Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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PROTOCOLES EXAO LOGICIEL ATELIER SCIENTIFIQUE POUR LES SVT CONSOLE ESAO VISIO

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PROTOCOLES EXAO

LOGICIEL ATELIER SCIENTIFIQUE POUR LES SVT

CONSOLE ESAO VISIO

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SOMMAIRE

PAGE 3 LA PHOTOSYNTHESE (module geacuteneacuteraliste) PAGE 14 MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME

CELLULAIRE DES LEVURES (module geacuteneacuteraliste)

PAGE 26 LA REACTION DE HILL (module geacuteneacuteraliste) PAGE 41 ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR

OXYMETRIE ndash LA GLUCOSE OXYDASE (module geacuteneacuteraliste) PAGE 60 ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE (module geacuteneacuteraliste) PAGE 66 ETUDE DU METABOLISME HUMAIN (module deacutedieacute) PAGE 71 LA SONDE O2 ndash MODE DrsquoEMPLOI PAGE 77 LA SONDE CO2 ndash MODE DrsquoEMPLOI

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LA PHOTOSYNTHESE Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Mise en eacutevidence des eacutechanges gazeux chez la plante en preacutesence et en absence de lumiegravere Montrer que les veacutegeacutetaux chlorophylliens utilisent lrsquoeacutenergie lumineuse ainsi que le CO2 pour transformer la matiegravere mineacuterale en matiegravere organique CO2 + H2O Lumiegravere gt (CH2O) + O2 avec CH2O = glucides

Lrsquointensiteacute photosyntheacutetique est mise en eacutevidence par la mesure de la concentration en O2 et en CO2 du milieu ici la cuve du bioreacuteacteur II qui donnera par calcul la consommationproduction de ces gaz au cours des phases sombres et phases claires de lrsquoexpeacuterimentation On alternera phase sombre (respiration) et phase claire (photosynthegravese) en ouvrant ou fermant les volets du bioreacuteacteur Cette expeacuterimentation se fait dans lrsquoeau Mode opeacuteratoire

Dureacutee de preacuteparation 20 min Dureacutee de reacutealisation en classe 30 min

22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree

21 Protocole expeacuterimental

a) Preacuteparation du mateacuteriel biologique On utilisera de preacutefeacuterence de la Cabomba vigoureuse que lrsquoon aura pris soin de placer quelques jours avant dans un aquarium sous un eacuteclairage important On peut eacutegalement utiliser du Ceacuteratophylle ou encore des Elodeacutees (attention la varieacuteteacute sauvage preacuteleveacutee en milieu naturel en hiver sera en eacutetat de vie ralentie et ne permettra pas une mise en eacutevidence nette de la photosynthegravesehellip) Un morceau de plante (environ deux laquo feuilles raquo) sera neacutecessaire pour chaque poste expeacuterimental

2 feuilles

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b) Montage expeacuterimental - Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur lrsquoadaptateur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

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- Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

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22 Reacutealisation de lexpeacuterience

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 23 avec de lrsquoeau agrave tempeacuterature ambiante attention agrave ne pas utiliser drsquoeau distilleacutee les plantes ont besoin de mineacuteraux Prendre de lrsquoeau de lrsquoaquarium dans lequel les plantes sont maintenues ou de lrsquoeau du robinet qursquoon aura laisseacute agrave tempeacuterature ambiante

b) Couper des fragments de Cabomba en petits morceaux de 2-3 mm et les deacuteposer dans la cuve du bioreacuteacteur

c) Placer les sondes par les emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur en eacutevitant lrsquoemplacement sous lequel se trouve lrsquoagitateur

NB La sonde O2 et CO2 ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

d) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet e) Fermer les volets du bioreacuteacteur f) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

NB On peut ajouter un thermomegravetre et un luxmegravetre afin de veacuterifier que la tempeacuterature est bien resteacutee constante La mesure de la lumiegravere permet de repeacuterer les peacuteriodes deacuteclairement ou dobscuriteacute

Acquisition

Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 3 agrave 4 minutes agrave lrsquoobscuriteacute Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur et la diriger vers la fenecirctre du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer le changement de condition de lumiegravere

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave la lumiegravere puis refermer les volets

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir agrave nouveau les volets

Multiplier les alternances lumiegravere obscuriteacute Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir modifier les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe CO2 et puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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23 Exemple de reacutesultats attendus

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 2: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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SOMMAIRE

PAGE 3 LA PHOTOSYNTHESE (module geacuteneacuteraliste) PAGE 14 MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME

CELLULAIRE DES LEVURES (module geacuteneacuteraliste)

PAGE 26 LA REACTION DE HILL (module geacuteneacuteraliste) PAGE 41 ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR

OXYMETRIE ndash LA GLUCOSE OXYDASE (module geacuteneacuteraliste) PAGE 60 ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE (module geacuteneacuteraliste) PAGE 66 ETUDE DU METABOLISME HUMAIN (module deacutedieacute) PAGE 71 LA SONDE O2 ndash MODE DrsquoEMPLOI PAGE 77 LA SONDE CO2 ndash MODE DrsquoEMPLOI

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LA PHOTOSYNTHESE Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Mise en eacutevidence des eacutechanges gazeux chez la plante en preacutesence et en absence de lumiegravere Montrer que les veacutegeacutetaux chlorophylliens utilisent lrsquoeacutenergie lumineuse ainsi que le CO2 pour transformer la matiegravere mineacuterale en matiegravere organique CO2 + H2O Lumiegravere gt (CH2O) + O2 avec CH2O = glucides

Lrsquointensiteacute photosyntheacutetique est mise en eacutevidence par la mesure de la concentration en O2 et en CO2 du milieu ici la cuve du bioreacuteacteur II qui donnera par calcul la consommationproduction de ces gaz au cours des phases sombres et phases claires de lrsquoexpeacuterimentation On alternera phase sombre (respiration) et phase claire (photosynthegravese) en ouvrant ou fermant les volets du bioreacuteacteur Cette expeacuterimentation se fait dans lrsquoeau Mode opeacuteratoire

Dureacutee de preacuteparation 20 min Dureacutee de reacutealisation en classe 30 min

22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree

21 Protocole expeacuterimental

a) Preacuteparation du mateacuteriel biologique On utilisera de preacutefeacuterence de la Cabomba vigoureuse que lrsquoon aura pris soin de placer quelques jours avant dans un aquarium sous un eacuteclairage important On peut eacutegalement utiliser du Ceacuteratophylle ou encore des Elodeacutees (attention la varieacuteteacute sauvage preacuteleveacutee en milieu naturel en hiver sera en eacutetat de vie ralentie et ne permettra pas une mise en eacutevidence nette de la photosynthegravesehellip) Un morceau de plante (environ deux laquo feuilles raquo) sera neacutecessaire pour chaque poste expeacuterimental

2 feuilles

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b) Montage expeacuterimental - Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur lrsquoadaptateur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

1

2 3

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22 Reacutealisation de lexpeacuterience

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 23 avec de lrsquoeau agrave tempeacuterature ambiante attention agrave ne pas utiliser drsquoeau distilleacutee les plantes ont besoin de mineacuteraux Prendre de lrsquoeau de lrsquoaquarium dans lequel les plantes sont maintenues ou de lrsquoeau du robinet qursquoon aura laisseacute agrave tempeacuterature ambiante

b) Couper des fragments de Cabomba en petits morceaux de 2-3 mm et les deacuteposer dans la cuve du bioreacuteacteur

c) Placer les sondes par les emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur en eacutevitant lrsquoemplacement sous lequel se trouve lrsquoagitateur

NB La sonde O2 et CO2 ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

d) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet e) Fermer les volets du bioreacuteacteur f) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

NB On peut ajouter un thermomegravetre et un luxmegravetre afin de veacuterifier que la tempeacuterature est bien resteacutee constante La mesure de la lumiegravere permet de repeacuterer les peacuteriodes deacuteclairement ou dobscuriteacute

Acquisition

Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 3 agrave 4 minutes agrave lrsquoobscuriteacute Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur et la diriger vers la fenecirctre du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer le changement de condition de lumiegravere

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave la lumiegravere puis refermer les volets

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir agrave nouveau les volets

Multiplier les alternances lumiegravere obscuriteacute Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir modifier les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe CO2 et puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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23 Exemple de reacutesultats attendus

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 3: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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LA PHOTOSYNTHESE Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Mise en eacutevidence des eacutechanges gazeux chez la plante en preacutesence et en absence de lumiegravere Montrer que les veacutegeacutetaux chlorophylliens utilisent lrsquoeacutenergie lumineuse ainsi que le CO2 pour transformer la matiegravere mineacuterale en matiegravere organique CO2 + H2O Lumiegravere gt (CH2O) + O2 avec CH2O = glucides

Lrsquointensiteacute photosyntheacutetique est mise en eacutevidence par la mesure de la concentration en O2 et en CO2 du milieu ici la cuve du bioreacuteacteur II qui donnera par calcul la consommationproduction de ces gaz au cours des phases sombres et phases claires de lrsquoexpeacuterimentation On alternera phase sombre (respiration) et phase claire (photosynthegravese) en ouvrant ou fermant les volets du bioreacuteacteur Cette expeacuterimentation se fait dans lrsquoeau Mode opeacuteratoire

Dureacutee de preacuteparation 20 min Dureacutee de reacutealisation en classe 30 min

22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree

21 Protocole expeacuterimental

a) Preacuteparation du mateacuteriel biologique On utilisera de preacutefeacuterence de la Cabomba vigoureuse que lrsquoon aura pris soin de placer quelques jours avant dans un aquarium sous un eacuteclairage important On peut eacutegalement utiliser du Ceacuteratophylle ou encore des Elodeacutees (attention la varieacuteteacute sauvage preacuteleveacutee en milieu naturel en hiver sera en eacutetat de vie ralentie et ne permettra pas une mise en eacutevidence nette de la photosynthegravesehellip) Un morceau de plante (environ deux laquo feuilles raquo) sera neacutecessaire pour chaque poste expeacuterimental

2 feuilles

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b) Montage expeacuterimental - Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur lrsquoadaptateur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

1

2 3

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22 Reacutealisation de lexpeacuterience

