Galle COMBEAUX (gaelle.combeaux@laposte.net) Nathalie FRATINI (nathalie.fratini@laposte.net) Claire MASSIMI (claire.massimi@laposte.net) Marion PUIMATTO (marion.puimatto@laposte.net)

EPU1 Groupe 2 22/05/2006

LARN INTERFERENCETuteur : docteur Gilles Pags Responsable du projet : Richard Christen

Anne 2005-2006

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SommaireSommaire ................................................................................................................................... 2 Liste des abrviations ................................................................................................................. 3 Introduction ................................................................................................................................ 4 1. Principe de lARN interfrence.............................................................................................. 5 1.1. Historique de lARN interfrence ................................................................................... 5 1.1.1. Dcouverte fortuite du phnomne dARN interfrence ......................................... 5 1.1.2 Dcouverte du phnomne chez les mammifres ..................................................... 7 1.1.3 Situation actuelle ....................................................................................................... 8 1.2. Mcanisme de lARNi..................................................................................................... 8 1.2.1. Mcanisme de la phase dinitiation.......................................................................... 8 1.2.2. Mcanisme de la phase effectrice........................................................................... 13 1.2.3. Etape damplification ............................................................................................. 16 2. Techniques de laboratoire .................................................................................................... 17 2.1. L'ARNi sur cellules en culture ...................................................................................... 18 2.1.1. Choix de la squence cible des siARN................................................................... 19 2.1.2. Conception des siARN ........................................................................................... 21 2.2. Visualisation du phnomne dARNi ........................................................................... 33 2.2.1. Immunofluorescence .............................................................................................. 33 2.2.2.RT-PCR................................................................................................................... 39 2.2.3. Un exemple dexprience....................................................................................... 43 2.3. Les expriences dARNi chez lanimal......................................................................... 44 2.3.1. Ladministration locale de siARN.......................................................................... 45 2.3.2. Ladministration de siARN par voie systmique ................................................... 47 2.4. Contrles ngatifs et positifs ......................................................................................... 49 2.5. Limites et contraintes des expriences dARNi ............................................................ 50 3. Applications de la machinerie de lARN interfrence ......................................................... 54 3.1. Le cancer ....................................................................................................................... 55 3.1.1. Silencing des oncognes......................................................................................... 55 3.1.2. Silencing du VEGF ou de son rcepteur ................................................................ 81 3.1.3. Silencing des tlomerases....................................................................................... 89 3.1.4. Silencing de p53 (et protines associes) ............................................................... 96 3.2. Le VIH......................................................................................................................... 103 3.2.1. Gnralits............................................................................................................ 104 3.2.2. Silencer les gnes du VIH .................................................................................... 112 4. Matriel et mthodes .......................................................................................................... 152 4.1. Matriel et mthodes de la partie Historique .............................................................. 152 4.2. Matriel et mthodes de la partie Mcanisme ............................................................. 155 4.3. Matriel et mthodes de la partie Techniques de laboratoire...................................... 163 4.4. Matriel et mthodes de la partie Applications Cancer............................................... 174 4.5. Matriel et mthodes de la partie Applications du VIH.............................................. 196 Annexes.................................................................................................................................. 205 Fiche temps : .......................................................................................................................... 207 5. Bibliographie...................................................................................................................... 208 Liste des figures ................................................................................................................. 220 Conclusion.............................................................................................................................. 225 Rsum ................................................................................................................................... 226 Summary ................................................................................................................................ 226

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Liste des abrviationsARNdb : Acide RiboNuclique double brin ARNi : ARN interfrence ARNr : Acide RiboNuclique ribosomal CMH : Complexe Majeur dHistocompatibilit CMV : Cytomgalovirus CHS : Chalcone Synthase DC : cellule dendritique dbSin : double strand Sindbis EMSA : Electrophoresis Mobility Shift Assay FACS : Fluorescence Activated Cell Sorting FAM : carboxyfluorescein-5-succimidylester FISH : Fluorescent In Situ Hybridation FITC : Fluoresceine Iso Thio Cyanate Gag : Group-specific Antigen GAPDH : Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GST : glutathione S-transferase hTERT : human Telomerase Reverse Transcriptase LTR : Long Terminal Repeat MALDI-TOF : Matrix-Assisted Laser DesorptIonionization- Time-Of-Flight miARN : micro Acide RiboNuclique MMT : Mthylcyclopentadinyl tricarbonyle de manganse Nef : Negative Regulatory Factor PAZ : Piwi Argonaute Zwille PBMC : Cellules Mononuclaires du Sang Priphrique PBS : Phosphate Buffered Saline Pol : POL Polyprotein PEG : PolyEthylne Glycol PEI : PolyEthylenImine PLK1 : Polo-Like Kinase 1 RdRP : RNA-directed RNA polymerase Rev : Regulator of Virion RISC : RNA-induced silencing complex RRE : Rev Response Element Sa-gal : Senescence-Associated -galactosidase SARS : Severe Acute Respiratory Syndrome SEC : Cassette dExpression drive de SiARN shARN : short hairpin ARN siARN : Small Interfering ARN SIV : Simian Immunodeficiency Virus stARN : Small Temporal ARN Tat : Trans-Activator of Transcription TIV : Transcription In Vitro TSP1 : Thrombo-Spondine 1 UNAIDS : United Nations Programme on HIV and AIDS VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor Vif : Viral Infectivity Factor VIH : Virus de lImmunodficience Humaine Vpr : Viral Protein R Vpu : Viral Protein U 3

IntroductionLARN interfrence (ARNi) est un mcanisme naturel, qui a dabord t caractris chez les plantes dans les annes 1990. Il sagit dun processus qui consiste inhiber lexpression de gnes cibles. Il est conserv au cours de lvolution et cest ainsi quen 2001 un laboratoire la mis en vidence chez les mammifres. Ses principales caractristiques sont sa spcificit et son efficacit. Par consquent, il fait lobjet de nombreuses recherches, que ce soit sur le plan fondamental ou en recherche applique. Dailleurs, le journal Science a considr lARNi comme la meilleure russite scientifique en 2002, et l'une des 10 meilleures avances scientifiques de lanne 2003. Cest pourquoi nous avons choisi deffectuer notre projet de recherche sur ce domaine. Nous avions obtenu quelques informations gnrales sur ce sujet lors de nos prcdentes recherches sur les thrapies anti-cancreuses cibles. Nous nous tions alors rendus compte quil serait intressant dapprofondir nos connaissances sur cette technique. Ainsi, lARNi pourrait tre utilise comme outil thrapeutique pour toutes les maladies caractrises par une surexpression de protines ou lapparition de mutations aberrantes. Pour notre projet, nous avons ainsi choisi de dvelopper deux de ces pathologies, savoir le cancer et linfection par le virus de limmunodficience humaine (VIH). En effet, le cancer implique trs souvent des gnes muts induisant une croissance cellulaire incontrle. On pense alors utiliser lARNi pour identifier les gnes du cancer puis les inhiber. Dans le cas du VIH, on peut envisager dteindre lexpression de gnes viraux pour notamment empcher la rplication du virus. Il faut cependant noter que les chercheurs fondent leur espoir sur cette mthode pour combattre dautres types de pathologies telles que des maladies neurodgnratives, oculaires, infections virales En recherche fondamentale, il peut servir comprendre la fonction dun gne dans la cellule ou au sein dun organisme entier. Nous avons dcid de ne pas dvelopper ce point lors de notre tude. Nous nous sommes interrogs sur les points suivants : quel est le principe de ce phnomne ? Comment lutilise-t-on concrtement en laboratoire ? En quoi peut il offrir une avance dans le cadre de la recherche fondamentale et thrapeutique ? Et par ailleurs, quelles sont les limites rencontres ? Nous avons divis notre travail en quatre parties. Nous expliquons tout dabord le principe de lARNi, dans lequel nous prsentons un bref historique et le mcanisme de ce processus. Puis nous nous sommes intresss aux techniques de laboratoire permettant lutilisation de lARNi. Nous avons galement abord les limites de ces techniques. Puis, nous avons tudi deux applications possibles : le cancer et le VIH. Enfin, nous prsentons notre matriel et mthodes expliquant la manire dont nous avons collect nos informations et orient nos recherches.

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1. Principe de lARN interfrenceLe gnome subit des altrations qui, si elles ne sont pas rpares, peuvent provoquer des mutations, dltions ou translocations gniques ; cela modifie l'expression des gnes, et ainsi entre autres, des protines. Certaines de ces altrations aboutissent la synthse d'une protine anormale ou sa surexpression. Ces altrations peuvent tre lorigine de maladies, dont beaucoup de cancers. Les chercheurs ont donc tudi diffrents moyens dinhiber spcifiquement lexpression dune protine anormale. Diffrentes techniques ont t dveloppes depuis plusieurs annes, notamment des approches concernant lARN anti-sens. Les chercheurs ont rcemment dcouvert une nouvelle technique, fonde sur une inhibition naturelle de l'expression gnique : l'ARN interfrence (ARNi). L'ARNi a t conserv au long de lvolution chez les Eucaryotes. Il fait aujourdhui l'objet d'un intrt grandissant dans le monde de la biologie car il montre une grande efficacit dans linhibition gnique. Par ailleurs, le phnomne dARNi permet de comprendre la fonction des diffrents gnes dans les gnomes aujourdhui squencs en permettant linhibition de lactivit du gne do une disparition de sa fonction.

1.1. Historique de lARN interfrenceLe phnomne dARNi, depuis 1990, prend de plus en plus dimportance dans le monde de la biologie. Diffrentes tapes ont permis daboutir la dcouverte de ce mcanisme et sa comprhension. 1.1.1. Dcouverte fortuite du phnomne dARN interfrence La premire manifestation du phnomne dARNi fut observe par lquipe de Richard Jorgensen en 1990. Ce chercheur travaillait sur les mcanismes de coloration des ptunias et souhaitait intensifier la couleur des ptales. Pour cela, il introduisit dans lorganisme une copie du gne CHS (chalcone synthase), responsable de la coloration des fleurs. Contre toute attente, il observe que 42% des fleurs dans lesquelles le gne CHS a t introduit sont blanches (contre 9% des fleurs contrle) ou anormalement pales. [M1].

Fleur sauvage

Fleur obtenue introduction du gne

aprs Fleur obtenue introduction du gne

aprs

Figure 1 : Phnotypes de la plante sauvage et des plantes transgniques obtenues aprs introduction du gne CHS. On constate que les fleurs obtenues aprs introduction du transgne ont un phnotype diffrent du phnotype parental : 42% des fleurs sont blanches et dautres sont pales. [M1].

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Lanalyse des ARN isols partir des fleurs blanches et protgs contres des ARNases a montr que le taux dARNm produit par le gne tait fortement rduit par rapport au taux dARN des fleurs contrles.

