DIRK BERGMAIER

PRODUCTION D'EXOPOLYSACCHARIDES PAR

FERMENTATION AVEC DES CELLULES

IMMOBILISÉES DE LB. RHAMNOSUS RW-9595M

D'UN MILIEU À BASE DE PERMÉAT DE

LACTOSÉRUM

Thèse

présentée

à la Faculté des études supérieures

de l'Université Laval

pour l’obtention

du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

Département des sciences des aliments et de la nutrition

FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION

UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

AOÛT, 2002

© Dirk Bergmaier, 2002

Résumé court Une méthode de dosage des EPS basée sur l'ultrafiltration (UF) du milieu fermenté a été mise au point. Cette méthode récupère entre 83 et 104% de l'EPS ajouté d'une solution avec une concentration d'EPS connue (40-1500 mg/l). La production d'EPS a été suivie avec la nouvelle méthode lors de fermentations en batch. La méthode d'UF a été rapide (8h), précise et simple, et a requis seulement un petit volume d'échantillon (1 à 5 ml). Des fermentations dans un milieu de perméat de lactosérum supplémenté (SWP) avec 5 ou 8% (w/w) de perméat de lactosérum un poudre (WP), 1% (w/w) d'extrait de levure, des minéraux et du Tween-80 ont été conduites. Des comptes cellulaires (1.3 · 1010 CFU/ml) et une production d'EPS (2350 mg/l) très élevés ont été obtenus lors de fermentations en batch avec des cellules libres dans le SWP. Une méthode de mesure de la biomasse immobilisée, basée sur l'analyse d'ADN microbien a été mise au point. Cette méthode a dosé une biomasse immobilisée très élevée de 8.5 · 1011 CFU/ml lors des cultures en batch répété avec des cellules immobilisées. Une concentration élevée d'EPS (1808 mg/l) a été mesurée après le quatrième cycle, avec un temps d'incubation très court (7 h) résultant en une productivité volumétrique d'EPS élevée de 258 mg/l h. Lors d'une culture continue avec des cellules libres, une production d'EPS de 1808 mg/l et une productivité volumétrique de 542.6 mg/l·h ont été obtenues pour un taux de dilution (D) de 0.3 h-1. Une fermentation continue avec des cellules immobilisées dans un système à deux étages a été conduite pendant 32 jours. L'influence de la concentration en extrait de levure, de la température et du taux de dilution sur les productions de cellules, d'EPS et d'acide lactique a été étudiée. Un effet significatif (P<0.05) a été trouvé seulement pour la production d'acide lactique mais pas pour la production de biomasse ou d'EPS. Une biomasse immobilisée très élevée et stable, égale à 5.3 ± 1.8 · 1011 CFU/g de support a été mesurée. Un changement physiologique et morphologique de la culture avec une perte de la capacité à produire des EPS solubles (138 mg/l) a été observé, résultant en la formation d'agrégats macroscopiques. Avec le temps, la concentration d'agrégats dans les deux réacteurs a augmenté et les agrégats ont quitté le système par l'effluent avec une productivité volumétrique entre 5.68 et 49.54 g/l·h. Les agrégats contenaient une teneur en biomasse totale de 73.8 % et en EPS non-soluble de 14.2 % (w/w). Un contenu de biomasse viable de 4.32 ± 0.97 · 1012 CFU/g a également été mesuré. Ces agrégats pourraient avoir un grand potentiel d'exploitation comme produit synbiotique, avec des concentrations en cellules actives et en EPS très élevées.

_______________________ ________________________ Dirk Bergmaier Christophe Lacroix Directeur de recherche

iv

Abstract A new method for EPS quantification based on ultrafiltration (UF) of fermented broth was developed. This method recovered between 83 and 104% of EPS in a solution with known concentration (40-1500 mg/l). The EPS production during batch fermentations was followed using the new method. The UF method was fast (8 h), accurate and simple, and required only small sample volumes (1 to 5 ml). Cultures were conducted in a supplemented whey permeate (SWP) medium containing 5 or 8% (w/w) whey permeate, 1% (w/w) yeast extract, minerals and Tween-80. Very high cell counts (1.3 · 1010 CFU/ml) and EPS productions (2350 mg/l) were obtained during batch fermentations with free cells. The cells were immobilized on solid supports and a method for immobilized biomass quantification, based on DNA analysis, was developed. This method measured a very high immobilized biomass of 8.5 · 1011 CFU/ml of support during repeated batch cultures. A high EPS concentration (1808 mg/l) was measured after the fourth cycle, with a very short incubation time (7 h) resulting in a high EPS volumetric productivity of 258 mg/l h. During continuous culture with free cells, an EPS production of 1808 mg/l and a volumetric productivity of 542.6 mg/l h was obtained for a dilution ratio (D) of 0.3 h-1. A 32-day continuous fermentation with cells immobilized in a two-stage bioreactor system was conducted. The influence of yeast extract concentration, temperature and dilution rate on the production of biomass, EPS and lactic acid was studied. A significant effect (P<0.05) was found only for lactic acid but not for biomass or EPS production. A very high and stable immobilized biomass equal to 5.3 ± 1.8 · 1011 CFU/g support was measured. A physiological and morphological change of the culture with the loss of the capacity to produce soluble EPS (138 mg/l) was observed, resulting in the formation of macroscopic aggregates. With time, the aggregate concentration in the two reactors increased and the aggregates left the system in the effluent with a volumetric productivity between 5.68 and 49.54 g/l h. The aggregates contained 73.8% total biomass and 14.2% insoluble EPS (w/w). A viable biomass content of 4.32 ± 0.97 · 1012 CFU/g was also measured. These aggregates could find applications as synbiotic food-ingredients with very high active cell and EPS concentrations.

_______________________ ________________________ Dirk Bergmaier Christophe Lacroix Directeur de recherche

v

Résumé long Le but de cette thèse a été de développer un procédé d'immobilisation cellulaire et de l'exploiter afin de produire des exopolysaccharides lors de fermentations d'un milieu à base de perméat de lactosérum par Lactobacillus rhamnosus RW-9595M. Des fermentations en continu avec des cellules immobilisées sur des supports poreux solides en caoutchouc de silicone (ImmobaSil®) ont été comparées avec des fermentations avec des cellules planctoniques. Différentes stratégies (cultures en batch, à cycles répétés et continue) de fermentation avec cellules libres ou immobilisées ont été testées pour la production d'EPS.

Tout d'abord, une nouvelle méthode de dosage d'EPS a été mise au point. Cette méthode utilise l'ultrafiltration dans des cellules agitées pour l'élimination des hydrates de carbone simples du milieu de culture. Ensuite, les exopolysaccharides (EPS) restant dans le rétentat sont dosés par la méthode phénol-sulfurique. La production d'EPS pendant des fermentations en batch dans divers milieux de culture (milieu défini BMM, perméat de lactosérum et perméat de lactosérum supplémenté) a été déterminée par la nouvelle méthode UF et par une méthode conventionnelle. Le taux de récupération des EPS ajoutés à une solution de 0.1 M NaCl ou à des échantillons de milieu de culture par la nouvelle méthode s'est situé entre 83 et 104% pour une concentration d'EPS entre 40 et 1500 mg/l. La méthode d'UF est rapide (8 h), précise et simple, et ne requiert qu'un petit volume d'échantillon (1 à 5 ml). Lors des fermentations à pH 6 et 37°C du perméat de lactosérum supplémenté avec de l'extrait de levure, des minéraux et de Tween-80 (SWP), une production maximale d'EPS très élevée a été mesurée par les méthodes UF et conventionnelle (1718 et 1755 mg/l).

Par la suite, d'autres cultures en batch à pH contrôlé ont été réalisées avec des cellules libres, et comparées avec des cultures en batch à cycles répétés avec des cellules immobilisées. Les cellules ont été immobilisées par adsorption sur des supports poreux solides en caoutchouc de silicone (ImmobaSil®). Les cultures ont été conduites à un pH de 6 et à 37°C dans le SWP, contenant du perméat de lactosérum à une concentration de 5% ou de 8% (w/w). Pour des cultures en batch avec cellules libres dans le milieu SWP à 8%, des comptes cellulaires (1.3 · 1010 CFU/ml) et une production d'EPS (2350 mg/l) très élevés ont été mesurés. Plusieurs méthodes de mesure de la biomasse immobilisée, basées sur l'analyse des composants de la biomasse (protéines, ATP et ADN) ont été examinées. La méthode d'analyse d'ADN s'est avérée la plus appropriée dans les conditions testées. Cette méthode a dosé une biomasse immobilisée très élevée de 8.5 · 1011 CFU/ml après la colonisation des supports ImmobaSil®. Pendant les cultures répétées avec des cellules immobilisées dans le milieu SWP à 5%, une concentration élevée d'EPS (1808 mg/l) a été mesurée après le quatrième cycle, avec un temps d'incubation très court (7 h). La biomasse élevée dans le système à cellules immobilisées a augmenté la productivité volumétrique

vi

maximale d'EPS (258 mg/l · h après 7 h) en comparaison avec les cultures en batch avec des cellules libres (110 mg/l · h après 18 h).

Une culture continue avec les cellules libres a été conduite pendant 9 jours à des taux de dilution (D) entre 0.3 et 0.8 h-1. Une production d'EPS (1808 mg/l) et une productivité volumétrique maximales (542.6 mg/l·h) élevées ont été obtenues pour un bas D de 0.3 h-1, tandis que la productivité spécifique en EPS était maximale (9.80 ± 1.01 · 10-11 mg/CFU · h) pour un D intermédiaire de 0.7 h-1. Ensuite, une fermentation continue dans un système de bioréacteurs à deux étages a été conduite pendant 32 jours. Le fermenteur du premier étage contenait des cellules immobilisées par adsorption sur des supports ImmobaSil®. Le deuxième étage de fermentation en série était constamment inoculé par les cellules produits dans le premier étage. L'influence de la concentration en extrait de levure, de la température et du taux de dilution sur les productions de cellules, d'EPS et d'acide lactique dans le milieu a été étudiée, en utilisant un plan central composite rotatif avec une analyse de surface de réponse. Un modèle statistiquement significatif (P<0.05) a été trouvé seulement pour la production d'acide lactique mais pas pour la production de biomasse ou d'EPS. Des concentrations moyennes de cellules libres de 1.36 · 109 CFU/ml et de 2.26 · 109 CFU/ml ont été déterminées dans le premier et le deuxième réacteur, respectivement. Une biomasse immobilisée très élevée et stable, égale à 5.3 ± 1.8 · 1011 CFU/g de support, a été mesurée par la méthode de dosage d'ADN. En dépit de ces concentrations élevées en cellules libres et immobilisées, la production moyenne d'EPS soluble a été très basse (138 mg/l). Ce résultat peut être expliqué par des changements morphologiques et physiologiques majeurs de Lb. rhamnosus RW-9595M qui conduisent, après dix jours de fermentation, à la formation d'agrégats de forte taille (1-2 millimètres), contenant des cellules. La perte de la capacité des cellules à produire des EPS solubles, observée dans le système à cellules immobilisées, était réversible et la production d'EPS a été entièrement récupérée après quatre cultures successives en batch à pH contrôlé.

Afin de mieux caractériser les changements physiologiques de la souche lors des fermentations continues avec cellules immobilisées, les agrégats ont été quantifiés et leur composition analysée. Avec le temps, les agrégats se sont accumulés dans le premier et dans le deuxième réacteur et ont atteint des concentrations moyennes respectives de 33.9 et 54.8 g/l, lors des 5 derniers jours de la fermentation. La concentration d'agrégats dans l'effluent du système à deux étages a varié entre 3.16 et 28.59 g/l selon les conditions et le temps de la fermentation, résultant en une productivité volumétrique d'agrégats entre 5.68 et 49.54 g/l · h. L'analyse chimique des agrégats a indiqué une teneur élevée en azote de 10.1 ± 0.1 % (w/w), ce qui correspond à une biomasse totale de 73.8 % du poids sec de l'agrégat. La teneur élevée des agrégats en polysaccharides (14.2 ± 1.6 %) a été attribuée à la production d'un EPS non-soluble par la culture immobilisée. Une biomasse viable extrêmement élevée et relativement stable dans les agrégats de 4.32 · 1012 ± 0.97 · 1012 CFU/g a également été mesurée par la méthode d'extraction d'ADN. Les

vii

agrégats produits pendant la culture en continu avec des cellules immobilisées dans un milieu de perméat de lactosérum supplémenté, peuvent être facilement séparés et pourraient avoir un grand potentiel d'exploitation comme produit synbiotique, avec des concentrations en cellules actives et en EPS très élevées.

_______________________ ________________________ Dirk Bergmaier Christophe Lacroix Directeur de recherche

Avant-propos Le corps de cette thèse est composé de cinq chapitres. Le premier chapitre, intitulé "Revue

de littérature", donne une vue d'ensemble des connaissances actuelles sur les

exopolysaccharides en général et les hétéropolysaccharides des bactéries lactiques en

particulier. Dans ce même chapitre, l'immobilisation cellulaire est également introduite et

une vue d'ensemble des techniques et des effets de l'immobilisation sur la culture

immobilisée est donnée. Les références bibliographiques des chapitres sont présentées à la

fin de la thèse.

Les chapitres suivants sont présentés sous forme d'articles scientifiques. Le travail rapporté

dans le chapitre 2, intitulé "New Method for Exopolysaccharide Determination in Culture

Broth using Stirred Ultrafiltration Cells", a permis de réaliser le premier objectif spécifique

de mon projet de doctorat: développer une méthode précise et rapide de mesure des EPS

produits dans le milieu de fermentation. Les résultats de ce travail ont été publiés dans le

journal "Applied Microbiology and Biotechnology". J'ai planifié l'ensemble des

expérimentations et je suis l'auteur principal de cette publication. J'ai exécuté les

fermentations dans le milieu à base de perméat de lactosérum et les expériences

d'ultrafiltration. J'ai bénéficié de l'aide de Maria Guadalupe Macedo qui a exécuté les

fermentations dans le milieu BMM et a mis à ma disposition les milieux fermentés.