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 23 avec de lrsquoeau agrave tempeacuterature ambiante attention agrave ne pas utiliser drsquoeau distilleacutee les plantes ont besoin de mineacuteraux Prendre de lrsquoeau de lrsquoaquarium dans lequel les plantes sont maintenues ou de lrsquoeau du robinet qursquoon aura laisseacute agrave tempeacuterature ambiante

b) Couper des fragments de Cabomba en petits morceaux de 2-3 mm et les deacuteposer dans la cuve du bioreacuteacteur

c) Placer les sondes par les emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur en eacutevitant lrsquoemplacement sous lequel se trouve lrsquoagitateur

NB La sonde O2 et CO2 ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

d) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet e) Fermer les volets du bioreacuteacteur f) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

NB On peut ajouter un thermomegravetre et un luxmegravetre afin de veacuterifier que la tempeacuterature est bien resteacutee constante La mesure de la lumiegravere permet de repeacuterer les peacuteriodes deacuteclairement ou dobscuriteacute

Acquisition

Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 3 agrave 4 minutes agrave lrsquoobscuriteacute Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur et la diriger vers la fenecirctre du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer le changement de condition de lumiegravere

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave la lumiegravere puis refermer les volets

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir agrave nouveau les volets

Multiplier les alternances lumiegravere obscuriteacute Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir modifier les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe CO2 et puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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23 Exemple de reacutesultats attendus

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 19 sur 85

- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 20 sur 85

- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

Page 21 sur 85

44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 4: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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b) Montage expeacuterimental - Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur lrsquoadaptateur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

1

2 3

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22 Reacutealisation de lexpeacuterience

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 23 avec de lrsquoeau agrave tempeacuterature ambiante attention agrave ne pas utiliser drsquoeau distilleacutee les plantes ont besoin de mineacuteraux Prendre de lrsquoeau de lrsquoaquarium dans lequel les plantes sont maintenues ou de lrsquoeau du robinet qursquoon aura laisseacute agrave tempeacuterature ambiante

b) Couper des fragments de Cabomba en petits morceaux de 2-3 mm et les deacuteposer dans la cuve du bioreacuteacteur

c) Placer les sondes par les emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur en eacutevitant lrsquoemplacement sous lequel se trouve lrsquoagitateur

NB La sonde O2 et CO2 ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

d) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet e) Fermer les volets du bioreacuteacteur f) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

NB On peut ajouter un thermomegravetre et un luxmegravetre afin de veacuterifier que la tempeacuterature est bien resteacutee constante La mesure de la lumiegravere permet de repeacuterer les peacuteriodes deacuteclairement ou dobscuriteacute

Acquisition

Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 3 agrave 4 minutes agrave lrsquoobscuriteacute Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur et la diriger vers la fenecirctre du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer le changement de condition de lumiegravere

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave la lumiegravere puis refermer les volets

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir agrave nouveau les volets

Multiplier les alternances lumiegravere obscuriteacute Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir modifier les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe CO2 et puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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23 Exemple de reacutesultats attendus

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 5: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

1

2 3

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22 Reacutealisation de lexpeacuterience

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 23 avec de lrsquoeau agrave tempeacuterature ambiante attention agrave ne pas utiliser drsquoeau distilleacutee les plantes ont besoin de mineacuteraux Prendre de lrsquoeau de lrsquoaquarium dans lequel les plantes sont maintenues ou de lrsquoeau du robinet qursquoon aura laisseacute agrave tempeacuterature ambiante

b) Couper des fragments de Cabomba en petits morceaux de 2-3 mm et les deacuteposer dans la cuve du bioreacuteacteur

c) Placer les sondes par les emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur en eacutevitant lrsquoemplacement sous lequel se trouve lrsquoagitateur

NB La sonde O2 et CO2 ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

d) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet e) Fermer les volets du bioreacuteacteur f) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

NB On peut ajouter un thermomegravetre et un luxmegravetre afin de veacuterifier que la tempeacuterature est bien resteacutee constante La mesure de la lumiegravere permet de repeacuterer les peacuteriodes deacuteclairement ou dobscuriteacute

Acquisition

Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 3 agrave 4 minutes agrave lrsquoobscuriteacute Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur et la diriger vers la fenecirctre du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer le changement de condition de lumiegravere

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave la lumiegravere puis refermer les volets

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir agrave nouveau les volets

Multiplier les alternances lumiegravere obscuriteacute Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir modifier les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe CO2 et puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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23 Exemple de reacutesultats attendus

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 19 sur 85

- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

Page 21 sur 85

44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 6: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- De mecircme positionner lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 9 sur 85

- Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

1

2 3

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22 Reacutealisation de lexpeacuterience

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 23 avec de lrsquoeau agrave tempeacuterature ambiante attention agrave ne pas utiliser drsquoeau distilleacutee les plantes ont besoin de mineacuteraux Prendre de lrsquoeau de lrsquoaquarium dans lequel les plantes sont maintenues ou de lrsquoeau du robinet qursquoon aura laisseacute agrave tempeacuterature ambiante

b) Couper des fragments de Cabomba en petits morceaux de 2-3 mm et les deacuteposer dans la cuve du bioreacuteacteur

c) Placer les sondes par les emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur en eacutevitant lrsquoemplacement sous lequel se trouve lrsquoagitateur

NB La sonde O2 et CO2 ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

d) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet e) Fermer les volets du bioreacuteacteur f) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

NB On peut ajouter un thermomegravetre et un luxmegravetre afin de veacuterifier que la tempeacuterature est bien resteacutee constante La mesure de la lumiegravere permet de repeacuterer les peacuteriodes deacuteclairement ou dobscuriteacute

Acquisition

Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 3 agrave 4 minutes agrave lrsquoobscuriteacute Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur et la diriger vers la fenecirctre du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer le changement de condition de lumiegravere

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave la lumiegravere puis refermer les volets

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir agrave nouveau les volets

Multiplier les alternances lumiegravere obscuriteacute Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir modifier les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe CO2 et puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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23 Exemple de reacutesultats attendus

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 7: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

1

2 3

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22 Reacutealisation de lexpeacuterience

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 23 avec de lrsquoeau agrave tempeacuterature ambiante attention agrave ne pas utiliser drsquoeau distilleacutee les plantes ont besoin de mineacuteraux Prendre de lrsquoeau de lrsquoaquarium dans lequel les plantes sont maintenues ou de lrsquoeau du robinet qursquoon aura laisseacute agrave tempeacuterature ambiante

b) Couper des fragments de Cabomba en petits morceaux de 2-3 mm et les deacuteposer dans la cuve du bioreacuteacteur

c) Placer les sondes par les emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur en eacutevitant lrsquoemplacement sous lequel se trouve lrsquoagitateur

NB La sonde O2 et CO2 ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

d) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet e) Fermer les volets du bioreacuteacteur f) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

NB On peut ajouter un thermomegravetre et un luxmegravetre afin de veacuterifier que la tempeacuterature est bien resteacutee constante La mesure de la lumiegravere permet de repeacuterer les peacuteriodes deacuteclairement ou dobscuriteacute

Acquisition

Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 3 agrave 4 minutes agrave lrsquoobscuriteacute Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur et la diriger vers la fenecirctre du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer le changement de condition de lumiegravere

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave la lumiegravere puis refermer les volets

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir agrave nouveau les volets

Multiplier les alternances lumiegravere obscuriteacute Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir modifier les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe CO2 et puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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23 Exemple de reacutesultats attendus

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 19 sur 85

- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 8: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

1

2 3

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22 Reacutealisation de lexpeacuterience

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 23 avec de lrsquoeau agrave tempeacuterature ambiante attention agrave ne pas utiliser drsquoeau distilleacutee les plantes ont besoin de mineacuteraux Prendre de lrsquoeau de lrsquoaquarium dans lequel les plantes sont maintenues ou de lrsquoeau du robinet qursquoon aura laisseacute agrave tempeacuterature ambiante

b) Couper des fragments de Cabomba en petits morceaux de 2-3 mm et les deacuteposer dans la cuve du bioreacuteacteur

c) Placer les sondes par les emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur en eacutevitant lrsquoemplacement sous lequel se trouve lrsquoagitateur

NB La sonde O2 et CO2 ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

d) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet e) Fermer les volets du bioreacuteacteur f) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

NB On peut ajouter un thermomegravetre et un luxmegravetre afin de veacuterifier que la tempeacuterature est bien resteacutee constante La mesure de la lumiegravere permet de repeacuterer les peacuteriodes deacuteclairement ou dobscuriteacute

Acquisition

Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 3 agrave 4 minutes agrave lrsquoobscuriteacute Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur et la diriger vers la fenecirctre du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer le changement de condition de lumiegravere

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave la lumiegravere puis refermer les volets

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir agrave nouveau les volets

Multiplier les alternances lumiegravere obscuriteacute Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir modifier les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe CO2 et puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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23 Exemple de reacutesultats attendus

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 9: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

1

2 3

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22 Reacutealisation de lexpeacuterience

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 23 avec de lrsquoeau agrave tempeacuterature ambiante attention agrave ne pas utiliser drsquoeau distilleacutee les plantes ont besoin de mineacuteraux Prendre de lrsquoeau de lrsquoaquarium dans lequel les plantes sont maintenues ou de lrsquoeau du robinet qursquoon aura laisseacute agrave tempeacuterature ambiante

b) Couper des fragments de Cabomba en petits morceaux de 2-3 mm et les deacuteposer dans la cuve du bioreacuteacteur

c) Placer les sondes par les emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur en eacutevitant lrsquoemplacement sous lequel se trouve lrsquoagitateur

NB La sonde O2 et CO2 ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

d) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet e) Fermer les volets du bioreacuteacteur f) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

NB On peut ajouter un thermomegravetre et un luxmegravetre afin de veacuterifier que la tempeacuterature est bien resteacutee constante La mesure de la lumiegravere permet de repeacuterer les peacuteriodes deacuteclairement ou dobscuriteacute

Acquisition

Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 3 agrave 4 minutes agrave lrsquoobscuriteacute Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur et la diriger vers la fenecirctre du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer le changement de condition de lumiegravere

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave la lumiegravere puis refermer les volets

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir agrave nouveau les volets

Multiplier les alternances lumiegravere obscuriteacute Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir modifier les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe CO2 et puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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23 Exemple de reacutesultats attendus

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 10: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

1

2 3

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22 Reacutealisation de lexpeacuterience

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 23 avec de lrsquoeau agrave tempeacuterature ambiante attention agrave ne pas utiliser drsquoeau distilleacutee les plantes ont besoin de mineacuteraux Prendre de lrsquoeau de lrsquoaquarium dans lequel les plantes sont maintenues ou de lrsquoeau du robinet qursquoon aura laisseacute agrave tempeacuterature ambiante

b) Couper des fragments de Cabomba en petits morceaux de 2-3 mm et les deacuteposer dans la cuve du bioreacuteacteur

c) Placer les sondes par les emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur en eacutevitant lrsquoemplacement sous lequel se trouve lrsquoagitateur