Figure 2 : Profil dexpression de lARN de CHS introduit et celui de CHS endogne. La ligne 1 reprsente les poids molculaires des marqueurs. La ligne 2 est la sonde non digre. La ligne 3 est un contrle. Les lignes 4 9 contiennent les ARN protgs des ARNases et issus de corolles de taille variable. La ligne 10 est un contrle ngatif. Les flches indiquent les fragments dARN endognes (E) et introduits (I). [M1]

La copie de gne introduite a inhib la pigmentation. Cette quipe a montr que ce gne navait pas t altr (lors de lintroduction) en squencant sa rgion codante et en la comparant avec la squence du clone dADNc (ADN complmentaire) dont elle tait drive. Ils ne constatrent aucune diffrence. Il semblait donc que lintroduction du transgne CHS avait inhib lexpression du gne endogne. Ainsi, en ajoutant un gne codant pour une protine dont la synthse tait dj prise en charge par un gne endogne, la protine nest plus exprime (ou moins exprime). A lpoque, le phnomne fut appel co-suppression . Ce phnomne fut r observ bien plus tard dans le rgne animal par les tudes menes par le groupe dAndrew Fire chez le nmatode C. elegans. Identifi sous le nom de PTGS chez les plantes pour Post-Transcriptional Gene Silencing , ce mcanisme dextinction de lexpression dun gne par lintroduction dARN homologue, fut alors appel ARN interfrence . [M2, M6]. Lquipe dAndrew Fire a montr que lintroduction dARN dans des cellules pouvait interfrer avec la fonction dun gne endogne et rduire spcifiquement lexpression de protines. Ils ont en effet pu inhiber 96% des 2300 gnes (environ) du chromosome III de C. elegans et ont dtermin la fonction dun gne impliqu dans la migration du noyau lors de la division cellulaire. [M2]. Ce mcanisme dextinction gnique est donc conserv chez les plantes, le nmatode C. elegans et la drosophile. Il a volu partir dun mcanisme naturel de dfense antivirale. [M7,M8]

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Au premier abord, il semblait peu probable que le mcanisme de lARNi fonctionne chez les vertbrs. En effet, lintroduction dARN dans les cellules de mammifres dclenche une forte raction antivirale non spcifique, appele rponse interfron. Il y a induction de la synthse dinterfron de type I et activation de deux types denzymes : la protine PKR et la 2,5oligoadenylate synthtase. Lactivation de ces voies bloque la synthse des protines cellulaires et provoque une dgradation non spcifique des ARN messagers dans les cellules atteintes. Ceci a pour but de bloquer la rplication de particules virales et de protger les cellules voisines.[M5] Les premires notions ont merg des travaux des groupes de Carthew et de Sharp sur les extraits dembryons de drosophile. Ils ont mis en vidence que lextinction des gnes de faon squence-spcifique avait lieu au niveau post-transcriptionnel et que la dstabilisation de lARN messager cibl tait provoque par lassemblage dun complexe nuclasique au niveau de lARNm qui provoquait sa dgradation. [M4,M9]. 1.1.2 Dcouverte du phnomne chez les mammifres En 2001, un article sur lARNi parait dans Nature et entrane un vritable engouement scientifique. En effet dans celui-ci, Sayda M. Elbashir montre que le phnomne existe chez les mammifres. Au mme moment, elle explique sa dcouverte au congrs annuel de la RNA Society. Dans cet article, lquipe dmontre que de petits fragments dARN inhibent rapidement, facilement et spcifiquement les gnes des cellules humaines. Lquipe a mis en vidence que la nature de la rponse cellulaire tait contrle par la taille de lARN introduit. De ce fait, lintroduction directe dans les cellules de mammifres de courts oligonuclotides (de 21 23 bases) pouvait bloquer spcifiquement lexpression du gne cibl sans dclencher de rponse antivirale de type interfron [M3]. Cela fournit un nouvel outil chez les mammifres, tant dans la recherche fondamentale (comprhension des gnomes) que dans la recherche applique (le traitement de maladies encore incurables devient envisageable). Lquipe de Elbashir dmontre dans larticle que lARNi supprime spcifiquement lexpression des gnes endognes dans diffrentes lignes de cellules mammifres, y compris dans les cellules embryonnaires de rein humain et les cellules HeLa. [M3]. Les chercheurs effectuent des expriences semblables sur des cellules de mammifres et des cellules de drosophiles. Ils transfectent lARNi avec un plasmide contenant le gne de la lucifrase. Aprs vingt heures, ils observent une fluorescence. Les rsultats obtenus sur la drosophile sont conformes aux attentes de lquipe : ils observent une inhibition spcifique de lexpression de la protine de la lucifrase complte. Sur les cellules de mammifres, ils obtiennent, pour une expression du gne beaucoup plus forte, une suppression spcifique nettement moins importante mais non ngligeable de lexpression de la protine. Deux hypothses sont alors proposes : lexpression trs importante du gne empche une dgradation aussi quantitative que chez la drosophile ou laccessibilit limite du gne cible diminue le taux dARN dgrad. Lquipe effectue dautres recherches pour confirmer les rsultats obtenus et conclut que le phnomne dARNi fonctionne dans les types de cellules utilises mme si la dgradation ne se fait pas 100%.

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1.1.3 Situation actuelle Depuis les annes 1990, et particulirement depuis 2001, un grand nombre de chercheurs sintresse au phnomne de lARNi pour tenter de mieux comprendre le mcanisme. Cependant, certains points restent inexpliqus : on ne sait actuellement pas pourquoi lextinction de lexpression du gne nest que partielle. Depuis 2001, le phnomne prend aux yeux des chercheurs un caractre universel. [M6]. De nombreux laboratoires de biologie cellulaire, molculaire ou de gntique travaillent aujourdhui en utilisant le phnomne dARNi, notamment pour la comprhension de diffrents gnes. En effet, en effectuant une recherche RNAi sur PubMed, on obtient 5789 rponses (dont 630 revues) pour 9826 pour la recherche gene silencing . En considrant que lARNi est un moyen de silencer les gnes, on remarque ici que sur PubMed le nombre de documents sur lARNi reprsente plus de la moiti de celui sur le silencing des gnes. LARNi est aussi tudi dans le cadre de la mdecine et de laspect thrapeutique de maladies diverses : infections virales, cancers, maladies neurodgneratives Toutes ces pathologies restent aujourdhui sans traitements efficaces et ont souvent une origine inconnue. LARNi, qui est au stade exprimental du point de vue thrapeutique, constitue un vritable espoir dans le cadre des thrapies de ces pathologies. Ce nest quen 2004 que les premiers tests sur lhumain ont t effectus.

1.2. Mcanisme de lARNiDans ltat actuel des connaissances, le processus de lARNi consiste en deux tapes distinctes : La phase dinitiation : elle consiste en la production des petits ARN interfrents partir du brin dARN exogne. De faon intressante, ces ARN interfrents ne sont pas exprims de faon endogne chez les mammifres. La phase effectrice : elle met en jeu une activit nuclasique qui dtruit lARNm cibl en le coupant. Elle est commune tous les organismes. [G1 ;G5] 1.2.1. Mcanisme de la phase dinitiation Le phnomne de lARNi est initi par la reconnaissance de lARNdb par un complexe nuclasique. Ce complexe dcoupe cet ARNdb en petits fragments de 21 25 nuclotides avec des extrmits 3 symtriques comportant 2 nuclotides sortants. Grce aux tudes ralises sur la drosophile, on peut caractriser cette activit enzymatique capable de reconnatre et de dcouper lARNdb [G32]. Cette activit est assure par une ribonuclase de la famille de la RNase III appele Dicer [G7,G25]. 1.2.1.1. Enzyme Dicer Cette enzyme, trs conserve tant chez le nmatode C. elegans que chez les mammifres, est localise dans le cytoplasme, ce qui implique que lARNi est de faon prdominante, un processus cytoplasmique.[G25]. La protine Dicer possde : un domaine ARN hlicase dans sa rgion N-terminale, un domaine PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille), deux domaines ARNase III, 8

un motif de liaison lARNdb dans sa rgion C-terminale. [G10 ;G11].

Figure 3 : Structure de lenzyme Dicer. Elle possde un domaine hlicase, un domaine PAZ, deux domaines ARNase III et un motif de liaison lARNdb. [G26].

Ltude de la structure de lenzyme a permis de concevoir un fonctionnement en dimre antiparallle [G26]. Elle se divise en quatre sites actifs, dont les deux centraux seraient inactifs cause de lintroduction de rsidus dans le centre catalytique du deuxime domaine de Dicer. Lquipe de Bernstein a pu caractriser en 2001 lexistence de deux types de Dicer chez la drosophile. Des mutations sur le gne Dicer-1 empchent linhibition de la traduction de lARNm alors que des mutations sur Dicer-2 perturbent la dgradation des certains ARNm. Cependant chez les mammifres, un seul type de Dicer a t dcouvert. [G24]. De plus, on savait que Dicer-2 se liait une protine R2D2 (R2 car elle a deux sous-units et D2 pour Dicer-2), il a t rcemment dcouvert que R3D1 se fixe de la mme manire Dicer-1 [G14].

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Figure 4 : Deux voies de lARNi : par les siARN ou par les miARN. La voie de lARNi peut tre mdie par des siARN ( gauche) ; lenzyme dicer-2 sassocie R2D2. Ou bien la voie dARNi empreinte lutilisation des miARN ( droite) ; Dicer-1 lie cette fois-ci R3D1. [G14].

1.2.1.2. Fonction nuclasique de Dicer : formation des siARN La fonction principale de Dicer est de cliver lARNdb en petits fragments. Pour remplir cette fonction, Dicer doit reconnatre lARNdb et sy lier. Dicer semble tre localise dans le rticulum endoplasmique, du moins pour Dicer humaine, ce qui lui procure une augmentation de spcificit. Elle peut alors discriminer les ARNdb devant rendre silencieux des gnes, de ceux essentiels pour la traduction et pour dautres processus ARNdpendants. Une fois l ARNdb reconnu, Dicer na pas besoin de Mg+ pour sy fixer, en revanche ce cation est indispensable pour le clivage. De plus, ces ions stabilisent la dimrisation Dicer/ARNdb. Le clivage de lARNdb ne ncessite pas dATP chez les mammifres, mais pour la drosophile et les nmatodes, lATP se lie au domaine

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ATPase/hlicase de Dicer. Diffrentes hypothses sont proposes pour comprendre lintrt de lhydrolyse de lATP; elle pourrait permettre : le dplacement de Dicer le long de lARNdb et le droulement local du substrat ; le relargage du produit par lenzyme et pour son transfert la nuclase RISC (phase effectrice) ; un rarrangement structural de Dicer ncessaire pour la liaison et le clivage du substrat suivant. [G33]. Dicer se compose de deux domaines catalytiques, do un clivage des deux brins de lARN fix tous les 22 nuclotides dintervalle. Les modifications dans Dicer par rapport la squence consensus entranent une variation dans lespace entre les centres catalytiques, ce qui explique la variation spcifique dans la longueur des fragments produits. Ces fragments sont appels small interfering ARN (siARN). Dicer clive lARNdb prfrentiellement ses extrmits. Lefficacit du clivage dpend de la longueur de lARNdb. Dicer reste lie au produit de clivage, ce qui ralentit lactivit enzymatique. 1.2.1.3. Production des miARN : intervention de Drosha et Dicer Dicer est galement implique dans la production dune autre classe de petits ARN, appels micro ARN (miARN). [G23]. Du fait de leur petite taille, les miARN sont longtemps passs inaperus dans les processus classiques de purification dARN. Ils ont t identifis, il y a une dizaine dannes chez le ver C. elegans. Par la suite, ils ont t bien dcrits chez Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster et Homo. sapiens. De faon remarquable, certains miARN sont trs conservs au cours de lvolution, ce qui suggre une fonction biologique importante [G27]. La maturation des miARN fait intervenir au moins deux protines apparentes lARNaseIII : Dicer, comme dit prcdemment, et Drosha [G34]. Cette dernire appartient chez lHomme un gros complexe multiprotique contenant de nombreuses hlicases et protines du sarcome dEwing. Elle peut aussi tre associe DGCR8 (alias Pasha), une protine se liant aux ARNdb [G34]. Elle intervient dans le nucloplasme o elle convertit un transcrit primaire (pri-miARN) en un ARN ayant une forme dpingle cheveux denviron 70 nuclotides, on parle alors de pr-miARN. Ce dernier est pris en charge par Dicer qui faonne un intermdiaire de maturation transitoire nomm miARN:miARN*. Seul un brin formera le miARN mature, gnralement, celui dont lextrmit 5 est la moins apparie. Chez les plantes, les prcurseurs des miARN sont plus longs et ont une structure plus complexe. [G4].

