.~reli ivcs Intcrnationnles de Physiologic, 19%.i, Vol. SSSIS, Fmr. 3 rt 4. 31 1

[612.014.31 .741.6] Requ le 27 juillet 1934.

RECHERCHES SUR LA RBPARTITION DU POTASSIUM DANS LES CELLULES ET SUR LES DBPLACEMENTS

QU’IL SUBIT AU COURS DES PHENOMBNES D’EXCITATI ON

P A R

Victor B U R E A U

( Laboratoire de Biologie ginirale. Universitl de Liige).

Introduction

A. B. MACALLUM (9), le premier, a cherchi a mettre le potassium en Cvidence dans les cellules, par le cobalt-nitrite de sodium. Voici, brikve- ment rapportis, les principaux risultats de ses observations :

Pour cet auteur, il y aurait trois modes de localisation du potassium. Dans les espaces intercellulaires, le potassium, trks abondant, serait

(( un produit d’imprdgnation et d’infiltration 1).

Dans le cytoplasme, il se rencontre sous deux formes, dont I’une doit Etre considirie comme une (( pricipitation physiologique I), l’autre comme une (( condensation biologique 1). Cette distinction est basie la fois sur I’aspect du pricipiti et sur I’endroit qu’il occupe dans la cellule. La pri- cipitation physiologique consisterait e n une fixation du potassium, sous forme inerte, sur un support colloldal inactif. Cette precipitation repri- senterait du potassium de reserve. La condensation biologique serait une accumulation de sels de potassium libres, dans un endroit particulier de la cellule. Chez les Spirogyra, par exemple, ce potassium est condensi au voisinage immidiat du chromatophore, tandis que, dans les cellules sicre- tantes du pancreas du Cobaye et du Lapin, il se trouve concentri spici- fiquement dans la zone renfermant les grains de sicrition. Ces deux cas constituent des exemples de (( condensations biologiques 11.

Dans les fibres musculaires lisses, le potassium est uniformiment riparti dans tout le cytoplasme; tandis que dans les fibres striies, on le trouve condense seulement au niveau des disques sombres. Une disposition analogue se rencontre dans l a fibre cardiaque.

Le noyau cellulaire ne contient pas la moindre trace de potassium. L a cellule nerveuse (y compris les dendrites e t le cylindre-axe) en est

complktement dipourvue. Cependant le cobalt-nitrite de sodium pricipite du potassium, extirieurernent, tout autour du corps cellulaire et dans la gaine de mydine, principalement au voisinage des m u d s de Ranvier.

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plus ricemment, WOERDEMAN (16) a igalement i tud i i les ripartitions du potassium dans les fibres musculaires striies et dans les fibres cardiaques. Ses risultats ne font que confirtner ceux de MACALLUM.

Nous avons repris cette etude, B un double point de vue, B savoir : I) la ripartition normale du potassium dans la cellule ; I I) les diplacements du potassium au cours de l’activitk cellulaire.

Nos recherches ont i t i effectuies sur des tissus vigitaux (ipidermes, algues, etc ...) e t animaux (muscle principalement).

I. -DDCtection histochimique du potassium dans les tissus

Technique. - La technique dont nous nous sommes servi au d ibut , pour rechercher les localisations cellulaires du potassium, est celle qui a i t i employee par A. B. MACALLUM. Elle consiste essentiellement a traiter les tissus frais par une solution tres concentree de cobalt-nitrite de sodium acitique : Co Na,(NO,), + CI-&.CO.OH. En prisence de potassium, il se forme un sel triple qui, d’aprks les recherches de GILBERT (I), serait un hexanitrite de cobalt, sodium et potassium, ripondant B la formule Co(K2 Nall),(NO,),. Ce complexe pricipite sous la forme de cristaux de couleur jaune orange, complktement insolubles dans l’eau aux basses tem- peratures, ligkrement solubles et par consiquent se formant trks ma1 250-300 C, complktement solubles B 1000 C. Ceci implique la nicessiti de traiter les tissus A basse temperature, de prifirence au-dessous de 150 C. Pour que la pr6cipi)ation du potassium soit complete e t instantanie, il convient de priparer spicialement le riactif, soit selon la formule donnee par A. B. MACALLUM (a), soit selon celle donnie par HAMBURGER (9.

D’aprks A. B. MACALLUM, lorsque des iliments cellulaires isolis ou des morceaux de tissus frais sont immergb dans une certaine quantit i de son riactif, ce dernier pinktre, en quelques secondes, jusque dans la pro- fondeur de ces iliments et y precipite le potassium 18-meme oh il se trouve. Si ce metal s’y trouve e n quantit i appreciable, ce qui est le cas pour la plu- part des tissus vigitaux, le precipite se prisente sous la forme de cristaux volumineux; s’il s’y trouve en quantiti trks minime, les particules du precipiti sont si tinues qu’elles ne sont plus reconnaissables individuelle- ment. On a alors recours B un artifice : aprks avoir lave convenablement les pikces ainsi traities, de fqon Ci &miner tout le riuctif en excis, on fait agir une solution de sulfure d’ammonium (NH,),S, qui attaque le complexe triple et e n pricipite le cobalt sous la forme de sulfure de cobalt : Co,S,,

(l) Cite d‘apris MACALLUM (9). (*) Dissoudre 20 grammes de nitrite de cobalt et 35 grammes de nitrite de

sodium dans 7 5 cc. d’eau ; ajout-r 10 cc. d’acide acitique glacial ; diluer ensuite avec de l’eau jusqu’a 100 cc.