NB La sonde O2 et CO2 ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

d) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet e) Fermer les volets du bioreacuteacteur f) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

NB On peut ajouter un thermomegravetre et un luxmegravetre afin de veacuterifier que la tempeacuterature est bien resteacutee constante La mesure de la lumiegravere permet de repeacuterer les peacuteriodes deacuteclairement ou dobscuriteacute

Acquisition

Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 3 agrave 4 minutes agrave lrsquoobscuriteacute Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur et la diriger vers la fenecirctre du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer le changement de condition de lumiegravere

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave la lumiegravere puis refermer les volets

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir agrave nouveau les volets

Multiplier les alternances lumiegravere obscuriteacute Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir modifier les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe CO2 et puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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23 Exemple de reacutesultats attendus

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 19 sur 85

- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 20 sur 85

- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 11: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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22 Reacutealisation de lexpeacuterience

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 23 avec de lrsquoeau agrave tempeacuterature ambiante attention agrave ne pas utiliser drsquoeau distilleacutee les plantes ont besoin de mineacuteraux Prendre de lrsquoeau de lrsquoaquarium dans lequel les plantes sont maintenues ou de lrsquoeau du robinet qursquoon aura laisseacute agrave tempeacuterature ambiante

b) Couper des fragments de Cabomba en petits morceaux de 2-3 mm et les deacuteposer dans la cuve du bioreacuteacteur

c) Placer les sondes par les emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur en eacutevitant lrsquoemplacement sous lequel se trouve lrsquoagitateur

NB La sonde O2 et CO2 ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

d) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet e) Fermer les volets du bioreacuteacteur f) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

NB On peut ajouter un thermomegravetre et un luxmegravetre afin de veacuterifier que la tempeacuterature est bien resteacutee constante La mesure de la lumiegravere permet de repeacuterer les peacuteriodes deacuteclairement ou dobscuriteacute

Acquisition

Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 3 agrave 4 minutes agrave lrsquoobscuriteacute Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur et la diriger vers la fenecirctre du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer le changement de condition de lumiegravere

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave la lumiegravere puis refermer les volets

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir agrave nouveau les volets

Multiplier les alternances lumiegravere obscuriteacute Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir modifier les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe CO2 et puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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23 Exemple de reacutesultats attendus

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 12: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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Apregraves 3 agrave 4 minutes agrave lrsquoobscuriteacute Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur et la diriger vers la fenecirctre du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer le changement de condition de lumiegravere

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave la lumiegravere puis refermer les volets

Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 5 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir agrave nouveau les volets

Multiplier les alternances lumiegravere obscuriteacute Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir modifier les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe CO2 et puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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23 Exemple de reacutesultats attendus

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 20 sur 85

- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

Page 21 sur 85

44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 13: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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23 Exemple de reacutesultats attendus

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 19 sur 85

- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 20 sur 85

- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

Page 21 sur 85

44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

Page 22 sur 85

- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

Page 24 sur 85

55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 14: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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MISE EN EVIDENCE DU METABOLISME CELLULAIRE DES LEVURES + CO2

11 OObbjjeeccttiiff Montrer que les levures respirent et montrer que les levures produisent de lrsquoeacutethanol en milieu anaeacuterobie On place une solution de levure dans un faible volume hermeacutetique avec des sondes agrave dioxygegravene agrave dioxyde de carbone et agrave eacutethanol Rappel

La levure est un micro-organisme champignon unicellulaire de forme variable capable drsquoutiliser diverses moleacutecules organiques en particuliers des glucides pour en tirer de lrsquoeacutenergie par respiration ou fermentation gracircce agrave un eacutequipement enzymatique speacutecifique

La RESPIRATION est la deacutegradation complegravete du glucose

La FERMENTATION alcoolique est la deacutegradation -incomplegravete- du glucose avec production drsquoeacutethanol et de dioxyde de carbone en absence de dioxygegravene

22 PPrroottooccoollee

Preacuteparation des levures Diluer environ 10 g de levures fraicircches dans 1 litre drsquoeau Placer le reacutecipient sur un agitateur magneacutetique avec un bulleur au minimum 48H (les levures doivent ecirctre affameacutees mais bien vivanteshellip) Il est important drsquoutiliser un agitateur magneacutetique pour garder un milieu homogegravene en levure et eacuteviter ainsi un preacutelegravevement en surface qui contiendrait finalement peu de levure NB avec des levures lyophiliseacutees frac12 sachet par litre Attention si la concentration de levure est trop importante cela risque drsquoobturer la membrane de la sonde agrave O2hellip Preacuteparation du glucose Preacuteparer une solution de glucose agrave 50gL

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 15: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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33 MMiissee eenn ppllaaccee ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriimmeennttaattiioonn

- Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre - Connecter le capteur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde CO2 sur le capteur CO2megravetre - Connecter lrsquoadaptateur CO2megravetre sur lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO - Brancher la sonde eacutethanol sur le capteur Ethanol - Connecter lrsquoadaptateur Ethanol lrsquoune des entreacutees de lrsquointerface VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 16: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

- Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des adaptateurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

- Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 19 sur 85

- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 20 sur 85

- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

Page 21 sur 85

44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 17: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- De mecircme positionner les capteurs CO2megravetre et Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees

- Positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 19 sur 85

- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 20 sur 85

- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

Page 21 sur 85

44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

Page 22 sur 85

- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 18: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Etalonnage de la sonde O2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 19: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Etalonnage de la sonde CO2

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo CO2 raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux de CO2

- Mettre la sonde CO2 dans lrsquoair - Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur CO2megravetre au maximum - Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 000 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 20: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Etalonnage de la sonde eacutethanol

- Cliquer sur lrsquoicocircne Ethanol sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoeacutethanol

- Positionner le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du capteur Ethanol de faccedilon agrave obtenir 0 sur lrsquoonglet mesure en laissant la sonde dans lrsquoair

1

2

32

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 21: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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44 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llaa mmeessuurree

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre pour lrsquoadaptateur oxymegravetre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau)

- Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2 3

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

Page 33 sur 85

j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 22: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- De mecircme avec lrsquoadaptateur CO2

- Seacutelectionner le mode liquide pour la sonde eacutethanol ainsi que le calibre 1 gL pour lrsquoadaptateur Ethanol

1

2 3

1

2 3

4

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 23: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition agrave 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 24: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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55 RReacuteeacuteaalliissaattiioonn ddee llrsquorsquoeexxppeacuteeacuterriieennccee

a) Remplir la cuve du bioreacuteacteur au 34 avec la solution de levure de faccedilon agrave ce que cela deacuteborde une fois le couvercle positionneacute (pour eacuteviter une interface drsquoair)

b) Positionner les 3 sondes sur le couvercle du bioreacuteacteur Positionner de preacutefeacuterence la sonde eacutethanol au centre car elle est moins sensible agrave lrsquoagitation

NB Les sondes ne doivent pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

c) Fermer les trous laquo non utiliseacutes raquo gracircce aux bouchons preacutevus agrave cet effet d) Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation

Acquisition Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 25: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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Apregraves 4 agrave 5 minutes on peut proceacuteder agrave une injection de glucose via lrsquoorifice preacutevu agrave cet effet sur le bioreacuteacteur

NB La quantiteacute de glucose agrave injecter deacutepend de la qualiteacute et de la quantiteacute de levure preacutesente dans lrsquoenceinte Apregraves une premiegravere injection de 1ml si le changement de pente nrsquoest pas significatif il ne faut pas heacutesiter agrave ajouter davantage de glucose

Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace afin de marquer lrsquoinjection

on met en eacutevidence lrsquoapparition drsquoeacutethanol apregraves la disparition du dioxygegravene Pour afficher les courbes sur deux graphiques diffeacuterents afin de pouvoir adapter les eacutechelles il

suffit de cliquer sur lrsquoicocircne affichage

- seacutelectionner la courbe eacutethanol par exemple puis faire un clic droit - cliquer ensuite sur laquo Afficher en bas raquo

Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 26: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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66 EExxeemmppllee ddee rreacuteeacutessuullttaattss oobbtteennuuss

NB Le palier observeacute sur le taux de CO2 correspond au deacutepassement de la plage de mesure de la sonde CO2 dans un liquide ce deacutepassement nrsquoendommage en rien la sonde

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 27: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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LA REACTION DE HILL

Niveau lyceacutee- supeacuterieur Classe Terminale S Fiche professeur

11 OObbjjeeccttiiffss eett pprriinncciippeess Lors de la photosynthegravese il y a deacutegagement drsquoO2 (issu de lrsquoeau) et le CO2 est reacuteduit Cette reacuteduction se deacuteroule dans le chloroplaste et neacutecessite de leacutenergie Leacutenergie lumineuse capteacutee par les pigments chlorophylliens est convertie en eacutenergie chimique et il y a acquisition dun pouvoir reacuteducteur par les cellules La preacutesence drsquoun accepteur deacutelectrons oxydeacute qui serait reacuteduit par les eacutelectrons provenant de leau (en preacutesence de lumiegravere) peut ecirctre envisageacutee Cette expeacuterience (reacuteaction de Hill) a pour but de veacuterifier lexistence de cette phase photochimique ou phase claire de la photosynthegravese Dans les chloroplastes laccepteur deacutelectrons physiologique est le NADP+ Lors du broyage destineacute agrave extraire les chloroplastes ces derniers sont leacuteseacutes et le NADP+ diffuse dans le milieu et disparaicirct La chaicircne reacuteactionnelle est donc bloqueacutee Ladjonction dun accepteur deacutelectrons ici le ferricyanure de potassium reacutetablit la chaicircne reacuteactionnelle et donc le deacutegagement drsquoO2 lors de lillumination Cette expeacuterience reacutealiseacutee pour la premiegravere fois par Hill deacutemontre la reacutealiteacute des processus doxydo-reacuteduction lieacutes agrave la conversion de leacutenergie lumineuse en eacutenergie chimique La mesure de leacutevolution du taux de O2 (production de O2 = activiteacute photosyntheacutetique) dans une suspension de chloroplastes se fait en preacutesence ou en absence dun accepteur deacutelectrons (le ferricyanure de potassium Fe3+----gt Fe2+) et en alternant des phases deacuteclairement et dobscuriteacute

