………. 14
c- Méthode de transmission par voie gastro orale……………………………. 14
d- Méthode de transmission à partir de liquide gastrique…………………… 14
e- Méthode de transmission par l‟environnement…………………………… 15
f- Méthode de transmission par le risque professionnelle…………………… 15
I-5-1 Les facteurs de colonisation de H. pylori……………………………………... 16
I-5-1-1 Facteurs liée à la bactérie…………………………………………….. 16
I-5-1-2 Facteurs liée à l‟hôte………………………………………………….. 17
I-5-2 Le rôle pathogène de H.pylori………………………………………………... 18
I-5 -2-1Gastrite………………………………………………………………... 18
I-5-2-1-1 Gastrite aigue………………………………………………. 18
I-5-2-1-2 Gastrite chronique………………………………………….. 19
I-5-3 Comment un ulcère se forme-t-il?……………………………………………. 20
I-5-3-1 Ulcère gastrique………………………………………………………. 21
I-5-3-2 Ulcère duodénal………………………………………………………. 21
I-5-3-3 Dyspepsie non ulcéreuse……………………………………………… 22
I-5-4 Cancer gastrique………………………………………………………………. 22
I-5-5 Lymphome de MALT…………………………………………………………. 23
I-6 Méthode de diagnostique…………………………………………………………… 24
I-6-1Test invasif……………………………………………………………………... 24
I-6-1-1Test rapide à l‟urée.……………………………………………………. 25
I-6-1-2 Examen anatomopathologie………………………………………….. 26
I-6-1-3 Cytologie.……………………………………………………………... 26
I-6-1-4 Mise en culture……………………………………………………….. 27
I-6-1-5 Amplification génétique……………………………………………… 28
I-6-2 Test non invasif……………………………………………………………….. 29
I-6-2-1 Sérologie……………………………………………………………… 29
I-6-2-2 Test respiratoire………………………………………………………. 29
I-6-2-3 Test utilisant la salive………………………………………………… 29
I-6-2-4 Test de l‟urine………………………………………………………… 29
I-6-2-5 Test utilisant les selles………………………………………………… 29
I-7 Traitement…………………………………………………………………………. 30
I-7-1 Eradication de H pylori………………………………………………………... 30
I-7-2 Comment trait ont H-pylori?………………………………………………….. 30
I-7-3 Contrôle de l‟éradication……………………………………………………… 33
I-7-4 Echec de l‟éradication………………………………………………………… 33
I-7-5 Prise en charge des échecs d‟éradication……………………………………… 33
I-7-6 Vaccination contre H. pylori…………………………………………………... 34
Chapitre II : Bactéries lactiques
II-1 Définition…………………………………………………………………………... 35
II-2 Caractéristiques générales des bactéries lactiques…………………………………. 35
II-3 Habitats……………………………………………………………………………. 36
II-4 Taxonomie……………………………………………………………………….. 36
II-4-1 Caractères de classification………………………………………………… 36
II-4-2 Les différents genres des bactéries lactiques…………………………………. 37
II-4-2-1 Genre Streptococcus…………………………………………………. 37
II-4-2-2- Le genre Leuconostoc……………………………………………….. 37
II-4-2-3 Le genre Pediococcus……………………………………………… 38
II-4-2-4 Le genre Lactobacillus……………………………………………….. 38
II-4-2-5 Le genre Bifidobacterium………………………………………….. 40
II-5 Principales propriétés métaboliques des bactéries lactiques……………………….. 42
II-5-1 Les exigences nutritionnelles………………………………………………… 42
II-5-1-1 L‟utilisation des acides aminés libres………………………………. 42
II-5-1-2 L‟utilisation des peptides et des protéines du lait…………………… 42
II-5-1-3 L‟importance des vitamines du lait……….………………………… 42
II-5-2 Le métabolisme des sucres (la fermentation lactique)………………………. 42
II-5-2-1 Définition de la fermentation lactique……………………………... 42
II-5-2-2 Métabolisme du lactose……………………………………………. 42
II-5-2-3 Le bilan énergétique de la fermentation lactique…………………….. 43
II-5-2-4 Métabolisme des autres sucres……………………………………….. 43
II-5-2-5 Métabolisme du citrate et d‟autres substrats carbonés………………. 44
II-5-3 L‟activité protéolytique………………………………….…………………. 44
II-5-4 La production de polysaccharides………………………………………….. 44
II-5-5 La production de composes antagonistes…………………………………….. 45
II-6 Connaissance en génétique sur les bactéries lactiques…………………………… 45
II-6-1 Les bactériophages lactiques………………………………….……………. 45
II-6-2 Les plasmides résidents des bactéries lactiques……………………………. 45
II-7 Effets bénéfiques des bactéries lactiques sur la santé humaine………………….. 45
II-7-1 Amélioration de la digestion du lactose……………………………………. 46
II-7-2 Effets sur le transit et sur la flore intestinale……………………………….. 46
II-7-3 Effets sur la réponse immunitaire…………………………………………... 46
II-7-4 Rôle anti tumeur (cancérogenèse)…………………………………………... 47
II-7-5 Diminution du cholestérol sérique et déconjugaison des sels biliaires……... 47
II-7-6 Influence sur l‟absorption du calcium et des minéraux…………………….. 47
II-8 Devenir des bactéries lactiques ingérées…………………………………………… 47
Chapitre III: Interactions des bactéries lactiques.
III-1 Les phénomènes de stimulation ou de coopération………………………………... 49
III-2 Les phénomènes d‟antagonisme (d‟inhibition)……………………………………. 50
III-3 Facteurs d‟inhibition des bactéries lactiques………………………………………. 50
III-3-1 Les inhibiteurs non spécifiques………………………………………………. 50
III-3-1-1 Les inhibitions dues à la production d‟acides organiques…………… 50
III-3-1-2 Les inhibitions dues au peroxyde d‟hydrogène…………………….. 51
III-3-1-3 Autres inhibiteurs non spécifiques…………………………………... 51
III-3-2 Les inhibiteurs spécifiques « les bactériocines »…………………………….. 52
III-3-2-1 Définition……………………………………………………………. 52
III-3-2-2 Classification des bactériocines……………………………………... 52
III-3-2-3 Mode d‟action des bactériocines…………………………………….. 54
Partie expérimentale
Chapitre I : Matériel et méthodes……………………………………………………. 57
I-1 But du travail …………………………………….………………………………….. 57
I-2 Lieu et Période du travail……………………………………………………………. 57
I- 3 Matériels …………………………………….……………………………………… 57
I-3-1 Matière biologique ………………………….………………………………… 57
I-3-2 Appareillage et verreries……………………………………………………….. 58
I-3-3 Produits chimiques……………………………………………………………... 58
I-3-4 Indicateurs de couleurs ………………………………………………………… 58
I-3-5 Autres produits……………………………………………………………... … 59
I-3-6 Milieux de culture……………………………………………………………... 59
I-3-7 Matériel utilisés au laboratoire de Zoo technologie……………………………. 60
I-4 Méthodes ……………………………………………………………......................... 61
I-4-1 Protocole expérimentale……………………………………………………….. 61
I-5 Etude bactériologique Helicobacter pylori……………………………………...... 62
I-5-1Isolement d‟H-pylori…………………………………………………………… 62
I-5-2 Examen microbiologique………………………………………………………. 63
I-5-2-1 La culture……………………………………………………………... 63
I-5-2-2 Identification ……………………………………………..…………... 63
I-5-3 Tests biochimique……………………………………………………………… 64
I-5-4 Antibiogramme……………………………………………………………........ 66
I-5-5 Purification…………………………………………………………….............. 66
I-5-6 I-5-6 Détection de Helicobacter pylori et détermination de la résistance à la
clarithromycine par PCR en temps réel………………………………………..
66
I-5-7 Test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1)…………………………….. 68
I-5-8 Conservation des souches……………………………………………………… 69
I-6 Interaction bactérienne…………………………………………………………..... 70
I-6-1 Purification et Conservation……………………………………………………….. 70
I-6-2 Pré identification …………………………………………………………….... 70
I-6-2-1 Etude morphologique……………………………………………......... 69
I-6-2-2 Etude physiologique………………………………………………...… 70
I-6-2-3 Etude biochimique …………………………………………………… 70
I-6-2-4 La diminution du pH par les bactéries lactiques……………………… 70
I-6-3 Test de l‟antagonisme………………………………………………………….. 71
I-6-3-1 Préparation des prés cultures ………………………………………… 71
I-6-3-2 Détection de l‟activité antagoniste des bactéries lactiques…………… 71
I-6-4 Recherche des agents d‟inhibitions (bactériocines)…………………………… 74
I-7 Etude in vivo……………………………………………………………................... 76
I-7-1 Les étapes de la dissection ………………………………………………......... 77
I-7-2 - Les étapes de la réalisation des coupes histologiques………………………… 79
Chapitre II : Résultats
II-1 Résultats de l’identification d’ Helicobacter Pylori …………………………….
84
II-1-1-Etudes bactériologiques ……………………………………………………… 84
II-1-2 La culture……………………………………………………………...………. 84
II-1-1-1 Aspect macroscopique ……………………………………………… 84
II-1-1-2 Aspect microscopique………………………………………………... 85
II-1-3 Etude Biochimique…………………………………………………………… 86
II-1-4 Antibiogramme …………………………………………………………….... 89
II-1-5 Résultat du test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1)………………… 90
II-1-6 Résultat de la PCR……………………………………………....................... 91
II-2 Résultats de l’interaction bactérienne…………………………………………. 93
II-2-1 Résultats du pré identification des souches lactiques ………………………… 93
II-2-2 Les résultats de la mesure du pH et l‟acidité des bactéries lactiques ………... 97
II-2-3 Dénombrement ……………………………………………………………...... 97
II-2- 4Test de l‟antagonisme ………………………………………………………… 99
II-2- 4-1 Recherche des inhibitions …………………………………………… 99
II-2- 4-1 Recherche de bactériocine ………………………………….............. 101
II-3 Résultats de l’étude in vivo……………………………………………………...... 103
II-3-1 Résultats du Lot A …………………………………………………............... 103
II-3-2 Résultats du Lot B……………………………………………….................... . 107
Chapitre II : Discussion
III-Discussion des résultats…………………………………………………………….
III-1 Isolement et identification des souches de H.pylori…………………………… 111
III-2 Pré identification des bactéries lactiques………………………………………. 112
III-3 Interaction bactériennes………………………………………………………… 113
III-4 Discussion des résultats in vivo………………………………………………… 116
Conclusion……………………………………………………………............................. 119
Perspective……………………………………………………………............................ 121
Références Bibliographiques………………………………………………………….. 122
Annexe
Publication scientifique
i
Résumé
Helicobacter pylori est une bactérie pathogène reconnu récemment pour ces
implications dans les maladies gastro-duodénales : ulcère duodénal, ulcère gastrique,
lymphome gastrique du MALT et aussi du cancer gastrique. Sachant que les bactéries lactiques
notamment les Bifidobactéries jouent un rôle important dans les domaines biotechnologiques,
médicaux et dans la fabrication de produits alimentaires comme un meilleur conservateur vu
leurs caractéristiques fort intéressantes et leurs propriétés antimicrobiennes.
En se basant sur ces deux critères, nous avons commencé à réaliser l‟interaction
bactérienne entre les bactéries lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ 447,
Lactobacillus bulgaricus CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 et
Helicobacter pylori en passant par trois étapes :
La mise en évidence d‟H.pylori, qui repose sur la réalisation de biopsies gastriques
prélevées sur des patients souffrants de multiples infections gastroduodénales. La culture H.
pylori dans des milieux sélectifs et dans de meilleures conditions de croissance nous a permet
d‟isoler H.pylori. Pour compléter l‟identification de la bactérie, des tests biochimiques étaient
nécessaires en utilisant des galeries classiques API 20. A la fin de cette étape nous avons
réalisé l‟antibiogramme, important pour étudier la réaction d‟Helicobacter pylori vis-à-vis des
antibiotiques utilisés.
Le test de Western blot HELICO BLOT 2.1 a incriminé H. pylori comme agent causal
d‟ulcère chez onze (11) patients sur un totale de seize (16).
La PCR a permis d‟identifier deux souches d‟H.pylori (SAN 158 et 26695)
appartenants à la famille des Helicobacter.
L‟étude microbiologique des bactéries lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ
447, Lactobacillus bulgaricus CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 nous a
montré, que ces bactéries sont des Gram positif. Les tests biochimiques nous ont permis
d‟identifier le capitale enzymatique pour chacune des ces bactéries. La fermentation des sucres
était révélatrice car elle a confirmé l‟utilisation des sucres Glucose, Lactose, Saccharose
comme source d‟énergie par cette bactérie.
L‟interaction entre les bactéries lactiques et Helicobacter pylori a donné des résultats
positifs observés par la présence des zones d‟inhibitions, Bf.bifidum inhibe les souches de
H.pylori avec un diamètre minimal d‟inhibition de 08 mm, pour Lb. Bulgaricus de 05 mm et
pour Sc. Thermophilus de 03 mm. Des tests supplémentaires sont nécessaires pour connaître
la nature exacte de l‟agent inhibiteur. Les résultats ont montré que la sécrétion des acides
organiques et la production de bactériocines-like sont à l‟origine de l‟inhibition. Les résultats
de ces tests nous ont permis de constater la présence des bactériocines produites par Bf.
bifidum en bouillon MRS.
Les résultats des coupes histologiques indiquent que l'alimentation à base de Bf.
bifidums en premier lieu défi a un impact plus significatif sur l'inflammation due à H. pylori,
En fin, ces résultats suggèrent que les bactéries lactiques représentent un bon candidat
utilisé pour prévenir l'infection entérique humain.
Mots clés
Helicobacter pylori – Maladies gastroduodénales- Interaction – Bifidobacterium bifidum -
Biopsies gastriques –Inhibition- Coupe histologique.
ii
Summary
Helicobacter pylori is a pathogenic bacterium recently recognized for its implications
in gastroduodenal diseases duodenal ulcer, gastric ulcer, gastric MALT lymphoma and gastric
cancer also. Knowing that lactic acid bacteria, including Bifidobacteria play an important role
in biotechnology, medical fields and in the manufacture of food products as a better
conservative seen their very interesting characteristics and antimicrobial properties.
Based on these criteria, we began to realize the interaction between lactic bacteria
Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus bulgaricus and Bifidobacterium
bifidum CNRZ449 CUETM 89/29 and Helicobacter pylori through three stages:
The detection of Helicobacter pylori based on the realization of the gastric biopsies
from patients suffering of multiples‟ gastroduodenal infections. H. pylori culture in selective
media and better conditions of growth allows us to isolate Helicobacter pylori. To complete the
identification of the bacteria, biochemical tests were needed using standard API strips 20. At
the end of this stage, we realized susceptibility testing, important to study the response of
Helicobacter pylori against antibiotics.
The Western blot test HELICO BLOT 2.1 H. Pylori has been implicated as ulcer
causative agents in eleven (11) patients with a total of sixteen (16).
PCR was used to identify two strains of H.pylori (SAN 158 and 26695) apartments for
the family of Helicobacter.
The microbiological study of lactic acid bacteria Sc.thermophilus CNRZ 447,
Lb.bulgaricus and Bf.bifidum CNRZ449 CUETM 89/29 has shown that these bacteria are
gram positive. Biochemical tests allow us to identify the enzyme capital for each of these
bacteria. The fermentation of sugars was revealing because it confirmed the use of glucose
sugars, lactose, and sucrose as an energy source by this bacterium.
The results of the interaction between the lactic acid bacteria and H.pylori revels the
presence of inhibitory zones. H. pylori strains with a minimum diameter of inhibition of 08
mm with Bf. bifidum, Lb. Bulgaricus is 05 mm and for Sc. Thermophilus is 03 mm. Further
tests are needed to determine the exact nature of the inhibitor. The results showed that the
secretion of the organic acids and the production of bacteriocins are responsible for the
inhibition. The results of these tests show the presence of bacteriocins produced by Bf. bifidum
in MRS broth.
The results of histological sections indicate that the feeding of Bf. bifidums first
challenge has a more significant impact on inflammation caused by H. pylori.
In the end, these results suggest that lactic acid bacteria are a good candidate used to
prevent human enteric infection.
Keywords: Helicobacter pylori - Gastrointestinal Diseases - Interaction - Bifidobacterium bifidum -
Gastric biopsies -Inhibition- histological section.
iii
الملخص
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CUETM 89/29 :مهيليكوبرت ب بيلوي ري عالت ةالث ريآلمل ل
ملسكشااان عااا هيليكوبااارت ب بيلاااوي علاااه سااارتة ل يااال ملخللعااارت مل ألااا ق ريااا مل آل.اااه ملسااا ل لألااارت ون ريااا ملسةهااارت ريألااا . ملس يرتساي . م ارتلا 02API رتا ملالعةبرتيمل ملسبيو ي يرت يا برتساةا ملم ااآلمل السةك رتت ملسةألآل عله ملسبكة لرت، مهجرتك
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Lactobacillus bulgaricus CNRZ449 م Bifidobacterium bifidum ن ها ري ملسبكة لارت واباا س اابغ اااآلملم. ملالعةباارتيمل ملسبيو ي يرت ياا عةااي سجاارت ملسةألااآل مل ل ااك فاا ري ملسبكة لاارت. معكشاان ملسااةا ملم ملساااكآللرت هاام مل
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ريجاارتطل عثبااي ريااع مل اا هيليكوباارت ب بيلااوي م عيااه ةاارت وحرتبياا سااو رياا ماااودو ملسةفرتعاال باا بكة لاارت محااض ملسلبجياا Lactobacillus ريلام ت 22. م Bifidobacterium bifidum ريلام عثباي ت 20ملمدىن لبلا يآلهارت
bulgaricus CNRZ449 ريلام ت 20و Streptococcus thermophilus مهجارتك رتاا وم ريللاهم bacteriocinsرتن ملسألضول مو ةرتج ري ملالعةبرتيمل سةح ل ملسيبيأل ملس ي سل رت ع. م تهآل ملسجةرت ن و آلملز ملممح
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اي عاةا م جع ملسأل مى مل ألو ملسبشآل . ملسجهرتل ، عش ه ري ملسجةرت وم ن بكة لرت محض ملسال ةي هو ريآلا
الكلمات المفاتيحية:ب - بيلوي هليكوباكتر B. BIFIDUMS ملفض م ملجلهرتز ريآلملن - - .ملسجايمم ام - ملسبكة لرت ب ملسةفرتعل
iv
ABREVIATION
A H. pylori: Adhesin H. pylori
ADN : Acide désoxyribonucléique
ACH : Acetycholine
AG : Antigéne
AIF-1: Anti inhibitor factor-1
AINS: Anti-inflammatoire non steroiden
ARN: Acide ribonucléique
AS: Antisécrétoire
BAB : Blood group antigen
Bf: Bifidobactérium
CCK: Coléckcystokinine
CD: Cluster of differentiation
C-G: Cytosine - Guanine.
CSF: Colony stimulating factors
CMH: Complex majeur d‟histocompatibilité
DNU : Dyspepsie non ulcéreuse
E : Escherichia
EGF: Epidermal growth factor.
ET1: Endothéliale
F6PPK: Fructose 6 Phosphate Phosphorylase
GA: Gastrite aigue
GC : Gastrite chronique
GRP : Gastrin Relasing peptide
Halo : zone d‟inhibition
Vac A: Vacuolising associated cytotoxin
Hp-NAP: Helicobacter pylori neutropphile
activating peptide.
H : Helicobacter
HsP : Protéines de stress
IgA: Immulogglobuline A
IgG: Immulogglobuline G
IgM: Immulogglobuline M
La: Lactobacillus
IL8: Interleukine 8
KD: Kilo Dalton
MALT: Mucosa Associated Lymphoid
Tissue
MCP: Monocyte chemoattracant protéine
MIP1: Macrophage inflammatory protein
MRS: De Man Rogosa Sharp
NF: Nuclear factor
NO: Monoxyde
PCR: Plymerase chain reaction
PH: Potential ions Hydrogen
PN : Polynucleaires
REDOX : Orydo-réduction
SM : Souche ensemencée en touché
ST : Souche ensemencée en masse
Sc : Streptococcus
SS : Somatostatine
UD: Ulcère duodénal
UG: Ulcère gastrite
v
LISTE DES FIGURES
Figure 31 : La déshydratation des tissus dans des bains d‟alcool. 80
Figure 32 : Inclusion a la paraffine. 80
Figure 33 : Préparation des blocs des différentes parties du tube digestif du lapin. 81
Figure 34 : Lames après coloration « hématoxyline-éosine ». 83
Figure 01 : Relation phylogénétique de H.pylori avec certaines bactéries à Gram négatives 05
Figure 02 : La forme H. pylori sur microscope électronique 06
Figure 03 : Gastrique chronique 19
Figure 04 : Différents grades d‟atrophie de la muqueuse gastrique Fundique 20
Figure 05 : Métaplasie intestinale observée par la technique dit du tes- tape 20
Figure 06 : Formation de l‟ulcère 21
Figure 07 : Cancer gastrique superficiel 23
Figure 08 : Lymphome de MALT 24
Figure 09 : Les différents tests pour le diagnostic de H.pylori 25
Figure 10 : Etude anatomopathologique : H. pylori après différents colorations 27
Figure 11 : Aspect macroscopique des colonies d‟ H. Pylori sur Gélose chocolat après 5 jours
d‟incubation à 37°C en atmosphère micro-aérophile
28
Figure 12 : Streptococcus thermophilus sur Microscopie électronique à balayage 38
Figure 13 : Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus 39
Figure 14 : Association du Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus 40
Figure 15 : La symbiose des bactéries du yaourt
Figure 16 : Mode d‟action des bactériocines
50
54
Figure 17 : Lapines dans l‟animalerie 58
Figure 18 : Protocole expérimental 61
Figure 19 : Le protocole expérimental de l‟isolement et identification D‟ Helicobacter pylori 62
Figure 20: L‟étude biochimique sur des galeries (API 20 Campy) 65
Figure 21: Test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1) 69
Figure 22 : Les bandelettes de nitrocellulose 69
Figure 23 : Protocole expérimental de la méthode de diffusion par disques 73
Figure 24 : Schéma représentant la recherche de bactériocines
Figure 25 : Schéma représentant de l‟étude in vivo
75
76
Figure 26 : Fixation et dissection du lapin 77
Figure 27 : Observation du tube digestif 77
Figure 28 : Organisation du tube digestif 78
Figure 29 : Le contenue de l‟Estomac 78
Figure 30 : Un fragment de l‟Estomac 79
vi
Figure 35 : Incubation de H. pylori dans une jarre a anaérobiose. 84
Figure 36 : Aspect macroscopique des colonies d‟H.pylori après 5 jours d‟incubation à 37°C en
atmosphère micro-aérophile
85
Figure 37 : Aspect microscopique de H.pylori. 85
Figure 38 : Résultat de l‟oxydase 87
Figure 39 : Résultat de catalase 87
Figure 40 : Résultat du teste d‟urée 88
Figure 41 : Résultat de la DNAse 88
Figure 42 : Les résultats de l‟identification biochimique des trois souches isolées de H.pylori
utilisant des API 20 campy.
89
Figure 43 : le Figure 43 : Les Résultats de l‟antibiogramme sur Gélose Mueller Hinton + 5% de sang de mouton 89
Figure 44 : Résultats du test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1 91
Figure 45 : Contrôles de la PCR : 4 témoins (WT, G, C et TNEG) 91
Figure 46 : Résultat positive et sensibilité à la clarithromycine de la PCR de la souche SAN 148 92
Figure 47 : Résultat positive et sensibilité à la clarithromycine de la PCR de la souche 26695 92
Figure 48 : Culture de Lactobacillus bulgaricus sur le milieu MRS agar. 94
Figure 49 : Culture de Streptococcus thermophilus sur le milieu M17 agar 94
Figure 50 : Culture de Bifidobacterium bifidum sur le milieu MRSè Cyst agar. 95
Figure 51 : Aspect microscopique de Lb. bulgaricus après la coloration de Gram (G×100). 96
Figure 52 : Aspect microscopique de Sc. thermophilus après la coloration de Gram (G×100). 96
Figure n° 53 Figure 53 : Aspect microscopique de Bifidobactérium bifidum après la coloration de Gram
(G×100).
96
Figure 5 Figure 54 : La croissance de Bf. bifidum, Lb. Bulgaricus, Sc. Thermophilus et H. pylori 99
Figure 55 : Figure 55 : Méthode de diffusion par disques 100
Figure 56 : Résultats de l‟antagonisme de H. pylori avec les trois bactéries lactique 100
Figure 57 : Résultats de l‟antagonisme de H. pylori avec Bf.bifidum. 101
Figure 58 : La croissance H. pylori en présence de bactériocines – like produite par Bf.bifidum. 102
Figure 59 : Tube digestif d‟un lapin traité par probiotiques 14 jours (Lot A) 103
Figure 60 : Tube digestif d‟un lapin traité par probiotiques 28 jours (Lot A) 103
Figure 61 : Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique pendant 14 J (G×40) (Lot A) 104
Figure 62 : Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique pendant 28 J (G×40) (Lot A) 104
Figure 63 : Tube digestif 14 jours après prise de H. pylori (LotA) 105
Figure 64 : Tube digestif 28 jours après prise de H. pylori (Lot A) 105
Figure 65 : Coupe histologique de l‟estomac avec injection de H. pyloti pendant 4J (G×40) (Lot A) 106
Figure 66 : Coupe histologique de l‟estomac avec injection de H. pyloti pendant 8J (G×40) (Lot A) 106
Figure 67 : Tube digestif 14 jours après prise de H. pylori (Lot B) 107
Figure 68 : Tube digestif 28 jours après prise de H. pylori (Lot B) 107
Figure 69 : Coupe histologique de l‟estomac avec injection de H. pyloti pendant 14 J (G×40) (LOT B) 108
Figure 70 : Coupe histologique de l‟estomac avec injection de H. pyloti pendant 28 J (G×40) (LOT B) 108
vii
Figure 71 : Caecum irrité (Lot B) 109
Figure 72 : Présence de gaz dans l‟estomac et intestin grêle. (Lot B) 109
Figure 73 : Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique pendant 14J (G×40) (Lot B) 110
Figure 74 : Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique pendant 28 J (G×40) (Lot B) 110
viii
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 01 : Espèce des genres Helicobacter pylori 05
Tableau 02 : Le point actuel sur le réservoir et les sources d'infection 13
Tableau 03 : Sites où H.pylori peut être retrouvé chez l'homme en cas d'infection 13
Tableau 04 : Synthèses des caractéristiques des molécules actives sur H. pylori en monothérapies 31
Tableau 05 : Différentes bases du traitement anti-H. Pylori, dosage et Durée 32
Tableau 06 : Les différents milieux écologiques des BLs 36
Tableau 07: Les différents genres des BLs 38
Tableau 08 : Critères différentiels des 3 groupes de Lactobacillus 39
Tableau 09 : Les différents types des ferments lactiques 43
Tableau 10 : Exemples de bactéries lactiques utilisées dans la fermentation des aliments 44
Tableau 11 : Principaux rôles bénéfiques pour la santé humaine des bactéries lactiques 46
Table Tableau 12 : Pourcentages de survie de quelques bactéries d‟origine alimentaire dans l‟intestin grêle
humain
48
Tableau 13 : Classification des bactériocines de bactéries lactiques
Tableau 14 : Préparation des Mix PCR
53
67
Tableau 15 : Caractérisation biochimique des différentes souches de H. pylori 86
Tableau 16 : Antibiogramme des souches de H. pylori isolées. 90
Tableau 17 : Résultats d‟identification des souches lactiques. 93
T Tableau 18 : Diminution du pH par les deux souches lactiques cultivées dans le bouillon approprié
(MRS ou M17 liquide) pendant 48 h à 37°C.
97
Tableau 19 : Résultats de la densité optique de Bf. bifidum, Lb. blgaricus, Sc. Thermophilus et
H.pylori
97
Tableau 20 : Dénombrements de Bf. bifidum, Lb. blgaricus, Sc. Thermophilus et H.pylori 98
Tableau 21 : Résultats de l‟antagonisme de H. pylori 99
ix
Liste des Annexes
Annexe I : Caract éristiques biochimiques et culturales de C. jejuni, H. pylori, H. mustelae et W.
succinogènes
I
Annexe II : Sensibilité d‟ H. pylori aux antibiotiques
II
Annexe III : Composition des différents milieux de culture
III
Annexe IV : Technique de la coloration de Gram
IV
Annexe V : Préparation des réactifs et solutions
V
Annexe VI : Sérologie
VI
Annexe VII : Coupe histologique du lapin témoin
VII
Introduction
2
1- Introduction
Helicobacter pylori est une bactérie fut découverte accidentellement en 1982 par deux
chercheurs australiens, Robin Warren (pathologiste) et Barry Marshall (gastroentérologue),
qui isolaient et cultivaient des organismes à partir d'estomacs humains.
Mais la découverte du rôle d‟H. pylori, dans quelques-unes des maladies
gastroduodénales est venue bouleverser les concepts physiopathologiques jusqu‟alors retenu
(Fagniez, 1995).
Helicobacter pylori est impliqué dans la genèse de la majorité des gastrites chroniques,
dans les maladies ulcéreuses, duodénale ou gastrique, dans la dyspepsie non ulcéreuse ou
indirectement dans la survenue du lymphome ou cancer gastrique (Ferrero et al., 1995), on a
récemment suspecté puis confirmé que H. pylori pouvait contribuer à la survenue de la maladie
de Parkinson et les recherches sont en cours d'approfondissement (Chuan et al., 2005).
C‟est en tout cas un excellent marqueur de ces maladies (Fauchère., et Rosenau.,
1991). Puisque 80 % des ulcères gastro-duodénaux sont causés par des infections de H. pylori,
même si, chez beaucoup d'humains infectés, la maladie reste asymptomatique.
Helicobacter pylori est une bactérie très commune (trouvée chez 50 % des humains).
Elle vit exclusivement dans l'estomac humain et est la seule bactérie connue pouvant survivre
dans un environnement aussi acide. Son enveloppe hélicoïdale pourrait l'aider à se visser dans
le mucus de la paroi stomacale afin de la coloniser et d'y persister.