Le chapitre 3 expose une comparaison des résultats obtenus lors des fermentations en batch

avec des cellules libres et des cellules immobilisées de Lb. rhamnosus RW-9595M. Une

méthode de dosage de la biomasse immobilisée sur des supports libres y est aussi présentée.

Ce chapitre a été soumis pour publication dans le "Journal of Biotechnology". Je suis

l'auteur principal de cette publication et j'ai effectué l'ensemble des expérimentations.

L'article qui fait objet du chapitre 4 traite des fermentations en continu avec des cellules

libres et immobilisées de Lb. rhamnosus RW-9595M. Dans ce chapitre, l'effet de différents

paramètres (concentration en extrait de levure, température et taux de dilution) sur la

production d'EPS, d'acide lactique et de biomasse dans un système de fermentation en deux

étapes avec des cellules immobilisées est décrite. Le chapitre 5 examine de plus près un

iv

phénomène observé lors de cette fermentation, soit la formation d'agrégats macroscopiques.

Les résultats correspondants aux chapitres 4 et 5 ont été soumis pour publication dans

"Biotechnology Progress". Je suis auteur principal de ces publications et j'ai effectué

l'ensemble des expérimentations.

Ensemble avec les résultats d'un collègue, Yann Doleyres, les observations lors de ces

expériences et ont conduit au dépôt d'un brevet provisoire intitulé " Control and modulation

of probiotic culture characteristics with immobilized cell technology". Finalement, une

conclusion générale intègre les résultats les plus importants de ce projet et présente une

vision globale et les perspectives pour des travaux futurs.

Remerciements Cette thèse représente quatre années de travail, durant lesquelles l'appui et l'aide de

nombreuses personnes ont été essentiels.

A mon directeur, Christophe Lacroix, j'adresse ma reconnaissance pour ces conseils

scientifiques judicieux, sa disponibilité exceptionnelle, son appui financier et la liberté

d'action qu'il m'a laissée tout au long de ce projet. Je remercie également mon codirecteur,

Claude Champagne, pour ces suggestions pertinentes et son aide dans la rédaction des

articles.

Mes remerciements également au personnel et à mes collègues du Centre STELA ainsi qu'à

ceux des laboratoires du département ALN et des laboratoires de microscopie électronique

qui par leur appui technique et leurs conseils, ont contribué à la réalisation de ce travail. Je

pense plus particulièrement à Maria Guadalupe Macedo, Céline Paquin, Bernard Béliveau,

Jocelyne Giasson, Alain Gaudreau, Hélène Chamberland et Aristide Pusterla.

Je désire remercier le Conseil de Recherches en Sciences Naturelles et en Génie du Canada

(Programme de partenariats de recherche – Réseau de recherche sur les Bactéries

Lactiques), Agriculture et Agroalimentaire Canada, Novalait inc., les Producteurs laitiers

du Canada et l'Institut Rosell–Lallemand Inc. pour leur support financier.

Enfin, ce travail est l'aboutissement de longues années d'étude, auxquelles l'amour et le

soutien de ma famille en Allemagne ainsi qu'à Québec ont largement contribué. À ma

conjointe, Sophie, je voudrais rappeler mon amour et ma reconnaissance pour sa

compréhension, sa présence affectueuse à mes côtés et le plus beau cadeau de ma vie, notre

fils Victor.

Für meine Großeltern, Eltern und Schwester,

deren Nähe mir oft fehlte,

meine Familie in Québec,

die mich mit offenen Armen empfang,

Sophie und Victor,

die ich von Herzen liebe.

Table des matières Résumé court ....................................................................................................................... iii

Abstract................................................................................................................................ iv

Résumé long.......................................................................................................................... v

Avant-propos ....................................................................................................................... iii

Remerciements ..................................................................................................................... v

Introduction générale .......................................................................................................... 1

Chapitre 1 Revue de littérature...................................................................................... 2

1.1 Exopolysaccharides d'origine microbienne............................................................ 2

1.1.1 Fonction pour la souche productrice .............................................................. 3

1.1.2 Utilisations et applications industrielles......................................................... 5

1.2 Exopolysaccharides des bactéries lactiques ........................................................... 7

1.2.1 Composition et structure ................................................................................ 8

1.2.2 Fonctionnalité des hétéropolysaccharides...................................................... 9

1.2.2.1 Fonctionnalité technologique ..................................................................... 9

1.2.2.2 Fonctionnalité physiologique ................................................................... 10

1.2.3 Biosynthèse des hétéropolysaccharides des bactéries lactiques................... 13

1.2.4 Génétique de la production des hétéropolysaccharides ............................... 17

1.2.5 Production des hétéropolysaccharides par les bactéries lactiques ............... 19

1.2.5.1 Milieux utilisés pour la production d'EPS................................................ 20

1.2.5.2 Rendement de la production d'EPS.......................................................... 20

1.2.5.3 Effet du milieu de culture sur la production............................................. 23

1.2.5.3.1 Source d'azote .................................................................................... 23

1.2.5.3.2 Source de carbone .............................................................................. 24

1.2.5.3.3 Minéraux et vitamines........................................................................ 25

1.2.5.4 Effet du milieu sur la composition de l'EPS ............................................ 25

1.2.5.5 Cinétique de la production des EPS par les bactéries lactiques ............... 26

1.2.5.6 Effets des conditions de culture ............................................................... 27

1.2.6 Méthodes d'analyse des EPS ........................................................................ 29

1.2.6.1 Quantification........................................................................................... 29

viii

1.2.6.2 Caractérisation physico-chimique............................................................ 32

1.2.6.3 Production à grande échelle et traitement en aval.................................... 33

1.2.7 Utilisation et applications des hétéropolysaccharides.................................. 34

1.3 Technologie des cellules immobilisées................................................................ 35

1.3.1 Techniques et procédures d'immobilisation................................................. 37

1.3.2 Choix du support .......................................................................................... 40

1.3.3 Analyse des cellules immobilisées............................................................... 42

1.3.4 Effets physiologiques et morphologiques de l'immobilisation .................... 44

1.4 Problématique ...................................................................................................... 45

1.5 Hypothèse et objectifs de travail .......................................................................... 46

1.5.1 Objectif général............................................................................................ 47

1.5.2 Objectifs spécifiques .................................................................................... 47

Chapitre 2 New method for exopolysaccharide determination in culture broth

using stirred ultrafiltration cells ....................................................................................... 48

2.1 Résumé................................................................................................................. 49

2.2 Abstract ................................................................................................................ 49

2.3 Introduction.......................................................................................................... 50

2.4 Materials and methods ......................................................................................... 51

2.4.1 Microorganism ............................................................................................. 51

2.4.2 Culture media ............................................................................................... 51

2.4.3 Fermentations............................................................................................... 51

2.4.4 Cell enumeration .......................................................................................... 52

2.4.5 EPS purification and quantification by the conventional method................ 52

2.4.6 EPS purification and quantification using stirred ultrafiltration cells.......... 53

2.4.7 Validation of the ultrafiltration method for EPS analysis............................ 54

2.4.8 Sugar and lactic acid analysis ...................................................................... 55

2.4.9 Statistics ....................................................................................................... 55

2.5 Results .................................................................................................................. 56

2.5.1 Characterization of the UF method .............................................................. 56

2.5.2 EPS quantification during batch cultures..................................................... 57

2.6 Discussion ............................................................................................................ 60

ix

2.7 Conclusions.......................................................................................................... 64

Chapitre 3 Exopolysaccharide production during batch cultures with free and

immobilized Lactobacillus rhamnosus RW-9595M......................................................... 65

3.1 Résumé................................................................................................................. 66

3.2 Abstract ................................................................................................................ 66

3.3 Introduction.......................................................................................................... 67

3.4 Materials and Methods......................................................................................... 69

3.4.1 Strain and culture media............................................................................... 69

3.4.2 Fermentation techniques .............................................................................. 69

3.4.3 Cell enumeration and biomass determination .............................................. 70

3.4.4 Immobilized biomass determinations .......................................................... 70

3.4.4.1 DNA extraction ........................................................................................ 70

3.4.4.2 ATP extraction ......................................................................................... 72

3.4.4.3 Protein extraction ..................................................................................... 72

3.4.5 EPS concentration analysis .......................................................................... 73

3.4.6 Sugar and organic acid analysis ................................................................... 73

3.5 Results and Discussion......................................................................................... 73

3.5.1 Cell and EPS production during free-cell batch cultures ............................. 74

3.5.2 Cell production during repeated batch cultures with immobilized cells...... 76

3.5.3 Immobilized cell concentration in the solid supports .................................. 77

3.5.4 EPS production during repeated batch cultures with immobilized cells...... 81

3.6 Conclusions.......................................................................................................... 82

Chapitre 4 Exopolysaccharide production during chemostat cultures with free and

immobilized Lactobacillus rhamnosus RW-9595M......................................................... 83

4.1 Résumé................................................................................................................. 84

4.2 Abstract ................................................................................................................ 85

4.3 Introduction.......................................................................................................... 85

4.4 Material and Methods .......................................................................................... 87

4.4.1 Microorganism ............................................................................................. 87

4.4.2 Culture media ............................................................................................... 88

4.4.3 Fermentation techniques .............................................................................. 88

x

4.4.3.1 Free-cell continuous culture..................................................................... 88

4.4.3.2 Immobilized-cell continuous culture........................................................ 89

4.4.3.3 Successive free-cell batch cultures........................................................... 90

4.4.4 Cell enumeration and biomass determination .............................................. 90

4.4.5 Determination of immobilized biomass concentration in solid supports..... 91

4.4.6 EPS concentration analysis .......................................................................... 91

4.4.7 Sugar and organic acid analysis ................................................................... 91

4.4.8 Microscopy observations ............................................................................. 91

4.4.9 Experimental design and statistical analysis ................................................ 92

4.5 Results .................................................................................................................. 93

4.5.1 Free-cell chemostat cultures......................................................................... 93

4.5.2 Immobilized-cell chemostat cultures ........................................................... 94

4.5.2.1 Free and immobilized biomass production .............................................. 95

4.5.2.2 Sugar and product concentration.............................................................. 97

4.5.3 Successive batch fermentations with cells from immobilized cell culture 101

4.6 Discussion .......................................................................................................... 101

4.7 Conclusions........................................................................................................ 107

Chapitre 5 Aggregate formation during chemostat culture with immobilized

Lactobacillus rhamnosus RW-9595M ............................................................................. 109

5.1 Résumé............................................................................................................... 110

5.2 Abstract .............................................................................................................. 110

5.3 Introduction........................................................................................................ 111

5.4 Material and Methods ........................................................................................ 112

5.4.1 Microorganism and culture conditions ...................................................... 112

5.4.2 Biomass concentration determinations ...................................................... 113

5.4.3 Microscopy observations ........................................................................... 114

5.4.4 Aggregate dry weight determination.......................................................... 114

5.4.5 Chemical analysis of aggregates ................................................................ 115

5.4.6 Experimental design and statistic analysis................................................. 115

5.5 Results ................................................................................................................ 116

5.5.1 Microscopical and macroscopical observations......................................... 116

xi

5.5.2 Aggregate production................................................................................. 119

5.5.3 Aggregate composition .............................................................................. 120

5.6 Discussion .......................................................................................................... 122

5.7 Conclusions........................................................................................................ 126

Conclusion générale ......................................................................................................... 127

Bibliographie .................................................................................................................... 130

Annexe 1 Concentration en ATP pendant une fermentation avec des cellules libres de

Lb. rhamnosus RW-9595M.............................................................................................. 150

Annexe 2 Cell counts and lactic acid, soluble EPS and immobilized cell concentration

during a 32 day continuous culture in a two stage bioreactor system. ....................... 151

Annexe 3 Analysis of variance and parameter estimates for lactic acid concentration

in the effluent of the ICB and the FCB. ......................................................................... 152

Liste des tableaux Tab. 1.1 Production d'EPS par les LAB............................................................................... 22

Tab. 1.2 Avantages et désavantages de la technologie des cellules immobilisées. ............. 37

Tab. 1.3 Immobilisation par inclusion dans des supports solides poreux............................ 41

Tab. 2.1 EPS concentration and recovery rate (R) determined by the UF method for 0.1 M

NaCl and 5% WP solutions spiked with EPS. ............................................................. 57

Tab. 4.1 Real and coded values of the central composite experimental design for the

continuous immobilized cell fermentation................................................................... 95

Liste des figures Fig. 1.1 Structure du dextrane, un homopolymère................................................................. 8

Fig. 1.2 Structure de l'EPS de Lb. rhamnosus RW-9595M (Van Calsteren et al. 2002). ...... 9

Fig. 1.3 Schéma des voies métaboliques impliquées dans le catabolisme du

lactose/galactose et la biosynthèse des EPS par Lactococcus lactis Gal+ (via les

systèmes phosphoénolpyruvate PEP et phospho-transférase PTS) et par Lactobacillus

delbrueckii ssp. bulgaricus et Streptococcus thermophilus Gal- (via l'antiport

lactose/galactose) (De Vuyst et al. 2001). ................................................................... 15

Fig. 1.4 Modèle de la biosynthèse d'EPS par Lactococcus lactis ssp. lactis NIZO B40 (Van

Kranenburg et al. 1998) ............................................................................................... 16

Fig. 1.5 Organisation des gènes codant pour la production d'EPS chez Lactococcus lactis

NIZO B40 (plasmidique) et chez Streptococcus thermophilus Sfi6 (adapté de De

Vuyst et al., 2001)........................................................................................................ 19

Fig. 1.6 Classification des systèmes d’immobilisation selon quatre classes (adapté de

Willaert et Baron 1996)................................................................................................ 38

Fig. 2.1 Schematic diagram of the laboratory device used for ultrafiltration experiments in

stirred cells. .................................................................................................................. 54

Fig. 2.2 Change in viable cell count ( ), lactose ( ) and lactic acid ( ) concentrations,

and EPS production measured by the UF ( ) and conventional ( ) methods during

pH-controlled batch cultures with Lb. rhamnosus RW-9595M in BMM. Means and

standard deviations for three fermentations. ................................................................ 58

Fig. 2.3 Change in viable cell count ( ), volume of base consumed (―), and EPS

production measured by the UF ( ) and conventional ( ) methods during a pH-

controlled batch culture with Lb. rhamnosus RW-9595M in WP. Means and standard

deviations for duplicate analyses by the UF method. .................................................. 59

Fig. 2.4 Change in viable cell count ( ), lactose ( ) and lactic acid ( ) concentrations,

and EPS production measured by the UF ( ) and conventional ( ) methods during

pH-controlled batch cultures with Lb. rhamnosus RW-9595M in SWP. Means and

standard deviations for three fermentations. ................................................................ 60

xiv

Fig. 3.1 Viable cell counts (●), lactose (■) and lactic acid (♦) concentrations, and EPS

production (▲) during pH-controlled batch cultures with Lb. rhamnosus RW-9595M.