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 28: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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22 MMooddee ooppeacuteeacuterraattooiirree Dureacutee de preacuteparation de la seacuteance 2 h pour la mise en place du mateacuteriel des postes de travail la preacuteparation des solutions chimiques le reacuteglage des sondes les tests Dureacutee de reacutealisation en classe

TP eacutelegraveve 1 h 30 pour la reacutealisation et 0 h 30 pour lexploitation des reacutesultats

Important Tout le mateacuteriel doit ecirctre refroidi (reacutefrigeacuterateur) au moins 2 heures avant lrsquoextraction le bol du mortier la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal puis remis au froid jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience de maniegravere agrave ralentir la deacutegradation de la chlorophylle apregraves extraction

21 Preacuteparation des solutions chimiques

A preacuteparer par le personnel de laboratoire avant la seacuteance et agrave maintenir au froid jusquagrave lutilisation

- Solution dextraction des chloroplastes (concentration finale -simple concentration) Tampon phosphate pH 65 + saccharose (pour la pression osmotique) composeacute comme suit

Hydrogeacutenophosphate disodique Na2HPO412H2O

agrave 02 moll-1 soit 716 gl-1

Dihydrogeacutenophosphate de potassium KH2PO4

agrave 01 moll-1 soit 136 gl-1

Saccharose agrave 05 moll-1 soit 171 gl-1

Mettre ces trois produits dans une fiole de 1 L Dissoudre dans de leau distilleacutee Compleacuteter la fiole jusquau trait de jauge Il est utile de preacuteparer une solution double concentration et de preacuteparer la solution simple concentration en diluant celle-ci de moitieacute

- Solution oxydante

La solution doit ecirctre preacutepareacutee juste avant son utilisation et placeacutee dans un flacon en verre marron (craint la lumiegravere)hellip

Ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6]

agrave 02 moll-1 soit 329 g 50 ml

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 29: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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22 Preacuteparation de la suspension de chloroplastes

( Preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant deffectuer les mesures ) - Broyer 80 g de feuilles deacutepinard refroidies dans le broyeur fines herbes (ou dans un mortier avec un peu de sable) dans un peu de tampon simple concentration ajouter et meacutelanger le reste des 100 ml de milieu tampon simple concentration agrave pH 65 - Filtrer sur un tampon de gaze pour eacuteliminer les gros deacutebris dans un erlenmeyer NB vous pouvez eacutegalement utiliser une centrifugeuse reacutepartir le filtrat dans les tubes de centrifugation et centrifuger pendant 5 min agrave 1500 g - Conserver les tubes contenant les suspensions de chloroplastes dans le bac de polystyregravene contenant de la glace pileacutee Les en sortir au moins 15 min avant lrsquoexpeacuterimentation de maniegravere agrave deacutebloquer les reacuteactions enzymatiques Veacuterification - Veacuterifier que les chloroplastes ne sont pas complegravetement deacutetruits et que la chlorophylle nest pas en solution ce qui entraicircnerait une fluorescence de la suspension - Observer au microscope la preacutesence de chloroplastes et labsence de cellules entiegraveres La dureacutee de vie des chloroplastes eacutetant tregraves limiteacutee dans le temps preacuteparer la suspension de chloroplastes juste avant lemploi

23 Montage

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 30: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 31: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 32: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Mesure raquo pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 33: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 34: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 10 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 35: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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24 Reacutealisation de lexpeacuterience - Pour reacutecupeacuterer les chloroplastes au fond des tubes de centrifugation jeter lessentiel du surnageant en conserver un peu au fond du tube pour remettre en suspension les chloroplastes du culot agrave laide dune pointe de pipette effileacutee

- Faire tomber le contenu du tube de centrifugation (ou de la deacutecantation) dans la cuve du bioreacuteacteur qui contient 5 ml deau distilleacutee ainsi quun turbulent pour lagitation (Le choc osmotique fait eacuteclater les chloroplastes et lrsquoaccepteur deacutelectron biologique preacutesent se trouve ainsi tregraves dilueacute ce qui eacutequivaut agrave sa disparition) - Ajouter 5 ml de tampon double concentration pour reacutetablir la pression osmotique de deacutepart - Fermer le bioreacuteacteur qui doit ecirctre rempli complegravetement de liquide Faire attention de ne pas laisser de bulles dair agrave linteacuterieur de lenceinte - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Brancher le bioreacuteacteur lancer lagitation et fermer les volets pour laisser la preacuteparation agrave lobscuriteacute

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 36: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

- Laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant environ 1 min agrave lobscuriteacute - Allumer la lampe la placer agrave une dizaine de cm du bioreacuteacteur puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 1 min agrave la lumiegravere - Au temps 3 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 05 ml de ferricyanure de potassium dans la cuve du bioreacuteacteur

NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace puis laisser se deacuterouler lexpeacuterience pendant 2 min puis refermer les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience environ 2 min agrave lobscuriteacute puis ouvrir les volets - Laisser se deacuterouler lexpeacuterience agrave la lumiegravere pendant 2 min Au temps 8 min injecter une nouvelle dose de ferricyanure de potassium - Terminer agrave la lumiegravere - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 37: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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25 Variations du protocole - Les tubes de centrifugation contenant les chloroplastes qui ont seacutedimenteacute peuvent ecirctre fournis deacutejagrave precircts aux eacutelegraveves dans ce cas la manipulation deacutebute agrave Pour reacutecupeacuterer les chloroplasteshellip

- Les peacuteriodes de mesures agrave la lumiegravere et agrave lobscuriteacute peuvent ecirctre allongeacutees si les variations attendues ne sont pas constateacutees Il est possible de terminer la mesure agrave lobscuriteacute

Il est preacutefeacuterable dafficher en deacutebut de manipulation une dureacutee de mesure supeacuterieure agrave 10 min Attention cependant agrave ne pas faire durer trop longtemps la mesure agrave la lumiegravere en preacutesence de ferricyanure de potassium car le deacutegagement dO2 peut saturer le milieu et provoquer le blocage de la sonde - La reacuteaction de Hill peut ecirctre reacutealiseacutee dans lancien bioreacuteacteur Dans ce cas le volume de lenceinte est agrave reacutegler agrave 25 ml Le volume deau mis dans lenceinte au deacutepart est de 15 ml et la pression osmotique initiale est reacutetablie en ajoutant 15 ml de tampon double concentration Une injection de 02 ml de ferricyanure de potassium suffit pour observer un deacutegagement dO2 - Au deacutepart une leacutegegravere baisse du taux dO2 agrave lobscuriteacute est geacuteneacuteralement observeacutee et elle se poursuit agrave la lumiegravere - La remonteacutee du taux dO2 un peu apregraves linjection du ferricyanure de potassium sinterrompt lorsquon passe de la lumiegravere agrave lobscuriteacute

26 Exemple de reacutesultats attendus

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 38: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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Explication et interpreacutetation de ces reacutesultats - Laugmentation de la concentration en dioxygegravene dans les phases deacuteclairement et de

preacutesence daccepteur deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute photosyntheacutetique (phase claire) - Une diminution de la concentration en dioxygegravene dans les phases dobscuriteacute ou dabsence

daccepteurs deacutelectrons correspond agrave lactiviteacute respiratoire - En reacutealiteacute lactiviteacute photosyntheacutetique plus importante masque lactiviteacute respiratoire Les mitochondries preacutesentes dans le culot assurent en permanence lactiviteacute respiratoire

Astuces - Maintenir au froid le bol du broyeur la cuve du bioreacuteacteur les tampons ainsi que les feuilles de veacutegeacutetal jusquau moment de la reacutealisation de lexpeacuterience

- Il est possible dutiliser dautres tissus veacutegeacutetaux que leacutepinard pour reacutealiser lextraction des chloroplastes tels le poireau le cresson lortie loseille sauvage (Rumex) - Linjection de ferricyanure peut ecirctre augmenteacutee mais des injections trop importantes (gt agrave 2 ml) semblent bloquer parfois tout le fonctionnement - Les 500 ml de tampon double concentration reacutealiseacutes au deacutepart permettent de disposer de solutions tampons simple et double concentration pour une seacuteance de TP avec 9 postes de travail Reacutepartir les solutions tampons degraves leur preacuteparation dans des flacons (5 ml flacon pour le tampon double concentration et 100 ml flacon pour le tampon simple concentration) Reacutepartir la solution oxydante dans des flacons bruns (10 ml flacon) - En deacutebut de seacuteance sassurer que la centrifugeuse tourne avec toutes les gaines remplies ceci permet agrave 5 postes de travail de disposer rapidement dau moins deux tubes avec culot de chloroplastes La reacutealisation de cette expeacuterience depuis lextraction des chloroplastes par les eacutelegraveves est possible avec la dureacutee des seacuteances de TP de 2 heures en TS speacutecialiteacute SVT Par ailleurs la reacutealisation de la suspension de chloroplastes concreacutetise la reacutealisation de la technique de seacuteparation par centrifugation souvent eacutevoqueacutee en biologie cellulaire au cours dune seacuteance ougrave diverses capaciteacutes de manipulation sont mises en œuvre Cette seacuteance peut prendre sa place apregraves la deacutecouverte de lorganisation et du rocircle des chloroplastes et la preacutesentation des expeacuteriences de Ruben et Kamen - Avec lobservation des chloroplastes cette expeacuterience permet de bien eacutetablir la relation entre structure et fonction phase claire au niveau des thylakoiumldes et phase sombre au niveau du stroma du chloroplaste

27 Problegravemes eacuteventuels - Si la production dO2 en preacutesence de lumiegravere et de ferricyanure est insuffisante utiliser plusieurs culots de chloroplastes Le volume de la cuve est de 10 ml et dans ce cas le volume total de liquide provoquera des deacutebordements sans conseacutequence lors de la mise en place du couvercle du bioreacuteacteur - Eviter linjection trop brutale du ferricyanure de potassium qui risquerait de provoquer un arteacutefact au niveau du traceacute de la courbe dO2 Cet arteacutefact peut eacutegalement sobserver si bulles dair dans le catheacuteter placeacute agrave lextreacutemiteacute de la seringue de 1 ml nont pas eacuteteacute eacutevacueacutees