(3) Dissoudre d’une part 50 grammes de nitrate de cobalt et 25 cc. d’acide acitique glacial dans 100 cc. d’eau et , d’autre part, 50 grammes de nitrite de sodium dans 100 cc. d’eau. Milanger les deux solutions ainsi obtenues.

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noir, manifestement rnieux reconnaissable, au microscope, que le compose jaune orange de colbat-nitrite de sodium et de potassium.

Rksultats. - 1. Nous avons tout d’abord applique la mCthode de A. B. MACALLUM a 1’Ctude des localisations du potassium dans cer- tains Cpidermes vCgCtaux, particulibrement 1’Cpiderme du bulbe d’oignon qui prkente le double avantage de se detacher aisement e t de n’btre constitue que d’une seule assise cellulaire. Des lambeaux de tels Cpidermes trait& par le reactif pendant 20 a 30 minutes, comme le recommande A. B. MACALLUM, montrent, a I’examen mi- croscopique, les images suivantes ?) :

Le protoplasme a un aspect grumeleux tout a fait caractkristique, comme s’il avait subi une floculation brut‘ale. On ne parvient plus a distinguer les limitesdes vacuoles protoplasmiques. La forme e t la structure du noyau sont Cgalement altCrCes. Ces alterations cellulaires ne doivent pas nous surprendre: la solution de cobalt-nitrite de sodium est en effet t r b hypertonique ; elle contient, d’autre part , de fortes quantitks de peroxyde d’azote, NO,, et d’acide acitique.

Le protoplasme renferme quelques cristaux de potassium, peu volu- mineux et repartis uniformhent dans tout le territoire de la cellule. D’autre part , on constate ia prCsence constante, d la surface libre des cellules, de nombreux cristaux, semblables a ceux du protoplasme, mais, d’une fagon gCnCrale, b:aucoup plus volumineux que ces derniers. Comme ces cristaux extracelluhires se fomen t exclu- sivement a la face interne de l’epiderme, primitivement en contact avec le parenchyme, nous avons tout d’abord pense qu’il s’agissait la de potassium provenant des cellules parenchymateuses qui avaient C t C l&Ces au moment de I’arrachement de 1’Cpiderme. Mais le m&me phenomkne s’observe encore sur des Cpidermes prealablement lavCs soigneusement avec des solutions isotoniques de chlorure sodique ou de glucose exemptes de potassium. Le parenchyme ne peut donc Ctre mis en cause et le potassium pricipite a Ia surface interne de 1 ’epiderme doit donc provenir des cellules c’pidermiques elles-mAmes.

Une preuve directe nous en est encore fournie par 1’Ctude de la pricipitation du potassium dans des organismes a structure simple : les algues filamenteuses et monocellulaires, divers protozoaires,

( l ) Les cellules kpidermiques vkgktales contenant inormiment de pot:issium, il n’est pas nicessaire de recourir i l’action de sulfure d’ammonium.

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Paramczcium, Stylonichia, etc ... Ces organismes, traitis par le rkc t i f pendant un certain temps, montrent des images analogues a celles observies dans I’epiderme : mCme altiration du protoplasme et des noyaux, prQence de menus cristaux intracellulaires de cobalt-nitrite de potassium Cgalement distribuis dans toute I’etendue de la cellule. Enfin, les Q m e n t s et les cellules isolees sont, d‘une f q o n constante, entourks d’une gaine quasi continue de petits cristaux ripartis a peu pris uniform‘ment a la surface libre de l’organisme consi&ri.

Toutes les cellules que nous avons examinies, reagissent de la m&me manikre a I’action prolongke d’une solution concentrke de cobalt-nitrite de sodium acetique : altkrations structurales, formation de cristaux intracellulaires et extracel1ulaire.s.

I1 faut aussi signaler que jamais on ne peut, dans les conditions experimentales rkalisees, rencontrer des cellules plasmolysees, bien qu’elles aient C t e plongies dans une solution fortement hypertonique. Ceci peut se comprendre de deux faqons : ou bien la cellule a e t C d’abord plasmolysCe, mais le reactif toxique a dktruit peu a peu la membrane cellulaire, la rendant ainsi tout a fait permeable ; ou bien le reactif, agissant a la manikre d’un fixateur, a dCtruit directement la membrane cellulaire e t a pinetre instantankment jusque dans la profondeur du protoplasme.

2. L’absence de plasmolyse et surtout la formation de cristaux extracellulaires nous ont amenC a modifier la methode de telle sorte qu’elle permette d’etudier plus graduellement l’action du reactif sur la cellule. Le morceau d’kpiderme (ou de tout autre tissu) lave au liquide physiologique, est place entre lame et lamelle, le tout etant depose sur la platine du microscope. On fait arriver au contact du tissu une certaine quantite de la solution de cobalt- nitrite de sodium. Nous avons ainsi pu observer une succession d’images conduisant petit a petit aux rhul ta t s que nous avons d Ccr i ts ci -dessus .

Au moment oh le reactif arrive au contact d’une celIule, il se pro- duit immediaternent e t sirnultanCment, d’une part une trks forte plasmolyse, d ’autre part de nombreux cristaux extra-cellulaires. La teinte Claire du protoplasme indique que le reactif n’a pas, a ce moment, franchi la membrane physiologique de la cellule (1).