Means and standard deviations for two fermentations................................................. 75

Fig. 3.2 Free-cell counts (●), immobilized cell concentration measured by DNA extraction

method (■) and polysaccharide concentration in the broth (vertical bars) during four

repeated batch cultures with Lb. rhamnosus RW-9595M immobilized on ImmobaSil®

silicone rubber solid supports. ..................................................................................... 77

Fig. 4.1 Viable cell counts (vertical bars), EPS concentration (●), and EPS volumetric (■)

and specific productivities (▲) during free-cell chemostat culture with Lb. rhamnosus

RW9595M for different dilution rates. Means and standard deviations for two

replications of D........................................................................................................... 94

Fig. 4.2 Optical micrograph (10X) of a semi-fine slice (methylene blue staining) of the

ImmobaSil® support colonized with Lb. rhamnosus RW-9595M after 7 day chemostat

culture........................................................................................................................... 96

Fig. 4.3 Photomicrograph of Lb. rhamnosus RW-9595M: a) in the FCB effluent after

14 days of chemostat culture (63X) b) in the fermented medium at the end of a free-

cell batch culture (100X).............................................................................................. 97

Fig. 4.4 Response surface of lactic acid concentration in the first immobilized-cell

bioreactor (ICB) for T = 34°C, covariates stop = 0.5 and age = 12 days. ................... 99

Fig. 4.5 Response surface of lactic acid concentration in the second free-cell bioreactor

(FCB) for T = 34°C, covariates stop = 0.5 and age = 12 days................................... 100

Fig. 5.1 Scanning electron microscopy of colonized ImmobaSil® supports: a) pore at the

surface (magnification 1600 X, b) and c) inner pores (magnification 3600 X and

12000 X, respectively). .............................................................................................. 118

Fig. 5.2 Optical microscopy observations of semi-fine slices of aggregates stained with

methylene blue: a) high cell density (20 X), b) and c) formation of channels (63 X).

.................................................................................................................................... 118

Fig. 5.3 Scanning electron microscopy of a cut through the aggregate: a) at a magnification

of 11000 X, b) at a magnification of 7800 X with crystal. ........................................ 119

Fig. 5.4 Change of aggregate dry weight in the fermented broth in the first ICB (solid bars)

and the second FCB (dashed bars) bioreactors as a measure of aggregate accumulation

xv

during the 32-day continuous culture. Age 1 day corresponds to the start of the

experimental design after an 8-day initial stabilization period. Fermentation conditions

were changed every day according to the central composite rotatable design. ......... 121

Fig. 5.5 Change of aggregate dry weight in effluent samples (solid bars) and volumetric

productivity of the two-stage continuous culture (dashed bars) during the 32-day

experiment. Age 1 day corresponds to the start of the experimental design after an 8-

day initial stabilization period. Fermentation conditions were changed every day

according to the central composite rotatable design. ................................................. 121

Introduction générale Dans le domaine agroalimentaire, l’utilisation des polysaccharides est très courante. Leur

propriétés rhéologiques les rendent capables d’épaissir, de gélifier, de stabiliser et

d’émulsifier. Ils sont souvent utilisés pour diminuer l’activité de l’eau de l’aliment et

contribuent ainsi à la conservation. Appartenant à la classe des fibres alimentaires, ils

servent aussi à remplacer le gras. Ils peuvent non seulement améliorer les comportements

organoleptiques, mais ils pourraient permettre également de produire des aliments

possédant des propriétés nutraceutiques (immunomodulatrices, antivirales, anti-tumorales,

amélioration du transit digestif). Plusieurs bactéries lactiques synthétisent et excrètent des

polysaccharides qui peuvent être utilisés comme bioingrédients fonctionnels permettant de

remplacer d’autres agents polysaccharidiques tels que les carraghénanes, les alginates ou la

gélatine. Ainsi, à l’aide de ces bactéries, il est possible de fabriquer des produits laitiers

fermentés avec un comportement rhéologique amélioré et en même temps de répondre à

une forte demande des consommateurs pour des produits naturels sans additifs. Cependant,

on constate que les bactéries lactiques ont une faible production de polysaccharides et un

caractère épaississant extrêmement instable, ce qui représente un inconvénient majeur pour

l’exploitation en industrie laitière.

Pour remédier à ces problèmes, la technique d’immobilisation représente une bonne

solution. L'utilisation de l'immobilisation cellulaire avec des bactéries lactiques augmente

largement la concentration en biomasse dans le fermenteur. Avec l'immobilisation

cellulaire couplée avec une fermentation en batch-répété ou en continu, on peut obtenir un

rendement et une stabilité des cellules plus élevés qu'avec des cellules libres. Pendant la

fermentation, les cellules sont protégées des forces de cisaillement et elles peuvent être

récupérées et réutilisées. Plusieurs procédés d’immobilisation ont été développés au cours

des vingt dernières années. Souvent, le procédé imite ce qui se produit dans la nature où la

majorité des cellules microbiennes vivent sous forme de biofilm. L'immobilisation par

adsorption sur des supports solides préformés est une technique d'immobilisation qui

pourrait être très appropriée pour les bactéries lactiques productrices d'exopolysaccharides,

car le caractère mucoïde de ces souches favoriserait l'adhésion des cellules au support et

faciliterait ainsi sa colonisation.

Chapitre 1

Revue de littérature

1.1 Exopolysaccharides d'origine microbienne

La plupart des microorganismes synthétisent plusieurs types de polysaccharides qui

peuvent être classés selon leur localisation dans la cellule. Certains se trouvent à l’intérieur

de la cellule, dans le cytoplasme, où ils sont utilisés par la bactérie comme source

d’énergie. D'autres sont des composants de la paroi tels que les peptidoglycanes et les

acides téichoïques. Enfin, un troisième groupe de polysaccharides est excrété à l'extérieur

de la cellule. Le terme "exopolysaccharide" (EPS) ou "polysaccharide exocellulaire" a été

proposé par Sutherland (1972) et Cerning (1994) comme appellation générale pour ce

groupe. Les microorganismes peuvent excréter deux types d'EPS. Le polysaccharide peut

soit être excrété dans le milieu environnant, soit rester lié à la surface de la cellule sous

forme de capsule.

Les exopolysaccharides sont impliqués dans des phénomènes aussi différents que

l'adhésion de Staphylococcus epidermidis à des implants biomédicaux sous-cutanés (Dunne

2002), le colmatage des pipelines et des échangeurs de chaleur, ainsi que la formation de la

plaque dentaire (De Vuyst et Degeest 1999b). La grande diversité structurale des

polysaccharides microbiens témoigne de l'adaptation des microorganismes à des

environnements très différents.

Selon leur composition chimique, les EPS peuvent être subdivisés en deux groupes: les

homopolysaccharides et les hétéropolysaccharides. Tandis que les homopolysaccharides

sont constitués d'un seul type de monomère saccharidique, les hétéropolysaccharides

peuvent contenir plusieurs types de sucres. Parmi les homopolysaccharides, on retrouve les

α-glucanes généralement composés des résidus de glucose liés en α-1,6 et α-1,3; comme les

dextranes produits par Leuconostoc mesenteroides et les glucanes par Streptococcus mutans

et Streptococcus sobrinus. Les levanes, synthétisés de Streptococcus salivarius, sont aussi

des homopolysaccharides, constitués de résidus de fructose liés en β-2,6. Le groupe d'EPS

3

le plus large et le plus diversifié est le groupe des hétéropolysaccharides qui se composent

de plusieurs types d'oses constitutifs. Les hétéropolysaccharides sont formés d'unités

répétitives, variables dans leur taille (de di- à octasaccharides), mais aussi d'autres groupes

peuvent être présents, tels des groupements phosphate, amino ou acétyle. La production

d'hétéropolysaccharides est très fréquente parmi les microorganismes et on y trouve aussi

bien des souches d'un intérêt médical comme Escherichia coli, Salmonella spp. ou

Enterobacter spp. que des bactéries lactiques.

1.1.1 Fonction pour la souche productrice

Des bactéries productrices d'EPS ont été identifiées dans une gamme de niches écologiques

différentes et il est évident que le rôle joué par l'EPS dépend de l'environnement du

microorganisme. Il a été proposé que la capacité de production d'EPS constitue une réponse

directe et logique aux pressions sélectives de l'environnement (Dudman 1977).

L'anabolisme d'EPS demande beaucoup d'énergie, il est donc improbable qu'une bactérie

utilise autant d'énergie et de substrat sans en tirer un avantage. L’importance des EPS pour

la cellule ne semble pas être très grande si on considère les bactéries in vitro. Par contre,

sous des conditions naturelles, ce qui signifie des conditions fortement concurrentielles, les

EPS semblent donner aux bactéries un avantage compétitif et leur permettre de se maintenir

(Cerning 1994). La prolifération des microorganismes ne semble pas être affectée par la

présence où l’absence d’une capsule. L'enlèvement mécanique ou enzymatique de la

capsule polysaccharidique n'affecte pas négativement la croissance cellulaire in vitro et des

mutants non-producteurs d'EPS peuvent apparaître spontanément. En général, les bactéries

productrices d’EPS ne sont pas capables de cataboliser les EPS qu’elles ont produits. Ainsi,

les EPS ne semblent pas jouer le rôle d’une source d’énergie quoique dans certains cas, une

dégradation du polymère a été observée (Cerning 1994).

Le rôle des EPS pour la cellule le plus souvent proposé est de nature protectrice vis à vis de

son environnement. La capacité de s'enrober dans une couche d'EPS avec un forte teneur en

eau la rend plus résistante à la dessiccation et à la déprédation des protozoaires. La nature

anionique de la couche d'EPS autour de la cellule peut aider à capturer des minéraux

4

essentiels et des nutriments. Ainsi, un rôle écologique de l'EPS des cyanobactéries semble

être le recyclage des métaux multivalents comme le Mn2+.

De plus, une couche d'EPS autour de la cellule influence significativement la diffusion de

différentes molécules aussi bien vers l'extérieur ou vers l'intérieur de la cellule. Ainsi, des

agents anti-microbiens peuvent plus difficilement l'atteindre (Whitfield 1988). La

production d'EPS a conféré à une souche de Lactococcus lactis une tolérance augmentée

envers le cuivre, la nisine et le lysozyme (Looijesteijn et al. 2001). Une autre fonction des

EPS pourrait être de protéger les cellules contre la phagocytose. Il semble qu’il existe une

relation entre l’encapsulation de la bactérie et les phénomènes de virulence. En augmentant

l’hydrophobicité de la surface bactérienne, la capsule diminue sa disposition à être absorbée

par les neutrophiles.

Dans la littérature, il existe des données contradictoires en ce qui concerne la relation entre

les EPS et la résistance phagique. Bien qu’il semble que la capsule ait la fonction de

protéger la cellule, les bactériophages actifs sur les souches encapsulées sont généralement

spécifiques pour les polysaccharides de la capsule. Valyasevi et al. (1994) ont montré que

les polysaccharides de la paroi des souches de L. cremoris KH et L. lactis C2 favorisent

l'adsorption des bactériophages Kh et sK1, respectivement. D'autre part, la production d'un

EPS capsulaire confère à L. lactis MG1614 contenant le plasmide pNZ4030 codant pour la

production d'EPS une résistance accrue envers le bactériophage ML3 (Looijesteijn et al.

2001).

Dans l'environnement naturel, les micro-organismes se trouvent souvent en haute densité

cellulaires dans un biofilm. La production d'un glycocalyx, qui est composé principalement

d'EPS, est essentielle pour la formation d'un biofilm. C'est l'EPS qui rend la bactérie

capable de s'attacher aux surfaces et qui protège contre les surfactants et même les anti-

biotiques (O'Toole et al. 2000a). De plus, si un biofilm est composé de plusieurs souches,

comme c'est le cas par exemple dans les intestins, les produits métaboliques d'une souche

peuvent servir comme substrat pour une autre et la capacité de s'attacher d'une cellule peut

procurer des sites d'attachement à d'autres (Dunne 2002). La capacité de s'attacher n'est

toutefois pas toujours avantageuse pour l'homme et peut occasionner des pertes

économiques considérables causées par l'obstruction des conduits d'écoulement des fluides,

5

des filtres ou des échangeurs de chaleur (Bryers 1993). Parfois, la destruction corrosive

causée par des biofilms bactériens peut être une source inépuisable de profit économique,

comme on peut le constater après une visite chez le dentiste.