Mais depuis la découverte des probiotiques, ces dernières suscitent l‟intérêt des
médecins et des nutritionnistes en raison de leur absence en pathogéneicité et de leur réputation
de protection vis à vis des gastro-entérites (Marteau et Seksik., 2005).
Les bactéries lactiques comptent parmi les principaux probiotiques. Leur nom générique
vient du fait qu‟elles produisent de l‟acide lactique. Elles comprennent, notamment, les
lactobacilles (bactéries du genre Lactobacillus), les bifidobactéries (bactéries du genre
Bifidobacterium) et certains streptocoques (bactéries du genre Streptococcus).
Ce sont des bactéries de ce type qui servent généralement à la production du yogourt
(Lb. bulgaricus, Sc. thermophilus), de la choucroute, des légumes lactofermentés et du salami
(Lb. plantarum)
Introduction
0
Les probiotiques agissent par 3 principaux mécanismes (Penner et al., 2005) :
Le premier consiste à moduler l‟activité du système immunitaire intestinal (Haddad et
al., 2005).
Les probiotiques renforcent l‟immunité lorsqu‟elle est faible, par exemple, au moment
du développement du système immunitaire chez l‟enfant, ou de son vieillissement chez les
personnes âgées.
Ils diminuent également la suractivation du système immunitaire, notamment dans les
cas d‟allergies ou des maladies inflammatoires de l‟intestin. En second lieu, les probiotiques
augmentent la fonction de barrière de la muqueuse intestinale, par exemple en accentuant la
production de mucus ou des anticorps de type IgA.
Finalement, les bactéries lactiques ont des effets antimicrobiens directs, en prenant la
place des bactéries pathogènes (phénomène de compétition) et en empêchant leur adhésion à la
paroi intestinale.
Ces bactéries produisent de l‟acide lactique et de l‟acide acétique qui ont pour effet
d‟abaisser le pH et de limiter la croissance de certains germes pathogènes. (Rasick et
Kurmann, 1983).
La limitation de la croissance de ces dernières est également due à la production par les
bifidobactéries de H2O2 et des bactériocines. Pour cela, de nouvelles stratégies sont mises en
place pour l‟utilisation de ces bactéries pour limiter la croissance de H.pylori dès l‟enfance.
Pour ces raisons citées précèdement nous allons nous s‟intrésser à mettre en évidence
l‟effet probiotique in vitro et in vivo de ces quelques bactéries lactiques sur H .pylori et le
travail sera organisé comme suit :
1-Une revue bibliographique, comprenant trois chapitres
Une étude concernant la bactérie H. pylori où nous avons retenu les aspects
microbiologiques, épidémiologiques, physiopathologiques, thérapeutiques et les tests
diagnostiques.
Une synthèse sur les caractéristiques générales des bactéries lactiques et
principalement le genre Bifidobacterium qui a un intérêt thérapeutique.
Les différents phénomènes l‟interaction bactérienne sont expliqués dans le
dernier chapitre.
Introduction
0
2- La méthodologie permettant dans un premier temps ;
L‟isolement et Identification d’Helicobacter pylori, responsables de certaines
maladies gastro-duodénale.
Dans un deuxième temps une pré identification des bactéries lactiques
Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus bulgaricus CNRZ449 et
Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 et la réalisation d‟un test d‟antagonisme afin de
démontrer l‟inhibition Helicobacter pylori par les bactéries lactiques.
Dans un troisième temps, nous réalisons in vivo l‟effet probiotique
Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29.
3- Les résultats et la discussion sont présentés dans la troisième partie.
Revue Bibliographique
d'Helicobacter pylori
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
4
I-1 Historique
La découverte d'H. pylori a commencé en 1981 par Barry Marshall durant son stage de
gastro-entérologie, ou il a rencontré Robin Warren, qui avait un intérêt particulier pour les
bactéries spiralées de l‟estomac, bactérie qu'il avait observé après coloration argentique de
biopsie gastrique dès 1979 (Warren et al., 1983).
Il élabora ainsi le protocole d'une étude endoscopique portant sur 100 patients qui débuta
en avril 1982 et bénéficia d'une mise de culture micro- aérobie systématique des biopsies
gastriques. La survenue d'une épidémie d'infection à staphylocoque résistant mobilisa
cependant toute l'équipe du laboratoire de microbiologie durant le week-end de pâque, qui
abandonna bien involontairement pendant cinq jours les prélèvements dans un incubateur.
Hasard de la recherche, ce temps d'incubation plus prolongé que d'habitude permit la première
culture d‟H. pylori, tout d'abord identifié comme un organisme voisin des campylobacters
«campylobacter like organisme » ou CLO (Marshall., 1996).
Mais l'examen microscopique électronique de ces biopsies et les cultures ont montré que
cette bactérie était au moins une nouvelle espèce et peut être un nouveau genre car elle avait
plusieurs flagelles engainés, à la différence des Campylobacter entériques qui n'avait qu'un
seul flagelle non- engainé (Goodman et al., 1996) ; le nom a été modifié en Campylobacter
pylori et fut définitivement appelé Helicobacter pylori, du fait de ces particularités
génomiques et fonctionnelles notamment enzymatiques. Cette découverte a conduit à admettre
que l‟estomac, jusqu'alors considéré comme peu propice à la multiplication bactérienne en
raison de son pH très acide, pouvait être le siége d'une croissance bactérienne (Wyatt., 1996).
Depuis la première culture en 1982, le nombre de publications a augmenté de manière
exponentielle et a permis de mieux comprendre les nombreux travaux précédents qui ont
concerné la microbiologie, la biochimie et l'histologie de la muqueuse gastrique après un
certain scepticisme de la part des médecins (Lamoulaitte et al., 1992).
I-2 Taxonomie d’ Helicobacter pylori
Le genre Helicobacter a été créé en 1989 avec H.mustelae et H. pylori (Avril, 1988)
bactéries préalablement placées dans le genre Campylobacter. Il fait partie de la famille des
Spérilaçae et du groupe Vibrion (Axon., 1997). Ce groupe réunit les genres : Campylobacter,
Helicobacter, Acrobacter et Wollinella. Depuis une dizaine d‟années, d‟autres espèces ont
été découvertes ou reclassées dans ce genre, la plupart colonisent l‟estomac de différents
animaux. Les dernières espèces identifiées ne sont pas encore officiellement reconnues est ce
sont : H. canis (du chien) et H. hepaticum (chez la souris) (Mégraud et al., 1999) (Tab. 01 et
Fig. 01).
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
2
Tableau 01. Espèce des genres Helicobacter pylori d‟après Mégraud et Lamouliatte., 1997
Espèces Niche Ecologique Site D’infection
H.pylori
H.cinaedi
H.fennelliae
H.mustelae
H.felis
H.muridarum
H.nemestrinase
H.acinonyx
H.heilmanu
H.canis
H.hepaticum
Flexispira rappin
Homme
Hamster, Homme Chien, Chat
Furet
Chien, Chat
Souris
Singe macaque
Léopard
Chat, Chien
Chien
Souris
Souris
Estomac Intestin Intestin Estomac Estomac Intestin Estomac Estomac Estomac Intestin Intestin, foie Intestin
Figure 01. Relation phylogénétique de Helicobacter pylori avec certaines bactéries à Gram
négatives d‟après Mégraud et Lamouliatte., 1997
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
1
I-3 Etude bactériologique
I-3-1 Caractères généraux
Helicobacter pylori peut être considéré comme le chef d‟un nouveau groupe de bactéries
appelées superfamille VI de bacilles gram négatif. Elle représente le genre H. pylori qui est
distinct du genre Campylobacter et de la famille des Vibrionaceae ; elle fait partie des bactéries
qui colonisent le mucus digestif. Ce genre réunit les genres Campylobacter, Helicobacter,
Arcobacter et Wallinla (Sobhani et al., 1995).
II-3-1-1Caractères morphologiques
Helicobacter pylori développe de petites colonies de 1 à 2 mm de diamètre, transparentes
ou grisâtres, luisantes, discrètement bombées, rondes et régulières (Biomerieux, 1994 ; Cellini et
al., 1995; Sobhani et al., 1995 ; Mégraud et al., 1998). C‟est un bacille à gram négatif de 3 à 5
µm de long et 0.5 à 1 µm de large (Fléjou, 1989 ; Biomerieux., 1994 ; Avril., 1988).
Helicobacter pylori se présente sous forme spiralée, incurvée ou en forme de U ou O
dans les jeunes cultures (Sobhani et al., 1995 ; Fauchère., 1994 ; Fauchère et Rosenau, 1991)
pouvant évoluer vers des formes coccoïdes non cultivables dans les vielles cultures et seraient
pour certains des formes de dégénérescence, pour d‟autres des formes de résistance
(Biomerieux., 1994; Cellini et al., 1994 ; Sobhani et al., 1995 ; Mégraud., 1994 ; Fauchère.,
1994 ; Fauchère et Rosenau., 1991).
C‟est une bactérie non sporulée (Vincent, 1999), mobile par 4 à 6 flagelles unipolaires
engainés, (Sobhani et al., 1995 ; Vincent., 1995 ; Fauchère., 1994 ; Fléjou., 1989) ce qui lui
confère une grande mobilité par frétillement et par des mouvements de rotation caractéristiques
(Sobhani, et al., 1995). Chaque flagelle possédant un bulbe terminal qui le distingue des autres
campylobacters (Fléjou, 1989). (Fig. 02)
Figure 02. La forme Helicobacter pylori sur microscope électronique d‟après Mégraud, 1994
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
7
Organisation Interne
Helicobacter pylori a un cytoplasme dense contenant le matériel nucléaire, des ribosomes et
a une structure de paroi des bactérie à Gram négatif avec une membrane externe et une
membrane cytoplasmique séparées par un espace péri plasmique, le tout d'une épaisseur de 3 nm
(Goodwincs., 1989; Jones et al., 1985). En général, elle possède de 4 à 6 flagelles, (Sobhani et
al., 1991) et on observe un bulbe ou un disque à l‟extrémité distale de ses flagelles que l‟on ne
retrouve pas chez les espèces de Compylobacter (Jones., 1985 ; Kaspar., 1989 ; Sobhani et al.,
1991).
L'insertion du flagelle est associée avec une zone translucide mais pas exactement en dessous
: il existe une bande d'une épaisseur de 6 à 8 nm, dense aux électrons, qui se trouve à environ 20
nm sous la membrane cytoplasmique (Lee., 1998) ; c'est ce qu'on appelle la membrane
polaire. L‟association de cette structure avec le complexe basal du flagelle n'est pas clairement
définit, il pourrait s'agir d'une structure spécialisée qui a évalué en tant qu'endroit ou l'énergie
nécessaire à la mobilité ou à la synthèse de la paroi est produite.
la surface de la cellule bactérienne
Des coupes d‟H pylori à la glutaraldehyde et au rouge Ruthénium ou à l'acide tannique
montrent la présence d'une couche externe de glycocalyx (Goodwin et al, 1989). Les
colorations négatives de ces organismes montrent la présence de structures circulaires au
niveau de la paroi qui ont un diamètre déférent (Jones et al., 1985). Quand on traite les cellules
bactériennes par des sacrosaintes, un grand nombre de ces structures circulaires deviennent
visibles ainsi que des disques de 80 nm de diamètre. Le traitement avec la trypsine et la chaleur
conduit à la disparition des structures précédentes suggérant qu‟elles sont de nature protéique.
On pense que ce pourrait être une couche S, un type de glycocalyx définit par Costreton
comme une rangée de glycoprotéine disposée régulièrement à la surface de la cellule ; beaucoup
d'autres bactéries ont des structures de ce type. Hawtin et al., 1995 ont montré que l'uréase d‟H.
pylori purifiée par chromatographie avait des structures similaire de 10 nm diamètre avec une
région centrale. Ils pensaient que ces structures étaient associées à l'uréase, ce ci a été confirmé
par Austan et al, 1979, qui ont conclu que ces structures contenaient un assemblage de
macromolécules d'uréase, molécule ayant une structure similaire : protéine de choc toxique qui
co-purifie avec l'uréase (Kasper., 1989 ; Sobhani et al., 1991).
les flagelles de Helicobacter pylori
Helicobacter pylori est une bactérie très mobile ; cette propriété lui permet une colonisation
rapide de la muqueuse gastrique. Cette bactérie possède un ensemble de flagelles à l'extrémité
des cellules dont la terminaison des flagelles forme un bulbe (Sobhani et al., 1991).
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
0
la gaine des flagelles
Une propriété unique de tous les Helicobacter est la présence d'un flagelle engainé. Cette
gaine est une structure en continu avec la paroi. Son rôle est peut être de protéger les filaments de
flagelline de l'environnement. Cette gaine protége la bactérie contre l'acidité gastrique (Jones et
al., 1985).
La gaine est vue aisément sur les préparations de cellules colorées négativement et sa
continuité avec la paroi est observée dans des sections fines. En outre, les fibres périplasmiques
n'avaient pas été rencontrées chez H. pylori. Ces fibres entourent les bactéries et sont observées
au niveau du périplasmiques.
I-3-1-2 Caractères physiologiques
Les bactéries H. pylori sont micro aérophiles et ont besoin d‟oxygène pour leur
métabolisme, mais à une concentration inférieure à celle présente dans l‟air. La concentration
d‟oxygène optimale est de l‟ordre de 3 à 5% (Mégraud., 2004).
Elles ont un métabolisme respiratoire comme les campylobacters et tirent principalement
leur énergie des réactions de phosphorylation oxydative. Le caractère micro aérophile dépend de
l‟inhibition d‟enzymes comme la lactate déshydrogénase plutôt que celle de la chaîne de
cytochrome (Sobhani et al., 1991).
Le capital enzymatique de H. pylori est important puisqu‟il possède une catalase,
phosphatase alcaline, phosphatase acide, cytochrome oxydase, superoxyde dismutase, DNAase,
gamma glutamique transpeptidase, leucine aminopeptidase, lipase estérase, des amidases, des
protéases, des lipases, des phospholipases, et surtout une uréase extracellulaire en quantité
extrêmement importante (Sobhani et al., 1995 ; Fauchère et Rosenau, 1991 ; Sobhani et al.,
1991 ; Mégraud, 1999) ce qui permet de la différencier des campylobacters (Sobhani et al.,
1991), une NADPH (Cayla et al., 1995) ainsi que l‟opéron hydrogénasse sont aussi présentes
dont l‟importance est considérable dans le métabolisme de H. pylori.
Helicobacter pylori ne réduit pas les nitrates et n‟hydrolyse pas l‟hippurite (Biomerieux.,
1994 ; Mégraud., 1999), il n‟utilise pas les sucres (saccharolytiques) ni par fermentation ni par
oxydation (Mégraud., 2004 ; Sobhani et al., 1991) c‟est à dire qu‟il tire son énergie d‟autres
sources comme les acides aminés (Mégraud., 1995) et les acides organiques (Mégraud., 2004).
Il a été démontré que H. pylori a des voies actives pour la dégradation de plusieurs acides
aminés dont la conséquence est une augmentation de l‟ammoniac produit (Mendes et al., 1996)
qui est éliminé par un cycle catabolique de l‟urée présent chez H. pylori (Monterio et al., 1997).
Cette bactérie possède, de plus, un matériel de surface (glycocalix) abondant à l‟intérieur de la
paroi bactérienne (Goodwin., 1989) contenant la quasi-totalité de l‟activité uréasique da la
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
6
cellule bactérienne (Fauchère., 1994 ; Fauchère et Rosenau., 1991), des adhésives et des
immunogènes majeurs (Bazooli et al., 1998) (Annexe I).
I-3-1-3 Caractères culturaux
Helicobacter pylori est une bactérie relativement fragile, sensible à la dessiccation et
exigeante sur le plan métabolique (Lamouliatte et al., 1992 ; Mégraud et al., 1992).
Elle ne pousse que dans une atmosphère microaérophile humide contenant 5% d‟O2, 10% CO2,
85% d‟N2 (Avril., 1988). Sa culture exige des milieux enrichis tels que des milieux gélosés
additionnés de sang, lysés ou cuits, d‟hémines, du sérum du charbon ou d‟amidon (Fauchère.,
1994 ; Fauchère et Rosenau, 1991), ces milieux sont rendus sélectifs par addition
d‟antibiotiques spécifiques visant à éliminer les contaminants. La température optimale de sa
croissance est de 37°C, (Cellini et al., 1995 ; Le veau et al., 1993) par contre H. pylori perd sa
viabilité à température ambiante et à l‟air (Lamouliatte et al., 1992), dans ces conditions, les
colonies apparaissent en 3 à 7 jours pour une primoculture, ou en 2 à 4 jours pour un repiquage
(Cellini et al., 1995 ; Biomerieux., 1994).
II-3-1-4 Caractères génétiques
Le génome de H. pylori est trois fois plus petit que celui de E. coli et code à peu prés
27000 protéines dont 500 n‟on pas d‟homologue connu dans le monde vivant. A ce jour, la
composition génomique de deux souches de H. pylori est connue « H. pylori J99 » isolée en
Etats-Unis en 1994 ; ces deux génomes contiennent 1 667 867 et 1 643 831 paires de bases pour
les souches à Haemophilus influenzae, leur G+C est de 36 à 37% (Mégraud et Labigne.,
1998). Distincte du groupe du Vibrion (G+C 38 à 51%) ou du genre Wollinella (G+C 46 0 49%)
(Goodwin et al., 1989).
I-3-2 Propriétés spécifiques d’Helicobacter pylori
H. pylori possède 3 propriétés spécifiques qui signent son adaptation à l‟environnement
particulier de l‟estomac, il s‟agit de :
L’uréase : enzyme existe en grande quantité chez cette bactérie. Le but de l‟activité
uréasique est la production d‟ammonium et de bicarbonate à partir de l‟antre. En
hydrolysant l‟urée présente dans l‟estomac en ammoniac, la bactérie tamponne sa poche
environnement et se protège de l‟acidité gastrique.
La mobilité : permet à H. pylori de se mouvoir dans le mucus mieux que d‟autres
bactéries. Elle est non seulement due à sa forme spiralée mais aussi à l‟existence de
gaines autour des flagelles qui résistent à l‟acide et protègent la protéine des flagelles qui
sans cela serait dégradée (Fauchère et Rosenau, 1991 ; Lamouliatte, 1994 ; Monterio
et al, 1998).
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
22
L’adhérence : H. pylori est étroitement adhérente aux membranes de cellules (Fauchère
et Rosenau, 1991 ; Fauchère., 1994). Cette adhérence est due à la présence des
antigènes bactériens (désignés adhésines) comme l‟hémagglutinine capable de se fixer
sur les récepteurs de l‟épithélium comme N-acétyl-neuraminyl lactose (Mégraud et
Labigne., 1998 ; Monterio., 1995).
I-3-2-1 Sensibilité d’ Helicobacter pylori aux antibiotiques
Helicobacter pylori est naturellement sensible à de très nombreuses familles
d‟antibiotiques : macrolides, céphalosporines, quinolones, aminosides …etc). Cependant d‟un
point de vue thérapeutique, seuls certains : (Amoxicilline, Clarithromycine, Métronidazole)
restent actifs dans l‟environnement gastrique.
Il est donc important, comme dans toute infection, de tester la sensibilité à ses
antibiotiques (Mégraud et Labigne., 1998). La méthode utilisée est celle de la diffusion sur
Agar (méthodes des disques) (Fox et al., 2000) (Annexe II).
II-3-2-2 Réservoir d’Helicobacter pylori
Dans l‟état actuel de nos connaissances, l‟estomac humain apparaît donc comme étant le
réservoir essentiel d‟H. pylori où elle vit profondément enfouie dans la couche de mucus qui
tapisse la muqueuse de l‟estomac (Mégraud et al., 2000). Il est possible que la bactérie soit
aussi adaptée à d‟autres niches comme la bouche du sujet infecté ou l‟estomac de certains
animaux domestiques (Mégraud., 1998). Cependant, ces sites secondaires ne semblent ni
constants ni permanent et leur rôle, s‟il existe, est probablement limité (Vincent., 1995).
I-4 Epidémiologie
Connaître l‟épidémiologie d‟une infection et le mode de transmission de son agent est
essentiel pour proposer des mesures de santé publique visant à limiter la diffusion et donc à
maîtriser ses conséquences pathologiques. De nombreuses études de prévalence ont été
réalisées de par le monde. Par contre, les études d‟incidence et les travaux étudiant la
transmission sont difficiles à les mettre en œuvre et peu développés (Vincent., 1999).
I-4-1 Prévalence de l’infection à Helicobacter pylori
La prévalence observée aujourd'hui est la conséquence des conditions socio-
économiques et de l‟environnement (Broutet et al., 1996).
Le facteur de risque principal de l‟acquisition est l‟état socio-économique défavorable
des familles ; on entend, par là, le niveau économique qui détermine la taille du logement et
son niveau sanitaire ainsi que souvent la taille de la famille et le niveau d‟éducation qui peut
retentir sur les pratiques d‟hygiène. Ces conditions sont associées avec un taux d‟acquisition
élevé dans l‟enfance.
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
22
Si on considère les pays de la communauté européenne, la prévalence de l‟infection
augmente avec l‟âge (15 à 20%) à 20 ans jusqu‟à (50%) au-delà de 50 ans (Broutet et al.,
1998). Mais les plus fortes prévalences sont observées dans les pays en voie de développement
comme l‟Amérique latine et l‟Afrique. La prévalence de l‟infection à H. pylori apparaît ainsi
comme un indice de niveau socio-économique qui va en pair avec le niveau de promiscuité
(Malaty et al., 1996).
D‟autre facteurs de risque, possibles de l‟infection ont été étudiés mais sans trouver
d‟effet, comme par exemple « la consommation d‟alcool et de tabac ». Si l‟ethnie semble, à
priori, avoir un rôle, toute fois, les études chez les jumeaux ont montré que la part du terrain
génétique est légèrement supérieure a celle de l‟environnement dans la prévalence de
l‟infection (Malaty et al., 1994).
I-4-2 Incidence de l’infection à Helicobacter pylori
L‟incidence peut se mesurer par des études prospectives de sujets non infectés ou par
déduction à partir des données de prévalence. Peu d‟enquêtes prospectives ont été menées
essentiellement dans la population adulte. Il en ressort que l‟incidence est sans doute inférieure
à 0.5% par an.
Des études d‟incidence ont aussi été réalisées chez les malades infectés traités pour
apprécier le risque de réinfections. La fréquence de réinfections ne semble pas plus importante
que la fréquence de primo-infection.
Les données les plus récentes provenant de la surveillance de cohortes, notamment
durant la grande enfance et l‟adolescence, indique qu‟en fait la prévalence observée a un âge
donné et une variable dynamique résultant de l‟acquisition de l‟infection chez certains sujets et
de pertes de l‟infection chez d‟autres (Malaty et al., 2002).
I-4-3 Où se trouve Helicobacter pylori ?
I-4-3-1 Chez l'homme
Helicobacter pylori est retrouvé essentiellement dans l'estomac, aussi bien dans l'antre
que dans le fundus et on peut l'isoler à partir du liquide gastrique dans les conditions normales
d'acidité (Vincent., 1995). Sa présence dans des conditions habituellement hostiles aux
bactéries est due à sa résistance aux grandes variations de pH (Goold et al., 1995). La
production d'uréase permet en effet à la bactérie de dégrader l'urée du son environnement
immédiat (Goodwin et al., 1989) ; cette bactérie s'implante et se multiplie dans l'épaisseur de
la couche de mucus et à la surface de la muqueuse gastrique (Wyatt., 1996). En dehors de la
muqueuse de type gastrique, la présence de H. pylori est exceptionnelle dans l'œsophage
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
20
normal ; il n'a été isolé que dans quelques cas et toujours en l'absence de réaction
inflammatoire (Vincent., 1995) laissant ainsi supposer qu'il s'agissait d'une migration
transitoire d'origine gastrique sans colonisation de la muqueuse.
Dans la bouche, qui représente un milieu favorable pour les bactéries microaérophiles,
pourrait favoriser la présence de H.pylori. De nombreux travaux ont trouvé des traces
d’H.pylori, par amplification génique ou à l'aide d'anticorps monoclonaux en
immunofluorescence (Husson et al., 1991) ; de plus, bien que dans la plupart des cas, les
cultures effectuées à partir de la cavité buccale restent négatives. L'isolement de H. pylori a été
rapporté : un cas à partir de la plaque dentaire, un cas de salive, ainsi que de la langue, du
palais ou de la joue (Frexinos et al., 1989).
Dans l'intestin, on n'observe pas de colonisation de la muqueuse normale. Celle-ci, en
effet, n'offre pas les récepteurs spécifiques nécessaires ; néanmoins, la question de l'élimination
digestive basse de formes viables d‟H. pylori reste posée (Mégraud et al., 1996) bien que la
bactérie soit inhibée in vitro par les sels biliaires. Sa présence dans le muqueuse gastrique en
zone rectale montre qu'un passage intestinal est possible (Vincent., 1995). Cependant, aucun
élément n‟est disponible pour savoir si ce passage est constant ou s'il ne s'effectue
qu'exceptionnellement dans des conditions particulières (Parsonnet., 2000). (Tab. 02)
I-4-3-2 Chez l'animal
Aucune association n'est connue entre l'infection humaine à H. pylori et le contact avec
les animaux d'élevage ou de compagnie, ou avec le mode d'alimentation carnée (Vincent.,
1995). Des travaux ont suggèré qu'on pouvait trouver cette bactérie à l'état naturel, par exemple
en Chine. Quatre chats ont été trouvés infectés, et la culture étant positive aux Etats-Unis
(Wang et Gibson., 1993). Une culture à été obtenue chez six chats avec identification
complète de l'espèce H. pylori. Des travaux restent donc à faire pour préciser la prévalence de
l'infection féline et sa place dans la transmission à l'homme afin de savoir si l'estomac du chat
est effectivement un réservoir d'infection pour l'homme, ou s'il n‟est qu'un facteur
épidémiologique (Vincent., 1995).
I-4-3-3 Dans l'environnement
Helicobacter pylori n'a jamais été isolée à partir de l'environnement et notamment à
partir de l'eau où sont retrouvées pourtant de nombreuses espèces voisines comme celles du
genre Champylobacter (Mégraud., 1999). (Tab. 03).
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
20
Tableau 02. Le point actuel sur le réservoir et les sources d'infection d‟après Mégraud., 1996
Tableau 03. Sites où Helicobacter pylori peut être retrouvé chez l'homme en cas d'infection
d‟après Mégraud., 1998
I-4-4 Méthodes de transmissions
a) Transmission par voie orale-orale
A partir de l‟estomac, H. pylori peut coloniser la partie haute du tube digestif. On peut
postuler que le liquide gastrique transporte les organismes viables jusqu‟à l‟œsophage et la
bouche durant la régurgitation (Mégraud., 1995).
Helicobacter pylori a été cultivée à partir de la salive dans plusieurs études. Les
données récentes supportent le rôle prépondérant de la transmission par voie orale- orale.
(Deltenre et Koster, 2000). L‟évidence de la propagation intra familiale de l‟infection entre
parents et enfants, entre les époux ou entre les personnes habitant un même lieu, plaiderait
aussi en faveur de ce mode de transmission (Zehou et al., 2000).
Homme Estomac +++
Bouche ?
Animal Peut être le chat Rôle
marginal ?
Environnement Eau Pas de
confirmation
pour l'intestin (théoriquement possible)
Bouche salive, plaque dentaire, muqueuse Quelque cas
Muqueuse normale Exceptionnelle
Œsophage Endobronchi- œsophage Variable
Estomac Antre, fundus, liquide Constant
Duodénum Métaplasies gastrique Fréquent
Intestin Estropie gastrique uniquement Quelques cas
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24
b) Transmission par voie fécale-orale
S'il parait maintenant certain que la transmission de H. pylori est inter humaine, la voie
de transmission reste mystérieuse et il n‟y a pas des arguments sérieux pour la voie fécale orale
(Mégraud., 1998). Après largage dans le liquide gastrique, la bactérie ne survira pas a priori,
dans la lumière intestinale ou, outre son inhibition par les sels biliaires, elle se trouve affrontée
à des milliers de bactéries (Mégraud., 1998). La question de l'excrétion de H. pylori sous
forme viable dans les selles des sujets infectés reste posée. Seule une tentative de mise en
culture à partir des selles de nourrissons africains malintentionnés , ayant donc un temps de
transit extrêmement bref (Thomas et Sparling., 1994), mais l'hypothèse d'une excrétion sous
forme viable mais non cultivable ou sous forme morte ou moins dégradée, n'est pas écartée
(Vincent., 1999).
Enfin, la transmission fécale-orale semblerait peu importante dans les pays développés
et plutôt limitée à des zones géographiques (région de Santiago du Chili, par exemple, ou l'on
fertilise les culture de l'engrais humain) (Mégraud et al ., 1999).
c) Transmission par voie gastro-orale
Une autre hypothèse est la transmission lors de vomissements quand ceux-ci
proviennent de sujets infectés (Axon., 1994). H. pylori peut rester viable durant plusieurs
heures, ce qui en fait une source possible d‟infection. L‟hypothèse a été récemment renforcée
en induisant des vomissements chez des volontaires adultes (Parsonnet et al., 1999). Elle est
compatible avec une transmission dans l‟enfance. En effet, les vomissements sont fréquents à
cette période de la vie. Les enfants vivent souvent en communautés et portent les objets à la
bouche.
L‟acquisition de l‟infection par les endoscopies entre dans ce même cadre avant l‟ère de
la protection systématique de ces dernières 20 années ; la prévalence de l‟infection à été élevée
chez les endoscopiques. Il est probable que le contact avec le liquide gastrique était la cause
(Broutet et al., 1996). Ensuite, on a observé que le personnel soignant au service de
réanimation où les sécrétions gastriques sont possibles était plus souvent infecté que celui qui
avait travaillé dans les services non exposés à ce risque (Broutet., 1998).
d) L'infection à partir du liquide gastrique
A ce jour, seule la transmission par du liquide gastrique infecté a pu être mise en
évidence et plusieurs cas de transmission hétérogène dans des séries de sujets participant à des
protocoles d'étude de la sécrétion acide ont été rapportés (Graham et al., 1998). Dans un cas,
la confrontation de l'empreinte génétique des isolats bactériens a permis de confirmer la
transmission de la même souche (Langherandries et al., 1995).