(1) Le reactif de MACALLUM a, en effet, une teinte crangie assiz foncie sous faible ipaisseur, une teinte brun rouge trhs ,foncCe sous forte ipaisseur, et sa pinitration dam la cellule ne peut kchapper a I’observateur.

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Au bout d’un quart d’heure, la rnasse protoplasrnique commence a se diplasrnolyser e t le reactif pknktre petit a petit a I’intkieur de la cellule, ce qui se marque, d’abord par la teinte orangee que prend cette dernikre e t par la precipitation de quelques menus cristaux intra- cellulaires de cobalt-nitrite de potassium. Au bout d’une demi- heure environ, le protoplasrne a repris son volume primitif et la cellule presente alors I’aspect decrit EOUS le paragraphe 1 ci-dessus (l). Au bout de deux ou trois heures, le protoplasme commenze a se dbagrkger, il se fragrnente en masses plus ou rnoins volurnineuses, a bords irriguliers, qui tornbent dans la cavite constituee par la coque cellulosique ou membrane anatornique.

Contrairernent donc a I’affirrnation de A. B. MACALLUM, le reactif ne penktre pas instantanement dans la cellule; il provoque tout d’abord une trks forte plasmolyse qui ne se riduit qu’a la faveur de la destruction progressive de la membrane cellulaire par le reactif hi-rn&me.

La m&rne suite de phinomknes a Cte observie sur les differents epi- dermes que nous avons pu nous procurer, sur des algues filarnenteuses ou monocellulaires, sur des protozoaires rencontrk par hasard dans nos cultures d’algues, sur la fibre nerveuse (provenant du nerf scia- tique de la Grenouille). Dam ce dernier cas, il se forrne au debut, sur toute la surface de la fibre, une couche continue de petits cristaux (”. Bientbt, le reactif atteint la gaine de rnyeline, oil le prkcipite dessine une fine trarne que.I’on met trks bien en evidence psr la reaction au sulfure d’arnrnoniurn. Cornrne I’avait constate A. B. MACALLUM, on peut voir des masses assez volumineuses de prkipi te , principalement au voisinage irnrnidiat des noeuds de Ranvier. Un exarnen plus attentif rCvele la prkence d’une fine gaine continue du precipite entourant le cylindre-axe.

Les fibres rnusculaires striees (couturier et gastrocnernien de la Grenouille), traitees successivernent par la solution concentr Ce de cobalt-nitrite de sodium acetique et par le sulfure d’arnrnoniurn, prbentent un aspect rappelant, en certains points, celui des tissus CtudiCs prkcedernrnent. Les fibres, plissees et forternent contractkes, ont ete I’objet d’une excitation apparernrnent violente, relevant vraisemblablernent de la toxicite du peroxyde d’azote et de I’acide

(1) Dans un certain nombre de cellules, le protoplasme ne s’imbibe pas uni-

( 2 ) On a sans doute l i affaire A du potassium provenant de la gaine de Schwnnn. formkrnent de reactif, mais i l se forme des vacuoles d’ktendue variable.

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acitique contenus en assez forte quantite dans le reactif. Les cellules musculaires sont entouries chacune d’une gaine continue e t uniforme de petites granulations noires de sulfure de cobalt. D’autre part, comrne l’avaient observe A. B. MACALLUM et WOERDEMAN, on peut pricipiter du potassium a l’interieur des fibres musculaires, unique- ment au niveau des bandes anisotropes ; les disques clairs en sont cornplktement depourvus. Nous n’avons pas pu contrder si ce potas- sium des disques sombres siege dans les myofibrilles ou dans le sarcoplasme.

3. La formation de cristaux extracellulaires, coincidant toujours avec une plasmolyse de la cellule, nous .devons admettre que ce der- nier phenornene se traduit par le transit a travers la paroi cellulaire, non seulement d’eau, mais aussi de certains sels, en tous cas de sels de potassium. Ce transit peut n’btre que la consequence de l’hyper- tonie du reactif ; nous avons entrepris de preparer par tltonnernents un reactif isotonique et recherche si une telle solution permet desituer topographiquernent le potassium cellulaire, tout en respectant I’integrite de la cellule. Malheureusement tous nos essais dans ce sens ont C t C nkgatifs : un tel reactif respecte parfaitement 1’intCgritC des cellules, ne provoque pas la formation de cristaux au dehors de celles- ci, mais il ne franchit la barridre que lui oppose la membrane physio- logique qu’aprds plusieurs hures de contact et, dam ces conditions, la localisation des cristaux de potassium a une signification trds incertaine.

4. Les rbul ta ts decrits ci-dessus nous ont amenC a rechercher la possibilite d’associei le reactif a un fixateur, de telle sorte que la pen& tration de cobalt-nitrite de sodium puisse s’effectuer rapidement. Dans ce but, nous avons essaye des solutions de colbalt-nitrite de sodium, contenant des proportions assez ClevCes de certains fixateurs. Nous avons de preference utilisC les deux melanges suivants : rkc t i f de A. B. MACALLUM normal et forrnol du commerce dans les propor- tions de trois a un ; reactif de A. B. MACALLUM normal e t solution saturee de chlorure mercurique dans les proportions de un a trois. De telles solutions pinetrent imme’diatement dans la cellule, ce qui se reconnait par la coloration orangee que prend le protoplasme et par la formation de quelques menus cr istaux du complexe potassique dans la cellule. Les cristaux ainsi forrnes ne different, ni en nornbre,

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ni en volume, de ceux obtenus par I’action prolongke du riactif sans fixateur. Par cette mkthode, nous avons pu constater, contrairement a ce que dit A. B. M A C A L L U M , ~ ~ ~ le noyau cellulaire renferme des petits cristaux du complexe potassique ; de plus, on rencontre kgale- ment de semblables klkments colles a mCme la surface de l’appareil nuclkaire.