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 39: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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33 UUnn ppeeuu ddrsquorsquohhiissttooiirree Vers 1900 leacutetat des connaissances sur la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacute par leacutequation

suivante

lumiegravere

CO2 +

H2O rarr

(CH2O) +

O2 (ΔG = + 115 kcal)

chlorophylle

reacuteaction endergonique qui ne peut ecirctre reacutealiseacutee que par lapport deacutenergie lumineuse capteacutee par la

chlorophylle

Degraves 1905 un chercheur britannique en physiologie veacutegeacutetale FF Blackman interpreacutetait la forme

des courbes de saturation lumineuse (plateau de la courbe de lIP en fonction de leacuteclairement au

delagrave de 10 000 Lux) en eacutemettant lhypothegravese que la photosynthegravese est un meacutecanisme agrave deux

eacutetapes comportant une reacuteaction photochimique ou reacuteaction claire et une reacuteaction non

photochimique ou reacuteaction sombre La reacuteaction sombre est enzymatique et plus lente que la

reacuteaction claire ceci a pour conseacutequence quaux intensiteacutes lumineuses eacuteleveacutees la vitesse de la

photosynthegravese deacutepend entiegraverement de la vitesse de la reacuteaction sombre La reacuteaction claire est peu

ou pas sensible agrave la tempeacuterature contrairement agrave la reacuteaction sombre cette sensibiliteacute agrave la

tempeacuterature est caracteacuteristique des reacuteactions enzymatiques Il faut bien comprendre que la

reacuteaction dite sombre peut se produire aussi bien agrave la lumiegravere quagrave lobscuriteacute Avant 1930 nombre

de chercheurs pensaient que la reacuteaction fondamentale de la photosynthegravese eacutetait un fractionnement

du gaz carbonique en carbone et oxygegravene sous laction de la lumiegravere et que le carbone eacutetait

ensuite reacuteduit par leau en glucides au cours dune autre seacuterie de reacuteactions Deux deacutecouvertes

importantes modifient cette ideacutee vers 1930 La premiegravere deacutecouverte mit en eacutevidence que certaines

bacteacuteries assimilaient le gaz carbonique et syntheacutetisaient des glucides sans utiliser deacutenergie

lumineuse (par chimiosynthegravese) En effectuant une eacutetude comparative des photosynthegraveses

veacutegeacutetale et bacteacuterienne le microbiologiste hollandais CB Van Niel montra que certaines bacteacuteries

pouvaient assimiler le gaz carbonique agrave la lumiegravere sans produire doxygegravene et qursquoen labsence

dun substrat donneur dhydrogegravene la photosynthegravese de ces bacteacuteries eacutetait stoppeacutee Selon Van

Niel la photosynthegravese pouvait ecirctre repreacutesenteacutee par leacutequation geacuteneacuterale suivante ougrave H2 A est le

substrat oxydable

lumiegravere

CO2 + H2A rarr (CH2O) + H2O + 2A

chlorophylle

Van Niel suggeacutera que la photosynthegravese des plantes et algues vertes constituait un cas particulier

ougrave H2A eacutetait H2O et ougrave 2A eacutetait O2 Dans la photosynthegravese veacutegeacutetale lopeacuteration fondamentale

serait le fractionnement de leau en un oxydant (OH) et un reacuteducteur (H) Le reacuteducteur (H) servirait

alors agrave la reacuteduction du CO2 pour aboutir aux constituants de la cellule cependant que loxydant

(OH) serait eacutelimineacute par une reacuteaction ougrave il y aurait libeacuteration doxygegravene et formation deau (H2O)

Selon Van Niel leacutequation globale de la photosynthegravese des plantes vertes est donc

lumiegravere

CO2 + 4 H2O rarr (CH2O) + 3H2O + O2

chlorophylle

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 40: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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Cette eacutequation est la somme de trois eacutetapes distinctes suivantes

lumiegravere

(1) 4H2O rarr 4 (OH) + 4H

pigments verts

(2) 4H + CO2 rarr (CH2O) + H2O + O2

(3) 4 (OH) rarr 2 H2O + O2

La seacutequence des reacuteactions montre clairement que loxygegravene produit vient de leau et non du gaz

carbonique En 1937 la seconde observation importante fut reacutealiseacutee par R Hill de luniversiteacute de

Cambridge Il seacutepara les particules photosyntheacutetiques de feuilles vertes (chloroplastes) des

particules respiratoires (mitochondries) par centrifugation diffeacuterentielle dun homogeacutenat de tissus

de feuilles Une fois eacuteclaireacutes seuls les chloroplastes de Hill ne produisirent pas doxygegravene (peut-

ecirctre parce quils avaient eacuteteacute endommageacutes par la seacuteparation) par contre lorsque des accepteurs

deacutelectrons (oxydants) comme le ferrioxalate de potassium ou le ferricyanure de potassium furent

ajouteacutes agrave la suspension il y eut production dO2 agrave raison dune moleacutecule pour quatre eacutequivalents

doxydant reacuteduits photochimiquement Cependant les chloroplastes ne parvenaient pas agrave reacuteduire

le CO2 qui est laccepteur deacutelectrons naturel de la photosynthegravese Ce pheacutenomegravene connu

maintenant sous le nom de reacuteaction de Hill consiste en un transfert deacutelectrons sous laction de la

lumiegravere de leau vers des oxydants non physiologiques (reacuteactifs de Hill) contre le gradient de

potentiel chimique Linteacuterecirct de la reacuteaction de Hill est de deacutemontrer que la production doxygegravene par

la photosynthegravese se fait seacutepareacutement de la reacuteduction du gaz carbonique En 1941 Ruben et Kamen

en Californie prouvegraverent que loxygegravene produit au cours de la photosynthegravese provenait de la

deacutecomposition de leau Ils ont placeacute des cellules photosyntheacutetiques dans de leau enrichie en

oxygegravene (18O isotope de loxygegravene) Loxygegravene deacutegageacute avait la mecircme composition isotopique que

loxygegravene de leau et cette composition neacutetait pas celle de loxygegravene du gaz carbonique utiliseacute

CO2 + 2 H2O rarr O2 +(CH2O) + H2O

Kamen et Ruben ont eacutegalement deacutecouvert le carbone 14 (14C isotope radioactif du carbone) qui a

servi agrave Bassham Benson et Calvin en Californie pour suivre le cheminement du carbone dans la

photosynthegravese Calvin et ses collaborateurs ont montreacute que la reacuteduction du gaz carbonique en

glucides eacutetait le fait de reacuteactions enzymatiques sombres et que pour reacuteduire une moleacutecule de

CO2 il fallait deux moleacutecules de pyridine nucleacuteotide reacuteduit (NADPH2 = RH2) et trois moleacutecules

dATP Le rocircle des pyridines nucleacuteotides et de lATP dans la respiration cellulaire eacutetait deacutejagrave eacutetabli agrave

leacutepoque En 1951 trois laboratoires mirent en eacutevidence la reacuteduction photosyntheacutetique de NADP

en NADPH par des chloroplastes isoleacutes avec production simultaneacutee dO2 En 1954 Arnon Allen

et Whatley ont reacutealiseacute une photosynthegravese sans cellule cest-agrave-dire lassimilation de CO2 et la

production dO2 par des chloroplastes deacutepinard isoleacutes En 1958 Arnon et ses collaborateurs

deacutemontregraverent en seacuteparant physiquement les deux phases que la phase claire de la reacuteaction

globale de fixation et de reacuteduction du CO2 en glucides se produit dans les lamelles granaires (ou

disques thylakoiumldes) du chloroplaste alors que la phase sombre se deacuteroule dans le stroma Ils ont

eacuteclaireacute des chloroplastes en labsence de CO2 et laisseacute se former de grandes quantiteacutes de

NADPH2 et dATP avec production concomitante doxygegravene Ils ont ensuite casseacute les

chloroplastes et seacutepareacute le stroma des lamelles quils ont jeteacutees A lobscuriteacute le stroma a eacuteteacute

alimenteacute en CO2 radioactif et les enzymes preacutesentes ont effectueacute lassimilation du CO2

aboutissant aux mecircmes glucides que les chloroplastes entiers et les feuilles vertes intactes

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 41: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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14 CO2 fixeacute (coups par

minute)

1 Stroma (agrave lobscuriteacute) 4000

2 Stroma (agrave lobscuriteacute) + grana (agrave la

lumiegravere) 96000

3 Stroma (agrave lobscuriteacute) + ATP 43000

4 Stroma (agrave lobscuriteacute) + NADPH2 + ATP 97000

TABLEAU - Fixation du gaz carbonique agrave lobscuriteacute et agrave la lumiegravere dans les chloroplastes par le

stroma (matrice jaunacirctre) et par les granas (membranes vertes contenant de la chlorophylle)

Ces expeacuteriences ont tregraves clairement montreacute que tous les transporteurs et enzymes neacutecessaires agrave

la formation des composeacutes reacuteduits (NADPH2) et dATP au cours des transports des eacutelectrons

(sous laction de la lumiegravere) sont lieacutes aux membranes du chloroplaste Les enzymes responsables

de la fixation proprement dite du CO2 sont quant agrave elles situeacutees dans le stroma amorphe et

jaunacirctre

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 42: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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ETUDE DE CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE

11 OObbjjeeccttiiff Montrer la speacutecificiteacute de substrat et drsquoaction drsquoun enzyme et faire lrsquoeacutetude des facteurs influenccedilant la reacuteaction enzymatique (Substrat tempeacuterature pH)

2 Oxydation du glucose par la glucose oxydase (GOD)

La glucose oxydase est une enzyme catalysant lrsquooxydation aeacuterobie du D-glucose Cette oxydation consomme de lrsquooxygegravene et produit du gluconolactone (qui se transforme spontaneacutement en acide gluconique) et du peroxyde drsquohydrogegravene

D-glucose + O2+ H2O Acide D-gluconique + H2O2 C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

On va donc mesurer la disparition de lrsquooxygegravene en fonction du temps

vitesse drsquoune reacuteaction enzymatique

Calcul de la vitesse de la reacuteaction enzymatique elle correspond agrave la vitesse de disparition drsquoun

des substrats (ici lrsquoO2) Dans ce TP on mesurera lrsquoinfluence de la concentration en substrat (glucose) sur la vitesse

de la reacuteaction enzymatique pour une concentration en enzyme constante V=dTdO2

cette valeur correspond agrave la pente de la courbe eacutetudieacutee

33 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

31 Mise en eacutevidence de lrsquoinfluence de la concentration en substrat sur la vitesse de reacuteaction enzymatique

311 Preacuteparation des solutions

Preacuteparer des solutions de glucose de concentrations diffeacuterentes (ex 0001 01 05 et 1M)