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22
En dehors de la manipulation du liquide gastrique infecté, on ignore quelles sont dans
la vie courante, les substances qui véhiculent la bactérie sous une forme infectante et en
quantité suffisante, et dans quelles circonstances un individu entre en contact avec la substance.
e) Le risque environnement
Le rôle de l'eau comme vecteur potentiel est actuellement très controversé, ce rôle est
théoriquement possible (Mégraud et al., 1992) mais la bactérie n'a jamais été isolée de l'eau
(Waldbeser et al., 1993). En dehors de l'eau, les viandes qui sont largement impliquées dans
la transmission d'espèces voisines comme les espèces du genre Compylobacter ont été
suspectées (Mégraud., 2004). Un travail récent vient de rapporter que des chats infectés par H
.pylori pouvaient également l'éliminer dans leur salive sous forme viable (Wang, et al, 2000).
De plus, dans les selles, des traces d'ADN de H. pylori étaient retrouvées par amplification
génique dans quatre cas sur cinq (Fox et al., 1995). Ce résultat préliminaire demande à être
confirmé et il reste de nombreuses inconnues sur la prévalence de l'infection chez le chat
(Vincent., 1995).
La primo-infection par H. pylori, qui s'accompagne de vomissements, pourrait aussi
être la première occasion d'éliminer la bactérie et la question du contact des enfants vivant dans
l'entourage, avec les liquides de régurgitation d'un sujet infecté reste posée (Vincent., 1999).
De plus, les auteurs conçoivent, que si les conditions d'hygiène sont mauvaises et notamment
en l'absence d'eau courante, ces contacts sont possibles.
f) Transmission professionnelle
Certaines professions s'accompagnent en effet de contacts rapprochés et fréquents avec
un grand nombre de sujets infectés et selon une étude japonaise, le risque de contamination par
H. pylori lors d'une fibroscopie gastrique est démontré, avec une fréquence de l‟ordre de 1%
(Link et al., 1994 ). Dans une autre étude menée par Broutet et al., 1995, la prévalence était
liée au nombre d'endoscopies pratiquées par les gastro-entérologues ; ce risque souligne
l'importance des mesures des infections du matériel ainsi que celle du port de gants par les
endoscopiques (Mégraud et al., 1998). De plus, la présence de H. pylori dans la bouche
(salive, plaque dentaire) pourrait s'accompagner d'un risque d'infection pour les dentistes
exposés aux aérosols salivaires de leurs patients.
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21
I-5 Pathologie
I-5-1 Les facteurs de colonisation de Helicobacter pylori
I-5-1-1 Facteurs liés à la bactérie
a- Adaptation à la colonisation de l'estomac
Mobilité et muqueuse gastrique
La mobilité de H. pylori tient d'une part à sa forme spiralée ou hélicoïdale, et d'autre part à
la surface de la bactérie contenant des cils et des flagellés engainés (Marshale., 1996). H.
pylori se déplace rapidement dans un environnement visqueux du mucus et une fois arrivé dans
l'estomac, elle échappe à l'acidité gastrique grâce à cette mobilité particulière qui lui permet de
se déplacer de la lumière vers les cellules épithéliales de surface au travers de la couche de
mucus. L‟importance de la mobilité dans la colonisation de l'estomac a été déterminée lors
d'expériences effectuées chez les porcelets gnoséologiques utilisant des variants immobiles de
H. pylori et en effet ces variantes colonisent plus difficilement que des gènes codant pour la
flagelline majoritaire Fla A la flagelline minoritaire Fla B (Suganuma et al., 2001); ces gènes
clonés et inactivés sous forme de simple mutant ou de double mutant par "génétique reverse"
chez H. pylori (Johnsen et Peura., 1982).
Uréase et acidité gastrique
La plus puissante des barrières gastriques est la production de grandes quantités d'acide
chlorhydrique qui maintient le pH en dessous de 2. Il a fallu que H. pylori développe des
stratégies nouvelles pour survivre à un pH encore plus bas ; il s'agit de l'uréase (Ferrero et al
,1995), enzyme qui a une fonction essentiellement physiologique pour l'utilisation de l'azote de
l'urée (Hwang et al., 2002). Il s'agit de la localisation externe de l'uréase qui doit être
transportée à l'extérieure de la cellule bactérienne (Evans et al, 1990) ce qui n'est pas le cas
pour les autres uréases bactériennes. Quand H. pylori pénètre dans la lumière gastrique, il est
immergé dans le liquide gastrique très acide où sont présentes de petites quantités d'urée qui
diffusent de la paroi (Ferrero et al., 1992). L'ammoniac libéré forme autour de la bactérie un
nuage qui la protège de l'acide (Marshall., 1996) et des données expérimentales, in vitro, sont
en faveur de cette hypothèse. Quand une suspension de H. pylori est placée dans le tube à pH
2, les bactéries sont tuées rapidement ; alors, que si l'on ajoute une concentration d'urée comme
celle présente dans l'estomac, les bactéries sont bien protégées bien que l'uréase soit essentielle
pour la colonisation de l'estomac, elle ne semble pas être nécessaire à la persistance de H.
pylori au niveau de la muqueuse (Ferrerob et al., 1992).
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
27
L'administration d'inhibiteurs puissants d'uréase comme l'acide acétohydroxamique protège
contre la colonisation (Ferrero et al ., 1995).
Adhésines de Helicobacter pylori
Le tropisme tissulaire s'explique par la présence d'adhésines spécifiques, molécules qui sont
complémentaires aux récepteurs présents sur le tissu où se fixe la bactérie. De nombreuses
études ont été menées il y a quelques années dans le but d'identifier ces adhésines. La première
est l‟hémagglutinine qui caractérisée a donné la N-acétyl-neuraminyl- lactose (Evans et al.,
1990). D'autres hémagglutinines ont été ensuite décrites. Enfin, la colonisation est rendue
possible par ces facteurs d'ahésines capables de se fixer sur des récepteurs siadyl-carbo-
hydratés par exemple (Hwang et al., 1999 ; Wadstrom., 1995). On comprend ainsi aisément
qu'en fonction des caractéristiques de l'hôte ou de la bactérie, H pylori puissent entraîner
diverses pathologies.
Micro aérophiles
Helicobacter pylori est une bactérie micro aérophile et une concentration en oxygène
optimale est effectivement présente dans l'environnement de la muqueuse gastrique (Archibalt
et al., 1986). C‟est peut être au niveau des jonctions intercellulaires que l'on trouve les
concentrations gazeuses les plus adéquates (Lee., 1998). Il y a peu de connaissances dans ce
domaine qui est vaste tout à fait ignoré jusqu'à présent.
Les jonctions intercellulaires
La première photographie d‟H. pylori en microscopie électronique a montrait la présence
de cette bactérie dans les espaces entre les cellules gastriques. Hanzell., 1995 a noté une
association d‟H. pylori aux jonctions intercellulaires. Depuis, plusieurs scientifiques ont
montré cette localisation intercellulaire et ont souligné qu‟il s‟agissait de son site préféré de
colonisation et que la bactérie pouvait pénétrer profondément au niveau de cette jonction en la
détruisant. Stojiljkovic., 1994 a suggéré qu'il existait une interférence avec la laminine,
conduisant à un relâchement de la liaison intercellulaire qui permettrait à H.pylori la
pénétration (Stojiljkovic et al., 1994) et la fixation sur la laminine, mais aussi sur d'autres
molécules servant de support aux cellules, comme le collagène de type IV.
I-5-1-2 Facteurs liés à l’hôte
a- Echappement aux défenses de l’hôte
Helicobacter pylori persiste au niveau de la muqueuse gastrique en dépit d‟une réponse
immunitaire locale et générale (Fauchère et Rosenau., 1991 ; Fauchère., 1994). L‟existence
de mécanismes d‟échappement aux effecteurs de l‟immunité ou l‟inefficacité de ces effecteurs
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20
dans l‟environnement gastrique, ont deux explications possibles (Lamouliattes, et al., 1992,
Fauchère., 1994), l‟obtention d‟une tolérance immunitaire peut également être liée à la
saturation des anticorps (IgG, IgA, IgM) et consécutive à un excès d‟antigènes bactériens
(Fauchèrs et Rosenau., 1991 ; Fauchère., 1994).
b- Induction d’une réponse inflammatoire
La muqueuse infectée par H. pylori est le siège d‟une réaction inflammatoire intense
caractérisée par une infiltration de polynucléaires neutrophiles (Sobhani et al., 1991). Cet
infiltrat est lié à la sécrétion de substances chimiotactiques par H. pylori. Les cellules de
l‟infiltrat inflammatoire peuvent également libérer d‟autres substances chimiotactiques telles
que les cytokines par les macrophages dont les effets sont délétères sur les cellules (Sobhani et
al., 1991).
I-5-2 Le rôle pathogène de Helicobacter pylori
L‟infection a H. pylori est considérée comme chronique elle est acquise essentiellement
dans l‟enfance et persiste durant des décennies, voire toute la vie. Cette bactérie est impliquée
dans la genèse des maladies inflammatoires gastro-duodénales, comme elle est l‟agent
étiologique des gastrites chroniques antrales, mais aussi responsable de l‟évolution au cours du
temps de ces gastrites chroniques antrales vers les maladies ulcéreuses, les lymphomes de
MALT ou l‟atrophie gastrique, précurseur des adénocarcinomes (Fig. 06). Il convient donc
d‟analyser les propriétés bactériennes spécifiques à H. pylori qui permettent de rendre compte
de son succès à coloniser la muqueuse gastrique, à persister en dépit la réponse immunitaire de
l‟hôte et son aptitude à endommager les tissus (Sobhani et al., 1991).
I-5-2-1 La gastrite
La gastrite est un trouble de la digestion qui se manifeste par l‟inflammation de la
muqueuse de l‟estomac (Sobhani et Wyat., 2000). La muqueuse agit comme barrière
protectrice de la paroi de l‟estomac en absorbant les sécrétions acides produites par la digestion
des aliments. Sans cette protection, la paroi de l‟estomac .devient plus sensible et serait vite
attaquée par ces acides ou par d‟autres substances irritantes qui provoqueraient des ulcères.
C‟est ce qui se produit dans le cas de l‟ulcère gastro-duodénal (Malatesta et Graham., 1996).
Mais il arrive aussi que la muqueuse soit elle même irritée, sans que la paroi soit touchée : on
parle alors de gastrite. La gastrite peut être aiguë et se manifester soudainement ou être
chronique et évoluer lentement sur plusieurs années (Mégraud et Wyat., 2000).
I-5-2-1-1 Gastrite aiguë
C‟est une inflammation aiguë de la muqueuse gastrique de durée brève. Elle est
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
26
caractérisée par une inflammation mono et polynuclée, une diminution de la sécrétion acide
gastrique et une légère augmentation de la gastrine (Wyatt., 1996). En l‟absence de guérisons,
la colonisation bactérienne persiste à la surface de la muqueuse entraînant une gastrite
chronique active (présence de polynucléaires neutrophiles au sein d‟un infiltrat mononuclée)
(Wyatt., 1996).
I-5-2-1-2 Gastrite chronique
Définie par l‟existence au sien de la muqueuse gastrique des lésions inflammatoires et
atrophiques plus ou moins étendues (muqueuse antrale et muqueuse fundique) et plus ou moins
sévère (Fig. 03). La gastrite chronique comprend aussi des lésions épithéliales qui
s‟accompagnent de la présence de polynucléaires neutrophiles (Guerre., 1996). Une atrophie
des glandes et une métaplasie intestinale peuvent être présentes et leur fréquence augmente
avec l‟âge, probablement influencée par d‟autres acteurs génétiques et environnementaux
(Mégraud et lamouliatte., 1997).
La gastrite à H. pylori correspond le plus souvent à une gastrite antrale prédominante.
Schématiquement elle se caractérise selon Grouyon et al., 1996 par:
Des signes d‟activité comportant une infiltration du chorion et de l‟épithélium par des
polynucléaires neutrophiles. L‟infiltration peut être légère, modérée ou sévère : elle est
caractéristique de l‟infection par H. pylori.
Des signes d‟atrophie caractérisée par une réduction des glandes gastriques : elle peut être
légère, modérée ou sévère (Fig. 04).
Une métaplasie intestinale ainsi qu‟une fibrose du chorion peuvent se développer et
s‟associer à des signes histologiques de dysplasie qui peut être légère, modérée ou sévère; la
dysplasie sévère est synonyme de cancer, in situ (Sobhani et Waytt., 2000) (Fig. 05).
Figure 03. Gastrique chronique d‟après Wyatt., 1996
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02
Atrophie gastrique
légère
Atrophie gastrique
modérée
Atrophie gastrique
sévère (ou la
métaplasie intestinale
est présente)
Figure 04. Différents grades d‟atrophie de la muqueuse gastrique Fundique d‟après
Eaton et al., 1994
Figure 05. Métaplasie intestinale observée par la technique dit du tes- tape d‟après
Jean pierre dadoune., 1990
A : résultat négatif
B, C, D : Trois stades en métaplasies intestinale
I-5-3 Comment un ulcère se forme- t-il ?
L‟œsophage, l‟estomac et l‟intestin sont revêtus d‟une muqueuse qui constitue une
protection naturelle contre les sucs digestifs comme par exemple le suc gastrique acide, la bile
et la pepsine (Axon., 1997). Une muqueuse saine résiste en règle générale à ces substances
agressives. Toutes fois, une régénération insuffisante de la muqueuse, une irrigation perturbée
C
A
B
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02
de la paroi gastrique ou une surproduction d‟acide chlorhydrique, de bile ou de pepsine
peuvent provoquer des lésions de la muqueuse qui entraînent à terme des inflammations ou des
ulcères (Mégraud et al., 2001). De récentes découvertes montrent qu‟une bactérie H. pylori
perturbe également la couche protectrice de mucus. La muqueuse sensible est ainsi exposée au
contact avec l‟acide, ce qui peut déclencher la formation d‟un ulcère (Mégraud et
Lamouliatte., 1997) (Fig. 06).
Figure 06. Formation de l‟ulcère d‟après Sobhani et al., 1999
I-5-3-1 Ulcère gastrique
La relation causale, entre l‟infection a H. pylori et la chronique, est aujourd‟hui bien
établie et l‟on considère que cette bactérie est à l‟origine de 90% des gastrites chroniques
(Darra., 1994). En outre, l‟ulcère gastrique est toujours associé à la présence d‟une gastrite
chronique. Parmi les arguments qui confirment l‟association causale entre l‟infection à H.
pylori et l‟ulcère gastrique les plus importants sont les suivants : -Présence de cette bactérie
chez la majorité des malades ayant un ulcère gastrique (Lamireau., 1993). -Existence d‟une
relation temporelle entre l‟apparition de H. pylori et celle d‟un ulcère gastrique montrant que la
présence de cette bactérie précède l‟apparition de l‟ulcère (Marshall., 1996). L‟action toxique
directe ou indirecte exercée par cette bactérie conduit à la destruction de la barrière muqueuse
gastrique et à l‟augmentation de sa perméabilité aux ions H+.
I-5-3-2 Ulcère duodénal
L‟ulcère duodénal est localisé dans la majorité des cas au niveau du bulbe duodénal. Il est
favorisé par une augmentation de l‟acidité (Hwang et al., 2002). L‟ulcère duodénal est une
maladie fréquente 3 à 4 fois plus que l‟ulcère gastrique qui touche environ 8% de la population
active. On le rencontre plus souvent chez des sujets jeunes avec un pic de fréquence entre 40 et
50 ans. L‟incidence de cet ulcère est de 80000 nouveaux cas en Europe par an et sa prévalence
est 8%; la mortalité est de 1% (Mégraud., 1998).
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I-5-3-3 Dyspepsie non ulcéreuse
La dyspepsie est un mot grec qui signifie : une difficile digestion. Cette pathologie est
fonctionnelle ou organique (De Korwin., 1999). La dyspepsie non ulcéreuse (DNU) est
fréquente dans les pays occidentaux puisqu‟elle affecte environ un tiers de la population
générale (Delchier., 1999). La dyspepsie désigne un ensemble de symptômes qui semble avoir
pour origine la partie supérieure du tube digestif (oesophage, estomac, intestin grêle ou le
duodénum) ; elle peut être conçue comme une indigestion chronique (Johnson et Peura,
1982). Le rôle de H. pylori dans la dyspepsie est encore en cour d‟étude et la prévalence de
l‟infection à H. pylori dans la DNU est très variable suivant les études (Atherton et al., 1999).
I-5-4 Cancer gastrique
Le cancer gastrique est une affection multifactorielle (Uemura et al., 2001). H. pylori
occupe la première place parmi les paramètres étiopathogénique (Brenner et al., 2000).
L‟infection a H. pylori provoque une gastrite qui après plusieurs années d‟évolution chronique
peut aboutir au cancer (Mégraud et Waytt., 2002). Les étapes précédant le cancer sont :
l‟atrophie de la muqueuse gastrique, la métaplasie intestinale, le dysplasie et l‟adénocarcinome
(Fléjou., 1989). L‟atrophie est d‟autant plus menaçante qu‟elle touche le fundus
(Wang et al., 2000).
L‟infection a H. pylori a été reconnue carcinogène de type 1 par l‟Agence International de
Recherche sur le Cancer (AIRC) (Mégraud et al., 2001). H. pylori, en induisant une gastrique
atrophique antrofundique, interviendrait à un stade précoce de ce processus. En revanche la
gastrite antrale, non atrophique à H. pylori n‟est pas associée à l‟adénocarcinome gastrique
mais à l‟ulcère duodénal via l‟hypersécrétion acide (Fléjou., 1989). Par ailleurs, la présence
d‟un ulcère gastrique (non pré pylorique) associée à une atrophie gastrique induite par H.
pylori, double le risque de développer un cancer gastrique dans les trois ans (Hussel et al.,
1996).
Le rôle de cette bactérie dans la carcinogène a conduit les experts européens à élargir les
indications de l‟éradication en cas de facteurs de risque associé, notamment les antécédents
familiaux de cancer gastrique car l‟atrophie et surtout la métaplasie intestinale peuvent
persister longtemps après l‟éradication (Cayla., 1996). Cependant cette attitude n‟a pas été
retenue par la conférence de consensus française sur le plan moléculaire : les souches Cag A
positives sont plus souvent associées au cancer gastrique et persistent plus longtemps dans
l‟estomac que les Cag A négatives faisant de la durée d‟infestation un facteur déterminant de la
carcinogenèse (Fig. 07).
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
00
Figure 07. Cancer gastrique superficiel d‟après Wang et al., 2000
I-5-5 Le lymphome de MALT
Le lymphome gastrique du MALT (Tissu lymphoïde associé aux muqueuses) évolue très
progressivement et reste longtemps localisé à l‟estomac. Le développement du lymphome est
directement lié à l‟infection par H. pylori. La bactérie stimule une réaction immunitaire par
l‟intermédiaire des lymphocytes T qui provoquent la prolifération des lymphocytes B.
Pour une raison encore mal comprise, la réaction immunitaire ne permet généralement pas
d‟éliminer la bactérie. La stimulation antigénique persiste et sélectionne des clones de
lymphocytes B, antigène dépendant (Du et al., 1996). Il s‟ensuit une infiltration chronique du
chorion de la muqueuse gastrique par les lymphocytes. La persistance de la prolifération
lymphocytaire clonale pendant plusieurs années favorise l‟apparition de mutations génomiques
dont la plus fréquente concerne deux gènes proapophatiques API2 (Dierlamm et al., 1999).
Ces mutations accélèrent la prolifération qui évolue vers la monoclonaux et le lymphome bien
qu‟elle reste dépendante de la stimulation des lymphocytes T (Hussell et al., 1996 ; Greiner.,
1997). Cette dépendance explique la localisation du lymphome à l‟estomac et sa régression
après éradication. Le lymphome du MALT est donc secondaire à une stimulation excessive et
prolongée des lymphocytes B en réponse à l‟infection à H. pylori. (Fig. 08).
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
04
Figure 08. Lymphome de MALT d‟après Wang et al., 2000
I-6 Méthodes de diagnostics
I-6-1 Tests invasifs (Méthodes directes)
Méthodes utilisant des biopsies gastriques et nécessitent une endoscopie « Trois
biopsies » (Mégraud., 1995). (Fig. 09)
Prélèvement
Il se fera sous endoscopie dans la région antrale à environ 2cm du pylore et du fundus
(Mégraud et Labigne., 1998). Il est souhaitable d‟obtenir deux biopsies pour chaque test à
effectuer. (Mégraud., 1995)
Conditions du transport des échantillons
Les biopsies utilisées pour la culture pouvant être conservées dans un récipient contenant
du sérum physiologique afin d‟éviter la dessiccation et seront maintenues à 4°C (Mégraud.,
1995). Les biopsies destinées à effectuer un examen anatomopathologique sont mises dans du
formol à 10% (Sobhani., 1995).
Lymphome gastrique à petites
cellules
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
02
Figure 09. Les différents tests pour le diagnostic de H.pylori d‟après
Lamouliatte., 1994
I-6-1-1 Test rapide à l’urée
Ce test utilise la propriété exceptionnelle d‟H. pylori de posséder une très forte uréase
(Bruley Des Varennes., 1996). Cette uréase va hydrolyser l‟urée du milieu en ammoniac et
gaz carbonique ; l‟ammoniac libéré entraîne une augmentation du pH qui va provoquer le
changement de couleur d „un indicateur de pH (Mégraud., 1999). Le test consiste à écraser une
Méthode invasives (Endoscopie)
Méthode non invasives
(pas d’endoscopie)
Biopsies Sérodiagnostic
(sérologie) Sur 1 mg de sang
Test Elisa Délai de réponse 4H
Test respiratoire à C13 ou C14 urée sur l’air expiré mesuré
de CO2
Amplification génique par PCR Au laboratoire.
Test Uréase En salle
d’endoscopie Test
commercialisé (CLO ou CU test) Délai de réponse
20 minutes
Bactériologie
Histologie Au laboratoire,
coloration HES ou Giemsa, délai de réponse 2 jours
Culture Méthode de référence Milieu commercialisé
Délai de réponse 5 jours
Culture Méthode de référence Milieu commercialisé
Délai de réponse 5 jours
Antibiogramme
Sujet gastralgique
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
01
biopsie, puis la placer dans un milieu urée indole qui sera incubé à 37°C et observé après 20
minutes, 2 heures et 24 heures. Le passage du jaune au rouge traduit un résultat positif
(Mégraud., 2004).
La sensibilité de ce test est évaluée à 80-85%. Il existe plusieurs tests commercialisés
utilisables dans la salle d‟endoscopie comme le CLO-TEST, qui possède une sensibilité de
78% et une spécificité de 96%. La sensibilité du test est parfois insuffisante puisque elle
nécessite 105
bactéries dans le milieu pour qu‟elle soit positive (Mégraud., 1999).
I-6-1-2 Examen anatomopathologique
Helicobacter pylori a une morphologie et une localisation particulière qui le rend
accessible a un diagnostic lors d‟un examen anatomopathologique. Cet examen doit comporter
une fixation des biopsies dont le formol et adopté à des colorations facilitant la reconnaissance
de la bactérie au microscope. Les bactéries peuvent être recherchées sur les préparations
colorées par la coloration standard d‟Hématine Eosine Safran (ou elles apparaissent roses) ou
d‟autres colorations : Giemsa modifier au Crésyl violet, à l‟acridine orange ou la coloration de
Warthin starry (Mégraud., 2004) Cette recherche a une sensibilité excellente et une spécificité
proche de 95% si elle est effectuée par un observateur entraîné.
Sa limite est la faible reproductibilité interobservateur, un élément fondamental de cet
examen est bien sur la recherche des lésions histologiques de gastrites associées à H .pylori
(Mégraud., 2004) (Fig. 10).
I-6-1-3 Cytologie
Cet examen comporte la recherche de bactéries spiralées sur un frottis coloré par une
coloration de GRAM voir de Giemsa et une coloration nucléaire au bleu (Mégraud et
Raymond., 1999). Le frottis est préparé en écrasant la biopsie du coté mucus sur une lame
porte-objet. Les frottis seront examinés minutieusement d‟abord au faible grossissement pour
repérer les zones plus riches en cellules, puis au fort grossissement pour bien observer les
bactéries incurvées ou spiralées à GRAM négatif qui ont tendance à se trouver nombreuses
dans certaines zones du frottis (Mégraud., 2004).
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
07
Figure 10. Etude anatomopathologique : H. pylori après différents colorations d‟après
Adamek, et al., 1996.
A : Hématéine Eosine Safran; B: Warthin starry; D: Giemsa ; C : Crésyl violet
I-6-1-4 Mise en culture
La biopsie est broyée avec du bouillon nutritif (0,3 ml) dans un Potter. Le broyat est
ensemencée :
Sur une gélose sélective H. pylori (Pyl) (Biomérieux) ; le milieu contient la Vancomycine,
la Cefsulodine et le Cycloheximidine comme agent sélectif.
Sur une gélose Columbia ou Brucella ou Wilkins Chalgrin à 10% de sang de cheval
(Mégraud., 2004). Les boites sont placées en atmosphère micro aérophile (10% de CO2) et
examinées après 4 jours, puis tous les 3-4 jours pendant 15 jours (Avril, et al., 1995) après
une incubation de 2 à 5 jours à 37°C et dans une atmosphère appauvrie en oxygène. La
croissance obtenue sur une gélose enrichie au sang de mouton se traduit par l‟apparition de
colonies translucides, non pigmentées et d‟un diamètre de 1mm (Avril, et al., 1995)
(Fig.11).
Principaux caractères bactériologiques
H. pylori est un petit bacille de 0.5µm de diamètre sur 2µm de longueur, à GRAM
négatif, légèrement incurvé dépourvu de fibre périplasmique, mobile grâce à de multiples
flagelles observés au microscope électronique (Mégraud., 2004). Quelques caractères sont à
rechercher : Catalase+, Oxydase
+, Uréase
+, Gamma GT
+, Pal
+ (API Compylobacter, Bio
Mérieux).
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
00
Figure 11. Aspect macroscopique des colonies d‟ Helicobacter pylori sur Gélose chocolat
après 5 jours d‟incubation à 37°C en atmosphère micro-aérophile d‟après Ghouini., 1996
I-6-1-5 Amplification génique (PCR)
Il est possible d‟amplifier des séquences d‟ADN spécifique de H. pylori en utilisant des
amorces spécifiques. L‟analyse des produits d‟amplification permet d‟affirmer la présence
d‟ADN de H. pylori et donc de cette bactérie avec une grande sensibilité et spécificité .Il n‟est
pas nécessaire que les bactéries soient vivantes. Avant l‟amplification, la biopsie doit être
broyée et/ou lysée à l‟aide d‟un tampon spécifique afin de rendre l‟ADN des bactéries
accessible. Les produits d‟amplification sont ensuite analysés, soit par visualisation d‟une
bande d‟ADN de poids moléculaire donné, spécifique des amorces utilisée, après
électrophorèse, soit par hybridation en milieu liquide et la révélation par DNA-Enzyme
Immuno-Assy (Montério et al., 1998), soit par hybridation en dot. Plusieurs types d‟amorces
ont été proposés pour détecter H. pylori. Les plus utilisées sont issues du gènede l‟uréase ou de
l‟ARN ribosome 16s, gènes dont la fonction est parfaitement connue (Mégraud., 1998).
L‟utilisation avec succès des amorces amplifiant le gène correspondant à un antigène de 26 KD
spécifique de H. pylori ou au gène de l‟uréase A ou C (Mégraud et Labigne., 1998). D‟autres
amorces correspondant à un gène dont le produit n‟est pas connu ont également été proposées.
La sensibilité de la détection de H. pylori par PCR (polymérase chaîne réaction) est
comparable à celle de la culture. La PCR ne s‟est pas développée du fait de l‟absence de kits de
détection et donc de standardisation. L‟utilisation de procédure de PCR « nichée » n‟est pas
recommandée. Un autre intérêt de la PCR est la possibilité de typage moléculaire des souches
soit restriction des fragments obtenus, soit par séquençage. De plus l‟amplification de
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
06
séquences au hasard a aussi été appliquée à H. pylori dans un but de typage (RAPD)
(Makristhis et al., 1998).
I-6-2 Tests non invasifs (méthodes indirectes)
I-6-2-1 La sérologie (Méthodes utilisant le sang)
La sérologie est la plus ancienne des tests indirects disponibles. Il est connu depuis
longtemps que l‟infection à H. pylori se traduit presque constamment par une réponse sérique
de type IgG (Cutler et Havestad, 1995). Ces anticorps sont recherchés par des techniques
immuno-enzymatique « ELISA » utilisant des extraits antigéniques semipurifiés ou enrichis
pratiquer sur un échantillon de sérum. Tous les tests ELISA utilisés sont satisfaisant sur le plan
de la sensibilité et de la spécificité (Makristhis et al., 1998). Ces derniers varient selon les kits
commercialisés ; les limites de la méthode constitue à :
IgM ne sont pas détectés.
IgG n‟apparaissent que trois semaines après le début de la maladie.
IgA détectés en absence d‟IgG
I-6-2-2 Test respiratoire (Méthode utilisant l’urée)
Ce test est basé sur la propriété de H. pylori de posséder une uréase très forte (Bruley
Des Varannes., 1996). Il consiste à faire absorber au patient de l‟urée marqué au carbone 13,
puis à rechercher la présence ou l‟absence de l‟isotope dans le gaz carbonique expiré
(Mégraud., 1995). Le carbone 13 absorbée est hydrolysé dans l‟estomac par l‟uréase en
ammoniac et gaz carbonique 13
CO2, qui passe dans le sang puis dans les poumons et se
retrouve enfin dans l‟air expiré. Ce test faible à plus de 98% présente l‟avantage de rechercher
la présence de la bactérie dans la totalité de l‟estomac (Mégraud., 2004).