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Figure 5 : Biosynthse des miARN. Drosha et Dicer sont deux enzymes intervenant dans la maturation du miARN. A partir dun ARN prcurseur en tige boucle imparfaite ces enzymes produisent un ARN simple brin denviron 21-23nuclotides [G8].

Il semblerait que dautres facteurs participent cette biosynthse, notamment lexportine 5 qui assure le transport du pr-miARN du noyau vers le cytoplasme. Depuis 2002, plusieurs groupes se sont focaliss sur lidentification des squences pouvant former des boucles et gnrer ces petits ARN de 21-23 nuclotides [G31]. Leurs efforts ont conduit lidentification denviron 250 miARN chez lHomme mais il est probable que ce nombre sera bientt largement dpass. Les premiers miARN dcouverts furent lin-4 et let-7, des small temporal ARN (st ARN) qui interviennent dans le contrle du dveloppement de lanimal. La molcule dARN lin-4 (lineage-abnormal-4) rgule ngativement les gnes du dveloppement lin-14 et lin-28. Plusieurs travaux suggrent quelle exerce une rpression post-transcriptionnelle en se fixant au niveau de squences homologues situes dans la rgion 3UTR des ARNm. Dune faon similaire, let-7 (lethal-7) est un rgulateur transcriptionnel ngatif qui cible les rgions 3 UTR du messager lin-41 [G35]. On peut citer dautres miARN comme par exemple isy qui cible cog (gne dterminant lasymtrie neuronale) chez C. elegans. Chez la drosophile miR-14, bantam et miR-2, entre autres, contrlent la prolifration et/ou la diffrenciation cellulaires en modulant lexpression de gnes pro apoptotiques tel que hid [G30 ; G37]. Chez les mammifres, certaines cibles restent inconnues, cest le cas de lARNm attaqu par miR-181[G36].

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Figure 6 : Exemples de miARN dont la fonction biologique et /ou les cibles ARNm sont caractrises [G15].

La phase dinitiation se termine en aboutissant la production de petits fragments, siARN ou miARN, grce la diversit de la ribonuclase Dicer et par lintervention de Drosha. 1.2.2. Mcanisme de la phase effectrice Le but de cette tape est daboutir linhibition de lexpression de gnes cibls. Les siARN ou miARN, aprs avoir t produits grce Dicer, vont par la suite guider le complexe effecteur endonuclasique RNA-Induced Silencing Complex (RISC) sur lARNm homologue dtruire. [G12] 1.2.2.1. Le complexe RISC Le complexe RISC a t identifi partir dembryons de drosophile sous la forme dun complexe prcurseur de 250 kD par le groupe de Zamore [G17]. Il se compose de plusieurs domaines : [G7 ;G16] une protine de la famille des Argonautes : Cette protine peut varier selon les espces. Nanmoins, la protine Ago2 est trs conserve entre les espces. Son homologue chez lHomme est le facteur dlongation eIF2C, initialement caractris par son association aux ribosomes et son rle dans la traduction des protines. La protine argonaute/eIF2 est basique et a un poids molculaire denviron 100 kD. [G3}. De plus, sa nature dans le complexe influence la fonction de RISC. En effet, dans les RISC sassociant aux siARN, on retrouve lArgonaute Ago1 alors que dans les RISC contenant les miARN on trouve Ago2. o le domaine PAZ sapparierait avec le domaine PAZ de Dicer grce au facteur R2D2 ou R3D1 ; cela permettrait alors de lier l'ARN simple brin [G7 ;G6] o le domaine Piwi en C-terminal une hlicase permettant de dissocier lARNdb. Celle-ci est ATP-dpendante. A lheure actuelle, on a montr quune hlicase (la Gemim3) coprcipitait avec efF2CD2 (composant argonaute de RISC humain).

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une protine dFXR ou FMRP (homologue chez l'homme) qui est une protine de retard mental d au X fragile. Elle appartient des complexes ribonucloprotiques et rgule l'expression de certains gnes. Cependant son rle prcis dans le phnomne de l'ARNi n'a pas encore t identifi. [G18]. 1.2.2.2. Activation de RISC Le complexe inactiv contient les siARN ou miARN sous leur forme double brin alors que la forme active de RISC contient les formes relaxes simple brin qui servent de guide pour la reconnaissance de la cible. Il faut donc tout dabord que RISC reconnaisse Dicer, et cela se fait grce son domaine Ago. Ensuite, lhlicase composant RISC permet la dissociation des deux brins ; cette tape ncessite de lATP. On obtient ainsi un complexe RISC activ qui va pouvoir aller attaquer lARN cible. [G19 ;G38].

Figure 7 : Mode dactivation du complexe RISC. Dicer (ici Dcr-2) et sa protine associe (ici R2D2) sont lis au siARN double brin. Le domaine Ago-2 du complexe RISC reconnat tout dabord Dicer puis R2D2. Ensuite, Ago-2 clive le brin bleu. On obtient alors la forme active de RISC en simple brin. Elle peut maintenant aller reconnatre lARNm cible. [G33].

Un complexe RISC de plus grande taille (500 kD) a t identifi dans les cellules S2 de drosophile, suggrant quin vivo dautres protines peuvent interagir et moduler lactivit de ce complexe. Cependant, la sous-unit catalytique du complexe RISC na pas encore t identifie [G33]. 1.2.2.3. Deux mcanismes daction : dgradation dARNm ou inhibition de la traduction Une fois activ, RISC est guid par lARNi vers lARNm auquel il se fixe. Une diffrence fondamentale entre les siARN et les miARN rside dans la force de la liaison du fragment

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lARNm cible. En effet, contrairement la liaison des siARN sur leur squence cible, la liaison du miARN est imparfaite et forme une zone de msappariement. Ceci a pour consquence daboutir deux mcanismes daction diffrents. Dans le cas des siARN, il y a destruction de lARNm ; le siARN est fix par RISC sur une rgion codante de lARNm cible. La fixation des miARN sur lARNm se fait de manire imparfaite sur une rgion 3 non codante, donc cela a pour consquence de bloquer la traduction du gne et dempcher la synthse de la protine correspondante.

Figure 8 : Comparaison des mcanismes daction des siARN et des miARN. Le siARN gnr par laction de lenzyme Dicer se lie, par lintermdiaire du complexe RISC, sur une rgion codante dun ARN messager. La parfaite complmentarit de squence entre le siARN et lARN messager provoque la dgradation de ce dernier. Le miARN est gnr partir dun prcurseur en forme dpingle cheveux par lenzyme Dicer. Il est reconnu par un complexe qui ressemble au complexe RISC. Celui-ci provoque la liaison du miARN au niveau des rgions 3 non codantes dun ARN messager. La liaison imparfaite du miARN au niveau du messager provoque son inhibition post-transcriptionnelle et empche la synthse de la protine correspondante. [G15].

Finalement, soit lappariement entre ARNm et siARN cre une rgion de lARNdb activant le systme de dfense naturel de la cellule contre les virus (prsentant frquemment des ARNdb). Cela peut donc prsenter galement un intrt pour lutter contre les virus. Lendonuclase de RISC clive alors lARNm. LARNm tant dtruit, la protine normalement code par cet ARN ne peut plus tre synthtise. Soit la molcule hybride ARNm/miARN associe au complexe RISC va engendrer linhibition de la traduction du gne. [G7]

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Figure 9 : Fonctionnement classique de la machinerie de lARN interfrence. LARN double brin est reconnu et cliv par Dicer en siARN et miARN. Ces petits ARN se lient ensuite RISC formant ainsi un complexe, activ par de lATP, qui se lie lARNm cible. [G7].

Il existe des similitudes importantes dans le mcanisme daction des siARN et des miARN. Ainsi, il est possible que lARNi soit la voie ancestrale visant contrler les pathognes qui aurait volu vers le mcanisme des miARN pour contrler les propres gnes de la cellule. Empcher la traduction de lARNm plutt que le dtruire pourrait tre un meilleur moyen den moduler lexpression. Ainsi la phase effectrice se termine. Quelque soit la mthode employe (siARN ou miARN), le rsultat final reste le mme : lexpression dune protine est inhibe. [G2]. 1.2.3. Etape damplification Linhibition de protine par le phnomne dARNi ne semble exiger quune trs faible quantit initiale dARNdb. On suppose donc quil y a une tape damplification dans le phnomne dARN interfrence RdRP (RNA-directed RNA polymerase) est une polymrase qui intervient dans le phnomne de transitivit de lARNi pour augmenter lefficacit dinterfrence de lARN. [G20]. Il a t dmontr que, chez C. elegans, lARNi implique la production de deux populations de siARN par lintervention de RdRP [G21]. Le premier groupe de siARN (siARN primaires) provient de lARNdb initialement inject et permet de rendre silencieuses des rgions dARNm particulires par complmentation de squence. La liaison siARN/ARNm cible induit le clivage de lARNm et produit alors une structure servant de signal RdRP pour initier la synthse de siARN secondaires. Ces siARN secondaires ont une squence et une structure rvlant leur formation par RdRP ; ce sont des ARN anti-sens de lARNm cliv. Ils sont synthtiss par RdRP partir de lextrmit 3OH du siARN primaire anti-sens servant damorce sur lARNm cible [G28 ;G29]. Le rsultat de cette raction est la formation dun nouvel ARNdb. Ce dernier est alors utilis comme substrat par Dicer. Ce modle dit de PCR dgnrative aboutit une amplification du signal siARN. Ces siARN secondaires correspondant aux rgions de transcrit en amont de la cible initiale peuvent aussi rendre silencieux les ARNm de squence complmentaire la leur, pour augmenter la rponse. On pense que les ARNdb primaires sont initialement reconnus de manire diffrente par rapport la reconnaissance des ARNdb secondaires, produits par

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RdRP. Lamplification exponentielle du nombre de siARN permet des rponses plus sensibles et plus slectives. [G4 ;G22].