Preacuteparer une solution drsquoenzyme une pointe de scalpel dans 10 ml drsquoeau (il nrsquoest pas possible de donner une concentration exacte car la GOD nrsquoest pas pure il nrsquoy a pas proportionnaliteacute entre la masse de GOD et le nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme) La couleur finale

de la solution ressemble agrave celle du blanc drsquoœuf cru

312 Parameacutetrage de lrsquoacquisition

a) Brancher la sonde O2 sur lrsquoadaptateur oxymegravetre b) Connecter lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoune des 4 entreacutees de lrsquointerface VISIO

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

Page 74 sur 85

1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 43: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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c) Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

d) Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISO (ou choix automatique)

e) Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 44: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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f) Dans la fenecirctre qui srsquoouvre vous pouvez faire apparaicirctre le nom des adaptateurs connecteacutes agrave votre interface en positionnant la souris agrave droite des capteurs jusqursquoagrave

lrsquoapparition drsquoune double flegraveche Faire un clic gauche et deacuteplacer la souris vers la droite en maintenant ce clic

g) Placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur lrsquoaxe des ordonneacutees en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo puis en deacuteplaccedilant la souris en maintenant ce clic Les 6 points drsquoaccroche sur lrsquoaxe des ordonneacutees eacutetant eacutequivalents vous pouvez donc placer lrsquoadaptateur oxymegravetre sur celui de votre choix

h) De mecircme positionner lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 45: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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i) Etalonnage de la sonde

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees - Cliquer ensuite sur lrsquoonglet laquo Calibre raquo et seacutelectionner laquo Gaz raquo (on peut visualiser directement sur lrsquoadaptateur la led verte correspondant au calibre seacutelectionneacute)

- Cliquer sur lrsquoonglet mesure pour visualiser en temps reacuteel le taux drsquoO2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) du capteur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 sur lrsquoonglet mesure

1

2

32

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 46: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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j) Parameacutetrage de la mesure

- Seacutelectionner le mode laquo liquide raquo dans lrsquoonglet calibre

Remarque sur le logiciel lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo va disparaicirctre de lrsquoaxe des ordonneacutees (cette fonctionnaliteacute est preacutevue pour eacuteviter les changements de calibre non voulus la seacutelection du calibre de la sonde eacutetant deacuteterminante pour la mesure de lrsquoO2 dissout dans lrsquoeau) - Replacer lrsquoicocircne laquo Oxymegravetre raquo sur lrsquoaxe des ordonneacutees

1

2

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 47: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 5 min en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

NB on peut prolonger eacuteventuellement lrsquoacquisition en cours de manipulation en se placcedilant sur lrsquoaxe des abscisses le curseur laquo change raquo drsquoaspect (double flegraveche) il suffit alors de deacuteplacer la souris vers la gauche

1

2

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 48: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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313 Reacutealisation de lrsquoexpeacuterience - Remplir la cuve du bioreacuteacteur avec la solution de glucose 0001 M de faccedilon agrave faire deacuteborder la cuve une fois le couvercle positionneacutee - Brancher le bioreacuteacteur et lancer lagitation - Placer la sonde 02 dans lenceinte par lrsquoun des emplacements situeacutes dans le couvercle du bioreacuteacteur Eviter drsquoutiliser lrsquoemplacement central sous lequel se trouve lrsquoagitateur NB La sonde O2 ne doit pas toucher le fond de la cuve du bioreacuteacteur

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 49: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Au temps 1 min injecter (agrave lrsquoaide drsquoune seringue de 1 ml munie drsquoun catheacuteter) 01 ml de GOD

dans la cuve du bioreacuteacteur NB un petit orifice est preacutevu agrave cet effet dans le couvercle du bioreacuteacteur ce qui eacutevite drsquoouvrir le couverclehellip - Mettre un repegravere sur laxe des temps en appuyant sur la barre drsquoespace - Stopper la mesure en cliquant sur la croix rouge

NB une fois lrsquoexpeacuterience termineacutee enlever le couvercle de lrsquoenceinte et rincer tregraves soigneusement agrave lrsquoeau distilleacutee la sonde lrsquoagitateur le couvercle et la cuve Il faut en effet enlever toute trace de GOD

- Utiliser le mecircme protocole que preacuteceacutedemment pour les diffeacuterentes concentrations de glucose agrave tester Manipuler dans le sens croissant des concentrations Pour chaque expeacuterience choisir la superposition de la courbe aux preacuteceacutedentes

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 50: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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32 Reacutesultats obtenus

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 51: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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On prendra soin drsquoannoter les diffeacuterentes courbes en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Annotation drsquoune courbe raquo

1

2

3 4

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 52: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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44 EExxppllooiittaattiioonn ddeess rreacuteeacutessuullttaattss

41 Construction de la courbe vi = f([substrat]) Cette courbe peut ecirctre obtenue en utilisant aussi bien les courbes de deacutecroissance de la concentration en substrat ou les courbes drsquoapparition du produit Nous allons pouvoir construire la courbe vi=f([Substrat]) avec

Vi (vitesse initiale) =d[P]dt qui correspond agrave la pente de la droite dans les premiers temps de la reacuteaction une fois lrsquoinjection de la GOD

[substrat] qui correspond agrave la concentration en substrat

- Cliquer sur lrsquoicocircne laquo traitement des donneacutees raquo

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

Page 58 sur 85

- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

Page 60 sur 85

- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

Page 63 sur 85

- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 53: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Seacutelectionner agrave lrsquoaide de lrsquoascenseur laquo pente raquo comme mode de deacutetermination pour pouvoir mesurer directement les pentes (vitesses initiales) des diffeacuterentes courbes acquises

- Le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

NB le calcul de la pente se faisant simultaneacutement pour lrsquoensemble des courbes il est indispensable que lrsquointervalle seacutelectionneacute corresponde agrave des deacutecroissances strictes des diffeacuterentes courbes

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

Page 59 sur 85

- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

Page 60 sur 85

- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

Page 69 sur 85

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 54: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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Pour faciliter le traitement on va donc au preacutealable faire correspondre le temps correspondant agrave lrsquoinjection du glucose au temps t=0 et cela pour chaque courbe

- Seacutelectionner lrsquoonglet laquo Portion raquo puis le nom de la premiegravere courbe (0001M)

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car la courbe bleue (01M) nrsquoest pas strictement deacutecroissante sur

cet intervalle

Lrsquointervalle seacutelectionneacute nrsquoest pas adapteacute car les courbes rose (05M) et jaune (1M) ne sont pas strictement deacutecroissantes sur cet intervalle

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- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

Page 56 sur 85

+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 55: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

Page 55 sur 85

- Le choix de lrsquointervalle se fait directement sur le graphique + seacutelectionner lrsquooutil intervalle en faisant un clic droit sur la courbe

1 2

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

Page 59 sur 85

- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

Page 60 sur 85

- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

Page 61 sur 85

42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

Page 63 sur 85

- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 56: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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+ positionner la premiegravere droite verticale au niveau de lrsquoinjection puis faire un clic gauche Positionner la seconde droite verticale agrave la fin de la courbe

Les valeurs correspondantes agrave cet intervalle apparaissent automatiquement dans les cases laquo Intervalle raquo

- Cocher les cases laquo Deacutecaler la portion agrave lrsquoorigine raquo et laquo remplacer raquo puis laquo Tracer raquo

Injection de

la GOD

Fin de la

courbe

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 57: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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On obtient alors sur le graphique un deacutecalage agrave lrsquoorigine de la courbe rouge

Valeurs correspondantes

agrave lrsquointervalle choisi

1

2

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

Page 83 sur 85

Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

Page 84 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 58: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- On procegravede de la mecircme faccedilon avec les autres courbes pour obtenir le graphe suivant

- Retourner sur lrsquoonglet laquo courbe parameacutetrique raquo et seacutelectionner laquo Pente raquo

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- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 59: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

Page 59 sur 85

- Comme preacutecisleacute preacuteceacutedemment le choix des valeurs des cases laquo Deacutebut raquo et laquo Fin raquo se fait directement sur le graphique agrave lrsquoaide de lrsquooutil intervalle il suffit drsquoaller sur le graphique pour voir apparaicirctre une ligne verticale bleue correspondant au deacutebut de lrsquointervalle seacutelectionneacute Une fois le deacutebut valideacute en faisant un clic gauche sur la souris vous pouvez seacutelectionner la fin de lrsquointervalle en faisant de nouveau un clic gauche

- On seacutelectionne un intervalle qui convient agrave lrsquoensemble des courbes

Les valeurs correspondantes aux diffeacuterentes pentes apparaissent automatiquement dans le tableau

Pour chaque valeur dans le tableau on peut retirer le signe ndash de la colonne laquo Mesure sur le graphe raquo si on souhaite obtenir des vitesses positives

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 60: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Dans la colonne laquo Valeur du paramegravetre raquo il faut taper au clavier la valeur de la concentration en substrat correspondante Notez le point de couleur qui apparaicirct agrave cocircteacute de la case seacutelectionneacutee permettant de retrouver sur le graphe la courbe associeacutee

- Dans la partie laquo Nouvelle courbe raquo entrez les paramegravetres qui seront repreacutesenteacutes en abscisse et en ordonneacutee ainsi que leurs uniteacutes

- Cliquer sur laquo Tracer raquo

Suppression

du signe -

Concentration du substrat

associeacutee

Repegravere correspondant agrave la couleur de la courbe

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

Page 63 sur 85

- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

Page 65 sur 85

- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

Page 66 sur 85

- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

Page 68 sur 85

ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

Page 69 sur 85

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

Page 70 sur 85

- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

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2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 61: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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42 Reacutesultat obtenu

La vitesse initiale (Vi) de la reacuteaction enzymatique est drsquoautant plus eacuteleveacutee que la concentration en substrat est forte Peu agrave peu Vi tend vers une vitesse maximale pour une concentration en substrat optimale

La courbe Vi = f([Substrat]) montre lrsquoexistence drsquoune relation de proportionnaliteacute entre la vitesse de la reacuteaction bio-catalyseacutee et les faibles concentrations en substrat

Page 62 sur 85

ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

Page 78 sur 85

gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 62: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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ETUDE DU REFLEXE MYOTATIQUE Niveau lyceacutee 1ere S Physiologie Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur Electrophy sur lrsquointerface VISIO