I-6-2-3 Test utilisant la salive
Cette méthode consiste à rechercher des anticorps anti H. pylori dans la salive. Elle est
moins invasive que la recherche dans le sang mais plusieurs chercheurs ont découvert qu‟il y a
une bonne corrélation entre les IgG spécifique sériques et salivaires (Mégraud., 1998).
I-6-2-4 Test de l’urine
Il existe un test ELISA détecte les IgG spécifiques anti-H. pylori dans l‟urine. La
corrélation des anticorps sérique à été de 95% avec les anticorps urinaires, ce qui permet de
considérer cette méthode comme un diagnostic simple d‟H. pylori (Mégraud., 1998).
I-6-2-5 Test utilisant les selles
Ce test permet une détection directe mais non invasive d‟H. pylori .Il consiste en une
réaction ELISA ou les plaques sont coartées par des anticorps spécifiques d‟H. pylori, les
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
02
résultats ont montrés une sensibilité de 96%, une spécificité de 93% et des valeurs périditives
positives de 92% et négatives de 96% (Makristathis et al., 1998).
I-7 Traitement
I-7-1 Eradication d’ Helicobacter pylori
Depuis sa découverte il y a plus de 15 ans, H.pylori a été reconnu responsable de la
grande majorité des ulcères duodénaux, de la majorité des ulcères gastriques et des lymphomes
malins gastriques du MALT. Par contre, son implication dans la dyspepsie non ulcéreuse et
l‟efficacité de son éradication pour en améliorer les symptômes font encore l‟objet de
discussions ne permettant pas de conclure. De ce fait, les indications formelles de l‟éradication
de la bactérie sont des ulcères duodénaux, l‟ulcère gastrique et les lymphomes malins
gastriques du MALT (Cayla., 1996). Cette bactérie pose de difficiles problèmes d‟éradication,
ces difficultés sont liées à plusieurs problèmes (Cayla., 1995).
Diffusion mauvaise ou insuffisante, au site de l‟infection, pour certains antibiotiques
(Caroli et al., 1998).
Inactivation ou réduction d‟activité de certains antibiotiques en pH acide (Graham et
al., 1998).
Capacité élevée de résistance microbienne.
Croissance lente de la bactérie (El-Omar et al., 2000).
I-7-2 Comment traite-t-on Helicobacter pylori ?
Les monothérapies
Le premier modèle d‟étude thérapeutique d‟une infection bactérienne est de tester sa
sensibilité, in vitro, à différents agents antimicrobiens (Adamek et al ., 1996). Bien que H.
pylori soit sensible à de nombreux composés, in vitro, les béta lactamine, les macrolides, et les
nitro-imidazoles…etc avec des CMI90 régulièrement inférieures à 1 mg/l in vivo (Hussell et
al., 1995). Les différentes monothérapies sont inefficaces en termes d‟éradication de H.
pylori (Tab. 04) Après diminution majeure du nombre de bactéries au cours du traitement,
voire une disparition, l‟infection reprend le plus souvent à l‟arrêt du traitement. Il est probable
que les conditions d‟action des molécules en situation clinique soient profondément modifiées
par la localisation de ce micro-organisme au sein de la couche de mucus entourée par un milieu
acide formant ainsi une niche écologique protégée, d‟accès difficile.
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
02
Tableau 04. Synthèses des caractéristiques des molécules actives sur Helicobacter pylori en
monothérapies d‟après Adamek et al ., 1996
Dans ces conditions, les deux principaux paramètres qui semblent jouer un rôle sur
l‟éfficacité des molécules sont, d‟une part, l‟activité in vitro à pH neutre et/ou acide et d‟autre
par leur capacité à diffuser de manière active au sein de la couche de mucus. Il existe une
résistance naturelle à certains antibiotiques tels que la vancomycine, le trimethoprine, l‟acide
nalidixique et les sulfamides (Admek et al., 1996). Les monothérapies antibiotiques obtiennent
des taux d‟éradications de 20 à 40%.
Les bithérapies
Confrontés à la difficulté d‟éradiquer la bactérie par de simples monothérapies et à la
moindre éfficacité des antibiotiques en milieu acide les schémas thérapeutiques se sont orientés
vers l‟utilisation de combinaisons thérapeutiques de deux ou trois médicaments associant
antisécrétoire et/ou sels de bismuth et antibiotiques. Parmi les bithérapies, deux ont été
principalement testées associant antisécrétoire « IPP le plus souvent + amoxicilline dont le taux
d‟éradication est de 60% (Berry et al., 1995 ) et antisécrétoire + clarithomycine dont le taux
d‟éradication est de 66% (Devitis et al., 1995 ; Neri et al., 1997 ; Tham et al., 1998). Les
autres combinaisons telles que oméprazole–bismuth et oméprazol-ciprofloxacine se sont
révélées inéfficaces (Labenz et al., 1995). D‟autres bithérapies comme bismuth-imidazolés,
amoxicilline-imidazolés ou tétracycline-imadazolés ont donné des résultats variables mais, en
général moins éfficaces ou non reproductibles (Tham et al., 1998). Il faut noter que la bi-
Molécules CMI90 (mg/l) Sécrétion dans
le mucus
Taux (%) d‟éradication
in vivo
Bismuth
Amoxicilline
Tétracycline
Nitro-imidazole
Macrolides.
Anti-H2
Ipp..
4 à 32
0,06
0,5
2
0,06
>1000
8 à 64
-
+
+ +
+ + +
+ + +
-
-
20
20
<20
20-30
35
0
< 5
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antibiothérapie clarithromycine-tinidazole, administrée pendant une semaine, permet d‟obtenir
des taux d‟éradication supérieurs à 60% (Moayyedi et al., 1996).
Trithérapies
Il s‟agit de traiter l‟infection à H. pylori par un inhibiteur de la pompe à protons (IPP), à
double dose et double antibiotique comportant deux des antibiotiques suivants : amoxicilline,
clarithromycine, métronidazole.
IPP+ amoxicilline + clarithromycine ; la dose de amoxicilline généralement utilisé est
de 1g deux fois par jour pendant 07 jours et clarithromycine la dose optimal est de
500 mg (bonne résultat avec 250 mg également) 02 fois pendant 07 jours le taux
d’éradication est de 82 a 94% (Bazzoli et al., 1998).
IPP double dose + amoxicilline + métronidazole on utilise 1g, 2 fois Amoxiciline et
400mg ou 500 mg de métronodazole ; le taux d’éradication est généralement inférieur
à 66% et à 79% (Mégraud., 1999).
Omeprazole 20 mg+ Amoxicilline 2 mg + Tinidazole 1g (taux d’éradication 81-86%)
Lonzoprazole + Amoxicilline + Tinidazole (taux d’éradication 82%) (Bardhan et al.,
2000) (Tab. 05).
Tableau 05. Différentes bases du traitement anti-H.elicobacter pylori, dosage et Durée
d‟après Fagniez., 1995
Type de médicament Dosage Durée du traitement
Anti sécrétoires
Oméprazole
Lansoprazole
Anti-H2
40 mg/j (en 2 prises)
double de la dose
double de la dose
04 semaines
04 semaines
04 semaines
Antibiotiques
Amoxicilline
Metronidazole
Clarithromycine
1 gr 2 fois/j
500 mg 2 fois/j
500 mg 2 fois/j
7 jours
7 jours
7 jours
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I-7-3 Contrôle de l’éradication
Un contrôle de l‟éradication est nécessaire lorsque l‟indication est d‟importance vitale
« ulcère complique d‟un lymphome type MALT » ; ce contrôle de l‟éradication se justifie
également lors d‟ulcère d‟évolution sévère sans complication (Byk et al., 2002). Le contrôle de
l‟éradication devrait être effectué, au plus tôt, 4 semaines après l‟arrêt de toute thérapeutique
comprenant des substances anti- microbiennes « antibiotique, bismuth » ou inhibiteur de la
pompe à protons. Des contrôles trop précoces conduisent souvent à des résultats faussement
négatifs. Le contrôle l‟éradication devrait s‟effectuer à l‟aide d‟un test de détection rapide de
l‟uréase lorsqu‟un contrôle endoscopique est indiqué. Cela concerne essentiellement les
contrôles de guérison d‟un ulcère compliqué ou d‟un ulcère gastrique afin d‟exclure la
possibilité d‟une tumeur maligne. Lorsqu‟on renonce à un contrôle endoscopique, un test au
niveau des selles est une alternative intéressante. Les tests sérologiques ne sont pas indiqués
car la disparition des anticorps varie d‟un individu à un autre et peut ne survenir qu‟après des
mois ou des années (Mégrand et al., 2002).
I-7-4 Echec de l’éradication
Les causes des échecs de l‟éradication sont duent aux facteurs suivants :
Le suivi du traitement (Laine et al., 1996).
La résistance des souches bactériennes aux antibiotiques (Laine et al., 1998).
La durée du traitement qui n‟est encore pas clairement établie (7 ou 14 jours)
(Catalano et al., 1998)
La campliance du patient
La récidive de l‟infection
Les effets secondaires des différents antibiotiques (diarrhée à l‟amoxicilline) ;
les troubles du goût (Clarithromycine) et douleurs abdominales Les accidents majeurs, en
particulier à type de colite pseudo membraneuses, restent tout à fait exceptionnels.
I-7-5 Prise en charge des échecs de l’éradication
Après trithérapie comportant du métronidazole ou un imidazole, les taux de résistance
acquise en cas d‟échec thérapeutique semblent particulièrement élevés (43% à 100%) (Laine et
al., 1998).
La situation est plus contrastée pour Clarithromycine, car après trithérapie (IPP+
Amoxicilline + Clarithromycine) ou (IPP+ Métronidazole +Clarithromycine) les taux de
résistance varient de 0% à 45% (Lamarque et al., 1997). Certaines études ont montré des taux
de résistance de 69% à la clarithromycine quand aux double résistance au métronidazole et la
clarithromycine, et rarement mentionnée (Tankovic et al., 2001).
Revue Bibliographique d’ Helicobacter Pylori
04
Une étude française récente a confirmé ces résultats après un échec d‟un traitement par
(IPP + Clarythromycine + Amoxicilline) ou (IPP + Métronidazole + Amoxicilline) et a permis
l‟éradication de H. pylori chez 66% des malades sans contrôles de l‟antibiogramme, ces
résultats n‟étaient pas meilleurs chez les malades ayant eu une culture bactérienne avec
antibiogramme.
Ce qui doit permettre de considérer cet examen qu‟en cas d‟échec de ce traitement de
deuxième ligne (Mérgrand et al., 2001). L‟éfficacité, sur H. pylori de nouveaux antibiotiques
en été également prouvée. Les résultats de l‟association de (Oméprazole + Amoxicilline +
Ciprofloxacine) chez des patients ayant une double résistance au métronidazole et à la
Clarithromycine ont été décevants (25% d‟éradication) (Mégrand et al., 2001).
L‟association de Pantoprazole double dose (amoxicilline 1g et 2 fois par jour + 300 mg
de Rifabutine) semble prometteuse (Perri et al., 2000).
Pour certains auteurs, l‟association de ranitidine sous citrate de bismuth +
Clarithromycine + Métrnidazole ou la quadrithérapie (IPP, Bismuth, métronidazole,
clarithromycine) serait une solution aux échecs dus à la résistance à la Clarithromycine ou au
métronidazole.
En cas d‟échec de traitement de première ligne, plusieurs études récentes suggèrent que
la quadrithérapie (IPP+bismuth + 2 antibiotiques) serait la meilleure alternative que le
traitement administré soit de 7- 12 ou 14 jours.
I-7-6 Vaccination contre Helicobacter pylori
La prévention de l‟infection gastrique par vaccination a été réalisée dans plusieurs
modèles animaux. Chez la souris, plusieurs antigènes protecteurs de H. pylori ont été
identifiés. L‟uréase et la protéine de stress (heat shok protein : HSPA) sont les antigènes les
plus prometteurs pour le développement d‟un vaccin humain (Ferrero et al., 1995).
Une vaccination basée sur l‟uréase a notamment été éfficace chez le furet et le chat qui
sont les hôtes naturels respectifs de H.mustelae et de H.Felis.
La sécurité d‟emploi et l‟immunogénicité de l‟uréase ont été récemment confirmées chez
l‟homme. La vaccination anti-Helicobacter chez l‟animal peut entraîner la cure d‟une infection
préexistence (Corthésy et al., 1995). Cette observation initialement faite avec l‟uréase chez la
souris a été confirmée chez le furet et le singe macaque, des modèles d‟infections naturelles.
Bactéries Lactiques
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
02
Les bactéries lactiques ont été utilisées depuis des millénaires par l‟homme dans son
alimentation dont le but été : la fabrication et la conservation des aliments. La découverte de
leur action sur le lait (fermentation) fut probablement accidentelle (Novel., 1993).
C‟est à partir des travaux de Louis Pasteur sur la fermentation en 1857, qu‟un lien a été
établi entre la fermentation lactique et les bactéries (Roux., 1994). La première culture
bactérienne pure était une culture de Lb. lactis obtenue et décrite par Josef Lister en 1873.
Après le savant Ukrainien Metchnikoff prix Nobel en 1908, a isolé le bacillus bulgare nommé
de nos jours « Lb. bulgaricus » présent dans le yaourt et il a développé l‟idée que les bactéries
contenues dans le lait fermenté ont des effets bénéfiques sur la santé humaine (la longévité)
(Pernoud et al ., 2005).
II-1 Définition
D‟après Joffin (2001) et Dupin (1992), les bactéries lactiques sont des bactéries des
fermentations alimentaires qui se caractérisent par une très forte production d‟acide
lactique .Leur fermentation est homolactique si l‟acide lactique est le seul produit formé, et
hétérolactique dans le cas où d‟autres composés sont présents : acide acétique, éthanol, CO2 …
(Novel., 1993).
La plupart de ces bactéries ont des effets bénéfiques assurant la conservation des aliments
et la protection contre les affections intestinales de l‟homme et des animaux (Dellaglio et al.
,1994).
II-2 Caractéristiques générales des bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont des cellules vivantes, procaryotes, hétérotrophes et chimio-
organotrophes (De Roissart., 1986).
Ce sont des bactéries gram positif (+) généralement immobiles, asporulées, catalase
négatif -, oxydase (-) et nitrate réductase (-) (De Roissart et Luquet, 1994).
Elles ont des exigences nutritionnelles complexes pour les acides aminés, les peptides,
les vitamines, les sels, les acides gras et les glucides fermentescibles (Dellaglio, et al .,
1994).
Ce sont des anaérobies facultatifs ou micro-aérophiles, elles ne tolèrent que de très
faibles concentrations d‟oxygène (Canteri., 1997).
Elles ont un effet inhibiteur sur les bactéries indésirables et coagulateur, agissant aussi
sur les qualités organoleptiques des produits (Roux., 1994).
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
01
II-3 Habitats
En général, les bactéries lactiques habitent différentes niches écologiques telles que les :
produits laitiers et carnés, les végétaux, les muqueuses de l‟homme et des animaux (Renault et
Corthier, 1998). (Tab. 06)
Tableau 06. Les différents milieux écologiques des BLs
Genre Les milieu Les références
Lactococcus Le lait et les végétaux Novel., 1993.
Streptococcus thermophilus Les produits laitiers : yaourt,
les levains artisanaux.
Jeantet et al., 2007.
Lactobacillus
Surface des plantes, les
produits laitiers, la viande,
l‟eau, la bouche, le tractus
intestinal et le vagin.
Prescott et al., 2003.
Leuconostoc
Les végétaux frais et les
produits carnés.
Dellaglio et al., 1994.
Pediococcus
Les produits carnés fermentés
et le lait.
Larpent., 1996.
II-4 Taxonomie
Les bactéries lactiques forment un groupe très hétérogène (Leveau et Bouix, 1980).
Ce groupe a été défini par ORLA-JENSEN (1919) et réunit plusieurs genres d‟importance
différente (Novel., 1993).
Elles sont soit des cocci : Les Enterococcus, Streptococcus, Lactococcus ; Pediococcus
et Leuconostoc, soit des bacilli : Les Lactobacillus et les Carnobactériums (Larpent, 1996).
A ces genres, a été ajouté récemment le genre Bifidobacterium après leur découverte par
Tissier en 1900 (Romond et Romond, 1993).
II-4-1 Caractères de classification
Les bactéries lactiques sont distinguées par plusieurs caractères tels que :
Caractères morphologiques La forme des cellules microbiennes (sphères ou bâtonnets) le
diamètre cellulaire et la mobilité. (Dellaglio et al., 1994)
Caractères physiologiques parmi ces caractères (Choisy et al ., 1997)
- L‟influence de la température, notamment l‟aptitude à se développer à 10 °C et 45 °C,
la température optimale, la résistance à 60°C pendant 30 minutes ;
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
07
- L‟influence de la concentration en NACL à 2,4 et 6,5 % ;
- Le type fermentaire, homo ou hétérolactique ;
- Les sucres fermentés, avec notamment le galactose et les pentoses ;
Caractères biochimiques
- L‟utilisation des sucres, notamment du lactose ;
- Dégradation des protéines et des lipides ;
- L‟activité antagoniste et protéolytique (De Roissart., 1986).
II-4-2 Les différents genres des bactéries lactiques (Tab. 07)
II-4-2-1Genre Streptococcus
Le genre Streptococcus regroupe des coques Gram+, immobiles, généralement groupé en
paires ou en chaines de longueur variable (Guiraud., 1998). La dernière édition du Bergey’s
Manuel (1986) les classent en 6 catégories : les streptocoques pyogènes, les streptocoques
oraux, les Sc. fécaux, les Sc. lactiques, les Sc. anaérobies stricts et les autres streptocoques
(Dellaglio et al., 1994). Les espèces diffèrent principalement entre elles par la présence d‟un
antigène spécifique dit antigène de Lancefield et se composent en fait de deux groupes : les
streptocoques mésophiles possédant l‟antigène de groupe N et l‟espèce thermophile
Streptococcus thermophilus qui ne possède pas d‟antigène de Lancefield (Novel., 1993).
a. Lactococcus (les streptocoques lactiques mésophiles)
Selon Novel (1993), les lactocoques sont des streptocoques lactiques mésophiles capables
de croitre à une température moyenne de 20 à 30°C et une température minimale moins ou
égale 10°C. Ce genre appartient au groupe N de Lancefield (Prescott, et al. ,2003).
b. Streptococcus thermophilus
Selon Larpent (1996), Sc. thermophilus fait parti des levains thermophiles (yaourt,
fromage à pate cuite) qui dégrade plus rapidement la K-caséine que l‟α S1 ou la ß caséine. Ses
cellules de forme ovoïde, se regroupent en longues chaines, sont homofermentaires et
produisent de l‟acide lactique L(+). (De Roissart et Luquet, 1994). Sc. thermophilus se
caractérise par sa température de croissance optimale de 40-45°C, par sa résistance à un
chauffage à 63°C pendant 30 minutes et par son inaptitude à croitre en présence de 4 % de
NACL et à pH 9,6 (Choisy et al. ,1997). (Fig.15)
II-4-2-2 Le genre Leuconostoc
Ce sont les seules bactéries en forme de coques ayant un métabolisme hétérofermentaire;
elles produisent à partir des hexoses, du CO2, de l‟éthanol et de l‟acide lactique D (-). Leur
température optimale de croissance est de 25 à 30°C (Larpent et al., 1997)
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
00
II-4-2-3 Le genre Pediococcus
Ces bactéries ont un métabolisme homofermentaire et produisent de l‟acide lactique DL ou
L(+) (Dellaglio et al ., 1994).
Tableau 07. Les différents genres des BLs d‟après Novel., 1993.
GC % : pourcentage molaire de l‟ADN en bases G et C.
Figure 12. Streptococcus thermophilus sur Microscopie électronique à balayage d‟après
©INRA/Micheline Rousseau ANNEE
II-4-2-4 Le genre Lactobacillus
Ce groupe est constitué de bacilles réguliers, souvent allongés, Gram+, parfois groupés
en paires ou en chaines, généralement immobiles et réalisant une fermentation de type lactique
(Guiraud., 1998).
Cellules Fermentation Adn :
GC%
Milieux de
culture Forme Arrangement
-Streptococcus
-Leuconostoc
-Pediococcus
-Lactobacillus
-Bifidobacterium
Coque
Coque
Coque
Bacille
Variée
Chaines
Chaines
Tétrades
Chaines
Variée
Homolactique
Hétérolactique
Homolactique
Homolactique
Hétérolactique
Acétique et lactique
34-46
36-43
34-42
32-53
55-67
M17
MRS, KCA
MRS
MRS
LSD
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
06
Certaines espèces sont homolactiques dont l‟espèce souvent utilisée en industrie
alimentaire est Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus pour la production du yaourt en présence de
Streptococcus thermophilus (Gyang., 1984 ; Jeantet et al ., 2007).
Le genre Lactobacillus se subdivise en trois groupes : (Larpent et al ., 1997)
Le groupe I (ex : Thermobacterium) Des homofermentaires se développent à 45°C.
Le groupe II (ex : Streptobacterium) Des hétérofermentaires facultatifs ADH- :
fermentent le glucose et les pentoses sans dégagement de CO2.
Le groupe III (ex : Betabacterium) Hétéromofermentaires ADH+ : dégagement de
CO2. (Fig. 16 et 17) (Tab. 08).
Tableau 08. Critères différentiels des 3 groupes de Lactobacillus d‟après Larpent., 1996
Thermobacterium Streptobacterium Betabacterium
ADH
Glucose (gaz)
Glucosides
Gluconate (gaz)
Aldolase
Pentoses
Thiamine
Acide lactique
G+C %
-
-
+
-
+
-
-
DL ou L
34,7-50,8
+
-
+
+
+
+
-
D ou DL
33-46,4
+
+
-
+
-
+
+
DL
35-53,4
+ : positif
- : négatif.
Figure 13. Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus d‟après ©INRA/Micheline
Rousseau
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
42
Figure 14. Association du Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus d‟après
©INRA/Micheline Rousseau
II-4-2-5 Le genre Bifidobacterium
Le genre Bifidobacterium regroupe des bacilles sous forme de bâtonnets réguliers ou
ramifiés qui se développent sur un milieu nécessitant l‟addition d‟un agent réducteur
d‟oxygène telle que la cystéine chlorhydrique. L‟apparence des colories est très variable et
elles donnent sur un milieu gélosé nutritif 3 ou 4 types de colonies de taille et de couleur
différentes (Leveau et Bouix., 1993).
La morphologie des cellules est influencée par les conditions de culture ; l‟apparition de
formes bifides peut être stimulée par l‟addition de carbonates, d‟acétate de sodium, de
chlorures et de nombreux cations monovalents (Kojma et al., 1968).
Le terme de facteur Bifidogène a été employé par Gyoiuy en 1953 (Gibson et al., 1995).
Ces facteurs sont spécifiques à chaque espèce de Bifidobactérie; leurs origines sont diverses
soit : le monde microbien (extrait de levure) soit le monde végétatif (extrait des végétaux)
ainsi que le lait maternel. Ces facteurs jouent un rôle dans la stimulation de la croissance de
Bf. bifidium, Bf. infantis, Bf. longum et Bf. brève (Gibson et al., 1995); ce sont des dérivés
de N-Acétyle glucosamine lactose, des peptides ou des substances semblables aux peptides et
aux vitamines ou bien des oligo saccharides dans le lait humain (Gyorgy et al., 1995). Dans
le lait de vache et dans les laits modifiés, ces facteurs Bifidogène sont absents.
a- Bifidobactérium. Bifidum
Bensoltane et al., 1997 ont démontré que leurs ensemencement sur milieu gélosé, incubée
en anaérobiose donne des colonies sous forme circulaire blanchâtres opaques avec une surface
lisse ou rugueuse et un aspect muqueux; donc c‟est des colonies indiquant une bonne
croissance avec un culot au fond du tube et un éclaircissement de milieu de culture. Leur
température de croissance optimale est de 36°C à 38°C et leur pH optimum est de 6 à 7 de
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
42
croissance. La présence du fer et de Magnésium dans le milieu stimule sa croissance
(Archibald., 1986).
b- Bifidobactérium adolescentis
Ce sont des bâtonnets, courts, incurvés, anaérobies et ont des apparences variables; leur
isolement se fait à partir de caries dentaires, du vagin humain et des selles de nourrissons
(Scardovi., 1986). La croissance optimale est obtenue à la température optimale de 35°C à
37°C; la croissance est inhibée à 20°C et 46.5 °C (Bouchaman et al., 1974).
La présence de l‟acide et CO2 stimule l‟utilisation de la voie oxydative des hexoses
mono phosphates qui fermente le gluconate.
c- Bifidobactérium infantis
Ce sont de petites cellules fines, souvent globuleuses ou sphériques qui contiennent des
granulés centraux sous forme d‟un œil. Elles sont les plus prédominantes des espèces de
Bifidobactéries. Elles secrètent des acides aminés après la dégradation de la caséine
(Bensoltane et al., 1997).
d- Bifidobactérium brève
Bensoltane et al., 1997 ont démonté que se sont des cellules épaisses fines de forme
courte en bâtonnets associés et possédant des granulations qui apparaissent après la coloration
de Gram; leurs colonies ont des surfaces lisses ou ondulées entre 2 et 3 mm de diamètre.
e- Bifidobactérium longum
Des cellules de formes irrégulières, frêles, minces très allongées et branchements rares,
bifurques, leur Gram est variable ; les colonies apparaissent avec un aspect renflé. Leur
température de croissance optimale est de 35°C à 37°C. Ils ne fermentent pas le gluconate mais
fermente les pentases (Bellongue., 1993).
f- Bifidobactérium pseudo longum
Ce sont des cellules bactériennes qui ont des formes coccoïde ou incurvées courtes
souvent associées en deux et rarement en chaînes par fois isolées. Elles exigent pour leur
croissance un pH optimale de 6.5 et 7; leur croissance est lente à pH : 6 et inhibée à pH: 8.
Elles ont été isolées à partir de selles de souris, de poulets, de bovins et d‟ovins. (Bensoltane et
al., 1997).
g- Bifidobactérium thermophilum
Leur association se fait en paires avec des jonctions entre deux cellules présentant un
aspect irrégulier ; pas de fermentation de ribose ni de xylose (Bensoltane et al., 1997). Leur
température de croissance optimale est de 46°C avec un pH optimal de croissance de 6.5 à 7.
Elles sont isolées à partir de selles de porc, de poulet et de rognons des bovins.
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
40
h- Bifidobactérium suis
Cette espèce a des cellules en forme de bâtonnets fins et font jusqu‟à 6 mm de long
avec des colonies lisses, blanches. Elles sont anaérobies et circulaires. Elles poussent dans des
conditions optimums de température minimale de 20°C et la température maximale de 44°C,
pas de croissance à 60°C (Bouchaman et al., 1974).
II-5 Principales propriétés métaboliques des bactéries lactiques
II-5-1 Les exigences nutritionnelles
Les bactéries lactiques sont considérées comme un des groupes bactériens les plus
exigeants du point de vue nutritionnel (De Roissart., 1986). (Tab. 08)
II-5-1-1 L’utilisation des acides aminés libres
D‟après Novel (1993), Une bonne croissance des bactéries dans le lait est assurée par sa
trop faible concentration en acides aminés qui constituent leur source d‟azote et par l‟absence
de certains acides comme la méthionine.
II-5-1-2 L’utilisation des peptides et des protéines du lait
Même si tous les acides aminés du milieu sont utilisés, les bactéries lactiques utilisent
aussi les peptides de haut poids moléculaire et les protéines du lait comme source azotée pour
réaliser la fermentation lactique (Desmazeaud., 1997).
II-5-1-3 L’importance des vitamines du lait
Les bactéries lactiques ont besoin des vitamines pour leur croissance, en particulier : la
riboflavine (B2) ; la niacine (PP) et la pyridoxine (B6) parce que leurs concentrations sont trop
faibles dans le lait et elles sont très sensibles au chauffage (Desmazeaud., 1997).
III-5-2 Le métabolisme des sucres
III-5-2-1- Définition de la fermentation lactique
La fermentation est une méthode de stabilisation biologique utilisée depuis plus de 6 000
ans et parmi les fermentations les plus exploitées est la fermentation lactique. (Jeantet et al.,
2006)
Selon Guiraud (1998), la fermentation lactique est une étape essentielle dans la fabrication
des fromages et des yaourts, possédant un rôle organoleptique (acidification, arôme), de
stabilisation (par la baisse du pH et l‟antibiose) et un rôle sur la qualité alimentaire. (Tab. 09 et
10)
II-5-2-2 Métabolisme du lactose
D‟après Desmazeaud (1997), le sucre fermentescible du lait est le lactose dont la
concentration est voisine de 5%. Une bactérie lactique est capable d‟excréter l‟acide lactique
D(-), L(+) ou DL selon une de 2 voies métaboliques suivantes : (Larpent et al ., 1997)
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
40
Voie d‟Embden-Meyerhof-Parnas, homofermentation dans laquelle l‟acide lactique est le
seul produit du métabolisme excrété.
Voie de Dickens-Horecker, hétérofermentation conduisant à l‟acide lactique et d‟autres
produits : CO2, l‟acide acétique, l‟éthanol.
II-5-2-3 Le bilan énergétique de la fermentation lactique
Selon Novel (1993), le bilan énergétique de la fermentation homolactique est que : chaque
mole de lactose donne 4 molécules de lactate et 5 molécules d‟ATP et pour la fermentation
hétérolactique, la même molécule ne produit que 3 molécules de lactate et 4 molécules d‟ATP.
II-5-2-4 Métabolisme des autres sucres
Certaines espèces de Lactobacillus hétérofermentaire savent utiliser les pentoses et les
pentitols (arabitol, xylitol) : ces composés pénètrent grâce à des perméases spécifiques.