L’emploi du rkc t i f additionnk soit de formol ou de sublimk, tout comme le rCactiT employe seul, provoque la formation, a la surface de la cellule, d’une quantitk considkrable de cristaux extracellulaires, bien qu’il n’y ait aucune plasmolyse. Ceci ditruit I’hypothkse kmise plus haut, a savoir que la libkration de potassium par la cellule pou- vait gtre attribuee a la plasmolyse. I1 faut donc chercher une autre explication a ce phinomkne.

11. - Recherches sur les dkplacements que subissent les ions potassium

au cours des phknomhnes d’excitation

Les faits decrits ci-dessus nous montrent que le riactif de A. B. MACALLUM, employe seul ou associk a un fixateur, provoque la for- mation de cristaux de cobalt-nitrite de sodium et potassium en dehors de la cellule, outre les pricipitations intraprotoplasmiques et intranucleaires de ce composk. Cette constatation a retenu toute notre attention pour deux motifs :

1. La plupart des cellules zont normalement beaucoup plus riches en potassium que les liquides intercellulaires. I1 existe donc, dans les cellules, un mkcanisme grice auquel ce mktal peut se concentrer spicifiquement dans le protoplasme et y &tre retenu : combinaisons organo-mktalliques stables ou potassium diffusible vis-a-vis duquel la membrane cellulaire est impermeable de dedans en dehors (l). Le reactif de A. B: MACALLUM dktruit-il le complexe organo-potassique de la cellule ou dktruit-il le mkcanisme grice auquel ce potassium, normalement diffusible, ne peut sortir de la cellule (permkabilitk membranaire) ?

(l) La permiabili t i irriciproque de certaines membranes a i t i snutrnue, mnis aussi contestie.

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2. On sait que I’activite de certains tissus, comme le muscle, s’ac- compagne d’une augmentation de permiabiliti aux ions [DUBUIS- SON (2,3 et 4)] et que l’organe libkre du K + et des ions PO, (ERNST et Czucs (6), EGGLETON (5)’ etc ...) (l). Si cette augmentation de permeabilite, qui permet la sortie de potassium, Ctait un phenomene general, (ce qu’admet d’ailleurs OSTERHOUT (12, 13 et 14), la forma- tion du complexe potassique dans les experiences que nous avons de- cr ites ne serait peut-itre que la consequence de processus d’excitation provoques par le reactif utilise.

Nous avons entrepris de nombreuses recherches dans le but de prkciser les conditions d’apparition du potassium extracellulaire en variant le plus possible nos conditions d’expirience.

1. Les diplacements d’ions K+ au cours de l’action du riactif de A. B. MACALLUM sur le muscle de Grenouille.

Nous avons constate que si on immerge un gastrocnimien de Grenouille dans une certaine quantitk du riactif, on observe l’appa- rition de toute une sCrie de contractions fibrillaires interessant toute la surface du muscle ; bient6t celui-ci se met en contracture definitive. La mime riponse mkcanique a encore lieu si on a prkalablement diluC le reactif jusqu’a I’isotonie. Ceci peut Ctre dii a la toxicite du cobalt-nitrite de sodium pour le muscle, ou a la prbence exclusive dans ce milieu d’ions Na+ en l’absence d’ions K+ et Ca+ + . La pro- duction de contractions idio-musculaires sous I’influence du sodium est d’ailleurs bien connue [LOEB (8), etc ...I, Des coupes longitudinales de gastrocnemien, pratiqukes au microtome a congelation, s’enroulent sur elles-mimes dks qu’on les plonge dans le reactif, alors qu’elles restent parfaitement CtalCes si on remplace celui-ci par une solution isotonique de glucose. Si on suit au microscope I’action du reactif sur des fibres musculaires striCes isolees, on apeqoit des contractions violentes des fibres ; en mCme temps, il se constitue tout autour d‘elles une couche quasi-continue de tris petits cristuux de cobalt-nitrite de sodium et potassium.

2. Les de’placements d’ions potassium au cows de l’action des anesthb siques sur les cellules vbge’tales.

(l) On est ma1 fix6 d’ailleurs sur I’origine de ces substances (fibres musculaires ou conjonctif intermusculaire 9 )