Figure 10 : Amplification des siARN grce RdRP. Deux diffrentes voies impliques dans le phnomne dARNi. A partir du ARNdb inject, Dicer forme des siARN primaires. Ces fragments se lient ensuite RISC pour aller reconnatre lARNm cible. A partir de l, soit on empreinte la voie classique aboutissant la dgradation de lARNm, soit RdRP synthtise un nouveau brin qui sera par la suite cliv par Dicer, on obtient alors les siARN secondaire ; il y a une amplification du nombre de siARN dans la cellule. Et ensuite la boucle se referme [G7].

Labsence dhomologue de RdRP chez la Drosophile et les Mammifres suggre soit que dautres enzymes sont utilises pour lamplification, soit que le nombre de siARN primaires est suffisant pour produire une rponse efficace [G29]. On pense dans tous les cas que dautres mcanismes damplification interviennent pour le phnomne dARNi.

2. Techniques de laboratoireLutilisation du mcanisme dARN interfrence pour induire le silencing de gnes est une nouvelle mthode de laboratoire trs excitante permettant de crer des phnotypes de perte de fonction . Actuellement, lARNi est donc un puissant outil utilis pour comprendre la fonction des gnes. Elle est galement utilise dans un but thrapeutique. En effet, il semble que lARN interfrence constitue un outil de choix pour silencer lexpression de gnes surexprims dans diverses maladies. Dans cette partie, nous allons nous attacher dcrire les diffrentes techniques dont dispose concrtement le chercheur pour raliser des expriences dARN interfrence. Nous verrons donc que celles-ci peuvent se faire sur des cultures cellulaires (in cellulo), mais aussi, in 17

vivo, sur des animaux entiers. Une exprience dARNi se compose de plusieurs tapes successives. Pour chacune de ces tapes, plusieurs lments sont ncessaires : 1 2 3 4 Un ARN double brin (duplexe) spcifique qui cible le transcrit dun gne particulier pour induire le phnomne dARN interfrence Un systme dadministration efficace de lARN double brin Des tests pour suivre le processus dARN interfrence Des contrles appropris

2.1. L'ARNi sur cellules en cultureIl faut dj distinguer les expriences dARNi ralises sur les cellules non-mammifres de celles ralises sur les cellules mammifres. En effet, selon le type cellulaire tudi, les techniques employes pour mener bien lexprience ne seront pas les mmes. Chez les systmes non-mammifres comme Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster, on introduit dans la cellule de longs ARNdb (en gnral > 200pb) complmentaires de lARNm cible, pour induire le mcanisme dARNi. Une fois dans la cellule, la nuclase cytoplasmique Dicer clive les longs ARNdb en ARNdb de 21 23 nuclotides. Puis le processus naturel d'ARN interfrence se poursuit (RISC...) jusqu l'extinction de l'expression du gne cible. [N1] Dans les cultures de cellules mammifres, lARNi est induit par des siARN introduits directement dans la cellule. Ces siARN miment le produit gnr par Dicer lors de la phase initiatrice de lARNi naturelle. On nintroduit donc pas de longs ARNdb, car on s'est aperu que ces derniers pouvaient induire une rponse anti-virale dans la cellule mammifre. Les siARN pourront galement tre exprims sous forme de structure en tte dpingle , via une construction dADN. Les diffrents moyens d'administration des siARN sont dvelopps dans la partie qui suit.[N1] On voit donc que llment introduit diffre selon le type cellulaire (figure 11).

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Technique employe pour des cellules non mammifres

Technique employe pour des cellules mammifres

Figure 11 : Deux protocoles diffrents suivre pour raliser des expriences dARN interfrence sur cellules mammifres ou non-mammifres. En ce qui concerne les cellules non-mammifres, on introduit un ARNdb dans la cellule. Celui-ci va suivre le processus naturel de lARN interfrence, savoir dgradation par RISC en siARN puis association au complexe enzymatique RISC. Pour les cellules mammifres, on introduit dans la cellule directement un siARN. Une fois dans la cellule, celui-ci va se complexer RISC et le guider vers lARNm cible. Le but final est toujours la dgradation de lARNm par RISC. [N1].

2.1.1. Choix de la squence cible des siARN Quelle que soit la faon dont on va synthtiser les siARN, la premire tape dans le design de ces derniers est le choix de leur squence cible. Ce choix se fait en gnral, aprs consultation de la littrature actuelle dans le domaine tudi. On peut aussi se baser sur de observations empiriques. Des tudes ont dmontr que dans des cellules mammifres, lintroduction dARNdb de plus de 30 nuclotides active une rponse anti-virale de type interfron. Ceci conduit donc la dgradation non spcifique des ARNm et une rduction gnrale de la traduction protique au sein de la cellule. En consquence, on fabrique toujours des siARN de moins de 30 nuclotides de long. [N7]. La premire chose faire est de trouver une squence de 21 nuclotides dans lARNm cible, qui commence par un dinuclotide AA. En commenant par le codon initiateur de la transcription AUG, on cherche donc cette squence spcifique. Toutes les squences commenant par ce dinuclotide, et avec les 19 nuclotides suivants en 3 constituent donc un site cible potentiel pour les siARN. Cette stratgie concernant le choix de la cible des siARN est base sur les observations de lquipe de Elbashir. En effet, ils ont constat que les siARN avec un dbordement en 3, constitu dun dinuclotide UU, taient les plus puissants (plus puissants que les duplexes bouts francs). [N3, N18].

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Ceci est en accord avec le fait que la RNA polymrase III, lorsquelle synthtise les hairpin siARN naturels, arrte la transcription au niveau dune squence poly (T), ce qui cr une molcule dARN avec une petite queue poly(U). Si le dbordement contenant le dinuclotide terminal en 3 est diffrent, on observe quand mme un phnomne dARN interfrence. Il est cependant dconseill dutiliser des rsidus G dans cette rgion de dbordement, cause de la possibilit de clivage du siARN par les RNases au niveau des rsidus G simple brin. [N3] Il est galement fortement recommand de choisir 2 4 squence cible pour un gne. En effet, des recherches ralises par Ambion ou Dharmacon ont montr que plus de la moiti des siARN crs de manire alatoire induisent une diminution dau moins 50% du taux dARNm cible. Dautre part, on estime quenviron 1 siARN sur 4 provoquent une diminution de 75 95 % du niveau dexpression. Cependant, aucune relation entre la position du site cible sur lARNm, et la puissance de siARN na encore t tablie. [N1] Typiquement, on teste 4 squences de siARN, par ARNm cible. Il est prfrable despacer les squences du siARN sur la longueur du gne cible, pour rduire les chances de cibler une rgion de lARNm qui est fortement structure, ou lie des protines rgulatrices. Dailleurs, il existe une mthode pour cibler de manire efficace les squences dARNm. Cette mthode est base sur lobservation faite que les sites accessibles dun ARNm endognes peuvent tre cibls pour la dgradation par une RNase synthtique. Chaque site accessible identifi de cette manire est ensuite utilis comme insert dans la construction de notre choix. [N1] Une autre rgle importante est dviter les squences cible qui prsentent 16-17 paires de bases contigus similaires dautres squences codantes. En effet, des tudes ont permis de voir quon pouvait assister un silencing de gnes non-cibls contenant seulement 11 nuclotides contigus identiques au siARN. Ces rsultats dmontrent que les siARN ne peuvent tre utiliss que pour des cibles ne prsentant pas de trop fortes similarits avec dautres gnes. Cest ainsi que loutil BLAST pourra se rvler trs important, pour la comparaison de squences. Cet outil puissant est disponible sur le serveur du NCBI. Le but est dliminer les squences cible qui prsentent un trop fort taux de similarit avec dautre gnes. [N4]. En ce qui concerne les cellules non mammifres, les expriences d'ARN interfrence semblent tre assez simples. En effet, pour ces cellules, de longs ARNdb (en gnral > 200pb), complmentaires de l'ARNm cible sont utiliss pour induire le mcanisme d'ARNi. Le design de ces ARNdb est trs simple puisqu'en principe, n'importe quel long ARNdb complmentaire de l'ARNm cible sera efficace. Ces ARNdb peuvent tre gnrs par transcription in vitro. Les mthodes d'administration sont aussi trs simples. Ainsi, pour administrer un ARNdb dans une cellule S2 de Drosophila, celui-ci peut tre directement ajout dans le milieu de culture. Les ARNdb peuvent galement tre directement injects dans l'embryon de ver ou de mouche. [N1]. Nous allons donc plutt nous intresser aux expriences d'ARN interfrence ralises sur des cellules mammifres. Dans ce cas, on a alors recours des siARN. Dans la partie qui suit, nous allons dcrire les diffrents moyens d'obtenir ces siARN.

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2.1.2. Conception des siARN Il existe typiquement 5 mthodes pour gnrer les siARN. 1 2 3 4 5 synthse chimique transcription in vitro digestion in vitro dun long ARNdb par Dicer ou RNase II expression via un plasmide ou un vecteur viral expression via un produit de PCR (cassette)

Pour les 3 premires techniques, les siARN seront ensuite introduits directement dans les cellules mammifres par lipofection ou lectroporation Chacune de ces mthodes est adapte un type prcis dexpriences et un but en particulier. Chacune dentre elles a ses avantages et ses dfauts. Nous allons dcrire leurs applications possibles. [N1]. 2.1.2.1. La synthse chimique La synthse chimique est la mthode de prparation des siARN la plus utilise pour des expriences transitoires en culture cellulaire, car les siARN sont plus faciles transfecter que les plasmides. De plus, les siARN pr-designs et prts lemploi sont facilement disponibles. Elle apparat donc comme la mthode la plus rapide et facile pour les chercheurs. Elle reste cependant la mthode de gnration des siARN la plus chre. [N19] Des socits sont spcialises dans le design de siARN, cest le cas de la socit Ambion , qui est actuellement le leader sur la march, dans le dveloppement et la conception de produits utiliss en biologie molculaire. Ambion est partenaire de Cenix BioSciences, spcialistes dans le domaine de lARNi. La cration des siARN se fait alors par synthse chimique. La compagnie Cenix a dvelopp un algorithme qui permet daugmenter encore lefficacit des siARN, par rapport aux mthodes traditionnelles dcrites par Tuschl and al. En effet, aprs ralisation de nombreuses expriences dARNi, cette quipe de recherche a nonc un certain nombre de rgles respecter, qui permettent dobtenir une rduction denviron 50% dans lexpression des gnes cibls. Quelles sont ces rgles ? 1 Le siARN doit possder un dbordement UU en 3, que ce soit sur le brin sens, ou anti-sens 2 Le contenu en G/C doit tre denviron 50%. En effet, il semblerait que les siARN avec 30 50 % de contenu en GC soient plus actifs que ceux avec un contenu plus lev en rsidus GC. Un faible contenu en GC est donc corrl avec une augmentation de lefficacit de silencing. Il semblerait aussi que les siARN contenant un fort taux de rsidus GC au niveau de lextrmit 3 du brin anti-sens, et un faible taux, ct 5 soient plus efficaces. Ce principe est une des cls de lalgorithme [N18] Dautres caractristiques sont prises en compte lors de la conception des siARN : la temprature de fusion des domaines internes du siARN, la longueur du siARN, la position de la squence cible dans la rgion codante, et le contenu en nuclotides du dbordement 3. Ces diffrents paramtres sont pris en considration dans lalgorithme. [N19] Lun des principaux avantages de la synthse chimique est son rendement lev de siARN purifis. Ses inconvnients incluent un cot lev, et un temps de ralisation relativement

