Régulation génétique par les petits ARN Régulation génétique par les petits ARN non-codantsnon-codants

Christophe ANTONIEWSKIantoniew@pasteur.fr

Institut Pasteur« Génétique de la souris »

27 janvier (1h30)

Découverte de l’interférence par l’ARNDécouverte de l’interférence par l’ARN

InjectionInjection

transfectiontransfection

Inverted-repeatInverted-repeattranscriptiontranscription

VirusesViruses

ExogenousExogenous

EndogenousEndogenous

feedingfeeding

Homology dependent CosuppressionHomology dependent Cosuppression

ARN double-brinARN double-brin

Post Trancriptional Gene SilencingPost Trancriptional Gene Silencing(dégradation de l’ARNm de séquence homologue)(dégradation de l’ARNm de séquence homologue)

Interférence par l’ARNInterférence par l’ARN

S2 ExtractS2 Extract

Luc dsRNA*Luc dsRNA*

Elbashir et al. Genes & DevelopmentElbashir et al. Genes & Development(2001) 15: 188-200(2001) 15: 188-200

1ère partie: siRNA (small interfering RNA)1ère partie: siRNA (small interfering RNA)

DicerDicerImmunoprecipitationImmunoprecipitation

Cyc dsRNA*Cyc dsRNA*

Bernstein et al. NatureBernstein et al. Nature(2001) 409: 363(2001) 409: 363

• 19 nucléotides double-brin• 2 nucléotides débordants en 3’(OH)• Activité RNAi per se• Activité séquence-spécifique• Ciblent ARN sens et antisens• 2’-O-Met (in vivo)

Caractéristiques des siRNA

(O-Met-2’)

(2’-O-Met)

Le complexe RISC (Le complexe RISC (RRNA Induced Silencing Complex)NA Induced Silencing Complex)Le complexe RISC (Le complexe RISC (RRNA Induced Silencing Complex)NA Induced Silencing Complex)

ArgonautesArgonautes

AGO-1, AGO-2 : ubiquitaires

Piwi, Aubergine, AGO-3: Lignée Germinale

AGO-1, AGO-2 : ubiquitaires

Piwi, Aubergine, AGO-3: Lignée Germinale

Deux groupes de protéines selon la présence d’aa conservés N-term:

Williams RW, Rubin GM PNAS 2002

RNA Induced Silencing ComplexRNA Induced Silencing ComplexRISC RISC

mRNAdegradation

Cleavage and releaseof the "passenger" strand

Helicase ?(Armitage/sde3)

R2D2 se fixe à l'extrémité la + stableRecrutant Dcr à l'extrémité la - stableR2D2 "reconnaît" le 5'P du brin "passager"

G

G

2ème partie: les microRNA2ème partie: les microRNA

Lin-14, lin28 Lin-41, hbl1

lin-4

3’ UTR

CDSlin14

Ordres de grandeurOrdres de grandeurOrdres de grandeurOrdres de grandeur

Genome miRNA identifiés expérimentalement

C. elegansD. melanogasterM. musculusH. sapiens

~150~150~700~700

Structure des gènes des miRNAs - primary miRNA Structure des gènes des miRNAs - primary miRNA (pri-miRNA)(pri-miRNA)

miRNAautonomes

miRNA"passagers"

~50%

~50%

Pri-miRNA :« Cappés »Queue Poly-APol II-dépendants

Rare

Pri-miRNA --> Pré-miRNAPri-miRNA --> Pré-miRNA

Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006

Pri-miRNA --> Pré-miRNA : le complexe « microprocessor »Pri-miRNA --> Pré-miRNA : le complexe « microprocessor »

Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006

Biogenèse des miRNABiogenèse des miRNABiogenèse des miRNABiogenèse des miRNA

Mais quelle Argonaute ?Mais quelle Argonaute ?

GGBiais 5’UBiais 5’UGGBiais 5’UBiais 5’U

RISCRISC

1

« specialized » miRNA and siRNA pathways in « specialized » miRNA and siRNA pathways in DrosophilaDrosophila« specialized » miRNA and siRNA pathways in « specialized » miRNA and siRNA pathways in DrosophilaDrosophila

Répression traductionnelle Vs Répression traductionnelle Vs clivage clivage

Saxena et al JBC 2003

La séquence « graine » (seed)La séquence « graine » (seed)

Dur de trouver une cible de miRNA !