1.1.2 Utilisations et applications industrielles

Les polysaccharides d'origine microbienne sont toujours en compétition dans les

applications avec d'autres polymères d'origine naturelle ou synthétique. Souvent les

propriétés physiques et écologiques des EPS sont supérieures mais les polysaccharides

d'autres origines sont presque toujours meilleur marché à produire. C'est pourquoi les EPS

doivent avoir un avantage majeur, comme par exemple un bénéfice pour la santé du

consommateur, afin d'arriver à percer sur le marché. En général, les polymères d'origine

microbienne sont des produits uniformes et purs. Dans le cas de la cellulose bactérienne,

produite par exemple par Acetobacter xylinum, ces caractéristiques permettent de produire

des membranes acoustiques de grande fermeté et ainsi de soutenir avec succès la

concurrence de la cellulose végétale. Une autre stratégie est de donner au polymère une

valeur ajoutée par une modification chimique de sa structure. Ainsi, le produit trouve un

champs d'application spécifique comme c'est le cas pour Sephadex®, un dérivé du

dextrane.

Le curdlane est un 1,3-β-glucane d'une taille moléculaire d'environ 74 kDa produit par les

bactéries du genre Agrobacterium et Rhizobium. Il est soluble dans de l'eau froide et forme

un gel faible après chauffage au dessus de 55°C. La fermeté du gel est augmentée avec un

chauffage à plus haute température. Ces gels ont des propriétés se situant entre l'élasticité

de la gélatine et la fragilité de l'agar et ils montrent une bonne capacité de rétention d'eau. À

cause de ces propriétés, le curdlane est utilisé au Japon pour améliorer et modifier la texture

des aliments comme le tofu, les pâtes de poisson et les gels de fèves (Sutherland 1998).

Le pullulane est un α-D-glucane avec des liaisons α-1,6 linéaires, incluant des molécules de

maltotriose et maltotétraose liées α-1,4, et ayant une très bonne solubilité dans l'eau ainsi

qu'en présence d'ions. Ce polysaccharide, synthétisé par Aureobasidium pullulans, est

utilisé au Japon comme film d'emballage alimentaire. Une solution du polymère peut être

6

appliquée directement sur l'aliment et former une couche sans odeur et sans goût

(Sutherland 1998).

Le gellane est un polymère linéaire de 500 kDa, composé d'une unité répétitive de quatre

monomères avec des groupements O-acétyle et glycéryl. Produit par Sphingomonas

paucimobilis, il forme dans sa forme native des gels faibles, élastiques et thermoréversibles.

Il peut former des gels avec une vaste gamme de propriétés par un contrôle du degré de

l'acylation. Ce polymère est permis comme additif alimentaire aux États Unis et en Europe

et commercialisé sous le nom de Kelogen® et Gelrite®. Le gel est caractérisé par une

bonne saveur et est stable sur une vaste gamme de valeurs de pH. Ce polymère est aussi

utilisé pour remplacer l'agar dans les milieux de culture microbiologiques et il est utilisé

comme agent gélifiant dans des produits cosmétiques (Sutherland 1998).

Le xanthane est sans doute le vaisseau amiral parmi les EPS commercialisés et il est permis

comme additif alimentaire aux États Unis et en Europe depuis longtemps. Il est synthétisé

par Xanthomonas campestris et se compose d'une unité répétitive pentasaccharidique, une

épine dorsale cellulosique avec une ramification trisaccharidique contenant le mannose,

l'acide gluconique, l'acétate et le pyruvate. Le degré de ramification et d'acylation peut

différer selon la souche productrice et donner au produit des caractéristiques différentes. En

général, le xanthane se dissout très bien dans l'eau et ses solutions sont pseudoplastiques. Il

peut être utilisé dans une vaste gamme d'aliments, car il est compatible avec la plupart des

autres ingrédients alimentaires, tel que les protéines, les lipides et les autres

polysaccharides. De plus, il est stable dans des conditions acides, ce qui est important dans

plusieurs produits comme les vinaigrettes ou le yoghourt. Le xanthane est souvent utilisé en

combinaison avec d'autres polysaccharides, comme la gomme de caroube, à cause de l'effet

synergique entre ces polymères. Un mélange de deux polymères forme un gel très stable,

bien que chaque polymère seul ne gélifierait pas.

Le dextrane est synthétisé par Ln. mesenteroides dans une solution de saccharose, mais il

peut aussi être produit à partir d'un extrait enzymatique extracellulaire, la dextrane-sucrase.

Il est utilisé, par exemple, dans la récupération assistée de pétrole, comme couche

protectrice pour les graines de céréales, comme agent défloculant pour l’industrie du papier

et, dans le domaine alimentaire, pour la stabilisation et l’épaississement des sirops (Cerning

7

1994). De plus, le dextrane est utilisé comme additif dans le plasma sanguin et pour

moduler l’écoulement du sang.

Il est à noter que la présence d'EPS n'est pas souhaitée dans certains procédés de fabrication

et dans certains produits. Le dextrane, par exemple, a été découvert par accident. Des

mélasses transportées par bateau ont pris une consistance gélifiée et n'ont pas pu être

pompées. La source de ce problème a été une croissance de Ln. mesenteroides dans les

cales du bateau et la transformation du saccharose en dextrane. De plus, la production

d'EPS par certaines souches de Pediococcus dans les vins et les bières et par des souches du

genre Lactobacillus ou Leuconostoc sur des produits carnés emballés sous vide est non-

souhaitée car elle représente une altération du produit rendant celui-ci impropre à la

consommation.

1.2 Exopolysaccharides des bactéries lactiques

En raison de leur forte production, une grande partie des recherches sur les EPS s'est

concentrée sur les bactéries à Gram-negative (Ricciardi et Clementi 2000). Ces bactéries ne

sont pas reconnues comme étant de grade alimentaire et le processus d'approbation de leur

EPS est long. Par contre, les bactéries lactiques (LAB) sont reconnues comme GRAS

(Generally Recognized As Safe) ce qui rend leurs EPS très intéressants pour l'industrie

agroalimentaire (De Vuyst et al. 2001).

Les bactéries lactiques, en raison de leurs caractères technologiques, nutritionnels et

éventuellement thérapeutiques, jouent un rôle central dans le traitement du lait pour obtenir

des produits fermentés comme les fromages et les yoghourts. Par la fermentation, les

bactéries lactiques confèrent les propriétés organoleptiques et rhéologiques particulières

aux produits laitiers fermentés. Pour être classifiée comme bactérie lactique, une souche

doit être Gram-positive, catalase et oxydase négative.

La fermentation est connue depuis des siècles comme procédé de préservation et de

conservation des aliments. Encore aujourd'hui, une vaste gamme d'aliments et de boissons

fermentés est produit à l'aide de différents ferments et technologies. Les propriétés

importantes d'un ferment sont l'acidification rapide, la préservation microbienne du lait, la

8

formation de saveurs spécifiques, les capacités texturantes et les bienfaits pour la santé. La

production d'acides organiques durant la croissance bactérienne cause une acidification du

produit et protège ainsi contre la prolifération des pathogènes.

1.2.1 Composition et structure

Un grand nombre d’EPS microbiens, dont certains possèdent une importance industrielle,

sont des homopolysaccharides. Quoique la chaîne du polymère se compose d’un seul type

de monomère, les propriétés des homopolysaccharides peuvent varier énormément à cause

de leurs structures différentes. Le curdlane, la cellulose et le dextrane, par exemple,

montrent des comportements très différents concernant leur capacités épaississantes, bien

que seul le D-glucose compose leur chaîne. Les homopolysaccharides peuvent être classés

en quatre groupes: α-D-glucanes, β-D-glucanes, fructanes et autres comme polygalactanes.

Les homopolysaccharides ont des poids moléculaires très élevés. Ainsi, la masse

moleculaire du dextrane produit par Ln. mesenteroides NRRL B-512F varie entre 6.2 et

7.1 · 106 Da, et celles des levanes et fructanes, produits par S. mutans vont jusqu'à

21.6 · 106 Da et 12.4 · 106 Da, respectivement (Cerning 1990). La Fig. 1.1 montre comme

exemple la structure du dextrane qui est un homopolymère.

Fig. 1.1 Structure du dextrane, un homopolymère.

Les hétéropolysaccharides microbiens sont composés principalement d’unités répétitives,

variables dans leur taille, soit des di- à octasaccharides. En général, ils ont des poids

9

moléculaires élevés de 5 · 105 à 2 · 106 Da et sont formés d'unités répétitives de 1 à 8

monosaccharides. Parmi ces sucres monomères on trouve le glucose, le galactose, le

rhamnose, le mannose, le N-acétylglucosamine et l'acide glucuronique. De plus, il y a aussi

des résidus qui ne sont pas des sucres, comme le phosphate, l'acétyle et le glycérol. Les

différentes structures des hétéropolysaccharides ont été résumées par De Vuyst et Degeest

(1999b), Riccardi et Clementi (2000), De Vuyst et al. (2001) et Ruas-Madiedo et al.

(2002a). La Fig. 1.2 présente la structure de l'unité répétitive de l'EPS synthétisé par

Lb. rhamnosus RW-9595M. Il s'agit d'un heptasaccharide contenant du glucose, galactose

et rhamnose dans le rapport 2:1:4 et un groupement pyruvate.

α-D-Galp

[3)-α-L-Rhap-(1→3)-β-D-Glcp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→2)-α-D-Glcp-(1→]n

1↓2

6H3C

4HO2CR

Fig. 1.2 Structure de l'EPS de Lb. rhamnosus RW-9595M (Van Calsteren et al. 2002).

1.2.2 Fonctionnalité des hétéropolysaccharides

1.2.2.1 Fonctionnalité technologique

La fermeté, la consistance et la capacité de rétention d'eau sont des caractéristiques

importantes dans beaucoup de produits laitiers comme le yoghourt, le fromage et les laits

fermentés. Elles sont fortement influencées par le ferment utilisé. Ainsi, durant la

production d'un yoghourt avec des souches filantes, la fermeté du produit est réduite par la

production d'EPS (Laws et Marshall 2001; Marshall et Rawson 1999). La microscopie

confocale montre des espaces vides autour des bactéries productrices d'EPS dans un

yoghourt, ce qui affecte l'intégrité de la matrice protéique (Hassan et al. 1995). Ainsi, on

constate que des yoghourts faits avec des cultures productrices d'EPS montrent une

rétention d'eau accrue et une susceptibilité diminuée envers la synérèse (Wacher-Rodarte et

al. 1993).

Même si la contribution des EPS à la viscosité des laits fermentés est une supposition

généralement acceptée, il y a très peu d'études caractérisant les EPS sur les aspects

10

rhéologiques. D'ailleurs, il n'y a pas de corrélation claire entre la viscosité des laits

fermentés et la concentration en EPS (Wacher-Rodarte et al. 1993). Sebastiani et Zelger

(1998) n'ont pas pu trouver un rapport entre la quantité d'EPS produite par différentes

souches thermophiles et la viscosité du lait et du milieu M17 fermentés. D'autre part, un

ajout de peptone au milieu a augmenté considérablement la production d'EPS par une

souche de S. thermophilus, de même que la viscosité du milieu. Bouzar et al. (1997) et

Dupont et al. (2000) ont également observé une augmentation de la viscosité du lait

fermenté au cours de la culture avec des souches productrices d'EPS et ont suggéré que la

production d'EPS en est responsable.

Les propriétés rhéologiques des EPS dépendent de plusieurs facteurs. Tout d'abord, la

viscosité intrinsèque est une fonction de la masse moléculaire et du rayon hydrodynamique

du polymère (Tuinier et al. 1999a). Ce rayon est une mesure de la grandeur du polymère et

dépend de sa masse moléculaire et de la flexibilité de la chaîne polymèrique (Tuinier et al.

1999b). Afin d'obtenir une viscosité élevée, la masse moléculaire doit être haute et la

chaîne doit être rigide. La masse moléculaire d'un EPS produit par Lb. sake 0-1 est

comparable au xanthane, avec respectivement 6 · 106 Da et entre 4 · 106 et 9 · 106 Da, mais

sa viscosité est plus élevée (van den Berg et al. 1995). Dans ce cas, c'est la présence du

groupe phosphate avec sa charge négative qui augmente le volume hydrodynamique et la

viscosité intrinsèque (Ruas-Madiedo et al. 2002a). De plus, les différentes ramifications de

la structure des EPS et les interactions des EPS avec d'autres constituants du lait comme les

caséines contribuent aux différents comportements rhéologiques observés.

Récemment, les caractéristiques moléculaires des EPS de plusieurs souches de Lactococcus

lactis ssp. cremoris ont été corrélées avec la viscosité des laits fermentés (Ruas-Madiedo et

al. 2002b). Les auteurs ont montré qu'un EPS produit in situ dans des quantités typiques

d'environ 100 mg/l n'augmente pas significativement la viscosité du lait si sa viscosité

intrinsèque est plus petite que 1.5 m3 kg-1.

1.2.2.2 Fonctionnalité physiologique

Les effets bénéfiques des bactéries lactiques pour la santé du consommateur sont reconnus

depuis longtemps. Déjà, le zoologiste et microbiologiste Ukrainien Ilia Ilitch Metchnikov

11

(1845-1916) a mis en rapport la longévité de certains peuples, dont les Bulgares, et la

protection de l'organisme contre plusieurs maladies par la consommation de laits fermentés

et ainsi l'indigestion de grands quantités de bactéries lactiques. Aujourd'hui, l'incorporation

des bactéries dites probiotiques dans l'alimentation humaine a conduit à l'apparition de

nouveaux produits laitiers dont certains ont un succès considérable sur le marché. Un

probiotique est un supplément alimentaire microbien vivant qui a des effets bénéfiques sur

son hôte en améliorant l'équilibre de la flore intestinale, tandis qu'un prébiotique est un

ingrédient alimentaire non digestible qui a des effets bénéfiques sur son hôte en stimulant

de façon sélective la croissance et/ou l'activité d'une ou plusieurs bactéries présentes dans le

côlon (Gibson et Roberfroid 1995). Les synbiotiques correspondent aux produits dans

lesquels un probiotique et un prébiotique sont présents (Gibson et Roberfroid 1995).