D‟autres espèces homofermentaires utilisent le système PTS pour la perméation du glucose par
exemple chez Lb. helveticus et Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus. (Novel., 1993)
Tableau 09. Les différents types des ferments lactiques d‟après Canteri., 1997
Type levain Nouveau nom Produits
Més
op
hil
es
Lactococcus lactis ssp
cremoris
Lactococcus lactis ssp lactis
L.lactis ssp cremoris
L.lactis ssp lactis
Lc.mesenteroides ssp cremoris
Lc.lactis
L.lactis ssp cremoris
L.lactis ssp lactis
L.lactis ssp lactis diacetylactis
L.lactis ssp cremoris
L.lactis ssp lactis
L.lactis ssp lactis diacetylactis
Lc.mesenteroides ssp cremoris
Lc.lactis
Fromages frais, cheddar
Féta, mimolette
Pâtes molles
Pâtes pressées
Beurre
Beurre
Pâtes molles
Pâtes pressées
Beurre
Th
erm
op
hil
es
Sc.salivarius ssp thermophilus
Lb.delbrueckii ssp bulgaricus
Sc.salivarius ssp thermophilus
Lb.helveticus
Lb.delbrueckii ssp lactis
Yaourt
Emmental
Comté
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
44
Tableau 10. Exemples de bactéries lactiques utilisées dans la fermentation des aliments
Aliments/Produits Bactéries lactiques Références
Produits laitiers
Fromages
Yaourt
Lait fermenté
Beurre
Lactocoques, Lactobacilles…
Sc.salivarius,subsp.thermophiluset
Lb.bulgaricus subsp. delbrueckii
Lb.acidophilus
Lactocoques, Leuconostoc
Singleton., 1999.
Produits carnés et de la pêche
Saucisse sèche
Saucisse semi-sèche
Izushi
Pediocoques,Lb.plantarum, Lb.brevis
Pediocoques
Lc.mesenteroides, Lb.plantarum
Drouault et Corthier.,
2001
Produits végétaux
Olives
Choucroute
Sauce soja
Pédiocoques, Lb.plantarum, Lb.brevis,
Lc.mesenteroide
Lc.mesenteroides
Lb. subsp delbrueckii bulgaricus
Larpent-G et
Sanglier., 1992
Pains spécieux aux levains Lb.plantarum, Lb.brevis, Lb.fermentum,
Lb.sanfrancisco
Desmazeaud., 1996
II-5-2-5 Métabolisme du citrate et d’autres substrats carbonés
D‟après Desmazeaud, (1996), les bactéries lactiques, en plus de leur pouvoir
fondamental d‟acidification ont une capacité aromatisante dont l‟acide citrique est considéré
comme le principal précurseur de l‟arome.
(+) : exigence ; (-) : indépendance ; (S) : stimulation ; (?): non déterminé.
III-5-3 L’activité protéolytique
Le système protéolytique des bactéries lactiques est important : il permet la dégradation
des caséines du lait pour assurer leur nutrition azotée et il intervient au cours de l‟affinage du
fromage (Canteri., 1997).
II-5-4 La production de polysaccharides
Certaines espèces de bactéries lactiques synthétisent des exopolysaccharides (EPS) de
grande importance industrielle par exemple : des souches de Sc. thermophilus et Lb.
delbrueckii subsp bulgaricus considérées comme responsables de la viscosité du yaourt
obtenu (Novel., 1993).
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
42
II-5-5 La production de composés antagonistes
Selon Morisset et al., (2005), les bactéries lactiques sont utilisées depuis longtemps de
façon consciente ou non pour leur activité antimicrobienne. Cette propriété est le résultat de la
production par ces bactéries des substances inhibant la croissance d‟autres micro-organismes
comme les acides organiques (acides lactique et acétique), le peroxyde d‟hydrogène et les
bactériocines.
II-6 Connaissance en génétique sur les bactéries lactiques
La génétique des bactéries lactiques est récente, ces études sont développées notamment sur
Streptococcus thermophilus et quelques espèces de Lactobacillus .Elle s‟intéresse à étudier les
phages et les plasmides des bactéries lactiques, les transferts in vivo et in vitro des gènes et la
mutabilité de ces bactéries (Novel., 1993).
II-6-1 Les Bactériophages lactiques
En 1935, les Néo-Zélandais Whitehead et Cox ont identifié les premiers phages des BLs,
ils sont de si petite taille qu‟on ne peut pas les voir au microscope optique (Amiot et Lapointe-
V, 2002).
Selon Desmazeaud (1998), les phages lactiques sont 2 types : les phages virulents
provoquant la lyse (destruction) des cellules en envahissant les ateliers de fabrication des
levains et les phages tempérés : ils pénètrent dans la cellule, s‟y multiplient mais ne deviennent
lytique qu‟après un certain temps.
II-6-2 Les plasmides résidents des bactéries lactiques
La connaissance des plasmides d‟une souche est très nécessaire, grâce à leur fonction dans
la vie cellulaire (fermentation des sucres, protéolyse…) et dans les relations avec les autres
micro-organismes du milieu (production de composés antagonistes, résistance aux
antibiotiques, aux UV…) (Novel., 1993).
II-7 Effets bénéfiques des bactéries lactiques sur la santé humaine
A partir des travaux de Metchnikoff, en 1908, l‟idée que des bactéries lactiques ingérées
vivantes pouvaient avoir un effet bénéfique a été développée et la notion de « probiotique »
était née (Rambaud et al ., 2004). (Tab.11)
Les bactéries lactiques les plus fréquemment utilisées comme probiotiques sont des
lactobacilles : Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii subsp bulgaricus, Lb. lactis et aussi Sc.
thermophilus et Bf. bifidum (Novel, 1993).
La sélection de souches consiste à identifier les effets santés recherchés. Puis, sur la
connaissance des critères technologiques et physiologiques, comme la viabilité et la survie de
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
41
la souche dans le produit fini et l‟adaptation au milieu dans lequel elle sera utilisée (Pernoud et
al ., 2005).
Tableau 11. Principaux rôles bénéfiques pour la santé humaine des bactéries lactiques d‟après
Desmazeaud, 1996
Effets sur le transit intestinal et sur la flore intestinale :
- amélioration du transit et lutte contre les diarrhées ;
- effets bénéfiques des acides lactiques et acétiques sur la composition de
la flore intestinale (notamment contre les bactéries pathogènes) ;
- effets bénéfiques sur le métabolisme de la flore intestinale
(notamment dégradation des amines) ;
- production de bactériocines, antibiotiques, H2O2.
Le yaourt non chauffé permet l‟absorption du lactose chez les sujets déficients
en lactose intestinale
Les laits fermentés : - stimulent la réponse immunitaire
- ont un rôle anti-tumeurs
- interviendraient dans la minéralisation
- diminueraient la cholestérolémie
II-7-1 Amélioration de la digestion du lactose
Le premier effet démontré avec un haut niveau de preuve a été l‟amélioration de
l‟intolérance au lactose et de la malabsorption de ce sucre par les bactéries lactiques surtout
celles du yaourt (Marteau et Seksik., 2005).
II-7-2 Effets sur le transit et sur la flore intestinale
Selon Desmazeaud (1996), les laits acidifiés ou le yaourt sont souvent utilisés pour lutter
contre les diarrhées, notamment chez les jeunes enfants. L‟ingestion de ferments lactiques
inhibe la prolifération de certaines souches pathogènes par divers mécanismes :
- production de substances (H2O2, acides lactiques et acétiques) ;
- abaissement du pH par les acides produits ;
- détoxification par dégradation des entérotoxines ;
- fixation sur le tube digestif empêchant la colonisation de pathogènes.
II-7-3 Effets sur la réponse immunitaire
Parmi les effets supposés des bactéries lactiques chez l‟homme, la stimulation des
fonctions immunitaires est les plus étudiée. Dont les progrès dans la connaissance de
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
47
l‟immunité intestinale ont permis de montrer que 60 à 70% du nombre totale de nos cellules
immunitaires se trouvent dans la muqueuse de l‟intestin grêle et du colon (Moreau., 2005).
II-7-4 Rôle antitumeur (Cancérogenèse)
La flore colique pourrait être impliquée dans la cancérogenèse par l‟effet des enzymes
bactériennes qui activent des procarcinogènes en carcinogènes. Des études récentes ont montré
que plusieurs bactéries lactiques telles que : Lb.acidophilus et Lb.casei, pouvaient diminuer
les taux d‟enzymes responsables de l‟activation de certains procarcinogènes (Drouault et
Corthier., 2001)
II-7-5 Diminution du cholestérol sérique et déconjugaison des sels biliaires
L‟effet des bactéries lactiques sur le métabolisme du cholestérol reste encore controversé.
Alors que plusieurs études rapportent que la concentration en cholestérol sérique diminue
pendant la consommation de grandes quantités (680 à 5000 ml par jour) de produits laitiers
fermentés (Drouault et Corthier., 2001)
II-7-6 Influence sur l’absorption du calcium et des minéraux
Selon Desmazeaud (1996), les effets étudiés chez l‟homme sont beaucoup plus
contradictoires : une amélioration de l‟absorption des minéraux peut être notée lors d‟un
régime complété par le yaourt.
II-8 Devenir des bactéries lactiques ingérées
Selon Rambaud et al., (2004), la survie des micro-organismes ingérés diffère entre
genres microbiens, espèces et mêmes souches. Certains d‟entre eux sont détruits dés leur
passage dans l‟estomac alors que d‟autres ont une haute capacité de survie jusque dans les
selles.
Les bactéries lactiques sont adaptées à une croissance et à une survie dans du lait ou dans
des milieux dérivés du lait. Dans le tube digestif, les conditions d‟environnement sont très
différentes du produit laitier. Dans l‟estomac, l‟acidité peut être très élevée, dans l‟intestin
grêle : les sels biliaires, les enzymes pancréatiques et des défensives produites par les cellules
de l‟intestin grêle peuvent réduire la viabilité des bactéries lactiques (Corthier., 2006).
Les bactéries du yaourt : Lb. delbrueckii subsp bulgaricus et Sc. thermophilus à titre
d‟exemple, ont une résistance à l‟acide faible et sont rapidement détruites en quelques minutes
à des pH=1.Certains auteurs ont observé la survie de quelques bactéries du yaourt jusqu‟à la
fin de l‟iléon terminal mais jusqu‟ici ils n‟ont pas pu démontré une survie jusque dans les
selles. Mais d‟autres bactéries comme certaines bifidobactéries et Lb. plantarum ont une
survie très importante jusque dans les selles avec des concentrations fécales observées
supérieurs à 108
UFC/g (Marteau et Seksik, 2005). (Tab.12)
Revue bibliographique sur les bactéries lactiques
40
Tableau 12. Pourcentages de survie de quelques bactéries d‟origine alimentaire dans l‟intestin
grêle humain d‟après Drouault et Corthier, 2001
Bactérie lactique % de survie Site de récupération
Lb.plantarum NCIMB 8826
Lb.fermentum KLD
Lb. lactis MG1363
Bf. bifidum
Lb .acidophilus
Bifidobacterium sp
Lb. bulgaricus
Sc. thermophilus
7
0,5
1
37,5
1,5
23,5
>1
>1
Iléon
Iléon
Iléon
Iléon
Iléon
Iléon
Duodénum
Duodénum
Interactions des bactéries
lactiques
Interaction bactérienne
46
Les interactions entre micro-organismes évoluent en fonction des souches qui sont
associées. De plus, elles sont étroitement dépendantes des conditions de l‟environnement, en
particulier du milieu et des conditions de culture. Cela se comprend aisément, puisque les
principales causes d‟interactions entre micro-organismes dérivent de leurs propriétés
physiologiques, dont l‟expression est étroitement dépendante des conditions de culture
(Juillard et al ., 1998).
Lorsque les bactéries lactiques sont utilisées en culture mixte pour la fermentation du
lait, des interactions entre les différentes souches se manifestent (Grattepanche., 2005).
Selon Choisy et al. (1997), ces interactions sont classées en deux groupes : interactions
positives, qui caractérisent une stimulation du ou des micro-organismes, et interactions
négatives, qui correspondent à une inhibition de la croissance et de l‟activité métabolique.
III-1 Les phénomènes de stimulation ou de coopération
La coopération qui se définit comme une interaction positive entre les souches, est
divisée en plusieurs catégories. On distingue le commensalisme, lorsqu‟une population est
stimulée par la production d‟une substance essentielle ou la destruction d‟un facteur inhibiteur
par une autre population et le mutualisme ou la proto-coopération (exemple de Sc.
thermophilus avec Lb.bulgaricus), lorsque l‟interaction est positive pour chacune des
populations (Gratepanche., 2005).
D‟après Juillard et al. (1998), la coopération entre les bactéries lactiques est réalisée
par :
Production de nutriments azotés : L‟association de Sc. thermophilus et Lb.bulgaricus
pour la fabrication du yaourt est l‟exemple le plus connu et le plus stable. Dans le lait,
Lb.bulgaricus plus protéolytique que Sc. thermophilus, libère des acides aminés à partir de la
caséine dont Sc. thermophilus a besoin pour sa croissance. En retour, la croissance de Sc.
thermophilus en l‟absence ou à faible concentration d‟oxygène produit de l‟acide formique
stimulant le développement de Lb.bulgaricus (Novel., 1993). (Fig. 15)
Par modification des conditions physiologiques du milieu : Le lait n‟est pas un milieu
de culture optimale pour les bactéries lactiques, il est évident que des modifications de
conditions physiologiques peuvent avoir un rôle bénéfique pour les souches. Nous ne
reviendrons pas sur la modification de la teneur en acide aminés du lait, mais nous nous
attacherons aux conséquences de la modification du pH ou à la possibilité d‟élimination des
facteurs inhibiteurs (Juillard et al ., 1998).
Interaction bactérienne
22
Lactobacillus bulgaricus Acides aminés à partir de la caséine
Acide formique utilisé Streptococcus thermophilus
par Lactobacillus bulgaricus utilise ces acides aminés
Figure 15. La symbiose des bactéries du yaourt d‟après Fredot., 2007
III-2 Les phénomènes d’antagonisme (d’inhibition)
Selon Grattepanche (2005), différents agents antimicrobiens ayant la capacité
d‟inhiber le développement de bactéries pathogènes et/ou d‟une flore de dégradation de
l‟aliment sont produits par les bactéries lactiques durant la fermentation du lait. Il s‟agit
notamment des acides organiques issus des mécanismes homos et hétéro fermentaires des
bactéries lactiques, de peroxyde d‟hydrogène et des bactériocines produites par quelques
souches lactiques.
III-3 Facteurs d’inhibition des bactéries lactiques
Les inhibiteurs, produits par les bactéries lactiques peuvent être classés en inhibiteurs
non spécifiques ayant un large spectre d‟action et en inhibiteurs plus spécifiques tels que les
bactériocines (Aboura., 2004).
III-3-1 Les inhibiteurs non spécifiques
III-3-1-1 Les inhibitions dues à la production d’acides organiques
Les acides organiques, produits par fermentation dans les aliments, peuvent agir sur la
flore par abaissement du pH mais aussi par une action inhibitrice spécifique (Mathot et al .,
1996).
Effet de l’acidification
La majorité des espèces bactériennes ne peut pas se développer aux pH inferieurs à 4.
Dans les produits fermentés, la baisse du pH dépend du pouvoir tampon du produit, de la
concentration en substrats fermentescibles et du pH limite tolèré par les ferments. Les pH
atteints dans certains de ces produits (saucissons secs : pH= 4,6 à 5,3 ; choucroute : pH= 4,8 ;
yaourt : pH= 4,0) suffisent à provoquer l‟élimination de certains contaminants.
Effets spécifiques
La nature de l‟acide présent dans le milieu influe sur la résistance des microorganismes
face à l‟acidification. Pour des Salmonelles par exemple, des pH minima de croissance varient
de 4,0 avec l‟acide chlorhydrique et l‟acide citrique à 5,50 pour l‟acide propionique ; avec
Interaction bactérienne
22
l‟acide lactique cette limite s‟établit à 4,40. Cet effet inhibiteur spécifique des acides
organiques est généralement attribué à leur forme non dissociée (Mathot et al ., 1996).
D‟après Desmazeaud (1996), en général, c‟est la forme moléculaire (non dissociée) de
l‟acide lactique qui est le facteur toxique pour les bactéries. L‟acide non dissocié pénètre
librement dans la cellule et comme le milieu intérieur est moins acide, il se dissocie en
augmentant la concentration interne en proton, ce qui perturbe certains échanges entre la
cellule et son environnement : pénétration de nutriments, acides aminés en particulier (Mathot
et al., 1996).
III-3-1-2 Les inhibitions dues au peroxyde d’hydrogène
Les bactéries lactiques sont souvent appelées bactéries anaérobies facultatives, mais ce
terme cache une grande variété de comportements de ces germes vis-à-vis de l‟oxygène. Dans
les conditions d‟aérobiose, chez la plupart des bactéries lactiques, les molécules de NAD
réagissent avec l‟oxygène pour former du peroxyde d‟hydrogène (H2O2) ou une molécule d‟eau
grâce à des NADH : H2O2 ou NADH : H2O oxydases. Ce peroxyde d‟hydrogène est plus ou
moins toxique pour la bactérie lactique productrice, notamment dans le cas du lait, dont il est le
constituant d‟un système inhibiteur naturel devant comporter aussi une lactoperoxydase et du
thiocyanate.
Si le lait contient de l‟oxygène dissous, le peroxyde d‟hydrogène produit va activer
l‟oxydation du thiocyanate par la lactoperoxydase, en un intermédiaire oxydé :
l‟hypothiocyanate (Desmazeaud., 1996).
D‟après Choisy et al (1997), ce dernier est généralement bactéricide pour les bactéries
gram-négatif ou bactériostatiques pour les bactéries gram-positif. Il induit une inhibition des
enzymes de la glycolyse, mais aussi des lésions dans la membrane cytoplasmique, ce qui
favorise des fuites d‟ions K+, d‟acides aminés ou de peptides. Comme il peut être bactéricide
pour certaines bactéries de contamination, voir pathogène, la fédération internationale de
laiterie à proposé d‟utiliser les propriétés de ce système inhibiteur pour améliorer la
conservation temporaire du lait cru dans les pays chauds dépourvus d‟équipement de
réfrigération (Desmazeaud., 1996).
III-3-1-3 Autres inhibiteurs non spécifiques
Le diacétyle
Le diacétyle produit par nombre de bactéries lactiques est un inhibiteur actif contre des
nombreux microorganismes dont l‟action inhibitrice est accrue en milieu acide. Les bactéries
Gram négatives sont plus sensibles que les Gram positives (Mathot et al ., 1996).
Interaction bactérienne
20
Reutérine
C‟est une substance produite par Lactobacillus reuteri. Son action inhibitrice s‟exerce
sur un large spectre de microorganismes Gram négatifs et positifs (Salmonella, Listeria,
Staphylococci…) (Mathot et al ., 1996).
III-3-2 Les inhibiteurs spécifiques « Les bactériocines »
III-3-2-1 Définition
Les bactériocines sont définies comme étant des molécules de nature protéique,
synthétisées par voie ribosomale par des bactéries et présentant une action antibactérienne
contre des souches distinctes de la souche productrice. Cette dernière est protégée contre les
bactériocines qu‟elle produit par la synthèse d‟une protéine dite d‟immunité (Morisset et al .,
2005).
D‟après Léonil et Lortal (2006), les bactéries lactiques libèrent plusieurs substances de
nature peptidique au cours de la fermentation du lait, grâce à leur équipement enzymatique
constitué de protéases et de peptidases.
Chez les Lactocoques par exemple, c‟est la nisine (produite par certaines souches de
Lactococcus lactis subsp. lactis) qui est la bactériocine la mieux décrite. Elle présente la
caractéristique d‟inhiber différentes bactéries à Gram positif, notamment des Clostridiums et
des Bacillus (Desmazeaud., 1996).
III-3-2-2 Classification des bactériocines
La classification actuelle est fondée sur la taille et le fait que les bactériocines font
l‟objet ou non de modification post-traductionnelles (classification proposée par
Klaenhammer en 1993) (Cenatiempo et al ., 1996). (Tab.13)
Classe I Ŕ Lantibiotiques
Il s‟agit de peptides de taille réduite (< 5 KDa), contenant des acides aminés inhabituels
obtenus par modification post-traductionnelle dont le plus caractéristique est la lanthionine.
Pour souligner la présence de ce type d‟acides aminés, les bactériocines de classe I ont été
nommées Lantibiotiques pour « Lanthionine containing antibiotics ». La structure des
lantibiotiques varie essentiellement en fonction de la localisation de ponts établis entre les
acides aminés modifiés, ce qui permet de distinguer les types A (lantibiotiques linéaires) et B
(lantibiotiques globulaires). La nisine est considérée comme l‟archétype des lantibiotiques de
type A et elle est actuellement le seul peptide antibactérien à être utilisé comme additif
alimentaire, et récemment a été proposée comme alternative aux antibiotiques (Morisset et al .,
2005).
Interaction bactérienne
20
Classe II Ŕ Peptides de faible poids moléculaire (non antibiotiques)
Cette classe est constituée de petites bactériocines (<10KDa) thermorésistants et sans
modification post-traductionnelle. Ces bactériocines agissent principalement en perméabilisant
la membrane de la cellule cible.
Cette catégorie est la plus largement représentée avec plus de 50 bactériocines
caractérisées, ce qui a conduit à la création de trois sous classes :
La sous-classe IIa regroupe des peptides ayant une structure similaire et généralement
une activité contre Listeria monocytogènes ;
La sous- classe IIb regroupe les bactériocines à deux composants ;
La sous- classe IIc regroupe des peptides variés. (Morisset et al ., 2005).
Classe III Ŕ Peptides de haut poids moléculaire
Ces peptides d‟un poids moléculaire supérieur à 30 KDa se caractérisent par leur faible
thermo résistance. Ils sont en effet détruits par un chauffage de 10 à 15 min à 60°C. Ils sont
produits principalement par des souches de lactobacilles homofermentaires (avec une majorité
de thermophiles). (Mathot et al ., 1996).
Classe IV Ŕ Bactériocines complexes
Les bactériocines de classe IV étaient définies comme des protéines associées à une
composante non protéique, lipidique et/ou oligosaccharidique, nécessaires à leur activité
biologique. Cette classe présentée par Klaenhammer (1993), aujourd‟hui n‟est pas prise en
compte par de nombreux auteurs (non reconnue véritablement) (Morisset et al ., 2005).
Tableau 13. Classification des bactériocines de bactéries lactiques
d‟après Morisset et al ., 2005
Classes Sous-catégories
Classe I : antibiotiques Type A : molécules linéaires
Type B : molécules globulaires
Classe II : bactériocines non-modifiées
thermostables
Classe IIa : anti-Listeria
Classe IIb : bactériocines à deux composants
Classe IIc : autres bactériocines
Classe III : bactériocines de grande taille,
sensibles à la chaleur
Interaction bactérienne
24
III-3-2-3 Mode d’action des bactériocines
Toutes les bactériocines de bactéries lactiques, dont le mode d‟action a été étudié,
agissent de façon similaire en formant des pores dans la membrane plasmique des cellules
cibles (Cenatiempo et al ., 1996). (Fig.16)
Selon Desmazeaud et al. (1994), le mode d‟action des bactériocines se situe au niveau
membranaire, en modifiant le potentiel de la membrane grâce à une structure alternante
hydrophile et hydrophobe qui permet à ces peptides de s‟insérer dans la membrane des
bactéries cibles et y former des pores. Ce qui entraine des fuites d‟ATP et d‟ions K+ et par
conséquent l‟impossibilité pour ces cellules cibles de maintenir leur pH intracellulaire.
Figure 16. Mode d‟action des bactériocines d‟après Drider., 2005
Les lantibiotiques
Les lantibiotiques interagissent avec la membrane cellulaire par des interactions
électrostatiques ou par liaison à des récepteurs spécifiques tels que le lipide II (undecaprenyl-
pyrophosphoryl-MurNAc-pentapeptides-GlcNAc), un précurseur de peptidoglycanes. Suite à
cette liaison, les lantibiotiques peuvent former des pores larges et non spécifiques dans la
membrane cytoplasmique, ce qui va causer l'efflux rapide des petits composés cytoplasmiques
tels que les ions, les acides aminés, l'ATP, etc. Cette augmentation de la perméabilité
membranaire va conduire à la dissipation des deux composantes de la force proton motrice, à la
cessation rapide des activités cellulaires et à la mort de la cellule. L'interaction avec le lipide II
permet d'augmenter la stabilité des pores formés et de réduire la concentration du lantibiotique
nécessaire à la formation des pores, mais peut également conduire à l'inhibition de la synthèse
Interaction bactérienne
22
de la paroi cellulaire (McAuliffe et al., 2001 ; Twomey et al., 2002 ; Bauer et al., 2005 ;
Patton et al., 2005).
Les lantibiotiques de type A dissipent la force proton-motrice par formation de pores et
interfèrent avec la synthèse des peptidoglycanes alors que la plupart des lantibiotiques de type
B agissent par inhibition de la synthèse des peptidoglycanes. Néanmoins, certains forment
également des pores dans la membrane des cellules cibles (Bauer et al., 2005; Patton et al.,
2005). La nisine, un lantibiotique de type A, interagit avec le lipide II au niveau du MurNAc
tandis que la mersacidine, un lantibiotique de type B, interagit avec le GlcNAc du lipide II
(Willey et al., 2007).
Les lantibiotiques composés de deux peptides comme la lacticine 3147 agissent
également par formation de pores dans la membrane des cellules cibles (McAuliffe et al.,
2001). La lacticine 3147 a un spectre d'action large. Le peptide A1 a une activité qui est plus
élevée en présence du peptide A2. Il a été récemment proposé que la lacticine 3147 A1 agit en
se liant au lipide II, inhibant la synthèse des peptidoglycanes et permettant à la
lacticine 3147 A2 de former un pore dans la membrane de la cellule cible (Morgan et al.,
2005 ; Wiedemann et al., 2006).
Les bactériocines de classe II
Le mécanisme d'action supposé des bactériocines de classe IIa est l'interaction de la
bactériocine avec la membrane ou un récepteur spécifique, la « mannose perméase », pour
ensuite former un pore dans la membrane de la cellule, ce qui induit la perméabilisation de la
membrane, la dissipation des deux composantes de la force proton motrice et la mort de la
cellule (Bauer et al., 2005). Le mécanisme de formation des pores n'est pas connu, même si
l'hypothèse la plus courante est l'association de différentes molécules de la bactériocine (Diep
et al., 2007).
Les bactériocines de classe IIb ont en général un spectre d'action inhibant une large
gamme de bactéries Gram+. Elles forment des pores et rendent la membrane perméable à
différentes petites molécules, des cations monovalents ou des anions, ce qui dissipe une ou les
deux composantes de la force proton motrice. Les ions transportés sont spécifiques de la
bactériocine (Oppegard., 2007). Le ratio optimal d'activité entre les deux sous-unités est en
général de 1:1 mais il est de 4:1 pour la lactocine 705 (Castellano et al., 2007 ; Oppegard.,
2007). Néanmoins, les mécanismes d'interaction des deux bactériocines entre elles et avec la
Interaction bactérienne
21
membrane cellulaire ne sont que très peu connus. Il a été montré qu'il n'y avait pas de liaison au
même récepteur que pour les bactériocines de classe IIa (la « mannose perméase ») (Diep et
al., 2007). Castellano et al., (2007) ont récemment montré que les deux peptides composant la
lactocine 705 ont des activités bien spécifiques. La lactocine 705α interagit avec la surface de
la membrane cellulaire et la déshydrate, ce qui permet à la lactocine 705β de former des pores.
Les bactériocines de classe III
Le mode d'action de ces bactériocines diffère complètement des bactériocines des autres
classes. En effet, l'enterolysin A, la zoocin A et la millericin B agissent par l'hydrolyse des
liens peptidiques des peptidoglycanes des cellules sensibles. La zoocin A a un spectre d'action
étroit alors que l'enterolysin A et la millericin B ont un spectre d'action large. L'helveticin J a
un mode d'action bactéricide (Nilsen et al., 2003).
Matériel et Méthodes
57
I-Matériel et Méthodes
I-1 But de travail
Le but de notre travail expérimental est résumé en trois parties :
Isolement et Identification d’Helicobacter pylori, responsables de certaines maladies
gastro-duodénales.
Pré identification des bactéries lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ 447,
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum
CUETM 89/29 et la réalisation d‟un test d‟antagonisme in vitro afin de démontrer
l‟inhibition Helicobacter pylori par les bactéries lactiques.
Etudier l‟effet de Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 sur Helicobacter pylori in
vivo.
I-2 Lieu et période de travail
Le travail a été réalisé dans les laboratoires suivants :
Le laboratoire de microbiologie, Université Ibn Khaldoun, Tiaret. Algérie.
Période du 01/03/2011 au 30/05/2011.
Le laboratoire Zootechnique, Université Ibn Khaldoun, Tiaret. Algérie.
Période du 01/03/2013 au 05/06/2013.
Le centre national de référence des campylobacters et Helicobacters, laboratoire de
bactériologie Hôpital Pellegrin Bordeaux 2. France.
Période du 06/02/2010 au 28/02/2010.
Le laboratoire de génétique et biologie moléculaire, Université Bordeaux 2. France
Période du 28/01/2014 au 13/02/2014.
I-3 Matériel
I-3-1 Matière biologique
Les biopsies gastriques
Proviennent du laboratoire de Bayoune de lyon-France Reçu le 05/02/2010 au
laboratoire de bactériologie de l‟hôpital Pellegrin Bordeaux–France.
Matériel et Méthodes
58
Les bactéries lactiques
Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus bulgaricus CNRZ 449 et
Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 sont des souches de références du centre INRA de
Rennes- France.
Lapins
L‟expérimentation a été réalisée sur des lapines de même âge (1-3mois), pesant entre
400-990 g au début de l‟expérimentation. Les animaux mis individuellement dans des cages
métalliques ont été maintenus dans l‟animalerie de la faculté des Science de la Nature et de
la Vie, université IBN KHALDOUN –Tiaret, bien aérée, La nourriture et l‟eau sont
distribuées et le nettoyage des cages est assuré tous les matins voir Fig. 17.
Figure 17. Lapines dans l‟animalerie
I-3-2 Appareillage et verreries
Agitateur magnétique thermique IKA, LAMBO TECHNIK ;
Balance analytique SARTORIUS ;
Bain marie : MEMMERT type WB7;
Bec bunsen ;
Etuve : MEMMERT type 430;
Matériel et Méthodes
59
Microscope optique : Zeiss (west Germany) ;
Spectrophotomètre à UV, BAUSCH & LOMB, Spectronic 70 (λ = 560nm);
PH mètre : MA 5730 (IsKra) ;
Centrifugeuse ;
Autoclave, réfrigérateur, glacière ;
Pipettes graduées, pipettes Pasteur et micropipettes ;
Tubes à essais, boites de pétris, anse de platine, béchers, burette ;
Barreau magnétique, cloche du Durham ;
Lames et lamelles.