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long (4 12 jours). A cause du cot, beaucoup de chercheurs optent pour dautres mthodes de synthse comme la transcription in vitro, puis ont recours la synthse chimique, uniquement pour la squence la plus efficace. La synthse chimique est surtout utilise pour des tudes qui requirent de grandes quantits dune squence ultra pure de siARN. Elle nest pas recommande pour des tudes long terme. Depuis quelques annes, plusieurs algorithmes de design des siARN ont t conus. Leur but est daugmenter le taux de succs du silencing des gnes humains. La conception de tels algorithmes est base sur de grandes explorations statistiques et sur la ralisation de nombreuses expriences. Pour concevoir leur algorithme, les socits Ambion et Cnix ont test de multiples siARN ciblant des centaines de gnes humains exprims des niveaux dtectables dans diffrentes ligns cellulaires. Ltape cl de cet algorithme est lanalyse de chaque squence de siARN pour maximiser la spcificit du ciblage. [N1]. Dans une exprience de screening sur 79 gnes humains ralise par Ambion/Cenix, et base sur leur nouvel algorithme, on a pu observer que 94 % des siARN crs permettent dobtenir une rduction dau moins 70% des niveaux dARNm cibls (figure 12).

Figure 12 : Efficacit des siARN crs par Cenix. Les siARN ciblant 79 gnes humains (codant tous pour des kinases) ont t cres en utilisant lalgorithme dvelopp par la socit Cnix. Les siARN candidats pour chaque cible ont t prpars et transfects une concentration finale de 100mM. 48 heures aprs la transfection, lexpression des gnes cibles a t quantifie par une RT-PCR en temps rel. La diminution relative de lexpression des ARNm cible a t compare avec des cellules transfectes avec un siARN contrle ngatif (normalisation avec un ARNr 18S). On voit que 74 des 79 siARN, soit 94% des siARN tests donnent un taux de silencing suprieur 70%. [N1].

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Figure 13 : Efficacit de diffrents siARN valids et utiliss diffrentes concentrations. Les siARN indiqus ont t complexs avec un mlange lipidique (siPORT Lipid) et les complexes ont t administrs des cellules HeLa places dans des plaques 24 puits. Les concentrations finales de siARN utiliss sont indiques. 48 heures aprs la transfection, lARN des cellules traites a t rcupr, et reverse transcrit (RT). Les niveaux dADNc cible ont t mesurs par une PCR en temps rel. Lexpression des gnes cible dans les cellules transfectes a t compare celle observe dans des cellules transfectes avec une concentration gale de contrle ngatif. Les taux dADNc des diffrents chantillons ont t normaliss en utilisant lARNr de la sous-unit ribosomale 18S. [N1].

La figure 13 montre la puissance de 6 siARN diffrents conus grce lalgorithme de Cnix. Ces siARN sont aussi efficaces dans la rduction des niveaux dARNm cible 10, 30, ou 100mM. Il a t dmontr que mme de trs faibles quantits de siARN, de lordre du piccomolaire, sont capables dinduire une trs forte rponse dARNi. [N5]. Lutilisation de squences de siARN trs efficaces permet de diminuer les quantits de siARN utilises pour lexprience, ce qui rduit le cot des ractifs. Ceci va galement permettre dutiliser diffrents siARN dirigs contre diffrents gnes, dans une seule exprience. Mais ce qui est encore plus important, cest quen rduisant la concentration efficace de siARN utilise dans une exprience, on va pouvoir maximiser la spcificit des effets de lARN interfrence. Ceci na t dmontr que trs rcemment. De plus, il faut prciser que trop de siARN peut conduire une toxicit cellulaire et une mort de la cellule. [N1] Actuellement la socit Ambion fournit des siARN ciblant 98 % des gnes de lhomme, de la souris, et du rat (selon la base de donnes du NCBI), soit environ 35.000 gnes.[N1] 2.1.2.2. Transcription in vitro Le but est ici de synthtiser une paire complmentaire dARNm de 21 nuclotides, grce une RNA polymrase (en gnral T7) et un brin dADN. Chaque brin dARN est synthtis de manire spare. Les brins sont ensuite apparis pour former un duplexe. Les siARN produits par cette mthode sont considrablement moins chers que ceux synthtiss de manire chimique. De plus, ils peuvent tre obtenus beaucoup plus rapidement. Une fois que les deoxynuclotides ont t obtenus, il faut compter environ 24 heures pour raliser la raction de transcription in vitro. Ensuite, on passe ltape de 23

transfection des cellules. [N8, N19] Les inconvnients de cette mthode sont une possibilit de scale up limite (augmentation des quantits synthtises). Il faut cependant noter que chaque raction produit assez de siARN pour raliser des centaines de transfections. Un autre dsavantage est le fait que cette mthode demande plus de travail au chercheur, compar aux siARN synthtiss chimiquement qui peuvent tre achets dj prpars. Les siARN obtenus par transcription in vitro sont aussi efficaces que ceux synthtiss de manire chimique, et ceci de plus faibles concentrations (0,5-20nM vs.50-100nM). Cette mthode est choisie pour screener des squences de siARN ou quand le prix de la synthse chimique du siARN est un obstacle. Elle nest pas recommande pour des tudes long terme ou pour des tudes qui rclament de grandes quantits de siARN. [N1] Il est noter que la synthse chimique dARN ncessite ensuite (le plus souvent) une purification par un gel dlectrophorse non dnaturant ou par lectrophorse capillaire, ce qui va permettre de vrifier que les brins du siARN sapparient correctement. [N8, N19]. 2.1.2.3.Digestion de longs ARNdb pour crer un mlange de siARN Cette technique de production des siARN et celles qui vont suivre ncessitent le design et le test de plusieurs squences de siARN, afin didentifier la plus efficace. Cest le principal inconvnient de ces techniques. La prparation de mlanges de siARN permet de surmonter ce dsavantage. Dans cette mthode, de longs ARNdb sont prpars par transcription in vitro dune rgion de 200 1.000 nuclotides de lARNm cible. Ces ARNdb sont ensuite digrs in vitro par une RNase III (ou Dicer), pour produire une population htrogne de siARN. Puisque ce mlange contient diffrents siARN, lefficacit du knock-down est quasiment assure (figure 14).

Figure 14 : Exprience de silencing du gne Ku-70. Une population de siARN ciblant 200 nuclotides de lARNm de KU-70 ont t prpars (grce la RNase III) puis ont t transfects dans des cellules HeLa, une concentration finale de 100nM. Les cellules ont t analyses 48 heures aprs la transfection par immunofluorescence. On constate une rduction des niveaux de Ku-70 de 86% dans les cellules transfectes par le mlange de siARN, compar au contrle (cellules non transfectes). [N1].

Le principal avantage de cette approche (mlange de siARN) est la possibilit dviter les tapes de tests qui visent dterminer les squences de siARN les plus efficaces. Ceci permet en retour de faire gagner aux chercheurs du temps et de largent. On peut noter

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dailleurs que les ractions la RNase III sont en gnral moins chres que celle ralises avec Dicer. Pourtant un des points ngatifs de cette approche est la possibilit dobserver des silencing non spcifiques, particulirement au niveau de gnes troitement similaires. Cette stratgie est le plus souvent utilise pour des analyses rapides et peu coteuses de phnotypes de perte de fonction . Elle nest pas recommande pour des tudes long terme, ou pour des tudes qui requirent une seule squence de siARN bien dfinie. A ce jour, cette stratgie marche trs bien dans les lignes cellulaires de type NIH-3T3, HeLa, S3, 293, BJ, et pour inhiber lexpression de nombreux gnes, tels que c-fos, GAPDH, La, actin, ou encore Ku-70. [N1] Une fois que les siARN ont t obtenus par ces mthodes de prparation in vitro (synthse chimique, transcription in vitro, ou digestion de longs ARNdb), ils doivent tre dlivrs aux cellules. Pour les cellules primaires, en suspension, ou pour les lignes cellulaires difficiles transfecter, on aura plutt recours llectroporation. Sous certaines conditions de tampon, cette technique se rvle tre une mthode dadministration des siARN trs efficace. En gnral, on utilise des tampons doux, qui ne compromettent pas la viabilit de la cellule. D'autre part, il faudra le plus souvent avoir recours des tapes de purification de ces siARN obtenus in vitro. Celle-ci va nous permettre de sassurer de la taille et de la puret des siARN, avant quils ne soient transfects. Pour un plus grand niveau de puret, il est recommand dutiliser des filtres de liaison et dlution en fibres de verre, ou bien des gels de purification en utilisant 15 20% dacrylamide, afin dliminer les nuclotides en excs, les protines et les sels de la raction.. On pourra galement raliser des dprotections, suivies de colonnes de purification. Ces mthodes garantissent un taux de purification de 80%. LHPLC et le PAGE garantissent, eux, une purification 97. [N19] On peut galement avoir recours 2 mthodes dadministration compltement diffrentes, savoir les vecteurs dexpression, ou bien les cassettes dexpression. Lutilisation de vecteurs dexpression de siARN, ou de cassettes dexpression drives de produit PCR, repose sur une transcription in vitro de siARN puis une introduction dans les cellules. Lun des avantages de ces mthodes est quon ne travaille pas directement avec de lARN. Les squences de siARN exprimes par ces mthodes ne doivent pas contenir de squence comportant 4-5 A ou T, qui agirait comme un site de terminaison pour la polymrase III. 2.1.2.4. Vecteurs dexpression des siARN Pour induire le mcanisme dARN interfrence, on peut donc avoir recours des vecteurs dexpression siARN. Ils permettent des tudes de knock-down long terme. Il y a diffrents critres respecter concernant les inserts codant pour lexpression des siARN. La plupart des designs possdent 2 squences rptes, inverses lune par rapport lautre, et spares par une courte squence spacer . Ils se terminent par une queue polyT, qui sert de site de terminaison de la transcription. Ces designs vont produire un ARN qui va se replier, et adopter une conformation en forme de petite pingle cheveux (figure 15). [N9].

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Figure 15 : Schma dun Small Hairpin RNA produit par un vecteur dexpression siARN. Ce schma illustre la relation qui existe entre shRNA et squence de lARN cible. La cible correspond une squence de 19 nuclotides avec un dinuclotide AA lextrmit 5. Le siARN en forme de tte dpingle qui va tre exprim dans la cellule aprs transfection se compose dun brin sens et dun brin anti-sens, dpars par une squence spacer dont la taille est variable. [N1].