Il a été proposé que l'effet sur la santé des LAB produisant des EPS est attribuable aux

activités biologiques de ce biopolymère. Les EPS pourraient contribuer à la santé humaine

comme prébiotique ou grâce à leurs propriétés anti-tumorales, antivirales, anti-cancérigènes

et immunomodulatrices (De Vuyst et Degeest 1999b). De plus, une diminution du taux de

cholestérol chez des rats ayant consommé du lait fermenté par la souche L. lactis spp.

cremoris SBT 0495 a été observée et attribuée à l'EPS produit par cette souche (Nakajima

et al. 1992).

L'EPS de Lb. rhamnosus RW-9595M a été testé in vitro pour ses propriétés

immunomodulatrices sur des cellules de souris et humaines (Chabot et al. 2001). Les

auteurs montrent une stimulation de la production de TNF, IL-6 et IL-12 des cellules

humaines et des souris et de IFN-γ de splénocytes des souris. Ces résultats suggèrent la

possibilité de stimuler le système immunitaire par l'EPS des LAB, dans les individus

sensibles à un tel stimulus (Chabot et al. 2001).

La susceptibilité à la digestion pourrait être une caractéristique importante pour le rôle

possible d'un EPS comme prébiotique, car, comme déjà mentionné, une des caractéristiques

d'un prébiotique est sa non-digestibilité par l'humain. En soumettant la souche L. lactis ssp.

cremoris MG1614 et son variant isogénique NZ4010 et producteur d'EPS à des conditions

de digestion in vitro, Looijesteijn et al. (2001) ont trouvé que la présence de l'EPS ne

protège pas la souche productrice lors du transit digestif, même si l'EPS n'était pas dégradé.

12

Lors d'une étude de biodégradabilité des EPS par des microorganismes gastrointestinaux

humains (Ruijssenaars et al. 2000), les EPS produit par S. thermophilus SFi39 et SFi12 ont

été dégradés contrairement à ceux produits par Lb. sake 0-1, S. thermophilus SFi20 et

Lb. helveticus Lh59. Afin de prouver le potentiel prébiotique des EPS des LAB, des études

supplémentaires sur leur biodégradabilité et leur décomposition par la communauté

bactérienne gastro-intestinale doivent être réalisées.

Plusieurs études ont proposé que les EPS ont une activité anti-cancérigène. Kitazawa et al.

(1991) ont postulé que l'EPS produit par L. lactis ssp. cremoris KVS 20 est responsable

d'un effet anti-tumoral de cette souche. Ceci a été observé lors d'injections intrapéritonéales

chez des souris. Dans une étude subséquente, Kitazawa et al. (1996) ont attribué à un

exophosphopolysaccharide produit par cette souche une activation des macrophages et

l'induction de la production de cytokine. Kitazawa et al. (1998) ont fractionné l'EPS produit

par Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus OLL 1073R-1 en un polysaccharide neutre et un

polysaccharide acide. La fraction acide composée de glucose, galactose et phosphore a

démontré une activité mitogénique sur les lymphocytes B, dirigée par le groupement

phosphate. Une activité mitogénique a aussi été observée in vitro pour un polysaccharide

d'une taille de 1.5 · 106 Da produit par Bifidobacterium adolescentis M101-4 (Hosono et al.

1997). Un effet anti-cancérigène a été trouvé in vitro et in vivo pour les polysaccharides

capsulaires de Bifidobacterium breve YIT4014 et 4043 et Bifidobacterium bifidum YIT

4007 (Nagaoka et al. 1994). Ces polysaccharides étaient composés principalement de

rhamnose. Il a été montré que les polysaccharides contenant plus de 60% de rhamnose se

sont montrés plus efficaces pour le traitement du cancer gastro-intestinal.

Tous les travaux mentionnés jusqu'ici ont été fait in vitro ou par injection de l'EPS à des

rats ou des souris. Très peu d'expériences ont été réalisées in vivo avec administration orale

de l'EPS. Zubillaga et al. (2001) ont administré l'EPS KGF-C oralement. Les auteurs ont

observé un retardement de la croissance des cellules cancéreuses par cet EPS soluble dans

l'eau et extrait de grains de kéfir.

13

1.2.3 Biosynthèse des hétéropolysaccharides des bactéries lactiques

Le site de la synthèse des EPS et la nature des précurseurs permettent de distinguer deux

types principaux de biosynthèse par les LAB: la synthèse en dehors de la cellule

(produisant des homopolysaccharides) ou celle à la membrane cellulaire (produisant des

hétéropolysaccharides). Dans le premier cas, ce sont principalement, Ln. mesenteroides

(dextranes), S. mutans (mutanes) et S. salivarius (levanes) qui produisent des

homopolysaccharides; alors que les hétéropolysaccharides sont produits par des bactéries

lactiques mésophiles (ex. L. lactis, L. cremoris, Lb. casei) et thermophiles (ex. Lb.

bulgaricus, S. thermophilus).

Les homopolysaccharides sont synthétisés en dehors de la cellule grâce à des enzymes

excrétés par la bactérie. Dans la production du dextrane, par exemple, seulement une

enzyme est utilisée, la dextranesucrase. Cet enzyme est spécifique pour le sucrose et

l'énergie pour la polymérisation vient de son hydrolyse. Le dextrane peut être produit à

partir de cultures cellulaires de Ln. mesenteroides ou de préparations de l'enzyme sans

cellules vivantes, éventuellement immobilisée (Cerning 1990).

La synthèse des hétéropolysaccharides, par contre, a lieu à la membrane cytoplasmique.

L'EPS est construit par polymérisation des unités répétitives formées dans le cytoplasme

(Cerning 1990; De Vuyst et Degeest 1999b). L'unité répétitive est assemblée à la

membrane cytoplasmique par addition successive d'unités glucosyle au polysaccharide

naissant qui est probablement ancré sur un transporteur lipidique, nommé C55. Après

complétion de l'unité répétitive, celle-ci est transportée au travers de la membrane cellulaire

et polymérisée à l'extérieur de la cellule pour former l'hétéropolysaccharide, avec un poids

moléculaire finale élevé d'environ 1 · 106 Da. La synthèse des hétéropolysaccharides par

des LAB implique donc un grand nombre d’enzymes différentes comme, par exemple,

l’UDP-glucose déshydrogénase, la glucosyl-transférase et la galactosyl-transférase.

Plusieurs de ces enzymes ne sont pas seulement actives dans la synthèse des EPS, mais

aussi impliquées dans d’autres activités métaboliques. La Fig. 1.3 montre les voies

métaboliques impliquées dans le catabolisme des sucres et dans l'anabolisme des EPS chez

certaines bactéries lactiques. On voit l'importance des sucres nucléotidiques, dérivés des

14

sucres-1-phosphates qui, après avoir été transformés par des enzymes d'épimérisation, de

décarboxylation, de phosphorylation et de déshydrogénation, sont assemblés pour former

l'unité répétitive de l'EPS. Les précurseurs intracellulaires ont été dosés par résonance

magnétique nucléaire 31P pour deux souches de Lactococcus lactis, une souche productrice

(EPS+) et une non-productrice (EPS-) (Ramos et al. 2001). Les concentrations des

précurseurs d'EPS, l'UDP-glucose et l'UDP-galactose, ont été plus faibles dans la souche

EPS+ que dans la souche EPS-. Les précurseurs de la biosynthèse du peptidoglycane,

l'UDP-N-acétylglucosamine et l'UDP-N-acétylmuramoyl-pentapeptide, ont été les produits

derivés des UDP-sucres majeurs détectés chez les deux souches, mais leur concentration a

été plus élevée dans la souche EPS+, ce qui confirme la compétition entre la synthèse d'EPS

et la croissance cellulaire (Ramos et al. 2001).

Une fois que les sucres nucléotidiques sont formés, les glycosyl-tranférases commencent

leur activité pour la formation de la chaîne de sucres (Fig. 1.4). Ces enzymes spécifiques

attachent le premier monomère au transporteur lipidique qui se trouve ancré à la paroi

cytoplasmique. Dans la synthèse des hétéropolysaccharides, les transporteurs lipidiques

semblent jouer un rôle important. Ce sont des esters phosphates et des alcools isoprénoïdes

à longues chaînes, identiques à ceux décrits dans la biosynthèse des lipopolysaccharides, de

l’antigène O et du peptidoglycane (Sutherland 1990). Le rôle des transporteurs lipidiques

dans la synthèse des EPS serait de servir d'ancrage et de faciliter la formation précise et

ordonnée de la chaîne glucidique et le transport à travers la membrane cellulaire. Les sous-

unités répétitives sont assemblées sur le côté interne de la membrane et ensuite chaque

sous-unité est transféré au travers la membrane. Une fois à l'extérieur de la cellule,

plusieurs centaines, voir milliers, d'unités répétitives sont liés ensemble par une

polymérase. Certains polysaccharides sont polymérisés sur le côté interne de la membrane

cytoplasmique suivi de l'exportation du polymère. Certaines protéines, liés à des lipides,

pourraient jouer un rôle comme flippase-exportateur et polymérase de l'unité répétitive (De

Vuyst et al. 2001). Après l'excrétion, le polymère est soit libéré ou reste attaché à la surface

de la cellule formant la capsule. Le mécanisme de la polymérisation, de la détermination de

la longueur de chaîne, et de l'exportation n'est pas encore clair.

15

Fig. 1.3 Schéma des voies métaboliques impliquées dans le catabolisme du

lactose/galactose et la biosynthèse des EPS par Lactococcus lactis Gal+ (via les systèmes

phosphoénolpyruvate PEP et phospho-transférase PTS) et par Lactobacillus delbrueckii

ssp. bulgaricus et Streptococcus thermophilus Gal- (via l'antiport lactose/galactose) (De

Vuyst et al. 2001).

Les numéros se rapportent aux enzymes impliquées: (1) phospho-β-galactosidase, (2) β-galactosidase, (3) glucokinase, (4) phosphoglucomutase, (5) UDP-glucose pyrophosphorylase, (6) UDP-galactose 4 epimérase, (7) dTDP-glucose pyrophosphorylase, (8) deshydratase, (9) epimérase réductase, (10) phosphoglucose isomérase, (11) 6-phosphofructokinase, (12) fructose-1,6-bisphosphatase, (13) fructose-1,6-di-phosphate aldolase, (14) galactose 6-phosphate isomérase, (15) tagatose 6-phosphate kinase, (16) tagatose-1,6-di-phosphate aldolase, (17) galactokinase, (18) galactose-1-phosphate uridylyltransférase, (19) glutamine-fructose-6-phosphate transaminase, (20) glucosamine-phosphate acétyltransférase, (21) acétylglucosaminephosphate mutase, (22) UDP-glucosamine pyrophosphorylase, (23) UDP-N-acétylglucosamine 4-epimérase.

16

Les alcools isoprénoïdes ne sont pas seulement impliqués dans la production des

lipopolysaccharides, mais aussi dans celle des peptidoglycanes et acides téichoïques.

Comme la disponibilité de l’alcool isoprénoïde est essentielle pour la production des EPS,

la compétition pour cette substance a un effet direct sur la production. Si les bactéries ont

une croissance lente, leur besoin en phosphate d’isoprénoïde pour la formation des

polymères de la paroi est réduit et la production d’EPS dispose d'une plus grande quantité

de ces molécules. Pour cette raison, une meilleure production d’EPS dans des conditions

moins propices à la croissance des bactéries a été souvent observée, surtout pour les LAB

mésophiles (Cerning 1990; De Vuyst et Degeest 1999b) (voir aussi chapitre 1.2.5.5).

Fig. 1.4 Modèle de la biosynthèse d'EPS par Lactococcus lactis ssp. lactis NIZO B40 (Van

Kranenburg et al. 1998)

Après la formation des unités répétitives, celles-ci sont transportées au travers de la

membrane, probablement à l'aide d'une flippase, puis polymérisées et excrétées dans le

milieu environnant (Van Kranenburg et al. 1997).

17

Depuis une décennie, il y a eu plusieurs études sur les mécanismes de la biosynthèse des

EPS et les voies métaboliques sont maintenant relativement bien connues. Ceci permet de

mieux comprendre l'influence des conditions de culture et du milieu de culture sur la nature

et la composition des EPS (voir chapitre 1.2.5). De plus, une connaissance approfondie des

voies métaboliques permet d'identifier les enzymes clés de la production d'EPS et ainsi, par

le génie génétique, de moduler cette production et de créer des souches hyperproductrices

d'EPS ayant une structure définie (Ramos et al. 2001).

1.2.4 Génétique de la production des hétéropolysaccharides

Le premier travail portant sur les gènes structuraux impliqués dans la production des EPS

par les LAB a porté sur les gènes chez S. thermophilus Sfi6 (Stingele et al. 1996). Les

auteurs ont trouvé un seul locus chromosomique responsable pour la production d'EPS. Par

la suite, Van Kranenburg et al. (1997) ont identifié les gènes responsables de la production

d'EPS chez L. lactis NIZO B40 (Van Kranenburg et al. 1997) et ont montré que ces gènes

sont de nature plasmidique. Depuis, plusieurs recherches sur la génétique de la biosynthèse

d'EPS par les LAB ont été réalisées et les gènes impliqués ont été identifiés (pour une revue

récente voir Jolly et Stingele 2001). Dans tous les cas, ces gènes sont organisés dans un

locus montrant une bonne conservation en ce qui concerne leur organisation (Boels et al.

2001). La séquence des fonctions de tout ces opérons semble être comme suit: régulation,

détermination de la longueur de la chaîne, biosynthèse de l'unité répétitive, polymérisation

et exportation (Jolly et Stingele 2001).

Les deux opérons eps des LAB les mieux caractérisés sont probablement ceux de L. lactis

NIZO B40 et de S. thermophilus Sfi6. L. lactis NIZO B40 héberge le plasmide pNZ4000 de

42,180 pb qui contient l'opéron eps de 12 kb (voir Fig. 1.5) (van Kranenburg et al. 2000).