Stark et al Plos Biol 2004

Doench et al G&D 2004

Les miRNA agissent aussi en déstabilisant les mRNA ciblesLes miRNA agissent aussi en déstabilisant les mRNA ciblesLes miRNA agissent aussi en déstabilisant les mRNA ciblesLes miRNA agissent aussi en déstabilisant les mRNA cibles

miR124 fortement exprimé dans le cerveau Transfection de miR 124 dans des cellules HelamiR124 fortement exprimé dans le cerveau Transfection de miR 124 dans des cellules Hela

Lim et al. (2005) NATURE VOL 433, p770Lim et al. (2005) NATURE VOL 433, p770

174 gènes réprimés (Niveau ARN) 174 gènes réprimés (Niveau ARN)

Modèles d’action des miRNAModèles d’action des miRNA

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Eulalio et al, Cell 2008

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Fonction des miRNAs au cours du développement

Adapted from Alvarez-Garcia and Miska, Development 2005

miRNA et CancersmiRNA et Cancers

Amplified in B Cell lymphoma miR17cMyc target + regulates E2F1Trangenic mice overexpression miR17 harbor c-myc-induced lymphomas

They target Bcl2, upregulated in many types of cancers

Classification of human cancers using miRNA profilingLu et al (2005). Nature 435, 834

3ème partie: les piRNA3ème partie: les piRNA

Bergman et al. Genome Biology 2006, 7:R112

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Aravin et al. Developmental Cell (2003), Vol. 5, 337–350.

• 25 paires de bases• Biaisés en 5’: U (80% des cas)• 2’-O-méthylés à l'extrémité 3’• Correspondent majoritairement à des éléments transposables (transposons et rétrotransposons) rasiRNA• surtout abondants dans la lignée germinale (ovaires et testicules)

Co-immunoprécipitation par anti-Piwi À partir d’extraits d’ovaires

Clonage/séquençage des petits RNA associés

Saito et al., Genes and Dev (2006)

Les piRNAs représentent 80% des petits ARN coprécipités avec un Anti-PiwiIl correspondent bien à des éléments répétés du génome (rasiRNA).

piRNAs

Saito et al., Genes and Dev (2006)

Les piRNA sont majoritairement « antisens »

Vagin et al., Science (2006)

La voie classique RNA-i est sans effet sur le contrôle des rétroéléments

Pas de contrôle par dcr1 sur mdg1, roo et mst40: la voie miRNA est également sans effet

Dans la lignée germinale, les piRNA répriment l’expression des Elements Transposables

Les acteurs importants pour le silencing des rétroéléments sontPiwi, Aubergine, armi, et Spn-E (Homeless)

Séquençage direct de molécules uniquesSéquençage direct de molécules uniques

Pyroséquençage « 4-5-4 »Pyroséquençage « 4-5-4 »

From Margulies, M., et al. (2005).Nature 437, 376-380.

Solexa, Solid, Helico…Solexa, Solid, Helico…

10 à 100 millions de lectures, de ~ 50 nt

Pyroséquençage… Et la lumière fut !

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Origine génomique des loci producteurs de piRNA

Biogenèse et mécanisme d’action des piRNA chez la drosophileBiogenèse et mécanisme d’action des piRNA chez la drosophile

Deep sequencing of Ago2-associated small Deep sequencing of Ago2-associated small RNAsRNAs

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Biogenèse des endo-siRNA:Biogenèse des endo-siRNA:3 type de loci producteurs3 type de loci producteurs

Les éléments répétés, transposons et rétrotransposons

Les zones de recouvrement des 3’ UTR (gènes convergents)

Des ARN non-codants « structurés »

Endo-siRNAs silence transposable element in Endo-siRNAs silence transposable element in the somathe soma

(as do piRNAs in the germ line)(as do piRNAs in the germ line)

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Regulation ofgene expression

Regulation ofgene expression

Transposon repressionHeterochromatin formation

Transposon repressionHeterochromatin formation

Defense against virusesTransposon repression

Heterochromatin formation

Defense against virusesTransposon repression

Heterochromatin formation

Mathieu Bartoletti Bassam BerryCorinne Besnard-GuerinAnne-Laure BougéCaroline JacquierJosette PidouxEdwige SeguyHélène Thomassin

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