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I1 est bien connu que les anesthbiques agissent sur les tissus en deux temps : un premier pendant lequel l’excitabilite est exaltee ; un second qui constitue I’anesthCsie proprement dite et qui provoque petit a petit la mort de la cellule, si elle est suffisamment prolongke. Si l’anesthesie est arrCtCe a temps, le tissu recouvre, a p r b un certain moment, ses propriCtCs initiales. OSTERHOUT (1 1 et 15) a montrC lque la rbistance electrique mesurCe en basse friquence (inverse de la permiabiliti) croit pendant le premier temps et diminue pendant le second. Nous avons recherche si ces Idiffkrents stades de l’anesthbie : periode d’excitation et pkriode d’anesthbie proprement dite, trouvent leur correspondant dans des manifestations du transit des ions potas- sium. Nous avons utilise seulement deux anesthbiques : les vapeurs de chloroforme et les vapeurs d’Cther. Les lambeaux Cpidermiques de bulbe d’oignon, laves avec une solution isotonique de chlorure sodique ou de glucose et sCchCs rapidement, sont deposb sur des lames porte- objets et places en chambre humide dans des atmospheres saturies de vapeur d’anesthbique, a la temperature du laboratoire, soit environ 200 C. Au bout d’un certain temps, variable selon les expC- riences, on amkne au contact de I’epiderme une ou deux gouttes d’une solution isotonique de cobalt-nitrite de sodium. Cette solution a CtC prealablement reconnue capable de precipiter rapidement le potas- sium de ses solutions mCme diluees et incapable par elle-mime de provoquer une liberation de potassium dans le tissu CtudiC. Toutes nos experiences ont etC conduites en prbence de pikes timoins.

a) CHLOROFORME. - Lorsqu’on amkne le reactif de A. B. MACAL- LUM isotonique au contact de I’epiderme, quelques secondes seule- ment (environ 10 secondes) aprks sa mise en atmosphere saturee de vapeurs de chloroforme, on constate la formation instantanee de petits cristaux uniforrnement ripartis a la surface du tissu. Si l’action du chloroforme est prolongee pendant un certain temps (plusieurs minutes), le reactif isotonique precipite encore du potassium extra- cellulaire. Les crjstaux ainsi formb ne paraissent, dans ce cas, ni plus nombreux ni plus volumineux. La question se pose de savoir si cette liberation de potassium est, comme l’anesthbie, r&ervible ; autrement dit, si ce potassium est susceptible de rkintigrer la cellule a la faveur de l’elimination de l’anesthbique.

Deux morceaux d’ipiderme sont mis en atmosphere ’ saturee de vapeurs de chloroforme. Aprb avoir depose sur l’un d’eux seule-

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ment (no 1) une ou deux gouttes du reactif isotonique, on place les deux preparations dans une autre chambre hurnide sans anesthesique, ce qui permet au chloroforme de s’kvaporer des deux tissus. Aprb quelques instants (une ou deux minutes), on depose Cgalement une certaine quantite du reactif diluC sur l’autre Cpiderme (no 2). Dans ces conditions, I’epiderme (no 1) est toujours recouvert de menus cristaux jaune orange de cobalt-nitrite de potassium. Quant a l’epiderme (no 2), il en est cornplktement exempt, si l’action de l’anesthbique, dans les conditions de l’expkrience (atmosphkre saturie 200 C), n’a pas CtC pro2ongCe au-delh de 3 ii 4 minutes (l).

Passe ce delai, on retrouve constamment du potassium extracellulaire, mime a p r b I’elimination complkte du chloroforme.

b) ETHER. - Avec cet anesthesique, la suite des phknomknes observis est la mime que celle obtenue avec le chloroforme, mais les differentes phases se trouvent notablement allongees. Dans les mimes conditions, la liberation de potassium ne s’effectue qu’aprks 20 a 25 secondes. D’autre part, la reaction est encore riversible au bout de 7 a 8 minutes, ce qui n’est pas le cas avec le chloroforme.

3 . Les &placements d‘ions potassium au cours de la plasmolyse et de la turgescence des cellules vigitales.

a ) PLASMOLYSE. - Un lambeau d’epiderme place sur lame porte- objet est recouvert d’une quantite suffisante d’un reactif hyperto- nique obtenu en ajoutant une forte quantite de chlorure sodique ou de glucose a une solution isotonique de cobalt-nitrite de sodium, laquelle ne peut, a elle seule, provoquer la moindre liberation de potassium dans le tissu experimente. L’exarnen microscopique de preparations effectuees selon cette methode ne nous a jarnais revele la moindre trace de potassium a l’extirieur des cellules plasmolyskes, pas plus d’ailleurs qu’a l’intkrieur du protoplasme. Au bout d’un temps plus ou moins long, le reactif pknktre dans la cellule et on assiste a une veritable deplasmolyse progressive de la cellule. Ce phenomkne qui ne peut s’accornplir qu’a la faveur de la penetration de cristalloides dans la cellule, s’effectue complktement sans qu’on puisse mettre en evidence la moindre trace de potassium extracellu- laire.

(1) Grice A cette possibilitk du retour du potassium sa place initiale, nous avons pu repeter jurqu’h quatre fois I’expkrience sur un mCme lambeau d’kpi- derme.

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b) TURGESCENCE. - On procede cornme dans le cas precedent. Le reactif employe est une solution hypotonique de cobalt-nitrite de sodium acetique mais suffisamment concentrke pour prCcipiter rapide- ment le potassium de ses solutions mCme diluees. Les nombreuses observations que nous avons faites ne nous ont jamais permis de deceler la prkence de la moindre quantite de potassium a I’exterieur des cellules turgescentes. Cependant, dans certains cas, d’ailleurs peu nombreux, nous avons pu observer la prkipitation de quelques menus cristaux extracellulaires (l), mais seulement a la phase ultime de la turgescence, au moment donc oh la cellule tend a reprendre son volume primitif. Peut-Ctre n’est-ce la qu’une particularit6 de la sortie de cristalloi’des qui permettrait le ’retour du protoplasrne a ses dimensions normales.