I-3-3 Produits chimiques
Ethanol 95% ;
Eau Distillée ;
Eau physiologique, eau peptonée, TSE, eau oxygénée H2O2 ;
Acide chlorhydrique (HCL) concentré ;
Solution de soude NAOH 0,1N.
I-3-4 Indicateurs de couleurs
Bleu de méthylène en solution, violet de gentiane, lugol, fuschine,
BCP (Bromo-crésol-pourpre), phénophtaléine ;
L‟huile à immersion, l‟huile de paraffine.
I-3-5 Autres produits
Les sucres : glucose, saccharose, mannose et lactose
Peptone, NACL, agar
Papier aluminium, papier hygiénique, étiquettes et scotch
Les antibiotiques.
I-3-6 Milieux de culture
Ce travail expérimental a nécessité l‟utilisation de plusieurs milieux de culture :
Matériel et Méthodes
12
Milieu gélose au sang et colombia pour l‟isolement et l‟identification d’Helicobacter
pylori.
Milieu MRS (Selon Man, Rogoza et Sharpe) : milieu nutritif destiné à l‟enrichissement,
la culture et à l‟isolement de toutes les espèces de Lactobacillus
Milieu M17 (Selon Terzaghi et Sandine) : milieu utilisé pour l‟isolement et la culture
des Streptococcus lactiques ;
Milieu de MUELLER HINTON : milieu non sélectif pour l‟étude de la sensibilité ou la
résistance des germes pathogènes envers les antibiotiques et pour l‟étude
du test de l‟antagonisme ;
Gélose nutritive et Bouillon nutritif : utilisé pour la croissance des germes
Milieu citrate de Simmons : milieu synthétique de différenciation des Entérobactériacées
sur la base de leur métabolisme du citrate présent comme source de carbone ;
Mannitol mobilité : milieu de recherche simultanément la mobilité et l‟utilisation du
mannitol ;
Milieu TSI (triple sugar iron.): permet de mettre en évidence la fermentation du lactose ou
de glucose, du saccharose et la production d‟hydrogène sulfuré.
La composition des milieux de culture est indiquée dans l’annexe III.
I-3-7 Matériel utilisés au laboratoire de Zootechnologie
Matériel de dissection
-Scalpel.
-Pince.
-Paire de ciseaux.
-Planche à dissection.
-Epinglse.
-Microtome.
Autre produits
-Hématoxyline.
-Eosine (0.1%).
-Eau gélatinée 0.2%.
-Baume de Canada.
-Lames et lamelles.
Matériel et Méthodes
12
I-4 Méthodes
I-4-1 Protocole expérimental Globale
Les principales étapes d‟analyse effectuées dans notre étude expérimentale sont
résumées dans un protocole qui est présenté dans la fig. 18.
Figure 18. Protocole expérimental
Bactéries lactiques
référencieés sous formes
lyophilisées
La souche pathogène
H.pylori
Ensemencement dans les
milieux sélectifs
Isolement à partir de
biopsies gastriques (Fig.
24)
Pré identification des bactéries lactiques
Test de l’antagonisme Le pouvoir antimicrobien des souches lactiques isolées sur H.
pylori. Méthode de diffusion par disques sur le milieu Mueller-Hinton
Agar (Fig. 23)
La recherche de bactériocines
(Fig. 24)
Identification biochimiques et
génétique de la bactérie (Fig. 19)
Eude in vivo des effets prébiotique
des bactéries lactiques (Fig. 25)
Matériel et Méthodes
10
I-5 Etude bactériologique Helicobacter pylori
I-5-1 Isolement et identification de Helicobacter pylori
On reçoit les échantillons du laboratoire de Bayoune de lyon-France, sous deux
formes soit la souche bactérienne de H. pylori dans des tubes de gélose soit un fragment de
biopsie gastrique écrasé et dans les deux cas, nous suivons le protocole suivant :
Arrivée des échantillons
La souche dans un tube de gélose un fragment de biopsie écrasée
Repiquage sur milieu TSH avec écouvillon Incubation 10 jours sur
et transférer dans des tubes de Perston milieu Biomérieux
Poussé Observation et dénombrement des colonies
J 1 : et de 3gouttes de suspension de brucella sur un filtre
Abs de poussé Ré incubation 37 °C / 24 h (micro aérobiose)
Poussé repiquage sur milieu pylori et gélose de sang
J 2 :
Abs de poussé Ré incubation 37 °C / 24 h (micro aérobiose)
Poussé faire les tests (Gram, oxydase, catalase, DNAse et
J 3 : antibiogramme)
Abs de poussé Résultat négatif
Lecture des résultats et conservation des souches dans des
J 4 : tubes de glycérolé peptone à 4°C
Conservation des souches pour le light cycler
J 5 : Identification génétiques
Figure 19. Le protocole expérimental de l‟isolement et identification D‟ Helicobacter pylori
d‟après Mégraud., 2004
Matériel et Méthodes
10
I-5-2 Examens bactériologiques
I-5-2-1 La culture
Helicobacter pylori est une bactérie exigeante (Lamouliatte et al., 1992 ; Mégraud.,
1992). Sa culture exige des milieux de cultures enrichis additionnés de sang (Fauchère et
Rosenau., 1991 ; Sobhani et al., 1995).
Pour son isolement la biopsie gastrique des patients est broyée dans 1 ml de bouillon
cœur-cervelle à l‟aide d‟un mortier stérile de manière à libérer les bactéries, puis ensemencer
dans un milieu non sélectif au sang cuit, la gélose pylori et la gélose Colombai (Lamouliatte
et al., 1992 ; Mégraud., 1994). Ce dernier contient un mélange spécifique d‟antibiotique
destiné à inhiber la croissance d‟éventuel contaminant (Fauchère et Rosenau, 1991 ;
Lozniewski., 1996). Notons que, le milieu non sélectif est utilisé en raison d‟une inhibition
possible de H. pylori par le mélange d‟antibiotiques (Lozniewski., 1996).
Les boites sont incubées aussitôt ensemencées dans une jarre en atmosphère
microaérobie (en utilisant les systèmes Campy pack) à 37°C pendant 5 à 7 jours (Mégraud,
1994 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Mégraud., 1996). L‟atmosphère est renouvelée au moins
tous les deux jours pour avoir une croissance optimale (Mégraud., 1989 ; Fauchère et
Rosenau., 1991 ; Mégraud., 1994).
I-5-2-2 Identification
L‟identification est basée sur la détermination des caractères morphologiques et
biochimiques (Mégraud., 1994 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Mégraud., 1996).
a- Examen macroscopique
La morphologie des colonies et leur dimension sont étudiées à partir des cultures
obtenues sur les milieux suivants : la gélose Colombai et la gélose chocolat (Lamouliatte et
al., 1992 ; Fauchère et Rosenau., 1991).
Matériel et Méthodes
14
b- Examen microscopique
Il a été effectué sur un frottis bactérien, préparé à partir des colonies suspectes en
cultures pures, puis fixé et coloré par la méthode de Gram. (Annexe IV)
I-5-3 Tests biochimiques
L‟étude des caractères biochimiques est basée essentiellement sur la recherche
d‟oxydase, de catalase et d‟uréase, car leurs positivités confirment qu‟il s‟agit bien de H.
pylori (Sobhani et al., 1995 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Mégraud., 1992 ; Fauchère et
Rosenau., 1991) et nous avons utilisé des galeries spécifiques, en plus du reste des tests
biochimiques.
Recherche de l’uréase
La recherche d‟une uréase consiste à constater l‟alcalinisation d‟un milieu contenant
de l‟urée par la formation d‟ammoniac. A partir d‟une culture pure sur milieu Mueller-
Hinton, nous avons préparé une suspension dense dans 0,5 ml de milieu urée-indole. La
préparation est ensuite incubée à 37°C sous les conditions de la microaérobiose pendant 24
heures. Le résultat étant positif se traduit par un virage de l‟indicateur du jaune au rouge
violacé ou au rose rouge (Marchall et Goodwing., 1991).
Recherche de la catalase
La catalase a la propriété de décomposer l‟eau oxygénée H2O2 (composé toxique pour
la bactérie) en oxygène (sous forme gazeuse) et en molécule d‟eau (Marshall., 2004).
Le test consiste à déposer sur une lame une goutte d‟eau oxygénée à 10 volumes et à y
dissocier directement un peu de la culture prélevée sur milieu Muller-Hinton (Marshall et al.,
1991). Il est souhaitable de proscrire toute recherche de catalase sur gélose au sang (causes
d‟erreur) du fait de la présence de cette enzyme dans le sang, le dégagement de bulles de gaz
indique la présence de la catalase (Marshall et al., 1991).
Recherche de l’oxydase
Le cytochrome oxydase assure la fixation de l‟oxygène moléculaire sur le cytochrome
réduit. La recherche de cette enzyme est faite en utilisant des disques commercialisés « ox »,
Matériel et Méthodes
12
imprégnés d‟oxalate de N-dimethyl paraphrénie diamine (Diagnostic Pasteur, BioMerieux),
oxydé par le cytochrome C, se transforme en composé violet foncé (Marchall., 1996).
Le disque « ox » est déposé sur une lame propre et imbibé avec une goutte d„eau
distillée stérile. Une colonie est prélevée à partir milieu Muller-Hinton à l‟aide d‟une pipette
pasteur puis déposer sur le disque. La réaction d‟oxydase ne doit pas être recherchée à partir
de cultures sur gélose au sang (oxydase faussement positive). En présence de l‟oxydase (le
cas de bactéries oxydase positive), la coloration violet foncé apparaît immédiatement ou en
quelque secondes, puis noircit (Rose violette puis elle devient brun foncé) (Marchall et
Warren., 1983).
Pour plus de précision dans l‟étude biochimique nous avons utilisé des galeries API
20 Campylo pour H. pylori selon la technique suivante (Fig. 20)
Figure 20. L‟étude biochimique sur des galeries (API 20 Campy)
Matériel et Méthodes
11
I-5-4 Antibiogramme
La culture permet aussi d‟étudier la sensibilité des souches aux antibiotiques (Riachi
et Colin 1995 ; Lozniewski., 1996 ; Mégraud., 1994). Cette sensibilité a été testée par la
méthode de diffusion (méthode de disques) sur milieu Muller-Hunton en utilisant les
antibiotiques suivants : Amoxicilline - Pénicillines Chloramphénicol – Gentamicine -
Furanne - Ac.nalidixique – Sulfamide Trimethoprime – Métronidazole - Erythromycine –
Tobramycine - Tetracyline-Vancomycine - Cefsulodine.
Les boites sont ensemencées par une suspension bactérienne contenant 104 UFC/ml,
ajustée par l‟étalon 4 de Mc Ferland, sur lesquelles sont disposés les disques d‟antibiotiques.
L‟incubation s‟effectue à 37°C pendant 72 heures en micro aérobiose (Lamouliatte et
al., 1992 ; Mégraud., 1992).
La lecture des résultats s‟effectue par la mesure des diamètres de la zone d‟inhibition
apparue.
I-5-5 Purification
Après leur isolement et identification, les colonies obtenues sont repiquées et purifiées
sur le milieu gélose au chocolat, puis incubées à 37°C pendant 72 heures en micro aérobiose.
L‟opération de la purification par stries est répétée deux fois jusqu'à l‟obtention de souches
pures.
IV-5-6 Détection de Helicobacter pylori et détermination de la résistance à la
clarithromycine par PCR en temps réel
Préparation des ADN
L‟extraction d‟ADN selon le type de prélèvements (biopsies gastriques, souche
bactérienne, selles ou LCR) est effectuée en amont. Avant toute manipulation, il faut apporter
les extraits d‟ADN à l‟aide d‟un gant à usage unique jusqu‟à la salle « Dépôt des Acides
Nucléiques », et les mettre dans la boîte notée.
Préparation du Mix PCR
La préparation du mix s‟effectue dans la pièce « Pré-PCR MIX ». Le port d‟une blouse
bleue et de gants est exigé.
Matériel et Méthodes
17
Décontaminer la hotte dédiée pour la bactériologie avec un désinfectant (surfanios).
Mettre un tube vide (pour le mix), un tube d‟eau et un tube de MgCl2 disponibles dans le kit
« LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe » (voir EXT-LAB-066) (congélateur 771,
bac numéro 9) et les laisser ouverts sous UV durant 15 minutes.
Après les 15 minutes de décontamination, réaliser le mix PCR sous la hotte selon le
protocole suivant en fonction du nombre d‟échantillon N :
Le mix FastStart nécessite une préparation au préalable, en mélangeant le tube 1a avec le
tube 1b disponibles dans le kit « LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe ».
Lorsque les amorces et/ou sondes (voir EN-LAB-110) sont réceptionnées, elles sont
généralement sous forme lyophilisée. Les sondes doivent être impérativement conservées à
l‟abri de la lumière.
Tableau 14. Préparation du Mix PCR
Pour reprendre les amorces ou les sondes lyophilisées, il faut au préalable centrifuger
rapidement le tube avant de reprendre les amorces ou la sonde en suspension. Il faut ensuite
utiliser de l‟eau « UltraPure™ DNase⁄RNase-Free Distilled Water » pour reprendre les
amorces en solution à une concentration finale de 100 µM.
Exemple de calcul pour une quantité d‟amorce ou de sonde de 48,7 nmol : pour
obtenir une concentration de 100 µM, ajouter 487 µl d‟eau.
Avant de diluer les amorces ou sondes pour la préparation du mix, bien homogénéiser
la solution mère à l‟aide du Vortex et centrifuger rapidement. Diluer ensuite à 20µM : mettre
10 µl de la solution à 100 µM dans 40 µl d‟eau « UltraPure™ DNase⁄RNase-Free Distilled
Water ». Avant de quitter la salle, décontaminer, mettre la hotte sous UV 30 minutes.
Pour 1 échantillon
(µl)
Pour 9+1 échantillons
(µl)
Eau 4,98 4,98 x 10 = 49,8
MgCl2 25mM 0,66 6,6
Amorce 1 : HPY S 20µM 0,20 2
Amorce 2 : HPY A 20µM 0,20 2
Sonde 1 : Hpy RED 20µM 0,08 0,8
Sonde 2 : Anchor FL 20µM 0,08 0,8
Mix FastStart 10x 0,8 8
Total Mix 7,0 70
Matériel et Méthodes
10
Dépôt des Acides Nucléiques
Décontaminer la paillasse au surfanios. Prendre un bloc réfrigéré et le remplir du nombre
de capillaires nécessaires (suivre l‟ordre des numéros).
Répartir 7µl de mix dans chaque capillaire et boucher immédiatement le témoin
négatif. Déposer 1µL d‟ADN dans les capillaires correspondants (vortexer avant chaque
dépôt) et fermer chaque capillaire. En dernier, déposer les témoins positifs. Des extraits
d‟ADN de biopsies positives pour H. pylori sensible « WT » et résistants « A2142/3G » et
« A2142C » sont disponibles. Décontaminer la paillasse au surfanios.
Amplification par PCR en temps réel
Récupérer un rotor à bague de couleur noire et l‟amener auprès du bloc froid resté à l‟entrée
de la pièce. Disposer les capillaires dans le rotor, et appuyer sur chaque capillaire pour
l‟insertion complète dans le rotor. Poser le rotor dans un carrousel gris.
Centrifuger à l‟aide de la centrifugeuse spécifique. Vérifier ensuite que le volume est
identique dans chaque capillaire.
Utilisation du logiciel
Ouvrir le logiciel Light Cycler version 3.5
I-5-7 Test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1)
Helico Blot 2.1 est un test sérologique de Western Blot de lysat bactérien d‟une
souche d‟H. pylori provoquant des ulcères. Les protéines sont séparées par électrophorèse et
transférées sur bandelette de nitrocellulose. L‟antigène recombinant est également appliqué
sur la membrane. Les bandelettes de nitrocellulose sont incubées individuellement avec les
échantillons dilués de sérum et des contrôles. Les anticorps spécifiques des différents
antigènes s‟ils sont présents dans l‟échantillon, se fixent sur les antigènes de H. pylori
présents sur les bandelettes. Les anticorps fixés spécifiquement sont visualisés grâce à une
série de réactions avec des anticorps anti IgG conjugués de la phosphatase alcaline et le
substrat de BCIP/NBT. Cette méthode permet de différencier la réactivité à chacun des
antigènes de H. pylori. (MP Diagnostique, 2014) (Annexe VI). Ce test a été utilisé pour
confirmer la présence des anticorps dans le sérum chez 16 patients. (Fig. 21 et 22)
Matériel et Méthodes
16
Figure 21. Test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1)
Figure 22. Les bandelettes de nitrocellulose
I-5-8 Conservation des souches
Etant donné que H. pylori est une bactérie fragile, sa conservation à long terme n‟est
pas possible à 20°C (Mégraud., 1994). Pour cela et selon des données littéraires, la
conservation des souches de H. pylori a été effectuée à court terme (une semaine). Les
souches obtenues sur le milieu gélose au chocolat sont conservées à 4°C sous les conditions
de la micro aérobiose ou dans des épindoff qui contient 0,5 ml de glycérol peptone
(Mégraud., 1989 ; Mégraud., 1994).
Matériel et Méthodes
72
I-6 Interaction bactérien
I-6-1 Purification et Conservation
La purification des souches précédentes s‟effectue par 4 repiquages successifs dans les
milieux MRS et M17 solides et liquides.
Les bactéries lactiques purifiées ont été ensemencées dans des tubes de gélose M17et
MRS inclinée, ensuite incubées à 37°C pendant 18h puis conservées à 4°C.
I-6-2 Pré identification
I-6-2-1 Etude morphologique
Etude macroscopique
Consiste à étudier la forme, l‟aspect, le contour, la surface, la couleur des colonies
sur le milieu M17 et le milieu MRS.
Etude microscopique
Coloration de Gram
Les souches lactiques dans notre travail (Sc. thermophilus, Bf. bifidum et Lb.
bulgaricus) ont subi une coloration de Gram, afin de déterminer la morphologie des cellules
bactériennes et leur disposition. Mais aussi pour reconnaître le caractère de Gram positif ou
négatif de ces bactéries.
IV-6-2-2 Etude physiologique
Mobilité
Le test de mobilité a été vérifié dans le milieu Mannitol mobilité, qui permet de
rechercher la mobilité et la fermentation du mannitol par les bactéries.
Sa technique consiste à ensemencer par piqure centrale dans le milieu mannitol
mobilité des colonies à partir d‟une culture en milieu solide ou liquide et d‟incuber 24h à
37°C.
Lecture : Si la bactérie est mobile, elle diffuse à partir de la ligne d‟ensemencement en
créant un trouble du milieu. Si elle est immobile, elle croit uniquement le long de la piqure
(Marchall et Goodwin., 1991).
I-6-2-3 Etude biochimique
Test de catalase
La catalase est une enzyme présente chez la plupart des bactéries aérobies strictes et
anaérobies facultatives. Elle décompose l‟eau oxygénée formée en eau et en oxygène qui se
dégage. Pour mettre en évidence cette enzyme, on émulsionne sur une lame stérile un peu de
Matériel et Méthodes
72
la colonie suspecte dans une goutte d‟eau oxygénée. Le dégagement de bulles de gaz indique
la présence de la catalase : test catalase + (Delarras., 2007).
Test oxydase
L‟oxydase est une enzyme présente dans certaines chaînes respiratoires
cytochromiques bactériennes. La recherche de cette enzyme consiste à déposer sur une lame
stérile, un disque « Ox » et l‟imbiber avec une goutte d‟eau distillée. Ensuite, prélever une
partie de la colonie à étudier et l‟étaler sur le disque. Une coloration violet foncé apparaît
immédiatement sur le disque puis vire au noir : test oxydase+ (Delarras., 2007).
IV-6-2-4 La diminution du pH par les bactéries lactiques
Afin de démontrer l‟acidité provoquée par les bactéries lactiques, on a suivi la variation
du pH dans les deux milieux MRS et M17 liquide.
Les pH initial et final ont été mesurés à l‟aide d‟un pH mètre type MA 5730.
- Le pH initial correspond au pH du bouillon M17 ou du bouillon MRS sans inoculum (sans
bactérie).
- Le pH final est le pH mesuré après l‟incubation de chacune des souches lactiques cultivée
dans le bouillon M17 ou le bouillon MRS spécifique a sa croissance pendant 48 heures à
37ºC.
I-6-3 Test de l’antagonisme
I-6-3-1 Préparation des prés cultures
Pour réaliser le test d‟antagonisme, il faut avoir des pré cultures des souches lactiques
et la pré culture de la souche indicatrice (pathogène).
Á partir des tubes inclinés de gélose MRS et M17, nous avons ensemencé chacune
des deux souches lactiques isolées dans un tube à essais contenant 5 ml du bouillon approprié
(bouillon MRS ou bouillon M17). Le tube est incubé à 37ºC pendant 18 heures en
anaérobiose.
Alors que la souche indicatrice H. pylori a été ensemencées dans un tube de bouillon
nutritif et incubée à 37ºC pendant 18 heures.
I-6-3-2 Détection de l’activité antagoniste des bactéries lactiques (in vitro)
De nombreuses méthodes de détection de l‟activité antimicrobienne des bactéries
lactiques ont été utilisées. Leur principe est basé sur la diffusion de l‟agent antimicrobien
dans un milieu de culture solide ou semi-solide pour inhiber la croissance d‟un micro-
organisme indicateur sensible (Achemchem et Abrini., 2005). Pour mettre en évidence
l‟activité antimicrobienne des deux souches lactiques isolées, nous avons utilisé la méthode
de diffusion en puits (Schillinger et Lucke, 1987 ; Allouche., 2004).
Matériel et Méthodes
70
Méthode de diffusion par disques
Un volume du milieu Mueller-Hinton agar au sang est coulé dans des boites de Pétri
vides et stériles. À l‟aide d‟une cloche de Durham préalablement stérilisée, on réalise deux à
trois puits par boites de Pétri d‟environ 5 mm de diamètre avant que le milieu soit très solide.
Après solidification du milieu, les boites sont ensemencées en surface par la suspension de la
souche pathogène H. pylori, puis les disques stériles de Bio Mérieux sont imprégnées par 60
à 80 µl de surnageant filtré (environ 2 gouttes à l‟aide d‟une seringue jetable stérile), obtenu
après centrifugation à 4 000 tours / min pendant 15 min du bouillon MRS ou M17 cultivé
avec la souche lactique appropriée (Sc. thermophilus dans le bouillon M17 et Lb. bulgaricus
et Bf. bifudum dans le bouillon MRS) (Labioui et al ., 2005). (Fig. 23)
La diffusion des agents antimicrobiens dans le milieu gélosé est améliorée par une
incubation des boites à 37°C pendant 24 heures. L‟activité antimicrobienne se révèle par
l‟apparition de zones d‟inhibition autour des puits (Achemchem et Abrini., 2005).
Les diamètres des zones d‟inhibition apparaissant autour des puits seront mesurés, le
résultat est positif si le diamètre de la zone d‟inhibition est supérieur de 2mm (Tabak., 2007).
La mesure du diamètre d‟inhibition Zi est effectuée selon la formule suivante
Dans la majorité du temps les ferments lactiques sont en culture mixte. C‟est-à-dire en
association, comme dans le cas de plusieurs produits laitiers (Yaourt, fromage,…). Pour cette
raison nous avons fait l‟interaction entre le mélange des deux souches lactiques isolées avec
chacune des deux souches pathogènes.
Donc, notre souche pathogène a trois tests d‟antagonisme :
H.pylori + Streptococcus thermophilus
H.pylori + Lactobacillus bulgaricus
H.pylori + Bifidobacterium bifidum
Zi en (mm) = diamètre de la zone d’inhibition obtenue (mm) Ŕ diamètre du disque (6 mm)
Matériel et Méthodes
70
Les souches lactiques
(Streptococcus thermophilus ,
Bifidobacterium bifidum et
Lactobacillus bulgaricus)
purifiées et conservées.
Ensemencement de Sc.
thermophilus dans le
bouillon M17 et de Lb.
bulgaricus , Bifidobacterium
bifidum dans le bouillon
MRS
Incubation à 37ºC
pendant 18h
Centrifugation 4 000 trs/
min pendant 15 min
Récupération du
surnageant
Culot
La souche pathogène H.pylori
purifiée et conservée.
Préparation de la
suspension bactérienne La
souches pathogène H.pylori
Incubation à 37°C
pendant 18h
Ensemencement en surface de
0,1 ml de la suspension
bactérienne sur le milieu
Mueller Hinton agar contenant
trois puits.
Imprégner les disques
environ 2 gouttes du
surnageant
Incubation à 37ºC
pendant 24h
Apparition de zones
d’inhibition au tour
des puits
Mesure du diamètre des
zones d’inhibition.
Figure 23. Protocole expérimental de la méthode de diffusion par disques
Matériel et Méthodes
74
I-6-4 Recherche des agents d’inhibitions (bactériocines)
Les bactéries lactiques peuvent produire des substances inhibitrices différentes des
bactériocines. Pour s‟assurer de la présence de ces dernières, nous avons pris une culture
jeune de 18 heures de la souche lactique Bf. bifidum qui a été cultivée ensuite dans 50 ml de
bouillon MRS modifiée approprié et incubée à 37°C pendant 18 h.
Après l‟incubation, les tubes ont été centrifugés à 4 000 tours / min afin de récupérer
le surnageant. Pour éliminer l‟effet des acides organiques notamment des acides lactique et
acétique, le surnageant a été neutralisé à un pH = 7 par l‟ajout d‟une solution de NaOH 0,1 N
en présence d‟une goutte d‟une solution méthanoïque de phénophtaléine à 1% utilisée comme
indicateur coloré (Labioui et al ., 2005).
Un tube de pré culture de la souche pathogène (souche pathogène ensemencée dans le
bouillon nutritif et incubée à 37ºC pendant 18h a été préparée avant. La mesure de la
croissance bactérienne de la souche pathogène est réalisée par la mesure de la densité optique
toutes les deux heures.
Pendant la 6ème heure, on ajoute 1ml du surnageant neutralisé dans le tube et on
termine la mesure de la densité optique jusqu‟à 12 heure (Fig. 24).
La courbe DO = f (t) peut être tracée.
Matériel et Méthodes
72
Les tubes troublés sont ensemencés (Le bouillon MRS)
Récupération du surnageant
Neutralisation du surnageant à un pH= 7 par une solution de NaOH (0,1N)
Deux tubes de préculture pour chaque souche pathogène sont préparés avant ;
Mesure de la croissance bactérienne des deux souches pathogènes par la mesure de
la densité optique «DO» chaque 2 heures ;
L’ajout du surnageant neutralisé à un des 2 tubes à la 6ème heure ;
La mesure de la DO est suivie jusqu'à la 12ème heure.
Obtention d’une courbe DO= f (T)
Figure 24. Schéma représentant la recherche de bactériocines
NaOH ajouté +
goutte
de
phénophtaléine
Surnagean
t
Incubation à 37°C pendant 18 heures
Centrifugation 4 000 tours /min
pendant 30 min
Matériel et Méthodes
71
I-7 Etude in vivo Les étapes réalisées sont résumées dans le schéma suivant :
Figure 25. Schéma représentatif de l‟étude in vivo.
Etude in vivo
Période d‟adaptation durée de 7jours, effectif : 20
lapins
10 Lapins Régime standard additionné : Lot A
de yogourt (annexe V) synthétique a base de B.
bf quantité de 5ml/j pendant une durée de 28
jours, avec prise du poids chaque 14 j.
10 Lapins, Régime standard : Lot B
avec un inocolum de H. pylori de
2.108 /j pendant une durée de 28
jours, avec prise du poids chaque
14j.
Faire des coupes histologiques au 14ème
j et 28 ème
j au niveau
de l‟estomac.
Remplace le yogourt par
H. pylori 2.108 /durée 28j
avec prise du poids 14j.
14j.
Remplace H. pylori par le
yogourt /durée 28j avec prise du
poids chaque 14j.
Observation microscopique
Faire les coupes histologiques au 14 ème
j et 28 ème
j
au niveau de l‟estomac.
Matériel et Méthodes
77
I-7-1 Les étapes de la dissection
Etape 1 : Fixation du lapin sur la planche et dissection de l‟abdomen du lapin selon
la figure suivante
Figure 26. Fixation et dissection du lapin
Etape 2 : Observation du tube digestif et organisation générale du tube digestif d‟un
lapin. (Fig. 27 et 28)
Figure 27. Observation du tube digestif
Matériel et Méthodes
70
Figure 28. Organisation du tube digestif
Contenue de l‟estomac du tube digestif d‟un lapin est présenté dans la photo suivante :
Figure 29. Le contenue de l‟Estomac
Matériel et Méthodes
76
Etape 3 réalisation des la biopsie
Le maintien des tissus prélevés dans un fixateurs « formol ». Après chaque biopsie,
est utilisée pour la préparation des coupes histologiques suivant les quatre étapes :
fixation, inclusion, coloration et montage (Jean Pierre., 1990).
Figure 30. Un fragment d‟Estomac
I-7-2 Ŕ Les étapes de la réalisation des coupes histologiques
Fixation : mètre les parties coupées du tube digestif dans un fixateur, on a utilisé le
formol, pour une journée.
Inclusion
a-Déshydratation : dans des bains d‟alcool à différentes concentrations on met
le tissu : (Fig. 31)
- Un bain avec une concentration de 70° pendant 10minutes.
- Un bain avec une concentration de 80° pendant 10minutes.
- Un bain avec une concentration de 90° pendant 20minutes.
- Un bain avec une concentration de 100° pendant 20minutes.
- Un bain de toluène pendant 20 minutes.
Matériel et Méthodes
02
Figure 31. La déshydratation des tissus dans des bains d‟alcool
b- Inclusion dans la paraffine (Fig. 32)
- Préparation de la paraffine : fondre la paraffine dans une étuve a une température de 56°.