La longueur des squences rptes inverses qui vont reprsenter la tige de lhairpin, la longueur et la composition de la squence spacer qui reprsente la boucle de l hairpin, et la prsence ou non du dbordement 5 varient beaucoup dune exprience dARNi lautre. Des expriences ont t ralises en utilisant une longueur de tige de 19 29 nuclotides. Ces siARN avec des longueurs de tiges variables fonctionnent tous aussi bien dans les tudes de silencing des gnes. La longueur et la squence de la boucle liant les squences sens et anti-sens du siARN peuvent varier. Les tudes ont montr des rsultats de silencing significatifs pour des siARN possdant des boucles de 3 23 nuclotides. [N9, N10] La figure 16 reprsente les boucles qui se sont rvles efficaces lors dexpriences dARN interfrence. Ces boucles varient tant dans leur longueur que dans leur composition.

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Figure 16 : Tableau qui rpertorie les diffrentes longueurs et squences de boucles efficaces. On voit que ces boucles peuvent avoir une taille allant de 3 23 nuclotides. On nobserve pas de vritable squence consensus, puisque les squences sont trs diffrentes dune boucle lautre. Toutes ces boucles se sont rvles efficaces dans des expriences dARN interfrence. [N1].

Les clonages traditionnels se font laide du vecteur pSilencer. La plupart des vecteurs dexpression des siARN possdent un promoteur RNA polymrase III (pol III) pour diriger lexpression des small hairpin RNA dans les cellules mammifres. Deux promoteurs de type ARN polymrase III ont t caractriss, U6 et H1 et sont utiliss dans les vecteurs dexpression des siARN. [N7] On peut se demander pourquoi ce type de promoteur est plus utilis que les autres. Cela vient du fait quils expriment naturellement une trs grande quantit de smallRNA dans les cellules mammifres et quils terminent la transcription en incorporant une queue de 3 6 rsidus Uridine. Ceci est important puisque nous avons vu que pour tre le plus efficaces possibles, les siARN doivent possder un dbordement en 3. Ces 2 types de promoteurs sont trs diffrents. Le promoteur U6 fait plusieurs centaines de paires de bases de longueur, tandis que H1 nexcde pas les 100 pb. La quantit et la localisation des siARN dont lexpression est contrle par ces 2 promoteurs varient dun type cellulaire lautre. En effets, des tudes de localisation ont montr que diffrents promoteurs RNA Pol III gnrent des smallRNA qui sont retrouvs dans diffrentes rgions de la cellule. Lexpression et la localisation des siARN affectant sans doute le succs des tudes dARNi dans les cellules mammifres, il est donc important de tester les siARN sous le contrle de ces 2 promoteurs. [N19]

La figure 17 reprsente un exemple de vecteur dexpression qui est trs utilis dans les expriences dARN interfrence. Il sagit du vecteur pSilencer 1.0-U6

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Figure 17 : Vecteur dexpression de siARN de type pSilencer. On voit que ce plasmide contient un promoteur pol III de type U6, un gne de rsistance lampicilline, lorigine de rplication dE.coli. Il contient aussi de 1 3 marqueurs de slection antibiotiques (gnes de rsistance la nomycine, la puromycine, ou lhygromycine). [N1].

Ce type de vecteur plasmidique a t dvelopp par Sui et al. lcole mdicale de Harvard et a t utilis avec succs pour le knock-down de lexpression de cdk-2 et des lamines A/C dans les cellules HeLa, H1299, U-2 OS et C-33A [N7] En gnral, les vecteurs sont linariss grce 2 enzymes de restriction diffrentes pour permettre un clonage directionnel. Deux oligodoxynuclotides ADN complmentaires reprsentant la squence du shRNA sont crs pour linsertion dans le vecteur (clonage). On les utilise alors pour transformer E.coli. Les vecteurs linariss sont purifis pour liminer les vecteurs stant referm sans insert. Une fois que le plasmide a t dlivr aux cellules, on observe normalement une expression des siARN. A cause de ltape de clonage, la procdure peut prendre plusieurs jours. De plus, un squenage de la rgion contenant linsert reste ncessaire. Cependant, ces limitations sont contrebalances par la possibilit de produire de trs grandes quantits de vecteurs, une fois quon a vrifi que le vecteur tait effectivement efficace dans les expriences de silencing gniques (figure 18).

Figure 18 : Insert cr pour le vecteur pSilencer 1.0-U6. Linsert est cr de manire spcifique pour chaque vecteur. Il contient les dbordements 3 et 5 appropris pour un clonage correct dans le vecteur (complmentaires des sites de restriction du vecteur). La squence et la longueur de la boucle peuvent tre trs variables et peuvent tre ajustes souhait. [N1].

La squence sens et anti-sens du siARN sont relis par une squence spacer qui peu tre variable dune exprience dARN interfrence lautre. Voici un exemple de spacer de 9 nuclotides qui est souvent utilis : TTCAAGAGA Cinq ou six T sont ajouts en 3, la fin de loligonuclotide. De plus, pour le clonage dans

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le vecteur pSilencer 1.0-U6 par exemple, il faut aussi ajouter un dbordement de nuclotides complmentaires des sites de restriction EcoR I et Apa I en 5 et 3 de loligonuclotide. On sattend alors ce que lARN rsultant se replie et adopte la structure en tige et boucle espre : 19 pb pour la tige et 9 nuclotides pour la boucle, et 3 4 U lextrmit 3.

Le clonage dans le vecteur pSilencer adeno 1.0-CMV (vecteur viral) est comparable celui vu prcdemment. On note cependant une exception : labsence des 5-6 T lextrmit 3 de loligonuclotide. Ceci sexplique par le fait que dans les systmes vectoriels bass sur le CMV, le signal de terminaison de la transcription est apport pat le terminateur polyA SV40. De plus, pour le clonage dans le vecteur pSilencer adeno 1.0-CMV, il faut ajouter, en 5 et en 3 de loligonuclotide, les dbordements de nuclotides contenant les sites de restriction Xho I et Spe I (figure19). [N10; N7; N11]

Figure 19 : Insert cr pour le vecteur pSilencer adeno 1.0-CMV. Linsert est constitu de la squence sens, de la boucle spacer, puis de la squence anti-sens complmentaire de la squence sens. Aux extrmits 5 et 3 figurent les dbordements qui vont permettre un clonage directionnel dans le vecteur pSilencer adeno 1.0 - CMV, cest--dire complmentaire des sites de restriction Xho I et Spe I. [N1].

Via les vecteurs dexpression des siARN, on va donc exprimer long terme des shARN (en forme de tte dpingle) dans les cellules transfectes. Ces shARN sont dabord exprims dans le noyau de la cellule, puis sont transports vers le cytoplasme. Puis, on suit le processus naturel du mcanisme dARN interfrence. La nuclase cytoplasmique Dicer va cliver le shARN en siARN de 21 23 nuclotides (figure 20). Les siARN sont ensuite dirigs vers le complexe protique RISC. Puis les brins du siARN guident le complexe RISC vers lARNm complmentaire. RISC dgrade alors la molcule dARNm cible. [N1]

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Figure 20 : Mcanisme qui se droule dans la cellule suite lexpression de siARN via un vecteur dexpression. Les vecteurs dexpression permettent une expression maintenue des shARN lintrieur de la cellule. Ces shARN sont dabord exprims dans le noyau cellulaire, puis transloquent vers le cytoplasme. Dans le cytoplasme, laction de Dicer va conduire la formation de siARN. [N1].

Sans doute lun des principaux avantages des vecteurs dexpression des siARN est quils sont parfaits pour des tudes long terme. Des vecteurs avec des marqueurs de rsistance un antibiotique peuvent tre utiliss pour rduire lexpression des gnes cible pendant plusieurs semaines (pression de slection). Une slection transitoire des cellules transfectes grce des marqueurs spcifiques permet lenrichissement des cellules qui ont bien intgr le plasmide. Ceci permet de compenser la faible efficacit de transfection pour les cellules difficiles transfecter. Rcemment, plusieurs groupes ont commenc prparer des adnovirus, des rtrovirus, et dautres types de vecteurs viraux pour lexpression des siARN. Cest en revanche une mthode qui nest pas adapte au screening des squences de siARN les plus efficaces. Ce screening serait possible, mais demanderait beaucoup de temps et un travail intensif. [N10] Il faut noter que la faible efficacit d'administration est l'une des principales raisons qui font qu'une exprience d'ARNi choue ou donne des rsultats de faux ngatifs. C'est ainsi qu'ont t dvelopps des agents qui augmentent l'efficacit de transfection. On a en gnral le choix entre 2 mthodes : la transfection medie par des lipides (lipofection) ou bien llectroporation. Le choix entre ces 2 mthodes se fait en fonction du type cellulaire utilis et des caractristiques de lacide nuclique transfect. Pour la majorit des cellules immortalises et des cellules adhrentes, on utilisera des agents de transfection de type lipidique. Il sagit de mlanges de polyamines (siPORT Amine) ou bien de mlanges de lipides cationiques et neutres (siPORT Lipid). Ces deux agents prsentent des efficacits de transfection diffrentes en fonction du type cellulaire utilis, mais permettent tous les deux lintroduction de siARN dans une grande varit de lignes cellulaires. Il est essentiel dutiliser des agents crs pour dlivrer des petits RNA (la plupart des

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agents disposition sur le march ont t crs pour la transfection de grands plasmides dADN et pas pour des petites molcules dARN). Certains agents sont spcifiques dune ligne cellulaire (ex : cellules eucaryotes dun certain type), tandis que dautres ont un spectre daction beaucoup plus large. Loptimisation des conditions est ncessaire, pour augmenter lefficacit et la reproductibilit de la transfection [N1, N10] 3.12.5. Cassette dexpression des siARN drives de PCR (SECs) Il est vrai que construire et tester 4 plasmides dexpression de siARN par cible demande beaucoup de temps. Cest pour cela quil est peut tre prfrable de screener les squences potentielles des siARN en utilisant des cassettes dexpression des siARN drives de PCR. Les SECs (siRNA Expression Cassettes) sont des produits de PCR qui incluent un promoteur et une squence de terminaison, encadrant une squence de siARN. Les SECs, caractriss comme rprimant lexpression des gnes de faon efficace, pourront tre clons dans des vecteurs pour des tudes long terme. [N1]. Les SECs ont t dcrites pour la premire fois par Castanotto et al. Elles doivent contenir un promoteur RNA pol III (H1 ou U6), une squence codant le shRNA, et un site de terminaison de la RNA pol III. Contrairement aux vecteurs dexpression des siARN qui requirent un clonage et un squenage avant lutilisation (ce qui peut prendre 1 2 semaines), les SECs peuvent tre gnres par PCR en moins dun jour. Pour prparer par PCR une SEC, il faut crer 1 ou 2 oligonuclotides dADN, reprsentant la squence du siARN. Ces oligonuclotides sont utiliss comme primers dans une ou plusieurs PCR. Ils contiennent un promoteur. Le produit rsultant de la PCR est purifi sur colonne. En gnral, on utilise comme la squence pour la boucle la squence suivante : 5 U U U G U G U A G 3

Comme pour les inserts crs pour les vecteurs, une squence terminatrice de 5-6 T est ajoute, pour agir comme un terminateur de lARN polymrase III. Pour un clonage correct, les sites de restriction Eco RI et Hind III sont ajouts dans le primer. Pour cloner cette cassette dexpression du siARN dans un vecteur, il faut que le vecteur aussi possde les sites de restriction Eco RI et Hind III. Lincorporation de sites de restriction lextrmit de la cassette est indispensable pour un sous clonage dans un vecteur plasmidique ou viral. On cr ainsi vecteur dexpression de siARN. Les vecteurs linariss contenant les gnes de rsistance la nomycine, lhygromycine, et la puromycine, sont appels des vecteurs pSEC. Ces gnes de rsistance permettent une slection des cellules mammifres. Une cassette dexpression des shARN est gnralement construite pour contenir la squence sens de la cible, suivie dune espaceur, puis de la squence anti-sens de la cible. Mais il a t dmontr que linversion de lordre des squences sens et anti-sens de la cible lintrieur de la construction dexpression du siARN ne changeait pas lactivit de silencing du siARN. [N1]. Les SECs constituent donc un excellent outil de screening, pour trouver les squences de siARN les plus efficaces, ou pour identifier les combinaisons de promoteurs et de si RNA qui apportent le meilleur rendement dans une ligne cellulaire donne. En fait, les SECs apportent le complment parfait des vecteurs dexpression des siARN.