4. Les dkplacements d‘ions potassium dam les tissus sous l’action

A. - EPIDERMES V~GETALJX.

Sur une lame porte-objet recouverte d’une faible quantitk de la solution isotonique de cobalt-nitrite de sodium, on depose un mor- ceau d’ipiderme de bulbe d’oignon, de telle sorte que sa face interne soit orientke vers le bas. Des electrodes en argent chlorurk sont posees sur la face superieure ou externe du tissu.

du courant dectrique.

Courant galvanique. - Nous avons employe cornme source de courant d’excitation une batterie de 20 volts, riunie a un diviseur de potentiel, ce qui nous permettait d’utiliser toute la gamme des D. P. inferieures a 20 volts. De plus, une rbistance variable, d’une valeur maximale de 111.111 ohms, etait intercalie dans le circuit d’excitation.

Dans aucun cas, a la suite d’un seul choc de fermeture et d’ouver- ture, il ne nous a Cte permis de constater la liberation de potassium. Au contraire, en ripktant les excitations plusieurs fois successivement (fermetures e t ouvertures alternatives du circuit), 5 a 20 fois au rythme de 0,s a 4 par seconde, nous avons constate la liberation d’une quantitk abondante de potassium. Ceci ne fut jamais observe qu’en

(1) Leur nombre r t leur volume sont de lcin infkrieurs i ceux des cristaux prkcipites, soit par le reactif de A. B. MACALLUM, soit ,2 In suite de l’action des fixateurs ou des anesthisiques.

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employant une difference de potentiel supirieure a 4 volts. I1 est evident que ce seuil varie, d’une par t avec la rbistance intercalke dans le circuit d’excitation, d’autre part , avec la quantite de rbc t i f sous- jacente a l’epiderme. .En effet, le reactif et l’epiderme forment un couple de resistances en parallele e t il passe d’autant plus de courant par le tissu que la rbistance totale du reactif est plus forte.

Courant &induction. Le courant Ctait fourni par un chariot de Dubois-Reymond, alimente par une batterie de 4 volts au primaire.

Une faradisation suffisamment prolongee, au-dessus d’un certain seuil (distance maxima des bobines 10 cm.), provoque une liberation de potassium au dehors des cellules comprises entre les deux Clec- trodes.

Dbchurges de condensateur. - Pour ce mode d’excitation nous avons utilise le dispositif classique. A la suite d’une dkcharge unique, nous n’avons jamais pu prkcipiter de cristaux de cobalt-nitrite de potas- sium, sous aucune des deux electrodes, quelles que fussent la cons- tante de temps et l’intensitk des dkcharges que nous donnait le cir- cuit utilise. Mais des excitations rCpCtCes au rythme de 0,s a 2 par seconde finissent toujours par donner, a p r h une dizaine de decharges environ, une liberation trks nette de potassium.

Remarques. - l o Dans toutes les experiences prkcedentes, il est difficile d’obtenir une reaction tout-a-fait constante, du fait que la resistance totale du reactif sous-jacent a l’epiderme, change neces- sairement d’une experience a l’autre.

20 Si le reactif au lieu d’6tre strictement isotonique, est 1Cgerement hypertonique, la plasmolyse ainsi provoquee se rkduit dans une plus ou moins grande rnesure, uniquement dam les cellules qui ont ete le siege d’une liberation de potassium.

B. - FIBRE MUSCULAIRE STRIfiE.

Dans nos essais d’excitation du tissu musculaire par le courant Clectrique, nous avons utilise de minces faisceaux de fibres, obtenus par dissociation a l’aiguille, soit du couturier, soit du quadriceps de la Grenouille (de preference : Grenouille de Hongrie).

Le reactif de A. B. MACALLUM diluC jusqu’a l’isotonie et dont nous

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nous sommes servi dans les experiences pricedentes, contient certains elements toxiques : acide acktique et NO,, en quantite suffisante pour provoquer la contraction de la fibre musculaire. Comme le NO, n’est libere du complexe cobalt-nitrite desodium qu’a la faveur de la prQence d’acide acktique libre dans le milieu, nous avons, pour remedier a la toxicite du reactif, procede comme suit : 25-gr. de nitrite de sodium et 25 gr. de nitrate de cobalt sont dissous dans 100 cc. d’eau, a une temperature inferieure a lo00 C. On ajoute goutte a goutte de I’acide acktique glacial jusqu’a ce que I’effervescence produite par le degagement de NO, ait cesse complktement. I1 suffit ainsi d’une quantite d’acide acktique environ moitie moindre que celle necessaire pour la preparation du reactif de A. B. MACALLUM.

La solution ainsi obtenue pouvant encore contenir une minime quantit i d’acide acetique libre, il suffit pour l’eliminer de filtrer le liquide sur du carbonate de calcium. Ce reactif mCme trCs dilue est capable, au mCme titre que celui de A. B. MACALLUM, de pricipiter ie potassium de toutes ses solutions. I1 prisente en outre l’avantage de ne pas Ctre toxique pour les tissus contractiles.

Le faisceau de fibres musculaires, d’abord immerge dam du liquide de Ringer pour Cviter une deperdition par diffusion du potassium musculaire ( I ) est, immidiatement avant I’expkrience, convenable- ment et rapidement lave dans une solution isotonique de NaCl, dans le but d’elirniner le potassium provenant du liquide de Ringer. Le tissu est ensuite imbibe de liquide physiologique additionne d’une faible quantite de la solution de cobalt-nitrite de sodium, preparee comme il vient d’Ctre dit.