- Dans des moules on verse notre paraffine et on inclus le tissu, on la fait rentrer dans une
étuve pour une durée d‟une heure trente minutes (afin d‟assurer la pénétration de la
paraffine).
- Verser la paraffine liquide dans le moule constitué par deux barres de LEUKART,
prolonger et placer le tissu selon le plan de coupe désiré.
- Les blocs obtenus sont laissées pour une durée de 24h pour que la paraffine se solidifie
(Jean Pierre., 1990) (Fig . 33)
Figure 32. Inclusion a la paraffine
Matériel et Méthodes
02
Figure 33. Préparation des blocs des différentes parties du tube digestif du lapin.
Préparation des coupes
- Tailler le bloc obtenu.
- Placer le bloc dans le microtome « LEICA RM 2145» régler a 7µm.
- Le ruban obtenue sera placée sur une lame, ajouter des gouttes d‟eau gélatiné a
0.2% (voir annexe V), puis la mètre sur une platine chauffante pour quelque seconde.
- Faire rentrer des lames dans une étuve réglée à 46° pour assurer un bon séchage des
lames (déparaffinage).
Coloration : elle se fait en 2étapes : (Fig. 34)
a-Hydratation : dans des bains d‟alcool à degré alcoométrique descendant, on met les
lames :
- Deux bains de toluène (tremper la lame pour quelque instant).
- Deux bains avec une concentration de 100° pendant 5minutes.
- Deux bains avec une concentration de 90° pendant 5minutes.
- Deux bains avec une concentration de 80° pendant 5minutes.
- Deux bains avec une concentration de 70° pendant 5minutes.
- Un bain d‟eau distillée (hydratation).
Matériel et Méthodes
00
b-Coloration
À l‟aide des colorants qui permettent de mettre en évidence les principaux éléments
morphologiques des tissus traités, noyau et les affinités tinctoriales du cytoplasme ainsi
que les différents compartiments extracellulaire :
- Prolonger les lames dans l‟HÉMATOXYLINE DE GROAT (annexe V) pendant 10-
15minutes.
- Rincer les lames dans 3bains successives d‟eau de conduites puis 1 bain d‟eau distillé.
- Recouvrer les lames par une goutte d‟éosine « 0.1% aqueuse » pendant 2 minutes.
- Rincer sous l‟eau de robinet puis dans l‟eau distillé.
Avant de passer au montage, il faut procéder à une déshydratation qui va se réaliser
par une opération inverse a celle de l‟hydratation (bains d‟alcool a degré
alcoométrique ascendant) (Jean Pierre., 1990).
Montage
Les lames déshydratées sont recouvertes par une goutte de Baume de Canada et une lamelle
est déposée sur la coupe, on procède après à l‟observation microscopique. (Jean Pierre.,
1990).
Matériel et Méthodes
00
Figure 34. Lames après coloration « hématoxyline-éosine ».
Résultats
04
II-1 Résultat de l’identification d’Helicobacter pylori
II-1-1-Etude bactériologique
Les biopsies sont envoyées pour l‟étude bactériologique, au laboratoire de bactériologie
de (INSERM U853 et Centre National de Référence des Campylobacters et Hélicobacters)
l‟hôpital Pellegrin de Bordeaux 2, France.
II-1-2 La culture
II-1-2-1 Aspect macroscopique
Dans les conditions favorables à la croissance de H. pylori et après une incubation de 2
à 5 jours à 37°C dans une atmosphère appauvrie en oxygène (Fig. 35), les résultats obtenus de
la culture des quatre prélèvements sur une gélose enrichie au sang se traduisent par l‟apparition
de petites colonies de 1 à 2 mm de diamètre. Les colonies ont une coloration grisâtre ou
transparente, luisante : elles sont discrètement bombées, rondes et ont un contour régulier (Fig.
36).
Figure 35. Incubation de Helicobacter pylori dans une jarre a anaérobiose.
Résultats
02
Figure 36. Aspect macroscopique des colonies d‟Helicobacter pylori après 5 jours
d‟incubation à 37°C en atmosphère micro-aérophile
A : milieux pylori (biomérieux) B : milieux gélose au sang
II-1-2-2 Aspect microscopique
Coloration de Gram
La coloration de Gram, réalisée à partir des colonies apparues, montre la présence de
bactéries Gram négatif. Elles se présentent sous la forme de bacille droit, incurvé, en virgule,
en forme de C, V ou S, aux contours réguliers. Les bactéries évoluent rapidement au cours des
repiquages vers des formes d‟aspect coccoïde (Fig. 37).
Figure 37. Aspect Microscopique de Helicobacter pylori (Groussisement X100)
A B
Résultats
01
II-1-3 Etude biochimique
L‟identification est complétée par la recherche de caractères biochimiques (catalase,
oxydase et DNAse) et nous avons utilisées des API 20 campy.
Nous avons noté la présence d‟une uréase, oxydase, d‟une catalase et d‟une DNAse très
puissantes chez trois souches isolées d’H. pylori (Fig. 38 au 42). Les résultats sont représentés
dans le Tab.15
Tableau 15. Caractérisation biochimique des différentes souches de Helicobacter pylori
Souches
Test
H.pylori SAN 158
H.pylori 26695
Uréase +
+
Catalase +
+
Oxydase +
+
LDC +
+
ODC +
+
ADH
- -
ONPG
- -
Citrate de simmons +
+
Mannitol +
+
+: Positif - : Négatif
ONPG Ortho-Nitro-Phenyl ß Galactopy
Ranoside
LDC Lysine
ODC Ornithine
ADH Arginine
Résultats
07
Figure 39. Résultat de catalase
Figure 38. Résultat de l‟oxydase
Résultats
00
Figure 40. Résultat du teste d‟urée
Figure 41. Résultat de la DNAse
Résultats
06
Figure 42. Les résultats de l‟identification biochimique des deux souches isolées de
Helicobacter pylori utilisant des API 20 campy.
II-1-4 Antibiogramme
L‟étude de la sensibilité aux antibiotiques sur la croissance de cette bactérie est parfois
très utile dans le choix thérapeutique (Tab. 16) (Fig. 43). L‟étude a montré la sensibilité de H.
pylori aux antibiotiques : la Pénicilline, l‟Amoxicilline, l‟Erythromycine, au Chloramphénicol,
la Tetracyline, la Tobramycine, le Furane et la Metronidazole et une résistance remarquable
vis-à-vis des antibiotiques comme la Vancomycine, la Cefsulodine, la Trimethoprine, l‟acide
nolidixique et les Sulfamides.
B : Antibiotiques sous forme
Bandelette
Figure 43. Les résultats de l‟antibiogramme sur Gélose Mueller Hinton + 5% de sang de
mouton.
A : Antibiotiques sous forme de disque 1er Boite : Lincomycine, Cefazoline. Ciprofloxine,
Cephalotine, Vancomycine
2éme Boite : Ampiciline, Acide fusidique, Cefsulodine.
Tetracyline. Gentamicine Erythromycine.
1er
Amoxyline
Lerofloxacu
m
Résultats
62
Tableau 16. Antibiogramme des souches de Helicobacter pylori isolées.
II-1-5 Résultats du test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1)
Les criteres d‟interpretation recommandes pour determiner qu‟un echantillon est
seropositif a H. pylori sont l‟une des combinaisons suivantes :
1. 116 kd (cag a) positif, en presence d‟une ou plusieurs des bandes suivantes : 89 kd (vac
a), 37 kd, 30 kd (ure a) et 19.5 kd, ou le marqueur d‟infection active.
2. Présence d‟une des bandes suivantes : 89 kd, 37 kd, 30 kd ou 35 kd, avec ou sans le
marqueur d‟infection active.
3. Présence a la fois des bandes 30 kd et 19.5 kd, avec ou sans le marqueur d‟infection
active.
Sur les seize échantillons de sérum étudies, onze ont eté déclarés positifs en les comparants
avec le contrôle positif et négatif
ANTIBIOTIQUE Abréviation DMI (mm) Hp1 Hp2
Lincomycine
Cefazoline
Ciprofloxine
Cephalotine
Vancomycine
Ampiciline
Acide fusidique
Cefsulodine
Tetracyline
Gentamicine
Erythromycine
Amoxyline
Lerofloxacum
L
CZ
CIP
CF
VA
AM
FA
CFS
TE
GM
E
AC
LE
21
29
23
16
17
15
22
16
19
04
00
14
00
10
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
R
R
R
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
R
R
R
R
R : Résistante S : Sensible DMI : Diamètre minimale d‟inhibition
Résultats
62
Figure 44. Résultats du test de WESTERN BLOT (HELICO BLOT 2.1
II-1-6 Résultat de la PCR
Sur les cinq biopsies gastriques examinées dans le laboratoire nous avons procédé à
l‟extraction Rapide à 100°C de l‟ADN des biopsies gastriques, selon un Protocol adapté à
l‟appareil du light cycler et après séquence du gène ciblé de la ClariRes de H. pylori on a pu
détecté deux souches d‟H. pylori (SAN 158 et 26695) appartements à la famille des
Helicobacter. (Fig.. 45 - 47).
Figure 45. Contrôles de la PCR : 4 témoins (T NEG, WT, G et C)
Résultats
60
Figure 46. Résultat positif et sensibilité à la clarithromycine de la PCR de la souche SAN 158
Figure 47. Résultat positif et sensibilité à la clarithromycine de la PCR de la souche 26695
Résultats
60
II-2 Résultats de l’interaction bactérienne
II-2-1 Résultats de la pré identification des souches lactiques
Les résultats des études morphologiques, physiologiques et biochimiques de nos souches
lactiques sont résumés dans le tableau suivant :
Tableau 17. Résultats d‟identification des souches lactiques.
Souche lactique
Tests étudiés
Sc. thermophilus
Lb. bulgaricus
Bf. Bifidum
Etu
de
morp
holo
giq
ue
Aspect
macroscopique
Colonies rondes ou
lenticulaires de
couleur blanche crème
(Fig. 49).
Petites colonies
identiques de couleur
blanche crème
(Fig. 48)
des colonies
blanchâtres et
crémeuses avec un
contour régulier photo
(Fig. 50)
Aspect
microscopique
Des coques Gram
positif (+) groupés en
paires ou en chaines.
(Fig. 52)
Des bacilles Gram
positif (+) groupées en
paires ou en chaines.
(Fig. 51)
Gram positif, sous
forme de bacille droit,
courte, elle présente
des formes bifides en
V en Y. (Fig. 53)
Etu
de
bio
chim
iqu
e Test de catalase Catalase négatif (-) Catalase négatif (-) Catalase négatif (-)
Test d’oxydase Oxydase négatif (-) Oxydase négatif (-) Oxydase négatif (-)
Etu
de
ph
ysi
olo
giq
ue
Test de la
mobilité
Cellules immobiles
Cellules immobiles
Cellules immobiles
+ : Réaction positive. - : Réaction négative
Résultats
64
Aspect macroscopique des bactéries lactiques
Figure 48. Culture de Lactobacillus bulgaricus sur le milieu MRS agar.
Figure 49. Culture de Streptococcus thermophilus sur le milieu M17 agar.
37°C
Photo n°26 : Aspect macroscopique des colonies
de Bifidobactérium bifidum sur milieu MRS –Cyst.
Résultats
62
Figure 50. Culture de Bifidobacterium bifidum sur le milieu MRS agar.
Aspect microscopique
Figure 51. Aspect microscopique de Lactobacillus bulgaricus après la coloration de Gram
(G×100).
Résultats
61
Figure 52. Aspect microscopique de Streptococcus. thermophilus
après la coloration de Gram (G×100).
Figure 53. Aspect microscopique de Bifidobactérium bifidum
après la coloration de Gram (G×100).
(G×100).
Résultats
67
II-2-2 Les résultats de la mesure du pH et l’acidité des bactéries lactiques
La mesure des pH initial et final montre une diminution du pH dans le milieu contenant
les souches lactiques isolées. Cette diminution est indiquée dans le tableau suivant :
Tableau 18 : Diminution du pH par les deux souches lactiques cultivées dans le bouillon
approprié (MRS ou M17 liquide) pendant 48 h à 37°C.
Souche lactique
Initial
pH Taux d’acidité
° Dorinc
Final
pH Taux d’acidité
° Dorinc
Sc. thermophilus 7,50 24 4,95 49
Lb. bulgaricus 7,13 25 4,92 50
Bf.bifidum 7,23 27 4,97 52
II-2-3 Dénombrement
Les résultats de dénombrement bactérienne par la mesure de la densité optique
montrent que la croissance des bactéries lactiques est plus élevée que celle d‟Helicobacter
pylori, ceci prouve que les bactéries lactiques ont un temps de génération très court, alors que
H. pylori est de 5 jours. Nous avons calculé la croissance à l‟aide de la fonction logarithmique
des valeurs de la densité. (Fig. 54, Tab. 19, 20).
Tableau 19. Dénombrements de Bifidobactérium bifidum, Lactobacillus blgaricus,
Streptococcus thermophilus et Helicobacter pylori
Souches 1er
Boite 2eme
Boite 3eme
Boite
Bf. bifidum >300 >300 >300
Lb. blgaricus >300 >300 >300
Sc. Thermophilus >300 >300 >300
H. pylori 20 79 89
Résultats
60
Tableau 20. Résultats de la densité optique de B. bifidum, L. blgaricus, Sc. Thermophilus et
H.pylori
Heure
Densité
optique
0
2
4
6
8
16
20
Bf. bifidum 0.155 0.124 0.098 0.076 0.071 0.042 0.018
Lb. blgaricus 0.153 0.129 0.102 0.065 0.058 0.047 0.022
Sc.
thermophilus
0.149 0.127 0.099 0.060 0.056 0.040 0.025
H. pylori 0.150 0.130 0.098 0.059 0.049 0.041 0.019
Les résultats de dénombrement confirment les résultats de la densité optique.
Après l‟incubation nous avons calculé le nombre de colonies UFC en appliquant la
formule suivante :
Cpt 1
N= .
(n1.1) + (n2.0.1) + (n3.0.01) +………+ (nn.10ˉ-(n-1)
) Fd
n : Nombre de boite
Fd : Facteur de dilution
25< Cpt <250
Les résultats sont comme suite : H. pylori = 15.105 UFC
Résultats
66
Figure 54. La croissance de Bifidobactérium bifidum, Lactobacillus blgaricus, Streptococcus
thermophilus et Helicobacter pylori
II-2-4 Test de l’antagonisme
II-2-4-1 Recherche des inhibitions
Les résultats de l‟interaction obtenue révèlent la présence de zones claires au tour des
souches d‟H. pylori ensemencée en touches.
Ces résultats indiquent l‟existence des agents d‟inhibitions produits par les bactéries
lactiques et indiquent la nature de ces agents. (Fig. 55, 56 et 58)
Les résultats de l‟antagonisme sont indiqués dans le tab. 21.
Tableau 21. Résultats de l‟antagonisme de Helicobacter pylori
Souche Bf. bifidum Lb. blgaricus Sc. thermophilus
H.pylori + + +
DMI (mm) 08 05 03
- : Absence d‟halo + : Présence d‟halo
0
1
2
3
4
5
6
0 2 4 6 8 16 20
Temps (Heure)
S.thermophilus
L.bulgaricus
B.bifidum
H.pylori
Log Do
Résultats
222
En observant ce tableau, on remarque que les trois bactéries lactiques on inhibées la
croissance d‟H. pylori par l„activité d‟antagonisme, et on remarque aussi que H. pylori a été la
plus sensible à Bf.bifidum qui se traduit par un diamètre d‟inhibition minimale de 8 mm.
Ensemencement des souches d’H.pylori
Ensemencement des bactéries
Lactiques
Figure 55. Méthode de diffusion par disques
Figure 56. Résultats de l‟antagonisme de Helicobacter pylori avec les trois bactéries
lactique
HAL
O
Bf.bifidum
Sc. thermophilus
Lb. blgaricus
Résultats
222
Figure 57. Résultats de l‟antagonisme de Bifidobactérium bifidum et Helicobacter pylori
II-2-4-2 Recherche de bactériocines
Après une incubation à 37°C pendant 20 heures en micro aérobiose, la croissance
bactérienne est suivie par la mesure de la densité optique ; les résultats sont indiqués dans le
tableau 24.Nous avant calculé la croissance bactérienne à l‟aide de la fonction logarithmique
des valeurs de la densité (Log DO) afin de connaître l‟existence de bactériocine et son effet sur
la croissance d‟H. pylori
Les résultats sont traduits par une courbe qui montre une décroissance de la bactérie H.
pylori cultivée dans le milieu gélose pylori qui contient le surnageant, sachant que les
bactéries ont été développées dans un milieu à pH 7 contenant de la catalase. Ces résultats
s‟expliquent par la présence de bactériocines produite par Bf. bifidum. (Fig. 58)
Résultats
220
Figure 58. La croissance de H. pylori en présence de bactériocine-like produite par Bf.
Bifidum.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 2 4 6 8 16 Temps (Heures)
Log (DO)
H.pylori + 1 ml du surnageant
H.pylori
Résultats
220
II-3 Résultats de l’étude in vivo
II-3-1 Résultats du Lot A
Traitement N°01
Observation générale des lapins : durant les 8 premiers jours, les lapins avait un bon état
physique avec un poids stable (400-990). (Fig.59 et 60)
Figure 59. Tube digestif d‟un lapin traité par probiotiques 14 jours (Lot A)
Figure 60. Tube digestif d‟un lapin traité par probiotiques 28 jours (Lot A)
Résultats
224
Durant les huit premiers jours de l‟injection des probiotiques, la structure histologique du
tube digestif, dans tous ces parties, est complète, bien développée « présence de toutes les
couches ». Néanmoins, une augmentation dans les composants lymphoïdes a été observée, les
nodules lymphoïdes des Plaques de Payer sont très volumineux.
Les résultats sont présentés dans les Fig. 61 et 62, qui représentant les coupes histologiques
téVillosi
odules lymphoîdesN
Figure 61. Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique
pendant 14 J (G×40) (Lot A)
Figure 62. Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique
pendant 28 J (G×40) (Lot A)
Résultats
222
Traitement N°02
Observation générale après 14 jours de la prise de H. pylori, l‟état des lapins demeura
un peu inquiétant, ils ne mangeaient pas bien, activité physique diminue, chute de poids,
début de gonflement abdominale et présence de diarrhée. Fig. 63 et 64.
Figure 63. Tube digestif 14 jours après prise d'Helicobacter pylori (LotA)
Figure 64. Tube digestif 28 jours après prise d' Helicobacter pylori (Lot A)
Résultats
221
Après 4 jours d‟injection de H. pylori, on a vue qu‟un début d‟une inflammation mais avec
un degré très faible et certaines villosités sont devenues atrophiées. La réponse immunitaire
déterminée par le taux élevés des globules blancs colorées en bleu. L‟infection est observable
et très clair avec la disparition de certaines villosités et l‟ouverture au niveau de leurs
extrémités, qui indique que se sont en voie de destruction, les glandes de Liberkuhn
apparaissent comme des invaginations de l‟épithélium
Figure 65. Coupe histologique de l‟estomac avec injection
de Helicobacter pylori pendant 4J (G×40) (Lot A)
Figure 66. Coupe histologique de l‟estomac avec injection de Helicobacter pylori
pendant 8J (G×40) (Lot A)
Résultats
227
II-3-2 Résultats du lot B
Traitement N° 01
Observation générale : les lapins, durant les 14 premiers jours, étaient en mauvaise état
physique : gonflement abdominale, chute de poids, présence de diarrhée et des cas de décès.
(Fig. 67 et 68).
Figure 67. Tube digestif 14 jours après prise d' Helicobacter pylori (Lot B)
Figure 68. Tube digestif 28 jours après prise d' Helicobacter pylori (Lot B)
Résultats
220
Après quatre jours, l‟inflammation est très développée, une disparition avec un taux très
élevé des villosités, des nodules lymphoïdes et de certaines couches épithéliales (photo. 69). Et
une augmentation du taux des globules blancs.
Par contre au huitième jour l‟inflammation s‟aggrave, une mauvaise et très forte odeur
apparait au moment de la dissection et un gonflement, irritation de l‟estomac et de l‟intestin.
Le contenu de ces parties était liquide avec la disparition complète des villosités
« muqueuse » et une partie de la musculeuse mucosae. Les nodules lymphatiques deviennent
de petites tailles (Fig. 69 et 70).
Figure 69. Coupe histologique de l‟estomac avec injection d' Helicobacter
pylori pendant 14 J (G×40) (LOT B)
Figure 70. Coupe histologique de l‟estomac avec injection
d'Helicobacter pylori pendant 28 J (G×40) (LOT B)
Résultats
226
Traitement N°02
1- Observation générale : les lapins durant les 14 premiers jours ont souffrent de diarrhée,
mais le gonflement abdominal disparaît peut a peu. (Fig. 71 et 72).
Figure 71. Caecum irrité (Lot B)
Figure 72. Présence de gaz dans l‟estomac et intestin grêle. (Lot B)
Résultats
222
Après injection des probiotiques nous avons observé les résultats suivants :
Au quatorzième jour : l‟inflammation persiste encore, les villosités et certaines
couches « muqueuse et sous muqueuse» sont presque introuvables. Les coupes
histologiques effectuées après quatre jours de la prise du traitement montrent une irritation de
l‟appareil digestif. (Fig. 73).
Au 28éme
jour : L‟inflammation prend la voie progressive vers la guérisson avec la
restauration de certaines couches (muqueuse et musculeuse mucosae). Les nodules
lymphatiques rejoignent leur forme et se distribuent d‟une manière organisée au niveau de la
musculeuse mucosae (Fig. 74).
.
Figure 73. Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique
pendant 14J (G×40) (Lot B)
Figure 74. Coupe histologique de l‟estomac avec prise de probiotique
pendant 28 J (G×40) (Lot B)
Discussions
222
III-Discussion des résultats
III-1 Isolement et identification des souches de Helicobacter pylori
L'estomac est le seul réservoir de la bactérie H. pylori. Cette dernière s'acquiert dès
l'enfance et se transmet de personne à personne, par la bouche ou les selles. Elle y modifie la
sécrétion acide, neutralise les moyens de défense naturelle, empêche la réparation de la
muqueuse, bref concoure activement à la création et à l'entretien de l'ulcère, mais également à
la survenue de gastrites. Son rôle est même évoqué dans la survenue de cancer de l'estomac.
Selon Mégraud., 2004, H. pylori est responsable de 7 ulcères gastriques sur 10 et 9
ulcères duodénaux sur 10 sont liés à H. pylori.
Les Caractères culturaux de H. pylori montrent qu‟elle croît lentement (3 à 4 jours
minimum) et exige des conditions de culture particulières (micro-aérophile) et des milieux de
culture additionnés de sang, de sérum ou de suppléments d'enrichissement (Flandrois., 1997)
tels que la gélose PYL (sélective pour H.pylori) ou Columbia additionnée de sang.
Pour l‟isolement de la bactérie, il a fallut assurer des conditions favorables pour la
croissance d’H. pylori, soit une atmosphère micro-aérophile et des milieux riches et qui
contiennent différents antibiotiques pour éliminer toute contamination possible (Ghouini.,
1996 ; Sobhani et al., 1991 ; Mégraud., 1994 ; Cellini et al., 1995).
A partir des biopsies gastriques des malades, nous avons pu isoler trois souches d‟H.
pylori. Après cinq jours d‟incubation, des colonies transparentes, luisantes, visqueuses et fines
appairassent sue la gélose colombai et aussi sur la gélose chocolatée, avec un diamètre de 1
mm ou en nappes brillantes et non hémolytiques. Ces caractères culturaux correspondent à
Helicobacter pylori (Avril et al., 1995 ; Guetarni et Bensoltane., 201 3)
L‟observation microscopique sous fort grossissement a montré que H.pylori est un petit
bacille de forme incurvé, mobile grâce à de multiples flagelles qui jouent un rôle important
dans la colonisation de l‟estomac (Brenner, et al., 2000 ; Mégraud., 2004).
La coloration de Gram d‟une colonie prise des boites de pétri des trois souches isolées
d‟H. pylori montre qu‟il agit d‟une bactérie à caractère Gram négatif.
Les résultats biochimiques confirment l‟identification finale des souches isolées
catalase, oxydase et uréase. L'uréase transforme l'urée en dioxyde de carbone et ammoniac
permettant de neutraliser localement l'acidité gastrique et créer ainsi un microenvironnement
favorable au développement bactérien.
L'uréase de H.pylori est composée de deux sous unités :
Discussions
220
UreA et UreB. Elle correspond à 6 à 10% de la masse totale bactérienne, ce qui montre
le rôle essentiel de cette molécule.
Ces caractères doivent être positifs pour que nous puissions dire que ces souches sont
réellement des souches de H. pylori.
Les résultats obtenus montrent que cette bactérie possède une uréase, une catalase et
une oxydase positives, et donc une activité enzymatique importante. Ils montrent aussi que
cette bactérie utilise les citrates comme source de carbones et n‟utilise pas les substrats sucrés
comme sources de carbones (Medouakh et al., 2006 ; Mégraud, 1995).
L‟étude de la sensibilité de H. pylori aux antibiotiques a montré d‟excellents résultats
par rapport à l‟activité de la plupart des antibiotiques utilisés. Nos résultats ont montré que les
trois souches isolées d‟H.pylori sont sensibles à la Pénicilline, l‟Amoxicilline,
l‟Erythromycine, au Chloramphénicol, la Tetracyline, la Tobramycine, le Furane et la
Metronidazole.
En revanche, les souches de H. pylori montrent une résistance remarquable vis-à-vis
aux antibiotiques comme la Vancomycine, la Cefsulodine, la Trimethoprine, l‟acide
nolidixique et les Sulfamides ; une résistance au Metronidazole a été observé chez la souche
Hp2.
Donc il est important dans toute infection de tester la sensibilité de ses antibiotiques
pour leur utilisation dans le domaine thérapeutiques (Bell et al., 1993 ; Bigard et al., 1995;
Cayla., 1996 ; Cayla et al., 1996 ; Bardhan et al., 2000).
La sérologie révèle la présence des antigènes de H. pylori dans le sérum de onze
patients sur un totale de seize patient souffrants ulcères d‟estomac. Ceci nous a permet d‟isoler
deux souches de H. pylori qui ont été identifiés génétiquement par PCR a temps réel.
III-2 Pré identification des bactéries lactiques
D‟après les études morphologiques, physiologiques et biochimiques des souches
lactiques, on a constaté que :
La souche Sc. thermophilus cultivée sur le milieu M17 solide donne des colonies
rondes ou lenticulaires de couleur blanche crème. L‟étude microscopique d‟un frottis fixé et
coloré à partir des colonies précédentes montre que cette bactérie est sous forme de coques
Gram positif (+) groupés en paires ou en chaines.
La souche Lb. bulgaricus ensemencée sur le milieu MRS solide donne des petites
colonies identiques de couleur blanche crème. L‟observation microscopique de ces colonies
révèle que cette bactérie est sous forme de bacilles Gram positif (+) groupées en paires ou en
chaines.
Discussions
220
B. bifidum développée sur milieu MRS cystéine solide, nous avons remarqué que les
colonies sont blanchâtres, lisses avec un contour régulier. L‟étude microscopique d‟un frottis
fixé et coloré à partir des colonies de Bf. bifidum montre des bacilles incurvés à contours
réguliers souvent ondulés, avec une extrémité bifurque ou spatulée.
Notre étude a montré également qu‟il a un polymorphisme cellulaire (Bensoltane et al.,
1997 ; Bonaprite, et al., 2001 ; Mahi et al., 2006 ; Hadaji et Bensoltane, 2006). A l‟aide du
microscope, nous avons observé des bacilles Gram négatif, incurvés de forme bifidique
(Danone., 1997 ; Fox., 1982 ; Rasick et kurmann., 1983).
Le test de la catalase utilisé sur les colonies de Bf. bifidum se révèle négatif, et donc
montre l‟anaérobie strict de cette bactérie (Devuyest et Vandamme, 1994). En effet, ce test est
typique aux Bifidobactérium et très utilisé pour leur identification par de nombreux
chercheurs. (Scardovi., 1986)
Ces résultats ont été démontrés par plusieurs auteurs tels que : Larpent (1996),
Dellaglio et al. (1994) et Novel (1993).
Ces bactéries sont :
- Catalase négatif (-) car on n‟a pas observé un dégagement de bulles de gaz (Delarras.,
2007) ;
- Oxydase négatif (-) car le disque «Ox » demeure incolore (Delarras., 2007);
- Immobiles (Guiraud., 1998) parce que leur croissance est uniquement le long de la
piqure ;
- Mannitol négatif (-) expliqué par l‟absence de virage de couleur dans le milieu ;
- Lactose + indiquant la formation d‟acide lactique par les deux souches qui se manifeste
par le virage de couleur du violet vers le jaune ;
- D‟après Larpent et al., (1997), Sc. thermophilus est glucose (+), lactose - saccharose
(+). Alors que, Lb. bulgaricus est glucose (+), Lactose (+) et saccharose (-).
III-3 Interaction bactériennes
L‟abaissement du pH dans les milieux MRS et M17 liquides signifie que chacune des
deux souches lactique possède un effet acidifiant, en produisant des acides organiques, le
principal facteur d‟inhibition selon Mathot et al . (1996), Choisy et al. (1997)
La comparaison entre les graphes du pH et celui de l‟acidité montre que le taux
d‟acidité augmente avec la diminution du pH, la production des acides organiques à pour effet
l‟inhibition de la croissance des souches de H. pylori qui ne peut pas survivre à pH bas (Sheu
et al., 1997 ; Desmaseaud., 1994).
Discussions
224
D‟après les courbes tracées qui représentent la variation de la densité optique par le
temps, Nos résultats montrent que la croissance chez H. pylori est lente par apport à celles des
bactéries lactiques et surtout de Bf. bifidum.
Les résultats concernant les tests de l‟antagonisme révèlent l‟inhibition de Helicobacter
pylori par les bactéries lactiques. Cette interaction positive montre une inhibition de la
croissance de H. pylori, par une activité antagonisme élevé traduite par l‟apparition d‟halos
dans les deux souches isolées d‟ H. pylori.