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Un des inconvnients des SECS est quelles ne sont pas aussi facilement transfectes dans les cellules que les siARN. Etant donn que de nouveaux agents de transfection et de nouveaux protocoles ont t dvelopps, lefficacit de transfection des SECs devrait augmenter. Parce quelles sont gnres par PCR, les SECs ne permettent pas de scale up, sans clonage dans des vecteurs. On peut ainsi raliser des expriences dans lesquelles les SECs contiennent chacune un promoteur diffrent. On teste ainsi la capacit de ces diffrents promoteurs induire lexpression des siARN, et donc induire un knock-down de lexpression dun gne particulier (figure 21).

Figure 21 : Rduction diffrentielle dans lexpression du gne cible, en utilisant des SECs avec diffrents promoteurs. Les cassettes dexpression de siARN contenant les promoteurs Mo-U6 de souris, Hu-U6 humain, ou Hu-H1 humain et codant le shRNA spcifique de c-Fos ont t transfectes dans des cellules HeLa. 72 heures aprs la transfection, les cellules ont t analyses, en utilisant un agent de coloration du noyau, le DAPI, et une immunofluorescence a t ralise avec un anticorps dirig contre c-Fos. Les cellules non transfectes (NT), ainsi que les cellules transfectes avec une SEC exprimant un siARN contrle ngatif (scramble) montrent les niveaux naturels (sauvages) de c-Fos. La diminution relative dexpression gnique a t quantifie. Ces taux relatifs de c-Fos sont reprsents sur le graphe en barres. [N1].

Pour ces techniques d'introduction dans les cellules via des vecteurs ou des cassettes d'expression, on aura aussi recours des tapes de purification. En effet, tous les oligonuclotides dARN sont contrls par spectromtrie de masse de type 32

MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser DesorptIonionization- Time-Of-Flight). Il parat important de prciser quelques de rgles de base qui permettent de conduire au mieux les tapes de design et de conception des siARN dune exprience dARNi : 1 Eviter les RNases. En effet, ne serait-ce que des traces de ribonuclases peuvent saboter une exprience de siARN. Puisque les RNases sont prsentes partout dans lenvironnement du laboratoire, sur notre peau, dans lair, sur tout ce qui est touch par des mains nues, ou sur tout ce qui est en contact avec lair, il est important de prendre des prcautions pour prvenir et liminer la contamination par les RNases. 2 Maintenir des cultures cellulaires saines et des protocoles stricts pour une bonne reproductibilit de transfection. Sachant que lefficacit de transfection diminue avec le temps, il est recommand de na pas dpasser les 50 expriences de transfection sur une mme ligne cellulaire. Ceci permet doptimiser au maximum le rendement des expriences et dassurer une stabilit maximale des cultures cellulaires dune exprience lautre. [N1] [Annexe 1].

2.2. Visualisation du phnomne dARNiIl existe diffrentes mthodes pour vrifier si lexprience dARNi a effectivement march. Nous allons en dvelopper deux : limmunofluorescence et la RT-PCR. 2.2.1. Immunofluorescence Pour amliorer la comprhension du mtabolisme des siARN, des mthodes de visualisation des siARN dans la cellule sont dveloppes. Les tiquettes fluorescentes sont couramment utilises pour suivre le mouvement de petites molcules dans la cellule ou entre les cellules. Cependant, les siARN interagissent avec des lments cellulaires et lon ne savait pas si laddition de groupements volumineux naffecterait pas ngativement la capacit des siARN induire le silencing des gnes. Certaines socits telles Ambion ont prpar des siARN tiquets avec de la fluorescence et les ont compar avec des siARN non tiquets. Ces siARN tiquets sont toujours fonctionnels et on peut suivre leur dplacement aprs transfection. Des siARN doublement tiquets ont t utiliss pour suivre la sparation des brins de siARN dans les cellules intactes. [N1]. 2.2.1.1. Les siARN tiquets restent fonctionnels Deux tiquettes couramment utilises, Cy3 et FAM ont t couples des siARN et on a valu leur implication dans le silencing. Les cellules ont t transfectes avec un siARN au niveau de la rgion 3' UTR de c-myc et qui tait soit non tiquet, soit tiquet avec Cy3 seul, soit avec une double tiquette Cy3 (sur le brin antisens)-FAM (sur le brin sens). Des siARN synthtiss chimiquement ont t tiquets en utilisant un kit Silencer Cy3 et FAM siARN de Ambion. 5 g de siARN c-myc synthtiss chimiquement et des contrles ont t tiquets en utilisant 7,5 l dagent marqu. Aprs marquage, les brins ont t purifis, resuspendus et hybrids avant la transfection. Kimura et al. ont montr quune down-rgulation de c-myc pouvait provoquer une diminution de la prolifration cellulaire. La capacit des siARN, tiquets ou non, modifier le taux de prolifration cellulaire a t value dans des cellules HeLa S3. La croissance des cellules transfectes avec les siARN c-myc tiquets ou non a t rduite un niveau quivalent compar au contrle (scrambled) (Figure 22B). Pour confirmer que cette diminution de la prolifration tait due au silencing de c-myc, on a tudi lexpression

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de la protine 48h aprs la transfection en utilisant la microscopie fluorescence (Figure 22A). Les rsultats montrent que les siARN tiquets ou non sont tous deux capables de rduire lexpression de la protine, alors que les cellules transfectes avec les siARN contrles ne montrent pas de silencing. [C2]

Figure 22 : Les siARN tiquets sont fonctionnels. Un siARN c-myc anti 3' UTR a t tiquet avec Cy3 et FAM sur un ou deux brins. Puis, les siARN ont t transfcts dans des cellules HeLa S3. 48h aprs la transfection, les cellules ont t analyses pour tudier lexpression de la protine c-myc et ce en utilisant la technique dimmunofluorescence. La protine c-myc apparat en vert. 72h aprs la transfection, les cellules qui ont t transfectes avec des siARN contenant 1,2 ou aucune tiquette ont t dnombres grce un hmocytomtre. Le nombre de cellules a t calcul par rapport une population cellulaire non traite. [N1].

Pour tendre ces observations dautres gnes, on a test des siARN associs GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) ou la -actine (Figure 23). Ces siARN sont efficaces pour le silencing de gnes. Les siARN synthtiques ou transcrits in vitro sont capables de silencing, que ltiquette soit sur le brin sens et/ou antisens, et tiquets avec Cy3 ou FAM. Il ny a pas deffet cytotoxique associ la fluorescence. [N1]

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Figure 23 : Silencing de lexpression du gne GAPDH. Les siARN GAPDH et un contrle ont t tiquets avec Cy3, puis transfects dans des cellules HeLa S3, et analyss par microscopie fluorescence avec un anticorps anti-GAPDH. Rouge: siARN-Cy3. Bleu : DAPI; Vert: Anticorps anti-GAPDH. A. Silencing de lexpression de GAPDH dans les cellules HeLa S3. B. Le siARN contrle na pas deffet sur le taux de protines GAPDH. [N1].

2.2.1.2. Les siARN fluorescents peuvent tre suivis dans la cellule. Les siARN c-myc-FAM fluorescents ont t gnrs en tiquetant le brin dARN sens avec FAM et le brin antisens avec Cy3. Les siARN Cy3-FAM ont t transfects dans des cellules et visualiss laide de la microscopie fluorescence pour dterminer leur localisation subcellulaire. 48h aprs la transfection, les siARN taient localiss dans le cytoplasme prs de la membrane nuclaire (Figure 24). [N1].

Figure 24 : Sparation des brins du siARN. A. Les siARN c-myc-FAM ont ltiquette FAM sur le brin sens et ltiquette c-myc sur le brin anti-sens. 48h aprs la transfection, les cellules HeLa S3 ont t fixes et analyses en utilisant un microscope fluorescence Olympus. Les deux vues reprsentent diffrentes magnifications. Les flches pointent les foyers vert et rouge (brins sens et antisens individuels). B. Les siARN ont t tiquets sur le brin sens avec Blackhole et sur le brin sens avec c-myc, puis ont t transfects dans des cellules HeLa. 4, 24 et 48h aprs la transfection, les cellules HeLa S3 ont t fixes et analyses en utilisant un microscope fluorescence Olympus. [N1].

Dans les cellules en division, la fluorescence est concentre sur la ligne de division, suggrant que les siARN doivent tre diviss galement entre les cellules filles. Parmi la majorit des siARN-Cy3 antisens (en rouge) et siARN-FAM sens (en vert), on 35

trouve des siARN (en jaune) dans le cytoplasme prs de la membrane nuclaire et de faibles signaux vert et rouge ont aussi t observs (Figure 25). Les signaux rouges et verts isols sont le rsultat de la fluorescence de brins de siARN individuels. Pour confirmer ces observations, la technique du FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) a t utilise pour valuer les siARN dans les cellules transfectes. Dans cette exprience, le brin sens de c-myc a t tiquet avec Blackhole quencher (IDT) et hybrid avec le brin antisens complmentaire de cy3. Dans la forme double brin, le signal Cy3 est teint par Blackhole et on nobserve presque aucun signal. Le siARN teint est transfect dans des cellules et la fluorescence est observe 4, 24, 48 et 72h aprs la transfection. Comme dcrit prcdemment, une faible quantit de fluorescence est dtecte 4h, ce qui est peut-tre d une extinction incomplte de Cy3. Plus tard, une augmentation significative du signal est dtecte (Figure 25B), ce qui montre que les siARN sens et antisens sont spars dans les cellules mammifres intactes. [N1]

Figure 25 : Distribution In Vivo de siARN. Panel A. Les siARN-Cy3 ont t transfects dans des cellules HeLa poussant sur des boites en utilisant un transporteur cationique lipidique tiquet avec NBD. A lheure indique, les chantillons ont t analyss en utilisant la microscopie fluorescence pour la distribution relative des siARN (en rouge) et des lipides (en vert). Les siARN taient localiss dans des rgions proches de la membrane nuclaire aprs la libration par le transporteur lipidique ; Panel B. Les cellules HeLa S3 ayant pouss sur des boites ont t transfects avec des siARN anti c-myc tiquets avec FAM sur le brin sens ou Cy3 sur le brin antisens. 48h aprs transfection, les cellules sont traites et analyses par un microscope confocal Leica. Les flches montrent des brins sens (en rouge) et antisens (en vert) individuels. [N1].