Nous avons remarque que, d’une faFon gknerale, les muscles ou les fibres musculaires fraichement iso1k.s sont le siege de contractions fibrillaires, lorsqu’on les immerge soit dans du liquide de Ringer normal, sont surtout dans une solution isotonique de chlorure sodique ou de glucose. Nous avons rkussi a parer a cet inconvenient en ajoutant une trks faib!e quantite de chlorure de calcium aux solutions employees.

Les fibres musculaires &ant placees sur les electrodes, on fait passer le courant. Aprks l’excitation, les cristaux formes n’etant pas

(I) Des experiences de BOEHMS (1)’ de NEUSCHLOSS et TREBLES (lo), etc., ont montrC en effet que Iz tissu musculaire perd Pnormement de potassium, lorsqu’il est immerge pendant un temps suffisant dans des solutions nr contziiant pas, ou trop peu, de potassium.

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visibles individuellement, mCme a de forts grossissements, les fibres musculaires sont lavies convenablement, de faqon a Cli- miner le rhctif en excks, et sont ensuite traities par une solution diluCe de sulfure d’ammonium (voir p. 312).

Courant galvunique. - Le courant est fourni par une batterie de 4 volts, reliie a un potentiomktre ; on peut ainsi utiliser des D. P. variant entre 0 et 4 volts. Pour varier a volontk l’intensitk du cou- rant traversant le tissu, on shunte au moyen d’une rbistance variable tandis qu’une autre rbistance est intercalee dans le circuit d’excitation, en sCrie avec le tissu. On constate que, dks la fermeture du circuit, il se produit une liberation diffuse de potassium dans toute la portion du tissu comprise entre les deux electrodes.

L’examen microscopique attentif des preparations montre que la coloration noire obtenue est due a la prhence de trks petitsgrains noirs de sulfure de cobalt entre les fibres musculaires. Cette precipi- tation est d’autant plus considerable que l’intensite du choc a CtC plus ClevCe. C’est ainsi que pour un choc a peine liminaire, ne don- nant qu’une reponse micanique t r b peu marquee, le potassium n’est libire qu’en faibles quantites. Dans ce cas, l’examen micros- copique revkle qu’une partie seulement des fibres musculaires a C t C atteinte par l’excitation.

Chocs induits d’ouverture. - Le courant Ctait fourni par un chariot de Dubois-Reymond, aliment6 par une batterie de 4 volts au pri- maire. De multiples experiences nous ont montre que des chocs rCpetQ sub-liminaires, liminaires et supra-liminaires ont toujours pour effet de provoquer une liberation de potassium. L’intensite de cette liberation, au-dessous d’un certain maximum, depend de l’intensite des chocs, de leur frkquence et de leur nombre absolu.

Conch sions

1. Nous avons pu montrer au cours de ces recherches que le reactif de MACALLUM au cobalt-nitrite de sodium acetique pour la locali- sation histochimique du potassium dans les cellules ne pourrait donner des rbultats qu’a condition d’&tre isotonique vis-a-vis des tissus ktudib. Sinon, son hypertonicite et sa t r b grande toxicite, due a l’excks d’acide acktique libre et a la presence de peroxyde

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d’azote dans le reactif, provoquent a la fois une plasmolyse des cel- lules, avec des alterations structurales profondes du cytoplasme et du noyau et des phenomknes qui peuvent Ctre assimilQ a des processus d’excitation et qui se traduisent par un transit important d’ions potassium qui, sortant de la cellule, viennent s’accumuler au dehors d’elle.

Nous avons indiquk qu’en diluant convenablement le reactif et en le privant de ses compost% toxiques par des artifices de preparation, on constitue une solution qui, u priori, pourrait convenir dans la plupart des cas. Mais la membrane physiologique des cellules est impem’uble au reactif isotonique, du moins pendant les prernikres heures de son action. La solution ne pCnktre qu’a la longue, probable- ment au fur et mesure que la cellule s’altkre. Ceci constitue un trks grand inconvinient en ce sens que ces processus d’altkration modifient sfirement de faqon considerable la repartition du potassium intracel- lulaire et les images obtenues ne sont, en definitive, que des figures sans signification certaine. C’est pourquoi nous avons essaye d’as- socier le reactif a un fixateur a action rapide (sublime). Dans ces conditions, la penetration de la solution est pratiquement instantanbe, du moins dans les cellules qui Font immidiatement i son contact, e t nous croyons que la brusquerie de cette penetration permet de precipiter le potassium dans des conditions les moins anorrnales.

Contrairement a l’affirmation de A. B. MACALLUM, il existe non seulement du potassium reparti dans le protoplasme, mais aussi dans les noyaux des cellules vegetales.

2. Nous avons attache une importance particulikre au fait que, dans de nombreux cas, il apparait, a la pkripherie des cellules, traitees par le reactif de A. B. MACALLUM, une abondante precipitation de potassium. Nous avons pu mettre ce phknomkne en relation avec des processus d ’excitation.

On peut se demander d’oh vient ce potassium. Son origine doit Ctre recherchke dans la cellule elle-mtme ; on ne peut, en effet, ad- mettre qu’il soit d’origine extracellulaire, puisqu’il apparait aussi bien chez des cellules isolees (protozoaires) que dans des tissus. Sa precipitation etant instantanee, par exemple lors de I’emploi combine du reactif et d’un fixateur, nous ne croyons pas qu’il faille localiser son origine bien loin de la membrane physiologique ; peut-itre m&me est-ce dans cette pellicule, douke d’une composition et de proprietk

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particulikres (l) qu’il convient de localiser les complexes qui, sous I’action d’agents excitants, libereraient du potassium vers I’extCrieur.