- Connecter le cordon ECG-EMG sur lrsquoadaptateur Electrophy - Coller 3 eacutelectrodes adheacutesives et relier le cordon ECG-EMG comme indiqueacute sur le scheacutema ci-dessous

Remarque Les eacutelectrodes adheacutesives ont une dureacutee de vie qui est indiqueacutee sur le paquet ou une date de fabrication dans le cas de la date de fabrication les eacutelectrodes sont valables 2 ans Srsquoagissant de mateacuteriel meacutedical des eacutelectrodes ayant

passeacute cette date de quelques mois restent valables Il faut neacuteanmoins veiller agrave ne pas utiliser drsquoeacutelectrodes trop anciennes Dans tous les cas on veillera agrave bien veacuterifier la preacutesence de gel sur ces eacutelectrodes avant de les coller sur la peau Remarque 2 je conseille de mettre la masse sur la malleacuteole (cacircble avec partie violette) Ce qui eacutevite les inversions avec les autres cacircbles (rouge et jaune)

Page 63 sur 85

- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

Page 67 sur 85

33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

Page 78 sur 85

gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

Page 79 sur 85

6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

Page 81 sur 85

1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 63: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Brancher le martoreflex sur les entreacutees synchro de la console VISIO

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

- Veacuterifier que lrsquointerface seacutelectionneacutee (en bas agrave gauche) est bien la console VISIO (ou choix automatique)

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Geacuteneacuteraliste pour les SVT raquo

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

Page 83 sur 85

Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

Page 84 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 64: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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22 PPaarraammeacuteeacutettrraaggee ddee llrsquorsquoaaccqquuiissiittiioonn

- Positionner lrsquoadaptateur laquo Electrophy (non filtreacute) sur lrsquoaxe des ordonneacutees et le temps sur lrsquoaxe des abscisses

- Pour reacutegler lrsquoadaptateur Electrophy positionner le bouton en milieu de course

REMARQUE

Si le signal mesureacute apparaicirct trop petit une fois lrsquoacquisition effectueacutee on augmentera le gain en tournant le bouton vers 05 (par deacutefinition du gain)

Si le signal mesureacute apparaicirct satureacute on diminuera le gain en tournant le bouton vers 5

Page 65 sur 85

- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

Page 69 sur 85

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

Page 74 sur 85

1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

Page 78 sur 85

gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 65: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Parameacutetrer la dureacutee drsquoacquisition sur 100 ms en cliquant sur lrsquoicocircne laquo Temps raquo sur lrsquoaxe des abscisses

- Cliquer sur lrsquoonglet synchronisation et parameacutetrer comme ci-dessous

Le reacuteglage de la synchronisation va permettre de deacutemarrer lrsquoacquisition automatiquement degraves qursquoon aura tapeacute avec le martoreflex

1

2

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

Page 68 sur 85

ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

Page 69 sur 85

- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

Page 70 sur 85

- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 66: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Lancer la mesure en cliquant sur le feu vert puis en cliquant sur le bouton laquo Lancer raquo

Le logiciel se met alors laquo en attente de synchro raquo et lrsquoacquisition deacutemarra degraves qursquoon tapera avec le martoreflex sur le talon drsquoAchille (dans le cas du reacuteflexe achilleacuteen)

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 67: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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33 RReacuteeacutessuullttaatt oobbtteennuu

44 PPrroobbllegraveegravemmeess ppoossssiibblleess TTRRUUCCSS EETT AASSTTUUCCEESS

Les eacutelectrodes se deacutecollent deacutegraisser la peau agrave lrsquoalcool avant de coller les eacutelectrodes ou utiliser des eacutelectrodes permanentes

Veacuterifier la date limite drsquoutilisation des eacutelectrodes adheacutesives Si le traceacute apparaicirct trop tasseacute augmenter le gain agrave lrsquoaide du potentiomegravetre de lrsquoadaptateur

Electrophy La ligne de base du traceacute nrsquoest pas horizontale le traceacute est perturbeacute par lrsquoactiviteacute drsquoautres

muscles Si vous posseacutedez une ancienne version du capteur eacutelectrophy avec pile il est primordial

que la pile soit suffisamment neuve ou chargeacutee agrave 80 minimum (tension sup agrave 84 V)

IMPORTANT veiller agrave ce que les eacutelegraveves ne soient pas en deacuteseacutequilibre sur des tabourets trop hauts la mesure serait fausseacutee car les muscles ne seraient pas deacutecontracteacutes

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

Page 74 sur 85

1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

Page 78 sur 85

gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 68: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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ETUDE DU METABOLISME HUMAIN Niveau lyceacutee Fiche professeur

11 PPrroottooccoollee eexxppeacuteeacuterriimmeennttaall

- Brancher lrsquoadaptateur chronowin sur lrsquointerface VISIO - Faire le montage ci-dessous

- Lancer lrsquoAtelier Scientifique pour les SVT

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 69: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Double-cliquer sur lrsquoicocircne correspondante au module laquo Les eacutechanges gazeux respiratoires chez lrsquohomme raquo

- Cliquer sur laquo suite raquo

On peut soit travailler avec une sonde O2 soit avec une sonde CO2 ou les deux en mecircme temps

Dans le cas preacutesent on ne va utiliser qursquoune sonde O2

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

2

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 70: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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- Etalonnage de la sonde O2

- Mettre la sonde dans lrsquoair - Cliquer sur le bouton reacuteglage puis sur le bouton laquo suite raquo

- Positionner le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquoadaptateur oxymegravetre en milieu de course - Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) de faccedilon agrave obtenir 209 agrave lrsquoeacutecran

- Cliquer sur le bouton laquo Fermer raquo

1

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- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

Page 74 sur 85

1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

Page 75 sur 85

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

Page 78 sur 85

gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 71: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

Page 71 sur 85

- Lancement de lrsquoacquisition

- Cliquer sur lrsquoonglet laquo Echanges respiratoires raquo

- Cocher la case IR si vous souhaitez faire apparaicirctre lrsquoIntensiteacute Respiratoire sans oublier de renseigner les cases laquo Masse raquo et laquo Intervalle raquo

- Cliquer sur le bouton deacutemarrer

- Suivre les instructions agrave lrsquoeacutecran

1

2

3

4

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

Page 78 sur 85

gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 72: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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2 Exemple de reacutesultat

REMARQUES

- Il est important de veacuterifier que le taux drsquoO2 soit de 207 ou 208 dans lrsquoenceinte avant de deacutemarrer la mesure (voir eacutetalonnage de la sonde)

(Le logiciel fait la soustraction 209 ndash taux mesurer dans lrsquoenceinte il est donc important de ne pas reacutegler agrave 209 car la mesure nrsquoest pas forceacutement stable et peut basculer agrave 21 ce qui entrainera un graphique inverseacute neacutegatif Drsquoougrave lrsquointeacuterecirct de reacutegler agrave 207 ou 208 pour pallier agrave ce problegraveme eacuteventuel)

- Il est indispensable de bien aeacuterer lrsquoenceinte de respiration humaine entre 2 expeacuteriences pour ecirctre de nouveau agrave 207 ou 208

- Bien veacuterifier le branchement du clapet anti-retour (voir photo du montage)

- Bien fixer la turbine dans le capteur respiro agrave lrsquoaide du manchon en plastique fourni (voir photo du montage)

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

Page 74 sur 85

1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

Page 75 sur 85

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

Page 78 sur 85

gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

Page 83 sur 85

Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

Page 84 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 73: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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ANNEXE 1 SONDE O2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

1 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde 02 + Adaptateur Oxymegravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

2 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour

sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde

lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la

sonde Cette manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle

drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

3 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton zeacutero (situeacute agrave droite) de lrsquooxymegravetre en milieu de course et reacutegler le

bouton pente (situeacute agrave gauche) pour obtenir 209 dans lrsquoair

VOTRE SONDE O2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

Page 83 sur 85

Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

Page 84 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 74: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

Page 74 sur 85

1 Mise en service de la sonde 02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

Corps de la sonde

Electrode drsquoargent Tecircte de sonde

Membrane

Page 75 sur 85

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

Page 78 sur 85

gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

Page 83 sur 85

Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

Page 84 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 75: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde O2 permet drsquoobtenir une valeur du taux drsquoO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde O2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde O2 +

oxymegravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes dans lrsquoair

(la valeur du taux drsquoO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde O2

Pourquoi eacutetalonner une sonde O2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux drsquoO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde O2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation de la solution zeacutero) lorsqursquoon cherche agrave mettre en eacutevidence des variations du taux

drsquoO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

Lrsquoutilisation de lrsquoeacutetalonnage avec la solution zeacutero nrsquoest preacuteconiseacute que quelque fois par an une

fois au mois de septembre au redeacutemarrage et au moins une fois au printemps

Remarque

Pour lrsquoeacutetude de la respiration des levures il peut srsquoaveacuterer judicieux drsquoeacutetalonner la sonde

O2 avec la solution zeacutero pour eacuteviter drsquoobtenir une valeur leacutegegraverement neacutegative du taux drsquo02

une fois tout lrsquooxygegravene consommeacute par les levures

Comment eacutetalonner la sonde O2

- Positionner la sonde O2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) de lrsquooxymegravetre en milieu de course

- Ajuster le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 209

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeur identique dans les 2 cas

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4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

Page 83 sur 85

Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

Page 84 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 76: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

Page 76 sur 85

4 Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 1 ou 2 minute Poser la sonde sur le bord de la paillasse ou sur

une potence pour eacuteviter toutes interfeacuterences lieacutee aux mouvements du cacircble Avoir un sac

plastique non troueacute dans lequel on pourra souffler

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux puis rincer agrave

lrsquoeau distilleacutee

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

Retirer le sachet

Emprisonnement de la sonde dans le

sachet plastique dans lequel on aura souffleacute au preacutealable

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5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

Page 78 sur 85

gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

Page 81 sur 85

1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

Page 83 sur 85

Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

Page 84 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 77: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

Page 77 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Vous avez besoin de votre sonde O2 pour une seacuterie de TP

Vous pouvez conserver les sondes 02 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de sonde

en position verticale (dans un beacutecher par exemple ou tube agrave essai) avec de lrsquoeau distilleacutee

IMPORTANT veillez toutefois agrave changer lrsquoeacutelectrolyte toutes les semaines si votre

seacuterie de TP srsquoeacutetale dans le temps Cela vous permettra de veacuterifier lrsquoeacutetat drsquooxydation de la

partie en argent de la sonde ainsi que lrsquoeacutetat de la membrane de la tecircte de sonde

gt Votre seacuterie de TP ou vous avez besoin de la sonde O2 est termineacutee

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte et stocker les tecirctes de sonde dans un pot avec de lrsquoeau distilleacutee