Par la comparaison des séquences, les fonctions de la plupart des gènes ont pu être

trouvées. Les produits des gènes epsDEFGH et epsJ sont supposés agir comme

glycosyltransférases avec comme premier enzyme le EpsD qui commence avec la

construction de la chaîne glucidique de l'unité répétitive en attachant une molécule glucose

de l'UDP-glucose à un transporteur lipidique (Van Kranenburg et al. 1997). Ensuite, les

autres glycosyltransférases EpsE, EpsF, EpsG continuent à construire l'épine dorsale de

18

l'unité répétitive. EpsH et EpsJ sont supposés être impliqués dans l'attachement des

molécules de ramification, le rhamnose et le galactose-phosphate. EpsI et EpsK sont

homologues à des protéines de polymérisation et d'exportation impliquées dans la

production des lipopolysaccharides chez les bactéries Gram-négatives.

Chez S. thermophilus Sfi6, un locus chromosomique d'une taille de 14.52 kb regroupe les

13 gènes epsA à epsM dont les produits sont impliqués dans la production de l'EPS

(Stingele et al. 1996). La Fig. 1.5 montre l'organisation de ce locus. L'expression des gènes

epsE, epsF, epsG et epsI dans Escherichia coli et des réactions des glycosyl transférases in

vitro a permis d'identifier les produits EpsE comme étant une β-galactose transférase, EpsG

une α-1,3-N-acétylgalactosamine transférase et EpsI une β-1,3-glucose transférase. EpsF

serait alors un α-1,6-galactose transférase, car epsF est le seul gène codant pour une

glycosyltransférase qui n'a pas été assigné. Les gènes epsC et epsD sont putativement

impliqués dans la polymérisation des unités tandis que epsM serait responsable de

l'exportation. Finalement, epsJ serait impliqué dans la polymérisation des unités répétitives.

Ces dernières années, plusieurs travaux sur la biosynthèse des EPS par les LAB ont été

conduits. Pour certaines souches, les séquences de gènes codant pour la production d'EPS,

la structure de l'EPS correspondant et les voies métaboliques des sucres sont connues.

Cependant, il y a encore une manque de donnés sur le rapport entre les séquences de gènes

et la production d'EPS. Il reste à éclaircir s'il y a des éléments contrôlant l'expression des

gènes, où si les gènes sont toujours actifs, et le niveau de contrôle se trouve plutôt avec

l'activité des enzymes impliquées. Néanmoins, il a déjà été possible de contrôler la

production d'EPS non seulement par les conditions de fermentation mais aussi en

appliquant des techniques génétiques. Les premiers résultats utilisant l'expression

hétérologue des gènes eps de S. thermophilus Sfi6 dans la souche L. lactis MG1363 EPS-

montrent que cette technique peut résulter dans la production d'EPS par la souche réceptrice

(Stingele et al. 1996). Toutefois, seulement de faibles quantités d'EPS ont été produites

dans l'hôte hétérologue. L'EPS produit avait une masse moléculaire semblable mais une

structure différente de celle de la souche originale. Même si une meilleure connaissance des

mécanismes impliqués est encore nécessaire, ces résultats sont très prometteurs pour des

travaux futurs. La sur-expression des gènes eps peut résulter dans des productivités

19

augmentées et les EPS produits peuvent avoir des structures et des propriétés modifiées et

ils pourraient être utilisés comme nouveaux agents épaississants. Cependant, les LAB

génétiquement modifiées et leur produits doivent être approuvés légalement et être acceptés

par les producteurs et consommateurs.

Fig. 1.5 Organisation des gènes codant pour la production d'EPS chez Lactococcus lactis

NIZO B40 (plasmidique) et chez Streptococcus thermophilus Sfi6 (adapté de De Vuyst et

al., 2001).

1.2.5 Production des hétéropolysaccharides par les bactéries lactiques

Les propriétés des EPS des LAB peuvent différer considérablement d'une souche à l'autre.

Leur biosynthèse et sécrétion peut avoir lieu durant des phases de croissance différentes. En

outre, les conditions de croissance comme la composition du milieu de culture, la

température, le pH, la tension d'oxygène et la vitesse d'agitation peuvent influencer la

quantité mais aussi la composition et la taille de l'EPS. Cependant, des résultats

contradictoires ont été rapportés concernant l'influence de ces paramètres sur la production

des EPS.

20

1.2.5.1 Milieux utilisés pour la production d'EPS

Au début des recherches sur la production des EPS par les LAB, aucune production n'a été

observée dans des milieux semi-définis comme le MRS. Ainsi, plusieurs travaux ont été

réalisés dans le lait (Cerning et al. 1986; 1988; Cerning et al. 1990; 1992; De Vuyst et al.

1998; Garcia-Garibay et Marshall 1991) ou dans un milieu à base du lactosérum (Gassem et

al. 1997a; Macedo et al. 2002a; Macedo et al. 2002b). Seulement récemment des milieux

semi-synthétiques et synthétiques ont été utilisés (Cerning et al. 1994; Dupont et al. 2000;

Grobben et al. 2000; Grobben et al. 1995; Grobben et al. 1996; Grobben et al. 1997;

Kimmel et Roberts 1998; Petry et al. 2000; Pham et al. 2000; Torino et al. 2000; van den

Berg et al. 1995). En effet, un milieu chimiquement défini est plus approprié pour l'étude

de la biosynthèse des EPS par les LAB et des voies métaboliques impliquées. Dans ces

milieux il n'y a pas de composants qui interférent avec la quantification et avec l'analyse

des EPS. Pourtant, les composants des milieux complexes, comme le peptone ou l'extrait de

bœuf ou de levure, permettent une bonne croissance des LAB et souvent même une bonne

production d'EPS, mais ils contiennent d'autres polymères pouvant interférer avec le dosage

et l'analyse des EPS (Kimmel et Roberts 1998; Torino et al. 2000).

1.2.5.2 Rendement de la production d'EPS

La production d'EPS par les souches productrices varie énormément et dépend des

conditions de culture des bactéries. Une comparaison des données de la littérature des

rendements en EPS par les LAB doit être faite avec réserve car des techniques de

quantification et des milieux de culture différents ont été utilisés. Ceci peut avoir une forte

influence sur les résultats (voir aussi chapitre 1.2.6.1). Une vue d'ensemble sur les

productions d'EPS les plus importantes est donnée dans le Tab. 1.1. En général, des

concentrations d'EPS de 50 à 600 mg/l dans des conditions optimales de production ont été

obtenues (De Vuyst et Degeest 1999b; Ricciardi et Clementi 2000). Par contre, des

productions maximales de 1.14 g/l par S. thermophilus LY03 (Degeest et de Vuyst 1999),

de 1.37 g/l par Lb. sakei 0-1 (van den Berg et al. 1995) et de 2.77 g/l par Lb. rhamnosus

RW-9595M (Macedo et al. 2002b) ont été rapportées. Un effet synergique entre les souches

thermophiles S. thermophilus et Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus a été observé dans deux

21

études différentes (Tab. 1.1). Une souche productrice d'EPS de S. thermophilus (CNRZ

1066) en combinaison avec une souche non-productrice de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus

(CNRZ 398) a produit une quantité d'EPS (800 mg/l) beaucoup plus élevée que la souche

productrice seule (Cerning et al. 1990). De plus, la production de la souche Lb. delbrueckii

ssp. bulgaricus CNRZ 1187 a été plus élevée en culture mixte avec une souche non-

productrice de S. thermophilus qu'en culture pure (Bouzar et al. 1996; 1997).

22

Tab.

1.1

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23

1.2.5.3 Effet du milieu de culture sur la production

1.2.5.3.1 Source d'azote

Plusieurs des premières recherches sur la production d'EPS par les LAB ont été conduites

avec un milieu à base du lait. Il a été observé que l'addition des caséines hydrolysées au lait

a augmenté la croissance et la production d'EPS d'une culture de Lb. delbrueckii ssp.

bulgaricus (Cerning et al. 1990; Garcia-Garibay et Marshall 1991). Toutefois, dans une

étude de Cerning et al. (1986), la caséine a stimulé la production d'EPS par Lb. delbrueckii

ssp. bulgaricus mais pas sa croissance. Néanmoins, une souche de S. thermophilus peut

produire la même quantité d'EPS dans le lait ou le lait ultrafiltré (Cerning 1990). La

stimulation de la production d'EPS par la caséine hydrolysée reste controversée. D'une part

son addition à une culture de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus dans un milieu défini MRS

n'augmente pas la production spécifique (Garcia-Garibay et Marshall 1991), mais c'est le

contraire qui se produit pour un milieu semi-défini à base de lactosérum (Kimmel et al.

1998).

Pour certaines bactéries Gram-négatif comme des souches de Xanthomonas, Pseudomonas

et Rhizobium, une limitation de l'azote résulte en une production accrue d'EPS (Sutherland

1990). Pour les bactéries lactiques, cela ne semble pas être le cas. Il semble plutôt qu'un

équilibre optimal entre la source de carbone et d'azote soit nécessaire pour obtenir des

productions élevées d'EPS (De Vuyst et Degeest 1999b). La souche L. lactis ssp. cremoris

LC 330 produit deux EPS différents (Marshall et al. 1995), un EPS neutre avec une haute

masse moléculaire et un phosphopolysaccharide chargé, d'une masse moléculaire plus

petite. Les auteurs ont montré qu'une limitation par l'azote stimule la production de l'EPS

neutre mais pas celle de l'EPS chargé. Une étude sur l'effet de la concentration de

bactocasitone entre 10 et 40 g/l dans un milieu semi-défini pour des fermentations de Lb.

delbrueckii ssp. bulgaricus RR a montré qu'une concentration de 30 g/l est optimale pour la

production d'EPS (354 mg/l) (Kimmel et al. 1998).

Une étude sur l'effet de différentes sources d'azote sur la croissance de Lb. rhamnosus

RW-9595M dans un milieu à base de perméat de lactosérum a identifié un isolat de

protéine de lactosérum, un concentré de protéine de lactosérum et un extrait de levure

24

comme étant les meilleures sources d'azote (Macedo 2001). Aucune différence significative

entre ces trois milieux a été observée pour la biomasse maximale lors des fermentations,

tandis que la production d'EPS a été maximale avec le concentré de protéine de lactosérum.

Dans un travail ultérieur sur l'effet d'une supplémentation d'un milieu à base de perméat de

lactosérum et de l'extrait de levure avec des groupes de nutriments utilisés dans la

formulation du BMM, une influence significative du groupe des acides aminés sur la

production d'EPS par Lb. rhamnosus RW-9595M a été observée (Macedo et al. 2002b).

1.2.5.3.2 Source de carbone

La source de carbone a une influence majeure sur la biosynthèse des EPS par les LAB. En

plus du type de sucre (glucose, galactose, lactose, mannose, fructose etc.) et du rapport

entre eux, la concentration des sucres peut avoir un effet stimulant sur la production

(Cerning et al. 1992; Cerning et al. 1994; Gamar et al. 1997). La production d'EPS par

Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus a été plus grande dans un milieu avec du glucose ou du

lactose que dans un milieu avec du fructose, tandis que la supplémentation en mannose a

résulté en une croissance et une production d'EPS faible (Grobben et al. 1995; Grobben et

al. 1996). Gancel et Novel (1994) ont comparé le rendement en EPS de S. salivarius ssp.

thermophilus. Le rendement avec le milieu contenant du glucose et du fructose a été plus

élevé qu’avec le lactose ou le saccharose, tandis que la prolifération des bactéries a été

moins rapide. Cerning et al. (1994) ont étudié la production d’EPS par Lb. casei CG11 en

variant la source de carbone (galactose, glucose, lactose, saccharose, maltose, mélibiose).

Ils ont trouvé qu’avec le lactose et le galactose, la production d’EPS a été la plus faible,

alors que le glucose a été de loin la source la plus efficace. Pour Lb. rhamnosus C83, le

mannose ou une combinaison de glucose et de fructose ont favorisé la production d'EPS

(Gamar et al. 1997). Une combinaison de glucose et de lactose dans un milieu de culture a

augmenté la production d'EPS par S. thermophilus LY03 et S. thermophilus Sfi20, comparé

avec un milieu de culture avec le glucose ou le lactose seul, même si la concentration totale

des sucres était la même (7.5%) (Degeest et de Vuyst 2000; Degeest et al. 2001b).

25

1.2.5.3.3 Minéraux et vitamines

Les minéraux et les vitamines ont aussi une forte influence sur la croissance des LAB et

leur production d'EPS. Par exemple, la production d'EPS par Lb. casei CRL 7 a doublé

après ajout de Mn2+ dans un milieu défini (1995a; Mozzi et al. 1995b). Grobben et al.

(1998) ont examiné les besoins nutritionnels de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus NCFB 2772

en utilisant un milieu défini. Ils ont trouvé une augmentation de la production spécifique

d'EPS de 130 à 250 mg/l après omission de plusieurs vitamines non-essentielles du milieu

défini. Enfin, Macedo et al. (2002b) n'ont pas trouvé un effet significatif du groupe des

vitamines, utilisées dans la formulation du BMM, sur la production d'EPS par

Lb. rhamnosus RW-9595M dans un milieu à base de perméat de lactosérum et d'extrait de

levure. Toutefois, l'adition du groupe des minéraux a eu une influence majeure et a

augmenté considérablement la production d'EPS. La production maximale en EPS dans

cette étude de 2775 mg/l a été atteint dans un milieu perméat de lactosérum supplémenté

avec d'extrait de levure, des minéraux, des sels et des acides aminés.