Bf.bifidum inhibe les souches de H. pylori avec un diamètre minimal d‟inhibition de 08
mm pour Lb. Bulgaricus est de 05 mm et pour Sc. thermophilus est de 03 mm. (Biclecka et
al., 1998 ; Devuyest et Vandamme, 1994)
Les résultats du test de l‟antagonisme nous a permis de rechercher les agents
d‟inhibition chez le genre Bf. bifidum (Bouvier et al., 1994).
La présence des halos est due à la production des acides organiques par Bf. bifidum qui
ont un effet de baisser le pH dans le milieu. Aussi, la présence de souches Bf. bifidum et de
H. pylori dans le même milieu de culture qui contient l‟acide provoque une inhibition de la
croissance H .pylori mais pas celles de Bf. bifidum qui continue à croître car s‟est une bactérie
à caractère acidophile (Desmazeaud., 1983 ; Asperger., 1985 ; Eklund., 1989 ; Ballongue.,
1993).
L‟examen de l‟antagonisme explique l‟action des acides, en général sur la membrane
cytoplasmique des bactéries ; ces acides touchent à la maintenance du potentiel membranaire et
inhibent le transfert actif (Bouvier et al., 1994). L‟effet antimicrobien des acides diffère selon
les concentrations molaires des acides produits par les bifidobactéries.
Comme la présence d‟anneau d‟inhibition ne signifie pas forcement production des
acides (Kleanhammer., 1986) des tests supplémentaires sont nécessaires pour connaître la
nature exacte de l‟agent inhibiteur.
Les résultats de ces tests nous ont permis de constater la présence des bactériocines
produites par Bf. bifidum en bouillon MRS.
Des résultats similaires ont été trouvés par Carmen et al., 2000, qui confirment la
présence de bactériocine inhibitrice de H. pylori.
Ces substances ont été caractérisées par d‟autres chercheurs comme étant des molécules
de nature protéique (Delvis-Broughton., 1990) et sont donc sensibles à l‟action des enzymes
protéolytiques variées ou possédant une partie protéique et par conséquent, elles sont inactivées
par ces enzymes (Devuyest et Vandamme., 1994). La souche de Bf. bifidum peut
naturellement produire plus qu‟un bactériocine.
Discussions
222
D‟autres études ont été réalisées sur le mode d‟action des bactériocines, ce mode
d‟action se situe au niveau membranaire et modifie le potentiel de la membrane grâce a une
structure alternante hydrophile et hydrophobe (Stil et holzapfel., 1997). Ces bactériocines
peuvent s‟insérer dans la membrane des bactéries sensibles et y former des pores ce qui
entraîne des fuites d‟ATP et d‟ions K+
et par conséquent l‟impossibilité pour les cellules de
maintenir leur pH intracellulaire. (Desmazeaud., 1994)
Par ailleurs, aux Etats-Unis divers chercheurs ont mis en évidence l‟action
conjuguée d‟un chélateur alimentaire (citrate, phosphate, EDTA, EGTA) et la nisine pour
inhiber des bactéries à Gram négatives (Vanema et al., 1995).
De nombreuses études réalisées in vitro, ont montrés l‟effet antagoniste des
bifidobactéries contre différent pathogène tel que Schigella dysentrea, (Kirjavainem et al.,
1998) E. coli (Shah., 1997) et Yersinia enterolitica.
Une étude réalisé par Desmazeaud., 1996 a montré que les effets de la prolifération de
certaines souches pathogènes peuvent être inhibé par l‟ingestion de ferments lactiques, par les
mécanismes suivants :
Sécrétions de certaines substances antimicrobiennes par Bifidobactéries
(H2O2, Acide lactique, Acide acétique);
Abaissement du pH par les acides produits ;
Prévention de la synthèse d‟amines toxiques.
L‟effet d‟une barrière par compétition métabolique ou l‟empêchement de la
colonisation de pathogènes par la fixation sur le tube digestif ;
La dégradation des entéro-toxines par une détoxification.
Certaines souches de Bifidobactéries jouent un rôle de protecteur contre les
entérocolites nécrotiques néonatales (NEC) en évitant le développement de ces derniers par
l‟inhibition de leur croissance tel que Clostrdium (Bouhnik et al., 1996).
Les probiotiques, tels que les bactéries lactiques, sont des cultures bactériennes actives
possédant des caractéristiques uniques qui leur permettent de survivre dans le tractus gastro-
intestinal et de faire concurrence aux autres micro-organismes entériques. Ainsi, ils aident à
maintenir l'équilibre naturel du microbiote et un bon état de santé général (Balakrishnan et
Floch., 2012).
Discussions
221
Par ailleurs, les probiotiques pourraient promouvoir l'immunomodulation en se fixant
au tissu épithélial de l'intestin, en interagissant avec le système immunitaire et en produisant
des substances antimicrobiennes (Balakrishnan et Floch., 2012).
Les lactobacilles laitiers, consommés dans le cadre d'une alimentation habituelle,
pourraient également moduler les réponses immunitaires innées. De plus, les probiotiques
pourraient inhiber la croissance de bactéries qui transforment les procarcinogènes en
carcinogènes (Kumar., 2010).
Des recherches de Guetarni et al., 2012 et Medouakh et al., 2010 , ont montrée ne
inhibition importante de H. pylori par les souches Sc. thermophilus et Lb. Acidophilus.
III-4 Discussion des résultats in vivo
Des études précédentes sur des animaux ont indiqué que certaines souches probiotiques
commerciaux peuvent augmenter la résistance contre la colonisation et l'infection par des
bactéries entéropathogènes (Boulloche et al., 19944).
Notre étude est donc conçue de tester la capacité des probiotiques utilisées et de
comparer l'impact du challenge d'alimentation probiotique sur la gravité de l'infection gastro-
intestinal par H. pylori.
Nos résultats indiquent que l'alimentation à base de Bf. bifidums en premier lieu défi a
un impact plus significatif sur les inflammations dues à H. pylori, le tractus digestif dans ce cas
est considéré comme immunisé. Ceux qui ont eu comme premier traitement H. pylori
demeurent plus sensibles à l‟atteinte d‟une maladie gastrique en les comparants avec les
précédents.
Nos résultats indiquent aussi que le remplacement H. pylori par les Bf. bifidums génère
une réponse immunitaire au cours du temps, mais dans notre cas l‟inflammation n‟est pas
totalement guérie, et cela est dû à la courte durée du traitement.
De nombreux mécanismes ont été évoques par lequels les probiotiques pourraient
inhiber les entéropathogènes ; la suppression de pathogènes intestinaux par des bactéries
lactiques a été attribuée à leur capacité de modifier le microenvironnement intestinale par les
acides organiques sécrétant, principalement des acides acétique et lactique, conduisant à un pH
intestinal inférieur, et par la production de composés antibactériens (Servin et Connir., 2003).
Par exemple, Ashoor et Heute., (2004) ont montré que la concentration élevée d'acides
organiques à faible pH produite par Bf. Brève, qui colonise l'intestin est inhibe la production
Discussions
227
de toxine de H. pylori alors que Fuller., 1991, ont montré que les bifidobactéries produisent
un facteur protéique qui inhibe l'adhérence de certaines souches de H. pylori à la molécule de
GA1 in vitro.
La production d'acides organiques et des molécules antimicrobiennes, d'autres
mécanismes peuvent être impliqués dans nos rapports in vivo, dont ont mis l'accent sur la
modulation immunitaire et les preuves s'accumulent que les probiotiques influence locale ou
systémique sur la réponse immunitaire de manière souche-dépendante (Gill., 2003).
Selon Saavedra et al., (1994), l‟augmentation du nombre de cellules caliciformes
inflammatoire, qui est une réponse épithéliales intestinales à l‟inflammation, augmente les
sécrétions pour former un gel visqueux qui piège les microorganismes et les irritants et limite
leur accès à l'épithélium.
Plusieurs études utilisant des modèles animales ont montré que le traitement avec
différentes souches de Lactobacillus réduit la colonisation de H. pylori et une diminution de
l'inflammation gastrique induite par Helicobacter. Chez les souris classiques, le traitement oral
avec le surnageant de culture de la souche Lb. acidophilus LB humain a diminué la densité de
H. pylori, réduit l'activité de l'uréase de H. pylori, et guérit l'inflammation de la muqueuse. La
réduction de la densité de H. pylori et l'inflammation gastrique a également été observée chez
les souris axéniques spécifiques traités avec la souche de Lb. casei. Il a été suggéré que le
degré de suppression de H. pylori ou H. felis dépend de la souche probiotique utilisée. Par
exemple, Lb. salivarius supprimée H. pylori et a réduit la réponse inflammatoire chez les
souris plus efficacement que Lb. acidophilus ou de Lb. casei (Aiba et al., 1998).
Ainsi, il a été montré que le traitement probiotique chez l'animal, même s‟il est
incapable de désactiver H. pylori, est efficace pour réduire l'inflammation de l'estomac associé
à H. pylori.
Certains probiotiques sont utiles pour supprimer l'infection à H. pylori. Telle que Bf.
bifidum YIT 4007, qui peut améliorer la blessure gastrique expérimentale chez les rats et les
stades de la maladie sur la muqueuse gastrique, chez les patients ulcéreux, cette bactérie peut
affecter l'infection H. pylori ou de son activité, la situation de la muqueuse gastrique, et
l'émergence de symptômes gastro-intestinaux supérieurs (Miki et al., 2007).
Shirasawa et al., 2010, ont constaté que la pré-incubation avec Bf. bifidum supprime
l'expression de gènes H. pylori - induites dans les cellules humaines et que la plupart des gènes
affectés sont liés aux voies de signalisation NF -kB . Ces résultats suggèrent que Bf. bifidum
peut affecter le mécanisme de régulation des voies de signalisation NF -kB.
Discussions
220
En ce qui concerne l'utilisation des probiotiques comme agents fonctionnels, plusieurs
études ont montré qu'il existe une relation directe entre l'ajout de certaines bactéries
probiotiques et inhibition in vitro de H. pylori ; cependant les études in vivo montrant une
activité de bifidobactéries contre H. pylori restent rares.
Dans l‟étude faite par Chenoll et al., 2011, une souche de Bf. bifidum est révélé actif in
vitro contre H. pylori avec des niveaux d'inhibition prmet attiendre 81,94 % dans le cas du
surnageant et même 94,77 % d'inhibition de surnageant purifié et démontrent que Bf. bifidum
CECT 7366 peut être considéré comme un probiotique capable d'inhiber H. pylori in vitro et in
vivo.
Une revue systématique et méta-analyse d'études randomisées datant de 2009 a évaluée
l'effet des produits laitiers fermentés enrichis en probiotiques sur les infections à Helicobacter
pylori. Un total de 10 études admissibles, qui regroupaient 963 adultes et enfants, ont été
évaluées. Il a été démontré que les préparations laitières fermentées enrichies en probiotiques
réduisent les taux d'infection à H. pylori d'environ 5 à 15 % (Sachdeva et Nagpal., 2009).
Une étude prospective publiée en 2012 a examiné l'effet d‟un yogourt enrichi en
probiotiques sur la réponse immunitaire systémique auprès de 38 enfants atteints d'une
infection à Helicobacter pylori. Les auteurs de l‟étude ont conclu que chez les enfants qui
consomment régulièrement du yogourt, l'équilibre du microbiote de l'intestin peut être
préservé, et l'immunité humorale et à médiation cellulaire peut être stimulée (Yang et Sheu.,
2012).
Conclusion
Conclusion
226
Helicobacter pylori est définitivement admis pour sont rôle causal dans certaines
affections gastro-duodénales les plus fréquentes et qui constituent un problème important à la
santé publique en raison de leur prévalence élevée en Algérie (70% à 90%).
Tout diagnostic d‟une pathologie gastro-duodénale doit conduire à la recherche d‟une
infection à H. pylori par la réalisation des méthodes permettant la mise en évidence d‟H. pylori
par une culture, ou de son génome PCR ou d'anticorps spécifiques (sérologie). Ces méthodes
sont soit invasives et nécessitent une endoscopie digestive et des biopsies : culture, histologie,
cytologie, PCR, le test rapide à l'uréase soit non invasives : sérologie test respiratoire à l'urée.
Dans ce travail, le but a été de confirme la production d‟une bactériocine par la souche
Bf. bifidum, nous avons essayé de faire co-exister ces déférentes protocole expérimentale.
Nous avons isolé et identifie H. pylori, germe responsable de la pathologie gastro
duodénale par des examens biochimiques et un examen d‟antibiogramme afin d‟étudier la
sensibilité d‟ H. pylori aux antibiotiques pour nous conduire a un traitement efficace afin
d‟éradiquer H. pylori.
Une étude macroscopique, microscopique montre que des bactéries lactiques Bf.
bifidum, Sc. thermophilus et Lb. bulgaricus à Gram positif, catalase négative et le profil
fermentaire qui nous a permit d‟identifier.
Notre étude de la cinétique bactérienne montre une diminution importante de pH due à
la production d‟acide organique, et que Bf. bifidum est la bactérie la plus acidophile.
Le test de l‟antagonisme a montré l‟effet inhibiteur de notre souche de Bf. bifidum vis-
à-vis d‟ H. pylori cette interaction positive confirme l‟inhibition de la croissance de H. pylori
qui est traduite par l‟apparition des halos dans les cas des trois souches H. pylori isolées.
Les résultats des coupes histologiques montrent que l‟apport de probiotiques dans
l‟alimentation des lapins génère une protection contre les infections. En fin, ces résultats
suggèrent que les probiotiques représentent un bon candidat utilisé pour prévenir contre les
infections gastroduodénales.
Des données suggèrent que les produits laitiers probiotiques favorisent la santé
digestive et une bonne santé générale en améliorant le microbiote intestinal et en favorisant
Conclusion
202
l'immunité. Ils pourraient jouer un rôle bénéfique dans l'infection à Helicobacter pylori et le
syndrome du côlon irritable, et pourraient prévenir les diarrhées associées à la prise
d‟antibiotiques.
D'autres recherches, y compris des études randomisées à grande échelle et des études de
cohorte à long terme, sont nécessaires pour confirmer ces conclusions. De plus, davantage de
recherche est requise afin d'élucider le rôle des produits laitiers probiotiques dans l'intolérance
au lactose et le cancer de l'estomac.
Ceci fait qu‟aujourd‟hui les Bifidobacterium occupent un domaine vaste pour la
réalisation de nombreuses études sur le plan taxonomique, écologique et sur le plan médical.
Les futures indications des germes Bifidobactérium dans le domaine agro-alimentaire
et médical sont certainement apportées par une meilleure connaissance de ces bactéries.
Perspective
Perspective
202
Recherches en cours
Tester l‟effet probiotique de Lb. helveticus Rosell 52 sur H. pylori SAN
158 et 26695 et Staphylococcus aureus in vitro et in vivo. (en
collaboration avec le CNRCH, université de bordeaux 2).
Etude épidémilogique de H. pylori dans la région de Tiaret.
Effet de certaines plantes médicinales sur la croissance H. pylori.
Perspective
L‟identification des bactériocines produits par les Bifidobactéria.
Amélioration de l‟industrie laitiére comme le lait fermenté (Yaourt),
beurre, le fromage en utilisant des Bifidobactéria comme bactéries
lactiques actives métaboliquement et pouvant être bénéfiques pour les
consomateurs et leur santé.
Application du génie génétique pour la sélection des souches améliorées
afin de produire des cultures probiotiques à usage thérapeutique.
Réaliser une enquête nutritionnelle sur la prise des probiotiques par une
population souffrant de maladies gastroduodénales.
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Annexe
I
Caractéristiques C.jejuni
H.pylori H.mustelae W.succinogenes
Oxydase + + + +
Catalase + + + -
Uréase - + + -
Hydrolyse de l‟hippurate + - - -
Réduction de nitrate (microaérophilique) + - + +
Production de H2S dans TSI - - - F
Gamma- glutmyltranspeptidase - + + -
Alcaline phosphatase F + + -
Motilité dans le bouillon cœur-cervelle + + + +
Motilité sur les milieux gélosés + - - -
Croissance en anaérobiose à 37°C + - F +
Croissance sur la gélose au sang
contenant 3.5% NaCl
- - - -
Croissance sur 0.5% de glycine + + + -
Croissance sur 1% de glycine + - + -
Croissance sur 1% de bile + - - +
Sensibilité à l‟acide nalidixique (30µg) S R S R
Sensibilité à la céphalothine (30µg) R S R R
Sensibilité au métronidazole (5µg) R S S S
Annexe I
Caractéristiques biochimiques et culturales de C. jejuni, H. pylori, H. mustelae et W.
succinogènes d‟après Goodwin et al., 1989.
R : Résistant
S : Sensible
F : Faible
- : Négatif
+ : Positif
Annexe
II
Sensibilité d‟ H. pylori aux antibiotiques d‟après Mégraud, et Lamouliatte., 1997.
AGENT VALEURS
EXTREMES
50% CMI
(mg/l)
90% CMI (mg/l)
Pénicilline 0,015-0,12 0,06 0,12
Ampicilline <0,003-0,3 0,015 0,03
Acide clavulanique <0,01-0,64 0,16 0,64
Amoxicilline+Acide
clavula99nique
<0,01-0,02 <0,01 0,01
Céfalotine 0,023-0,4 0,2 0,2
Céfotaxine 0,01-0,16 0,04 0,08
Cefsulodine 5,12-41 20,5 41
Streptomycine 0,04-1.28 0,32 0,64
Kanamycine 0,04-0,64 0,16 0,32
To bramycine 0,04-0,64 0,08 0,16
Gentamycine 0,04-0,32 0,08 0,16
Erythromycine 0,1-0,8 0,2 0,4
Josamycine 0,4-1,6 0,8 0,8
Lincomycine 3,2-12,8 6,4 12,8
Chloramphénicol 2,0-8,0 2,0 4,0
Tétracycline 0,01-0,16 0,08 0,16
Rifampicine 0,5-2,0 1,0 1,0
Péfloxacine 1,0-8,0 4,0 8,0
Colistine 2,0-64 8,0 32,0
Vancomycine 50,0->100 >100 >100
Annexe II
Annexe
III
Composition des différents milieux de culture
Gélose au sang (Gélose chocolat) :
PH = 7. 2
Polypetone 15g
Amidon de mais 1g
Phosphate dipotassique 4g
Phosphate mono potassique 1g
Chlorure de Sodium 5g
Hémoglobine 10g
Gélose 10g
Milieu Mueller Hinton (g/l) :
C‟est un milieu utilisé pour l‟isolement des bactéries et l‟antibiogramme.
PH = 7. 4
Infusion de viande de bœuf 300.30g
Hydrolysat de caséine 17.50g
Amidon 1.50g
Gélose 17.00g
Milieu MRS modifié (g/l)
PH = 6. 2
Milieu MRS (g/l) (Robinson et samona, 1991)
PH = 7 Extrait de levure 5g
Tryptone 10g
Lactose 10g
Tween 80 1g
KH2PO4 3g
MgSO4 0.575g
MnSO4 0.12g
Citrate d‟ammonium 2g
Sulfate ferrique 0.34g
Cystéine -Hcl 0.3g
Lithium chlorite 1.2g
Propionate de sodium 6g
Extrait de levure 10g
Poly peptone ou peptone 10g
Trypsine de caséine 10g
Acétate de sodium 5g
Citrate d‟ammonium 2g
Glucose 2g
KH2PO4 2g
MgSO4 0.25g
MnSO4 0.5g
Agar agar 2g
Li cl 3g
Cysteine 0.5g
Sel biliaire 0.5g
Tween 80 1ml
Eau distillée 1000ml
Annexe III
Annexe
IV
Sulfate néomycine 0.08g
Sulfate paronomycine 0.02g
Eau distillée 1000ml
Milieu RCPB (g/l) (Ghoddusi et Robinson, 1996)
PH = 6. 8
LAB- Lemco 10g
Extrait de levure 3g
Peptone 10g
Glucose 5g
Amidon 1g
Sodium d‟acétate 3g
Chlorure de sodium 5g
Cystiène-Hcl 0.5g
Prussien bleu 0.3g
Eau distillée 1000ml
Milieu LP (g/l) (Lappiere et al., 1992)
PH = 6. 7
Bouillon Glucose Tamponne :
PH = 6. 9
Bacto-peptone 10g
Liverdigest 35g
Lactose 10g
Chlorite 0.2g
Propionate de sodium 0.3g
Eau distillée 1000ml
Tryptose 20g
Glucose 5g
Phosphate dis potassique 4g
Phosphate mono potassique 1.5g
Chlorure de sodium 5g
Acide de sodium 0.5g
Pourpre de bromocrésol 0.015g
Annexe
V
e de la colorationTechniqu
La coloration de Gram
1- Réaliser un frotti en étalant sur une lame stérile un peu de l‟échantillon à analyser
(yaourt agité ou une colonie de bactérie), puis sécher soigneusement ;
2- Recouvrir la lame par violet de gentiane pendant 1 minute ;
3- Recouvrir la lame par Lugol pendant 30 secondes ;
4- Rincer bien à l‟eau distillée ;
5- Recouvrir la lame par l‟éthanol 95% pendant 10 secondes ;
6- Laver rapidement et recouvrir la lame par la fuschine pendant 10 secondes à 1 minute ;
7- Sécher la lame à l‟air libre ;
8- Observer la lame, en ajoutant l‟huile à immersion pour le fort grossissement (100 et
plus).
la coloration au bleu de méthylène
Á l‟aide d‟un ose bouclé stérile prélevé un peu de l‟échantillon à analyser et le déposer
sur une lame stérile (à 1cm du bord) ;
Ajouter une goutte d‟eau distillée et mélanger le tout pour obtenir une solution
homogène ;
Avec une lame à étalement réaliser un frottis et le fixer sur la flamme ;
Recouvrir la lame par le bleu de méthylène ;
Apres une minute rincer la lame à l‟eau distillée ;
Laisser la lame pour se sécher ;
Déposer sur la lame une lamelle stérile ;
Observer sous un microscope photonique.
Annexe IV
Annexe
VI
Préparation des réactifs et solutions
Préparation du yaourt synthétique :
Le yaourt est préparé au laboratoire comme suite : 120g de poudre de lait entier
(LAHDA) est dissoute dans un litre d‟eau distillée et stérile. A ce lait, 80g de sucre et 3%
d‟inoculum (ferment lactique raison de 3g) sont additionnées. L‟incubation est durée 3 heures a
44°C. La multiplication des ferments lactiques est stoppée par le froid a 4°C.
Annexe n°04
Préparation des dilutions d’alcool
Le taux d‟alcool se mesure de la manière la plus facile avec un alcoomètre. C‟est un
instrument en verre ayant la forme d‟une ampoule lestée dans le fond surmontée d‟un tube
scellé hermétiquement et muni d‟une échelle graduée.
Il faut prolonger l‟alcoomètre dans une solution alcoolique (dont il doit flotté) Il suffit
donc de lire la graduation au niveau du liquide.
Pour 90° : on ajoute, à une alcool de 100°, 7.73ml d‟eau distillée.
Pour 85° : on ajoute, à un alcool de 100°, 14.73 ml d‟eau distillée.
Pour 80° : on ajoute, à un alcool de 100° ,22.45 ml d‟eau distillée.
Pour 70° : on ajoute, à un alcool de 100°, 40.85 ml d‟eau distillée.
Préparation des colorants
A-Hématoxyline de GROAT:
Solution A : Mélanger 1g de la poudre d‟hématoxyline avec 100ml d‟éthanol
Solution B : mélanger 1.6 d‟acide sulfurique avec 100ml d‟eau distillé, ajouter 2g d‟Alun de
fer puis on procède a une filtration.
On mélange la solution A et B.
B-Eosine aqueux 0.1%
On mélange 0.1g de poudre d‟éosine Y( (C20H6Br4na2O5) C.I.45380)dans 100ml
d‟eau distillé .
C-Eau gélatinée a 0.2%
Dans un bêcher, mélanger 0.2g de gélatine avec 100ml d‟eau distillé (utilisation
immédiate ou bien garder au congélateur).
Annexe V
Annexe
VII
Annexe VI
Sérologie
Annexe
VIII
Annexe VII
Témoin
Coupe Histologique d‟un estomac d‟un lapin témoin
(Sans aucun traitement et en bonne santé)
Publication scientifique
202
.
Résumé
Helicobacter pylori est une bactérie pathogène reconnu récemment pour ces implications dans les maladies gastro-
duodénales : ulcère duodénal, ulcère gastrique, lymphome gastrique du MALT et aussi du cancer gastrique. Sachant que les
bactéries lactiques notamment les Bifidobactéries jouent un rôle important dans les domaines biotechnologiques, médicaux et
dans la fabrication de produits alimentaires comme un meilleur conservateur vu leurs caractéristiques fort intéressantes et leurs
propriétés antimicrobiennes.
En se basant sur ces deux critères, nous avons commencé à réaliser l‟interaction bactérienne entre les bactéries
lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus bulgaricus CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum CUETM
89/29 et Helicobacter pylori en passant par trois étapes :
La mise en évidence d‟H.pylori, qui repose sur la réalisation de biopsies gastriques prélevées sur des patients
souffrants de multiples infections gastroduodénales. La culture H. pylori dans des milieux sélectifs et dans de meilleures
conditions de croissance nous a permet d‟isoler H.pylori. Pour compléter l‟identification de la bactérie, des tests biochimiques
étaient nécessaires en utilisant des galeries classiques API 20. A la fin de cette étape nous avons réalisé l‟antibiogramme,
important pour étudier la réaction d‟Helicobacter pylori vis-à-vis des antibiotiques utilisés.
Le test de Western blot HELICO BLOT 2.1 a incriminé H. pylori comme agent causal d‟ulcère chez onze (11)
patients sur un totale de seize (16).
La PCR a permis d‟identifier deux souches d‟H.pylori (SAN 158 et 26695) appartenants à la famille des Helicobacter.
L‟étude microbiologique des bactéries lactiques Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus bulgaricus
CNRZ449 et Bifidobacterium bifidum CUETM 89/29 nous a montré, que ces bactéries sont des Gram positif. Les tests
biochimiques nous ont permis d‟identifier le capitale enzymatique pour chacune des ces bactéries. La fermentation des sucres
était révélatrice car elle a confirmé l‟utilisation des sucres Glucose, Lactose, Saccharose comme source d‟énergie par cette
bactérie.
L‟interaction entre les bactéries lactiques et Helicobacter pylori a donné des résultats positifs observés par la
présence des zones d‟inhibitions, Bf.bifidum inhibe les souches de H.pylori avec un diamètre minimal d‟inhibition de 08 mm,
pour Lb. Bulgaricus de 05 mm et pour Sc. Thermophilus de 03 mm. Des tests supplémentaires sont nécessaires pour connaître
la nature exacte de l‟agent inhibiteur. Les résultats ont montré que la sécrétion des acides organiques et la production de
bactériocines-like sont à l‟origine de l‟inhibition. Les résultats de ces tests nous ont permis de constater la présence des
bactériocines produites par Bf. bifidum en bouillon MRS.
Les résultats des coupes histologiques indiquent que l'alimentation à base de Bf. bifidums en premier lieu défi a un
impact plus significatif sur l'inflammation due à H. pylori,
En fin, ces résultats suggèrent que les bactéries lactiques représentent un bon candidat utilisé pour prévenir l'infection
entérique humain.
Mots clés : Helicobacter pylori – Maladies gastroduodénales- Interaction - Bifidobacterium bifidum Biopsies gastriques –
Inhibition- Coupe histologique.
Summary
Helicobacter pylori is a pathogenic bacterium recently recognized for its implications in gastroduodenal diseases
duodenal ulcer, gastric ulcer, gastric MALT lymphoma and gastric cancer also. Knowing that lactic acid bacteria, including
Bifidobacteria play an important role in biotechnology, medical fields and in the manufacture of food products as a better
conservative seen their very interesting characteristics and antimicrobial properties.
Based on these criteria, we began to realize the interaction between lactic bacteria Streptococcus thermophilus CNRZ
447, Lactobacillus delbrueckii bulgaricus and Bifidobacterium bifidum CNRZ449 CUETM 89/29 and Helicobacter pylori
through three stages:
The detection of Helicobacter pylori based on the realization of the gastric biopsies from patients suffering of
multiples‟ gastroduodenal infections. H. pylori culture in selective media and better conditions of growth allows us to isolate
Helicobacter pylori. To complete the identification of the bacteria, biochemical tests were needed using standard API strips 20.
At the end of this stage we realized susceptibility testing, important to study the response of Helicobacter pylori against
antibiotics.
The Western blot test HELICO BLOT 2.1 H. Pylori has been implicated as ulcer causative agents in eleven (11)
patients with a total of sixteen (16).
PCR was used to identify two strains of Helicobacter pylori (SAN 158 and 26695) apartments for the family of
Helicobacter.
The microbiological study of lactic acid bacteria Streptococcus thermophilus CNRZ 447, Lactobacillus delbrueckii
bulgaricus and Bifidobacterium bifidum CNRZ449 CUETM 89/29 has shown that these bacteria are gram positive.
Biochemical tests allow us to identify the enzyme capital for each of these bacteria. The fermentation of sugars was revealing
because it confirmed the use of glucose sugars, lactose, sucrose as an energy source by this bacterium.
The results of the interaction between the lactic acid bacteria and Helicobacter pylori revels the presence of
inhibitory zones. H. pylori strains with a minimum diameter of inhibition of 08 mm with Bf. bifidum, Lb. Bulgaricus is 05 mm
and for Sc. Thermophilus is 03 mm. Further tests are needed to determine the exact nature of the inhibitor. The results showed
that the secretion of the organic acids and the production of bacteriocins are responsible for the inhibition. The results of these
tests show the presence of bacteriocins produced by B. bifidum in MRS broth.
The results of histological sections indicate that the feeding of B. bifidums first challenge has a more significant
impact on inflammation caused by H. pylori.
In the end, these results suggest that lactic acid bacteria are a good candidate used to prevent human enteric infection.
Keywords: Helicobacter pylori - Gastrointestinal Diseases - Interaction - Bifidobacterium bifidum -Gastric biopsies -
Inhibition- histological section.