La localisation des siARN transfects soulve la question de savoir si les siARN sont concentrs dans des vsicules lipidiques drives de la transfection dun transporteur. Pour rpondre cette question, des transfections ont t ralises, utilisant un transporteur lipidique tiquet NBD (en vert) pour transfecter un siARN-Cy3 (en rouge). Nous avons examin la distribution des fluorescences rouge et vert divers endroits sur une priode de 72h aprs transfection. 4h seulement aprs la transfection, une petite quantit de siARN libr par des vsicules lipidiques est dtecte alors que la majorit des lipides et des siARN sont co-localiss dans les foyers cellulaires. 24 et 48h aprs la transfection, on observe une plus grande quantit de siARN libr (Figure 25). La protine est tout dabord dtecte 4h aprs la transfection, puis on observe une suppression de lexpression de la protine 24h et le maximum de la suppression de lexpression est observ 48h aprs la transfection (Figure 26). La priode o le silencing est le plus important au niveau de taux de dARNm et de protine correspond la libration maximale de siARN de la vsicule

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lipidique et la sparation maximale des brins. (Exprience non montre). [C3]

Figure 26 : Induction et Dure de lARNi provoqu par les siARN. A. Les cellules HeLa S3 sont transfectes avec des siARN au niveau du 3' UTR de GAPDH. Aprs 4h, 24h, 3, 6, 10 et 12 jours aprs la transfection, les cellules sont rcoltes et analyses par Northern blot pour les taux dARNm de GAPDH et dARNr de 28S. B. Graph de Northern du Panel A montrant les taux relatifs dARNm de GAPDH C. Les cellules HeLa S3 ayant pouss sur cover slips sont transfectes avec des siARN au niveau du 3' UTR de GAPDH. Aprs 4h, 24h, 3, 6, 10 et 12 jours aprs la transfection, les cellules sont rcoltes et lexpression de la protine GAPDH est analyse en utilisant limmunofluorescence. Le DAPI (bleu) cible le noyau; un anticorps anti-GAPDH (en vert) se lie la protine exprime. [N1].

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Figure 27 : Distribution des siARN dans les cellules HeLa S3 en division. Les cellules HeLa S3 ayant pouss sur cover slips ont t transfectes avec des siARN-Cy3 (en rouge) et analyses par immunofluorescence. Les cellules en division qui contiennent des siARN sont dtectes en observant la condensation des chromosomes et les sparations et reformations nuclaires. LADN est analys en utilisant le DAPI. Dans tous les cas de division cellulaire, les siARN sont localises dans la rgion centrale de la cellule. [N1].

Les cellules HeLa S3 ont t transfectes avec siARN dirigs contre GAPDH pour examiner linduction et la dure du silencing. GAPDH a rduit les taux dARNm et de protines. On peut supposer que les siARN ont t transmis aux cellules filles. Si ce ntait pas le cas, le pourcentage de cellules contenant des siARN serait rduit en seulement 2 ou 3 jours. La technique dimmunofluorescence a montr que les siARN taient principalement localises dans les cellules en division (Figure 27) et sont transmis aux cellules filles (Figure 28). [N1].

Figure 28 : siARN associs aux noyaux des cellules en division. Les cellules HeLa S3 ayant pouss sur cover slips ont t transfectes avec des siARN -FAM GAPDH. Les cellules on t rcoltes et fixes en utilisant 4% de Paraformaldehyde 48h aprs la transfection. Les cellules ont t examines en utilisant les fluorescences appropries. Les siARN (en vert) peuvent tre associs chaque noyau (en bleu) dune cellule en division. [N1].

Les siARN tiquets entrent effectivement dans la voie de lARNi et sont capables de silencing, ce qui permet de suivre lARNi dans les cellules et de dresser des conclusions sur son mode daction. [N1].

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2.2.1.3. Localisation Les ARNdb sont accumuls dans le cytoplasme prs du noyau. 4h aprs la transfection, la majorit des siARN est concentre dans des vsicules lipidiques. 48h aprs, les siARN sont localiss dans le cytoplasme proximit de la membrane nuclaire (Figure 25). Cette localisation pourrait reprsenter des sites de traitement des siARN ou les sites de rsidence de RISC. Dautres recherches ont suggr que les longs ARNdb dgradaient lARN mature. On ne sait pas si les siARN des cellules de Mammifres peuvent agir de la mme faon. Mais laccumulation de siARN dans le cytoplasme corrobore ce protocole. Une autre explication possible de la localisation prinuclaire est que les siARN sont groups an niveau des pores nuclaires o ils peuvent dtecter lARN qui doit tre transport dans le cytoplasme via les pores nuclaires. Quand une squence complmentaire est dtecte, les siARN vont la cibler pour cliver lARN ce qui conduit au silencing du gne. [N1] Bien que la dissociation des brins de siARN soit dtecte dans la cellule, on retrouve que la majorit des siARN transfects reste sous forme double-brin. On peut supposer que limportance de la sparation des brins est proportionnelle la quantit de siARN ncessaire pour le clivage direct dun gne. [C3]. 2.2.1.4. Dure Les expriences prsentes suggrent que les siARN sont maintenus dans les cultures pendant 10 jours puis quils sont transfrs dans des cellules filles. Dans ce cas, et sil ny a pas amplification des siARN dans les cellules de Mammifres, alors la dure des effets des siARN devrait tre directement proportionnelle la concentration des siARN dans la cellules et au nombre de divisions cellulaires qui ont lieu. Ainsi, une variable exprimentale majeure serait lefficacit de linjection de siARN dans la cellule et donc de la concentration initiale de siARN. Dans le cas o un siARN est transfect avec une faible efficacit, les siARN tiquets peuvent tre utiliss pour identifier individuellement les cellules qui ont effectivement reu le siARN. [N1] 2.2.2.RT-PCR La RT-PCR quantitative est une des techniques les plus utilises pour quantifier les changements dexpression gnique parmi des chantillons. Il existe diffrents kits pour analyser les chantillons par RT-PCR. En travaillant sur des chantillons cellulaires ou tissulaires, il faut extraire lARN, traiter lchantillon pour liminer de lADN gnomique contaminant, puis inactiver la DNAse I avec une protinase K. Si seul un petit nombre de cellules est disponible, le risque de perdre certains chantillons dARN est possible. On peut mesurer le silencing directement dans les lysats cellulaires, sans avoir besoin dextraire lARN. [N1] 2.2.2.1. Transcription reverse sans isoler lARN Lisolation de lARN est ltape la plus laborieuse et la plus longue de lanalyse de lARN, surtout quand plusieurs chantillons doivent tre analyss. On peut utiliser des kits qui ne ncessitent pas disoler lARN, ce qui permet danalyser de nombreux chantillons. La procdure est simple. Les cellules sont lyses, et traites avec la DNase I. La synthse de dADNc est produite directement partir du lysat cellulaire. [N1]

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2.2.2.2. Evaluation du silencing induit par les siARN La disparition des ARNm endognes peut tre dtecte directement par RT-PCR. La technique de RT-PCR est ralise laide dune enzyme spcifique : la Taq polymrase. Dans les kits, on la trouve en gnral 5L Il faut galement disposer de primers : ce sont en gnral des T7-Oligo (dT)24 ou bien des dcamres alatoires, une concentration de 100ng/L. Le choix du primer se fera en fonction de la cible, afin de maximiser le rendement de lamplification des ARNm. Enfin, il faut aussi avoir recours des dNTP (10mM) qui vont permettre la synthse. La raction de RT-PCR va permettre damplifier des ARN cible spcifiques, partir de mlanges complexes. La premire tape de rversetranscription est ralise laide dune Reverse Transcriptase. En gnral, on utilise le Molony-Murine Leukemia Virus (M-MLV) comme enzyme. Elle va allonger le primer (oligo dT), qui est appari avec le brin dARNm contenant le message dintrt. Cette enzyme a une trs grande stabilit et une trs faible activit RNase intrinsque. Cest pour cela quelle est en gnral prfre dautres enzymes comme lAMV rverse transcriptase. Pour raliser la PCR et amplifier la squence cible, on aura recours une paire de primers spcifiques. On peut disposer de diffrents types de kits qui proposent de raliser sparment la raction de RT et celle de PCR, ou bien de combiner les deux. [N1] Des contrles positifs sont raliss, laide de primers qui permettent lamplification de gnes conservs et exprims de faon constitutive (ex : gne de la protine ribosomale S15). Pour dmontrer lutilisation de cellules Cells-to-cDNA II-96 Automated Kit pour mesurer le knockdown de lexpression des gnes induits par les siARN, les chercheurs dAmbion ont ralis des tudes utilisant des cellules HeLa transfectes avec des siARN synthtiss chimiquement dirigs contre cdc-2, GAPDH et la survivine. 3000 cellules HeLa cellules taient dposes dans des plaques de 96 puits et incubes 37C. Les cellules taient transfectes avec 100 nM de chaque siARN ou avec un siARN contrle, et incubes 37C pendant 48h. Les cellules sont ensuite laves, lyses et traites la DNAse. On a utilis 5 l de lysat, et effectu la RT-PCR avec des sondes Taq. Une sonde pour lARNr18S a t utilise pour normaliser les donnes pour chaque exprience (ralises 8 fois) La figure 29 montre que le silencing peut tre dtect directement par la RT-PCR.

Figure 29 : Utilisation de cellules (Cells-to-cDNA II-96 Automated Kit) et de RT-PCR pour mesurer le silencing. Les cellules HeLa ont t transfectes avec des chantillons contrle (rouge) et des siARN spcifiques de cdc-2, GAPDH et de la survivine (bleu). Le signal de lARNr 18S a t mesur dans les cellules transfectes avec les siARN contrle (vert) et les siARN spcifiques (noir). [N1].

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Figure 30 : Cells-to-Signal Procedure. Aprs une lyse cellulaire de 5 min, les lysats peuvent tre directement utiliss pour la RT-PCR, aussi longtemps que les primers hybrident les liaisons exon-exon. Une rverse transcriptase est incluse pour contrler lamplification potentielle de squences gnomiques. La spcificit de squence de la Taq permet une ou deux tapes de RT-PCR, alors que la dtection avecS