1.2.5.4 Effet du milieu sur la composition de l'EPS

D'après Sutherland (1972), la composition du milieu n'a pas d'effet sur la composition de

l'EPS produit. Cependant, un changement majeur de la composition en monosaccharides

des EPS produits par les LAB selon la composition du milieu de culture a depuis souvent

été observé. L'addition de glucose et de saccharose au milieu lait ou lait ultrafiltré n'a pas

seulement stimulé la production d'EPS par Lb. casei mais aussi changé sa composition, le

glucose devenant le monosaccharide dominant (Cerning et al. 1992). Contrairement à l'EPS

produit par cette souche sur le milieu BMM (Cerning et al. 1994), le rhamnose ne se

retrouvait plus dans la composition de l'EPS. Les auteurs ont conclu que cette souche était

capable de produire plus qu’un seul type d’EPS. En outre, ils ont trouvé que la dégradation

des EPS par la glycohydrolase a été arrêtée après avoir supplémenté le milieu de

fermentation avec du glucose. On peut en conclure que, soit l’activité de l’enzyme a été

inhibée en présence de glucose, soit le changement de composition des monomères de

l’EPS a rendu l’enzyme, fortement spécialisé, incapable de dégrader le polymère. Grobben

et al. (1996) ont montré que la quantité et la composition de l'EPS

26

(galactose : glucose : rhamnose; 6.8 : 1.0 : 0.7) produit par Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus

NCFB 2772 dans des cultures en continu ne change pas si la culture croît sur du lactose au

lieu de glucose. Cependant, avec du fructose comme source de carbone, la production a été

inférieure et le rhamnose a été absent de la composition de l'EPS (galactose : glucose;

2.5 : 1.0). Les auteurs ont aussi conclu que la souche produit plus qu'un polysaccharide.

Dans une étude ultérieure (Grobben et al. 1997), deux EPS avec des masses moléculaires

différentes ont été caractérisés. La production d'un EPS d'une masse moléculaire élevée,

ayant une composition en galactose, glucose et rhamnose dans un rapport de 5.0 : 1.0 : 1.0,

a été dépendante de la source de carbone, tandis que l'EPS d'une masse moléculaire plus

petite, ayant une composition en galactose, glucose et rhamnose dans un rapport de

11.0 : 1.0 : 0.4, a été produit plus constamment, indépendamment de la source de carbone.

1.2.5.5 Cinétique de la production des EPS par les bactéries lactiques

Il semble que les LAB mésophiles ont une production maximale d'EPS dans des conditions

de croissance sous-optimales (Cerning et al. 1992; Gamar et al. 1997; Gancel et Novel

1994; Gassem et al. 1997a; Kojic et al. 1992; Looijesteijn et al. 1999; Marshall et al. 1995;

Mozzi et al. 1995a; van den Berg et al. 1995), tandis que la production d'EPS des LAB

thermophiles semble être associée à la croissance (De Vuyst et al. 1998; Garcia-Garibay et

Marshall 1991; Grobben et al. 1995; Mozzi et al. 1995a). Si la production d'EPS est

associée à la croissance, la biosynthèse de l'EPS commence directement avec la croissance

bactérienne et montre la cinétique d'un métabolite primaire. Par exemple, une culture de

Lb. rhamnosus C83 dans un milieu défini sans contrôle de pH a montré une production

simultanée d'EPS, de lactate et de la biomasse (Gamar et al. 1997). Les auteurs ont conclu à

une production d'EPS associée à la croissance. Par contre, une culture de Lb. rhamnosus R

dans le milieu BMM et avec contrôle de pH a commencé à produire l'EPS seulement à la

fin de la phase exponentielle de croissance (Pham et al. 2000). De plus, la production d'EPS

a continué pendant la phase stationnaire de croissance dans le cas des cultures dans le

glucose, tandis que la production d'EPS a cessé dans le cas d'une culture dans un milieu

additionné de lactose. Les auteurs ont supposé que l'EPS produit par cette souche peut être

considéré plutôt comme un produit mineur détourné de la glycolyse que comme un

métabolite secondaire. De plus, la souche L. lactis ssp. cremoris NIZO B40 a produit la

27

majorité de l'EPS pendant la phase exponentielle de croissance, lorsque la souche croissait

dans un milieu avec le glucose comme source de carbone, tandis qu'avec le fructose, la

souche produisait environ 60% de l'EPS dans la phase stationnaire de croissance. Dans une

étude sur la production d'EPS par Lb. rhamnosus RW-9595M dans un milieu à base de

perméat de lactosérum additionné de yeast nitrogen base (YNB) comme source d'azote, la

température de la culture a été variée entre 22 et 42°C (Macedo et al. 2002a). Les auteurs

ont montré que la production d'EPS n'était pas liée à la croissance cellulaire pour des

températures élevées, alors que c'était le contraire à des températures sub-optimales.

Pour les LAB mésophiles, des conditions de culture comme la température, le pH ou la

composition du milieu peuvent permettre de découpler la croissance cellulaire de la

production d'EPS (Looijesteijn et Hugenholtz 1999). La production d'EPS peut être

augmentée en appliquant les conditions environnementales stimulant la biosynthèse d'EPS

une fois qu'assez de biomasse est formée (Degeest et al. 2001a). L'immobilisation cellulaire

pourrait être un moyen efficace de découpler la croissance cellulaire de la production d'EPS

et de garder une biomasse élevée dans un système de fermentation, tout en appliquant des

conditions de fermentation propices à la production d'EPS (voir chapitre 1.3).

1.2.5.6 Effets des conditions de culture

Lors des fermentations, les conditions optimales de température, pH, tension d'oxygène,

vitesse d'agitation et temps d'incubation résultent en un rendement en EPS amélioré (De

Vuyst et Degeest 1999b; Degeest et al. 2001a; Ricciardi et Clementi 2000). Cependant,

plusieurs études montrent que des températures sub-optimales influencent positivement la

production d'EPS par les LAB mésophiles et thermophiles (Cerning 1990; Cerning et al.

1992; Gamar et al. 1997; Gancel et Novel 1994; Gassem et al. 1997a; Kojic et al. 1992;

Kontusaari and Forsen 1988; Looijesteijn et Hugenholtz 1999; Marshall et al. 1995; Mozzi

et al. 1996b; van den Berg et al. 1995). Encore une fois, ces observations ont été expliquées

par la disponibilité plus élevée du transporteur lipidique chez des bactéries en croissance

lente (voir chapitre 1.2.3). Par exemple, un changement de la température de 37 à 25°C au

début de la phase exponentielle de croissance a amélioré significativement la production

d'EPS chez Lb. rhamnosus C83 (Gamar-Nourani et al. 1998). Garcia-Garibay et Marshall

28

(1991) ont trouvé une production spécifique d’EPS deux fois plus élevée pour une

température (48°C) supérieure à la température optimale de la croissance de la souche Lb.

delbrueckii ssp. bulgaricus (37 à 42°C). Cependant, une incubation à des températures sub-

optimales n'a pas changé le rendement de la production des EPS avec des bactéries

lactiques thermophiles (Sebastiani et Zelger 1998). Dupont et al. (2000) et Macedo et al.

(2002a) ont varié la température des cultures de Lb. rhamnosus RW-9595M (32 et 37°C et

dans l'intervalle 22-42°C, respectivement) dans des milieux différents. Les deux études

n'ont pas trouvé un effet significatif de la température sur la production d'EPS.

Il a été montré qu'un contrôle du pH de la culture augmente la production d'EPS comparé à

des conditions acidifiantes (De Vuyst et al. 1998; Gassem et al. 1997a; Grobben et al.

1998; Grobben et al. 1995; Mozzi et al. 1996b). Souvent, le pH optimal pour la production

d'EPS est proche de celui pour la croissance (Gamar-Nourani et al. 1998; Grobben et al.

1998; Mozzi et al. 1994; Mozzi et al. 1996b; Petry et al. 2000). Un ajustement périodique

du pH à une valeur de 6.2 lors des fermentation en batch avec Lb. delbrueckii ssp.

bulgaricus a augmenté la production des EPS, mesurée par la viscosité du milieu (Gassem

et al. 1997a). Lors d'une fermentation en continu (Gassem et al. 1997b), ce résultat a été

confirmé avec un pH de 6.5 favorisant la production d’EPS (comparé à un pH de 5.2 et de

5.8). Mozzi et al. (1996b) ont trouvé une production d’EPS considérablement plus élevée

pour Lb. casei CRL 87 avec un pH contrôlé, comparée à une culture sans contrôle du pH.

Le pH optimal pour la production d'EPS (488 mg/l) a été de 6.0 tandis que le pH optimal

pour la production spécifique (3.9 · 10-5 g EPS/g poids sec des cellules) a été de 4.0. De

plus, pour des cultures de Lb. sake 0-1, il a été observé qu'un pH plus bas (5.8) favorise la

production d'EPS, tandis qu'un pH plus élevé stimule plutôt la croissance de la souche (van

den Berg et al. 1995).

L'aération du milieu pendant la culture n'est pas nécessaire pour la production d'EPS par les

LAB. Au contraire, il semble qu'une basse tension en oxygène stimule la production (De

Vuyst et al. 1998; Looijesteijn et Hugenholtz 1999). Gamar-Nourani et al. (1998) ont

identifié une concentration d'O2 de 10% comme étant optimale pour la production d'EPS

par Lb. rhamnosus C83. Pham et al. (2000) ont étudié l'effet de l'oxygène sur la production

d'EPS par Lb. rhamnosus R. Des concentrations en oxygène basses (jusqu'à 20%) ont

29

augmenté la croissance et la production d'EPS. Cependant, la production spécifique a été

plus élevée pour des conditions anaérobe et aérobe. Les auteurs ont conclu que des

conditions de stress ont induit la production d'EPS.

Somme toute, il est à conclure que les effets des conditions de culture sur la production

d'EPS sont spécifiques pour chaque cas étudié. Les conditions de culture optimales sont à

déterminer pour chaque souche.

1.2.6 Méthodes d'analyse des EPS

1.2.6.1 Quantification

Traditionnellement, la mesure de la viscosité du milieu fermenté a été utilisée pour estimer

la production d'EPS d'une souche dans un milieu liquide (Cerning et al. 1986; Cerning et

al. 1988). Cependant, cette valeur n'est pas nécessairement corrélée avec la quantité d'EPS

produite (Sebastiani et Zelger 1998) (voir aussi chapitre 1.2.2.1) et est fonction des

interactions des EPS avec d'autres constituants du milieu. Ces interactions sont de nouveau

fonction de plusieurs facteurs comme le pH, la température et la force ionique du milieu.

Pour estimer la quantité d'EPS dans un milieu fermenté, il faudrait alors utiliser une

méthode de dosage spécifique. Cependant, une telle méthode n'existe pas. Différents

composants du milieu interfèrent avec la plupart des méthodes de dosage. Dans la plupart

des cas, une étape de purification avant le dosage est alors indispensable. L'isolement et la

purification de l'EPS produit dans un milieu complexe tel que le lait ou le lactosérum est

difficile à cause de la viscosité élevée du milieu fermenté, des faibles quantités d'EPS et de

la contamination par les protéines du lait. La première étape de purification est souvent une

centrifugation, afin de séparer les cellules du milieu. Cependant, la viscosité élevée

empêche souvent une sédimentation des cellules et rend la séparation plus difficile (Cerning

1990). L'addition d'un solvant organique au surnageant résulte en une précipitation de

toutes les macromolécules, incluant les EPS de la solution. La précipitation avec l’éthanol

s’est établie comme la méthode standard d’extraction des EPS. Il est aussi possible

d’utiliser d’autres solvants polaires de faible poids moléculaire tels que le méthanol,

l'acétone et le propane-2-ol, mais leur utilisation n’est pas compatible avec l’usage dans

30

l’industrie agro-alimentaire. L'ajout de sels peut aider à la précipitation d'un EPS chargé

(De Vuyst et Degeest 1999b). Cette étape permet d'augmenter la concentration en EPS et de

diluer les molécules de petite taille, notamment les mono- et disaccharides interférant avec

le dosage d'EPS. Une élimination complète de ces molécules est souvent obtenue par une

dialyse (Cerning 1994; Cerning et al. 1992; De Vuyst et Degeest 1999b; Grobben et al.

1995; Marshall et al. 1995). Surtout si un milieu de culture complexe comme le lait est

utilisé, l'EPS partiellement purifié est souvent encore contaminé par la partie protéique du

milieu et une précipitation avec l'acide trichloroacétique (TCA) est nécessaire (Macura et

Townsley 1984). Comme alternative, une hydrolyse des protéines avec des enzymes

protéolytiques est une bonne option pour éliminer les protéines contaminantes (Bouzar et

al. 1996; Bouzar et al. 1997; Yang et al. 1999). Gancel et Novel (1994) ont, par exemple,

ajouté la pronase pour hydrolyser les polypeptides. Un traitement avec des enzymes tels

que la désoxyribonucléase, la trypsine, la pronase et la protéinase K a aussi été

recommandé par Cerning (1990). Une fois l'EPS purifié, il est souvent concentré par

lyophilisation.

En raison de la longue durée et d'une faible exactitude des méthodes de purification

habituelles, plusieurs méthodes alternatives ont été proposées. Par exemple, Nakajima et al.

(1990) ont utilisé l'ultrafiltration pour la séparation et la récupération d'un

phosphopolysaccharide d'une souche de L. lactis ssp. cremoris. Toba et al. (1992) ont

présenté une méthode de purification partielle et de dosage d'un EPS par une méthode

d'ultrafiltration à petite échelle.

Le dosage des EPS (partiellement) purifiés peut se faire par simple gravimétrie (De Vuyst

et al. 1998) ou par des méthodes colorimétriques. Un dosage gravimétrique nécessite

cependant une purification complète de la poudre d'EPS, tandis que les méthodes

colorimétriques sont plus spécifiques. Le dosage des sucres totaux par la méthode phénol-

acide sulfurique (Dubois et al. 1956) est très fréquemment utilisée. Cette méthode a

l'avantage d'être très sensible et de détecter de façon fiable des sucres dans une solution

avec des concentrations aussi faibles que 10 mg/l, mais elle n'est pas spécifique pour les

EPS et détecte tous les saccharides ainsi que leurs dérivés méthyle-éthers, d'où l'importance

d'une bonne purification de l'EPS. Un autre désavantage de la méthode résulte d'une

31

différence de la réponse colorimétrique en fonction du sucre analysé. Cependant, la

composition exacte de l'EPS en monomères saccharidiques n'est pas toujours connue. C'est

pourquoi le glucose est souvent utilisé pour faire la courbe étalon. L'erreur résultant de la

réponse différente des monomères comme le rhamnose est acceptée et les résultats sont

exprimés en équivalent glucose.