(cela vous permettra de conserver la tecircte de sonde dans les meilleurs conditions de

conservation en conservant la membrane en milieu humide)

- Conserver les sondes de preacutefeacuterence verticalement agrave sec en proteacutegeant le corps de la

sonde tregraves fragile avec un morceau de tuyau coupeacute ou le capuchon fournit

Page 78 sur 85

gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

Page 79 sur 85

6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

Page 83 sur 85

Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

Page 84 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

Page 85 sur 85

6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 78: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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gt Une fois par an

Lrsquoeacutelectrode de la sonde eacutetant en argent des tacircches noires drsquooxydation peuvent

apparaicirctre Pour y remeacutedier nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode drsquoargent agrave

lrsquoammoniaque 01 M agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux

puis rincer agrave lrsquoeau distilleacutee

ATTENTION

- Ne pas plonger directement lrsquoeacutelectrode dans lrsquoammoniaque

- Eviter le contact avec lrsquoextreacutemiteacute en verre de lrsquoeacutelectrode

Electrode oxydeacutee

Nettoyage agrave lrsquoammoniaque 01 M Electrode apregraves nettoyage

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

Page 81 sur 85

1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

Page 83 sur 85

Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

Page 84 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 79: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

Page 79 sur 85

6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde O2 est une solution de phosphate de sodium (Na3PO4) agrave 50 gL Hors de

la sonde on peut le conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et

drsquohumiditeacute Avant son utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil

ne preacutesente pas avec de reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde O2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport en protection meacutecanique

Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser quand la sonde est en service avec la tecircte de sonde (Conserver les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions

et deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de

la tecircte de sonde

Ce Capuchon est agrave utiliser lors des peacuteriodes ou la sonde ne sert pas en protection

meacutecanique du corps de la sonde (partie en argent et verre)

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

- Il est important de ne pas laisser connecter en permanence la sonde et lrsquoadaptateur agrave lrsquointerface

ExAO si celle-ci est alimenteacutee par une alimentation externe (observation drsquoun deacutepocirct noir dans la

tecircte de sonde et diminution de la dureacutee de vie de la sonde)

NE PAS UTILISER POUR STOCKER QUANT IL Y A PRESENCE DE LA TEcircTE DE SONDES

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

Page 84 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 80: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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ANNEXE 2 SONDE CO2 ndash Mode drsquoemploi

Pour deacutemarrer rapidement

4 Mettre en place lrsquoensemble du mateacuteriel sonde C02 + Adaptateur CO2megravetre + Interface

ExAO et lancer votre logiciel drsquoacquisition

1 Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde

CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte deacuteborde lorsque la tecircte

de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde Cette

manipulation aura 2 effets

- Etre sure qursquoil nrsquoy a pas de bulle drsquoaire

- Veacuterifier lrsquoeacutetancheacuteiteacute de la membrane et lrsquoabsence de fuite

5 Visser la tecircte de sonde rincer agrave lrsquoeau distilleacutee et laisser le systegraveme se stabiliser pendant

quelques minutes dans lrsquoair (la valeur afficheacutee doit alors ecirctre constante)

4 Positionner le bouton pente (situeacute agrave droite) du CO2megravetre au maximum et reacutegler le bouton

zeacutero (situeacute agrave gauche) pour obtenir 000 dans lrsquoair

VOTRE SONDE CO2 EST PRETE A LrsquoEMPLOI

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1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 81: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

Page 81 sur 85

1 Mise en service de la sonde C02

Remplir la tecircte de sonde avec laquo lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 raquo de telle sorte que lrsquoeacutelectrolyte

deacuteborde lorsque la tecircte de sonde est visseacutee sur le corps de la sonde ce qui eacutevitera la preacutesence

de bulles drsquoair

Corps de la sonde

Electrode de verre

Tecircte de sonde

Membrane

NE PAS CONFONDRE LES FLACONS DrsquoELECTROLYTE ET DrsquoACIDE CITRIQUE

Page 82 sur 85

Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

Page 83 sur 85

Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

Page 84 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

Page 85 sur 85

6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

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Remarque

La preacutesence dune grosse bulle peut ecirctre deacutetecteacutee en observant la valeur renvoyeacutee par

la sonde positionneacutee successivement tecircte en haut puis tecircte en bas la valeur fluctue si il y a une

bulle

Dans ce cas-lagrave deacutevisser la tecircte de sonde compleacuteter avec de lrsquoeacutelectrolyte puis revisser

lentement

2 Polarisation de la sonde

La polarisation de la sonde CO2 permet drsquoobtenir une valeur du taux de CO2 qui soit

stabiliseacutee

Pour polariser votre sonde CO2 il suffit de connecter lrsquoensemble de votre mateacuteriel (sonde

CO2 + CO2megravetre + interface ExAO) et de laisser le systegraveme se stabiliser quelques minutes

dans lrsquoair (la valeur du taux de CO2 observeacutee doit alors ecirctre constante)

Remarque

Lors de 2 seacuteances de TP successives il est inutile de polariser de nouveau la sonde

3 Etalonnage de la sonde CO2

Pourquoi eacutetalonner une sonde CO2

Lrsquoeacutetalonnage de la sonde permet drsquoobtenir une valeur absolue du taux de CO2

Il nrsquoest par conseacutequent pas neacutecessaire drsquoeacutetalonner une sonde CO2 de faccedilon rigoureuse

(utilisation du meacutelange acide citrique et hydrogeacutenocarbonate de sodium) lorsqursquoon cherche agrave

mettre en eacutevidence des variations du taux de CO2 ce qui est le cas pour les TP suivants

bull La photosynthegravese

bull La reacuteaction de HILL

bull Etude de cineacutetique enzymatique par oxymeacutetrie

bull Etude du meacutetabolisme humain

bull Physiologie de lrsquoeffort

bull Etude de la respiration des levures

Pas de preacutesence de bulles drsquoair =gt valeurs identiques dans les 2 cas

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

Page 84 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

Page 83: Protocole ExAO - Atelier Scientifique SVT - Console ExAO Visio

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Comment eacutetalonner la sonde CO2

- Positionner la sonde CO2 dans lrsquoair

- Reacutegler le bouton pente (repeacutereacute par le symbole ) du CO2megravetre au maximum

- Ajuster le bouton zeacutero (repeacutereacute par le symbole ) pour obtenir 000

4

Test de la sonde

Parameacutetrer une acquisition sur 3 minutes Tenir la sonde entre les mains et souffler dessus

Vous devez obtenir une courbe qui preacutesente ce type drsquoallure

Si la courbe obtenue preacutesente un aspect diffeacuterent proceacuteder de la faccedilon suivante

- Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser srsquoeacutevaporer

- Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser lentement

- Changer la tecircte de sonde si la nouvelle courbe obtenue nrsquoest toujours pas correcte

On commence agrave

souffler

On pose la sonde

sur la table

Page 84 sur 85

5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

Page 85 sur 85

6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

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5 Entretien et conservation

gt Durant toute lrsquoanneacutee

Il faut TOUJOURS conserver la sonde CO2 avec lrsquoeacutelectrolyte agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde Il est recommandeacute de la positionner verticalement dans un beacutecher agrave sec

gt Une fois par an

- Deacutevisser la tecircte de sonde

- Vider lrsquoeacutelectrolyte de la tecircte de sonde

- Rincer la tecircte de sonde agrave lrsquoeau distilleacutee

- Nettoyer en frottant leacutegegraverement lrsquoeacutelectrode en verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun

chiffon doux preacutealablement imbibeacute et laisser srsquoeacutevaporer

- Remplir la tecircte de sonde avec de lrsquoeacutelectrolyte

- Revisser la tecircte de sonde sur le corps de la sonde

- Conserver les sondes verticalement dans un beacutecher

Au niveau de la tecircte de sonde

Il se peut que vous observiez par transparence un halot graisseux agrave lrsquointeacuterieur de la tecircte de

sonde

Pour deacutecoller ce halot utilisez un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg en tournant le coton tige

mais en faisant attention de ne pas transpercer la membrane

Ce halot va se deacutecoller facilement mais ne restera peut ecirctre pas sur le coton tige

Dans ce cas utilisez une pissette drsquoeau distilleacutee pour eacutevacuer ce halot

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

NE PAS UTILISER POUR

STOCKER LES SONDES

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6 TRUCS ET ASTUCES

- Lrsquoeacutelectrolyte pour sonde CO2 est une solution drsquoeacutethylegravene-glycol Hors de la sonde on peut le

conserver plusieurs anneacutees dans les conditions normales de tempeacuterature et drsquohumiditeacute Avant son

utilisation veacuterifier neacuteanmoins qursquoil soit bien totalement translucide et qursquoil ne preacutesente pas avec de

reflets jaunacirctres (eacutelectrolyte laquo peacuterimeacute)

- La sonde CO2 est livreacutee avec des capuchons tregraves utiles durant le transport pour proteacuteger les

membranes des tecirctes de sonde Il est fortement deacuteconseilleacute de les utiliser par la suite (conserver

les sondes directement dans un beacutecher avec un fond drsquoeau distilleacutee) car les surpressions et

deacutepressions creacuteeacutees agrave chaque fois qursquoon insegravere ou qursquoon retire la sonde fragilisent la membrane de la

tecircte de sonde

- Si la valeur afficheacutee est 012 avec le symbole laquo DEB raquo (pour laquo deacutebordement raquo) qui clignote

proceacuteder de la faccedilon suivante

Mettre les boutons pente et zeacutero du CO2megravetre au minimum

Deacutevisser la tecircte de sonde et rincer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeau distilleacutee jusqursquoagrave ne plus

observer le symbole laquo DEB raquo

Nettoyer lrsquoeacutelectrode de verre agrave lrsquoeacutethanol 95deg agrave lrsquoaide drsquoun chiffon doux et laisser

srsquoeacutevaporer

Nettoyer la tecircte de sonde avec un coton tige imbibeacute drsquoeacutethanol agrave 95deg

Remettre de lrsquoeacutelectrolyte laquo neuf raquo dans la tecircte de sonde puis revisser tregraves lentement

Changer la tecircte de sonde si laquo DEB raquo apparaicirct toujours

- La tecircte de sonde doit ecirctre changeacutee une fois par an en moyenne dans des conditions normales

drsquoutilisation

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