L’accumulation de potassium a la peripherie nucliaire, sous I’effet combine du reactif et d’un fixateur, revkt le mCme aspect que sa pre- cipitation a la peripherie protoplasmique. Sans doute s’agit-il ici de processus qui, au niveau des interphases nuclkoplasmatiques, ont une certaine analogie avec ceux qui interviennent au niveau de la membrane physiologique. MACALLUM hi-mkme avait signale di ja la formation de cristaux de potassium autour de certaines structures intraprotoplasmiques (chromatophore de Spirogyres). On peut d b lors se demander si la liberation de potassium n’est pas une carac- teristique generale des interphases polarisees des cellules.

MACALLUM signale aussi la prkence geniralement abondante de potassium dans les espaces intercellulaires des tissus. Nous nous demandons si ce potassium ne provient pas des cellules dont i l serait sorti sous I’influence de I’hypertonicite e t de la toxicite du reactif utilise par cet auteur, d’autant plus que nous avons pu constater a de nombreuses reprises qu’un reactif isotonique, non exci- tant pour les cellules epidermiques, ne precipitait ni dans les espaces intercellulaires, ni dans les membranes anatomiques, de cristaux de cobalt-nitrite de potassium decelables soit directement, soit par l’intermediaire du sulfure d’ammonium. Cependant, un reactif iso- tonique penktre bien jusque dans ces espaces et traverse facilement les membranes anatomiques. Nous nous posons la mkme question en ce qui concerne les cellules du ganglion spinal de la Grenouille, dans lesquelles MACALLUM (9) dit ne pas avoir decele I’existence de K alors qu’il s’en trouvait des quant i tk importantes tout autour du corps cellulaire.

Quoi qu’il en soit, nos experiences permettent de confirmer I’hypo- these d’OSTERHouT (13 et 14), selon laquelle des deplacements de potassium, au niveau de certaines interphases polariskes, accompa- gnent les phenomenes d’excitation. Ces deplacements sont reversibles comme le montrent nos recherches effectuies avec les anesthkiques.

Si I’on admet, d’une part , que la membrane physiologique est normalement plus permeable aux cathions qu’aux anions (MICHAE- LIS), d’autre part que le potassium joue, dans les phenomenes de polarisation membranaire, un r61e important [OSTERHOUT (12 et 13)],

( l ) Consulter D U B U I S S O N (4).

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est-il possible d’imaginer que le K qui se dCpIace au cours des phino- mtnes d’excitation est celui-lh mCme qui intervient dans les phenos mines de polarisation ? Nous pouvons nous representer, dans la cellule consideree a l’etat de repos, des ions Krepartis en dehors mais tout contre la membrane physiologique, oh ils sont retenus par l’attraction Clectrostatique des anions correspondants vis-a-vis des- quels la membrane est peu ou pas permeable. La formation, avec ces ions K, d’un sel insoluble sous l’action d’un reactif n’est possible que pour autant que les ions K puissent se liberer de cette attraction elec- trostatique. 11s ne le peuvent que si d’autres cathions viennent les remplacer [ERNST et SCHEFFER (7)] ou si les anions retenus au dedans peuvent se liberer au dehors. C’est, semble-t-il entre ces deux alter- natives qu’il faudrait choisir pour expliquer la formation de cobalt- nitrite de potassium au moment d’une excitation. Nous croyons que de nouvelles experiences destinies a rechercher si la region catho- dique se comporte differemment de la region anodique au cours des phenomknes d’electrotonus nous permettront de choisir parmi ces deux alternatives.

RCsu mC

Le reactif de MACALLUM pour la recherche des localisations cellu- laires du potassium ne pourrait donner des rkul ta ts precis qu’a la condition que la solution soit isotonique e t non toxique. Aussi les images obtenues par cet auteur sont-elles en grande partie des productions artificielles dues aux alterations cellulaires provoquies par le reactif. Nous croyons que des images normales ne peuvent Ctre obtenues qu’a la condition d’opkrer avec un reactif rendu isotonique et associe a un fixateur q u i permet une penetration rapide du melange et , par la m h e , un minimum d’alterations. On constate ainsi que

1. Le potassium cellulaire que le reactif permet de deceler (K non combine ?) est surtout accumult aux environs immediats de la mem- brane phydiologique, de la membrane nuclkaire e t des membranes qui entourent certaines structures protoplasmiques (enclaves) ;

2. I1 s’en trouve, en moindre quantite, uniformement reparti dam le cytoplasme et dans le nuclioplasme;

3. Dans la fibre musculaire striee, le potassium est condense aux environs de la membrane cellulaire et dans Ies disques sombres.

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Les disques clairs sont complktement dkpourvus de potassium dtke- lable par cette technique.

4. Les agents excitants (substances toxiques considerkes dans leur action primaire ; anesthkiques a faible dose, courant Clectrique) provoquent la sortie de quant i th abondantes de potassium en dehors des cellules.

BIBLIOGRAPHIE

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3. ID. - Etude des relations qui existent entre la permiabilitk et le courant de demarcation du muscle au cours de la contraction. Arch. inter?^. Physiol.,

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1934, X x X v l l I , 1 .

CCIV, 374.

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