En résumé, plusieurs méthodes différentes de dosage des EPS sont utilisées dans la

littérature, avec des résultats quelquefois questionnables (De Vuyst et Degeest 1999b). Les

diverses équipes de recherche utilisent souvent des protocoles adaptés à la souche étudiée et

au milieu de culture utilisé, avec des rendements en EPS différents. L'incohérence dans les

résultats de quantification d'EPS rend une comparaison de la production par diverses

souches très difficile. De plus, les méthodes nécessitent souvent une étape de purification

partielle de l'EPS laborieuse et de longue durée (10 jours) qui requiert un volume important

de milieu fermenté (100 ml). Un tel volume d'échantillonnage limite fortement la fréquence

des prises d'échantillons et le nombre de répétitions de la mesure par échantillon. Il est alors

primordial de développer une méthode rapide, exacte et reproductible de dosage d'EPS qui

nécessite seulement un petit volume d'échantillon. Dans ce but, nous avons testé dans le

Chapitre 2 une nouvelle méthode de purification partielle d'EPS avec des cellules

d'ultrafiltration agitées.

Récemment, dans notre équipe de travail, une méthode de quantification de l'EPS produit

par Lb. rhamnosus RW-9595M dans le milieu SWP par spectroscopie en proche infrarouge

(NIRS) a été mise au point (Macedo et al. 2002c). Cette méthode a permis de doser

simultanément l'EPS, l'acide lactique et le lactose directement dans le milieu de

fermentation, sans aucun traitement préalable du milieu. Le spectre obtenu par NIRS a été

calibré avec des mesures de la concentration d'EPS, prises avec la nouvelle méthode

d'ultrafiltration, mentionnée auparavant et développée dans le Chapitre 2, et un coefficient

de corrélation de 91% a été calculé. Cette étude a montré que la méthode NIRS peut être

utilisée pour prédire simultanément, en moins de 5 min, les concentrations de plusieurs

substances, entre autre d'EPS, pendant une fermentation avec des bactéries lactiques.

Cependant, la mesure a été affecté par des nombreuses paramètres du milieu ce qui a limité

l'exactitude de la calibration de la méthode.

32

1.2.6.2 Caractérisation physico-chimique

Afin d'élucider la composition et la structure de la molécule d'EPS, un très haut degré de

pureté est requis et plusieurs techniques de purification ont été développées à cet effet ces

dernières années. Tuinier et al. (1999b) ont mis au point un protocole de purification de

l'EPS de L. lactis ssp. cremoris NIZO B40 impliquant plusieurs étapes de filtration avec des

membranes ayant différents seuils de coupure et ont examiné les propriétés physiques de

l'EPS purifié.

Pour analyser chimiquement les monomères, on est obligé d’hydrolyser le polysaccharide

en utilisant un acide concentré et des températures élevées. Parce que les monosaccharides

n’ont pas tous la même résistance aux conditions d’hydrolyse, il faut contrôler les

conditions avec précision jusqu’à la conversion totale de l'EPS. On peut ensuite déterminer

la composition des EPS en utilisant différentes méthodes. L’identification des monomères

peut être réalisée par des méthodes enzymatiques, spectrophotométriques, par la

chromatographie liquide haute performance (HPLC), la chromatographie en phase gazeuse

(GLC) ou avec la spectrométrie de masse.

En raison du grand nombre de liaisons et de configurations possibles dans la formation des

EPS, il peut y avoir un grand nombre de structures et de propriétés résultantes. Chaque

hexose peut être lié en α ou β, dans la forme pyranose ou furanose et lié à la 2ième, 3ième,

4ième ou 6ième position. Le poids moléculaire peut être déterminé par des méthodes

chromatographiques. La méthode HPLC couplée avec la technique de perméation de gel est

couramment utilisée (Tuinier et al. 1999b; Van Calsteren et al. 2002), mais aussi les

techniques d'électrophorèse, et de chromatographie en phase gazeuse (GLC) (Knoshaug et

al. 2000; Lemoine et al. 1997; Looijesteijn et Hugenholtz 1999; Low et al. 1998; Van

Calsteren et al. 2002; Van Casteren et al. 1998). Pour l'identification des monomères de

l'EPS, la méthode classique est la méthylation suivie de l’hydrolyse, de l’identification et de

la quantification, par GLC, des sucres partiellement méthylés (Sutherland 1990). Cette

procédure donne des informations sur la taille et la structure des monomères.

Récemment, la technique de la résonance magnétique nucléaire (RMN) a permis de faire

des progrès considérables dans l'élucidation de la structure des EPS. En combinaison avec

33

l'analyse chimique, il est possible d'identifier par les spectres 1H-, 13C-et 31P-RMN les

substances présentes et leurs liaisons chimiques et ainsi la structure primaire de l'EPS. Avec

une biomasse assez importante dans le RMN, il est même possible d'obtenir sans détruire

l'échantillon des informations in vivo sur la formation des EPS. De cette façon, Hugenholz

et al. (2000) ont pu suivre l'évolution des intermédiaires clés de la formation d'EPS par une

souche EPS+ de Lactococcus lactis et les comparer avec une souche isogénique non-

productrice.

Van Calsteren et al. (2002) ont isolé et purifié les EPS de Lb. rhamnosus RW-9595M et de

Lb. rhamnosus R et les ont analysés par 1H- et 13C-RMN. Les spectres obtenus, et

conséquemment les EPS des deux souches, ont été identiques. Par la suite, les auteurs ont

déterminé la masse moléculaire de l'EPS par chromatographie de perméation sur gel et ont

élucidé la structure primaire de l'EPS par des méthodes chimiques et spectroscopiques afin

de confirmer les résultats obtenus par la RMN. Sur la base de ces analyses, l'unité répétitive

de l'EPS a été déterminée comme étant un heptasaccharide avec un pyruvate, deux D-

glucose, un D-galactose, et quatre L-rhamnose (Fig. 1.2).

1.2.6.3 Production à grande échelle et traitement en aval

La production d'EPS par les LAB étant limitée, il y a très peu d'études portant sur la

production à plus grande échelle. Ces EPS n'étant pas (encore) rentables comme ingrédient

pour l'industrie agro-alimentaire, la plupart des études se sont concentrées sur la production

d'EPS in situ dans les aliments fermentés. Kimmel et al. (1998) ont optimisé la production

d'EPS de Lb. delbrueckii ssp. bugaricus RR et ont réalisé une culture à pH contrôlé avec un

volume de 100 l dans un milieu semi-défini. Les auteurs ont concentré les EPS du milieu

fermenté avec une ultrafiltration et éliminé les matériaux ayant un faible poids moléculaire

par une dialyse avant la précipitation avec l’éthanol. Malgré cela, la poudre d'EPS contenait

1.4% de protéines et, en plus, les auteurs ont supposé une perte importante d'EPS lors de la

précipitation avec l'éthanol. Une récupération de seulement 30 g d'EPS purifié a été

mesurée suite au traitement des 100 l fermentés. Afin de diminuer la perte du produit

pendant le procédé, les auteurs recommandent la récupération du polymère par des

techniques de filtration. Un tel processus de traitement en aval du milieu fermenté pour la

34

récupération des EPS produits par les LAB pourrait s'inspirer des techniques utilisées dans

la fabrication du xanthane. L'ultrafiltration est utilisée pour la concentration du xanthane

dans le milieu fermenté (de 2.5 à 15% p/v), avant l'étape de précipitation par l'éthanol. Ceci

permet de réduire le volume d'alcool et ainsi la quantité d'énergie utilisée pour la

récupération de l'éthanol d'environ 80% (Lo et al. 1997). Des techniques de filtration ont

aussi été utilisées avec succès pour la récupération d'EPS produit par Sinorhizobium

meliloti M5N1 CS (Harscoat et al. 1999).

1.2.7 Utilisation et applications des hétéropolysaccharides

En examinant les procédés de production des yoghourts, on remarque que la production a

beaucoup changé ses dernières dizaines d'années. Sa rentabilité a augmenté avec la mise en

marché des procédés semi-continu. C’est ainsi que la production traditionnelle avec une

fermentation dans le pot n’occupe plus une part importante du marché actuel (Cerning

1990). Les nouveaux produits comme les yoghourts avec des fruits, les yoghourts

aromatisés ou les yoghourts buvables sont presque tous produits à grande échelle, donc

agités et transportés avant leur soutirage. Puisque le yoghourt perd en partie sa texture

pendant ces traitements mécaniques, on est obligé d’en augmenter la viscosité. La plupart

des producteurs utilisent à cette fin des méthodes comme l'augmentation des solides totaux

du lait standardisé, le traitement à la chaleur avant inoculation ou l'addition de

stabilisateurs. Ceci implique une augmentation des coûts considérable ce qui rend la

production des hétéropolysaccharides in situ par les LAB très intéressante (Bouzar et al.

1997; Marshall et Rawson 1999; Rawson et Marshall 1997).

L’utilisation d’EPS dans l’industrie laitière est basée principalement sur les aptitudes

épaississante, gélifiante, stabilisante et émulsifiante de ces composés. Ils jouent donc un

rôle important dans la formation de la texture des aliments. Les bactéries lactiques

mésophiles et thermophiles sont employées pour améliorer le comportement rhéologique

des laits fermentés et des yoghourts. Ces souches offrent la possibilité d’augmenter la

viscosité du yoghourt et de diminuer la susceptibilité à la synérèse ce qui est

particulièrement intéressant pour les pays interdisant l’addition des gélifiants ou

épaississants aux laits fermentés. En outre, ceci permet de diminuer la teneur en solides

35

totaux du lait standardisé pour la fabrication de yoghourt, tout en conservant des propriétés

rhéologiques et organoleptiques comparables aux yoghourts témoins produits avec des

cultures non épaississantes et enrichis en solides du lait. De plus, en employant les EPS des

LAB comme bioingrédients fonctionnels dans les produits laitiers pour remplacer des

agents polysaccharidiques d’autres origines (carraghénanes, alginates, xanthanes), on peut

produire des produits plus naturels et ainsi répondre à une demande des consommateurs

pour des produits sans additifs.

En employant des bactéries lactiques épaississantes productrices d’EPS, il est possible de

produire des fromages allégés. Par exemple, l'utilisation d'une souche de S. thermophilus

productrice d'EPS et de Lb. bulgaricus a permis de produire un fromage mozzarella allégé

avec des propriétés améliorées de fusion et de rétention de l’humidité (Low et al. 1998;

Perry et al. 1998; Perry et al. 1997). Une autre application possible des LAB productrices

d'EPS est leur utilisation dans le levain. Les EPS aident à ramollir le gluten et ainsi à

améliorer la texture du levain et à augmenter le volume spécifique du produit boulanger

(De Vuyst et al. 2001).

Appartenant à la classe des fibres alimentaires, les EPS peuvent servir de substituts à basse

teneur en calories pour remplacer le gras. C’est ainsi qu’on peut produire des aliments avec

moins de gras et de solides totaux, mais avec des propriétés organoleptiques comparables

aux produits traditionnels. De cette façon, les EPS pourraient contribuer à offrir une source

d’aliments plus sains aux consommateurs.

1.3 Technologie des cellules immobilisées

La technologie des cellules immobilisées (ICT) n’est pas récente. C'est un procédé

traditionnel utilisé, par exemple, dans la production du vinaigre par des bactéries acétiques

immobilisées sur des copeaux de bois (Ramakrishna et Prakasham 1999) ou dans la

production du Kéfir avec des levures coimmobilisées avec des bactéries lactiques

(Champagne et al. 1994). L'immobilisation permet de retenir les cellules microbiennes dans

un système de fermentation et d'obtenir des hautes densités de biomasse. Cette technique

comporte de nombreux avantages, mais aussi des inconvénients, comparé à des procédés

utilisant des cellules libres (Tab. 1.2). Les avantages majeurs sont, sans doute, une

36

productivité augmentée de la fermentation et une rétention des cellules, même à de hauts

taux de dilution (Champagne et al. 1994). D'autres avantages sont une réutilisation possible

des cellules, une protection contre des forces de cisaillement et une stabilité biologique

élevée, lors de fermentations en continu (Lamboley et al. 1999). De plus, il est possible que

les systèmes avec des cellules immobilisées soient moins susceptibles aux attaques des

bactériophages (Champagne et al. 1994) et à la contamination microbienne (Navrátil et

Sturdíc 1999).

La haute densité cellulaire et un micro-environnement différent des conditions dans le

milieu de culture résultent souvent en un changement morphologique et physiologique de la

culture (voir chapitre 1.3.4). Ceci peut représenter un avantage, par exemple en augmentant

la tolérance de la souche envers des substances inhibitrices ou en découplant la croissance

bactérienne de la production de métabolites (Norton et al. 1994a), ou un désavantage car le

métabolisme pourrait être modifié de façon non voulue.

37

Tab. 1.2 Avantages et désavantages de la technologie des cellules immobilisées.

AVANTAGES • Productivité augmentée à cause d’une

densité de biomasse plus élevée • Lavage de la biomasse du réacteur

empêché pendant la fermentation continue, même avec un taux de dilution élevé

• Stabilité biologique et physique des cellules plus élevée en raison de la protection par le support

• Découplage de la croissance et de la production de métabolites

• Coût réduit pour le traitement en aval du milieu

• Rendements plus élevés pour la production de métabolites secondaires

• Rétention élevée des plasmides chez les cellules qui en possèdent

• Protection contre certains effets inhibiteurs dans le milieu

• Susceptibilité diminuée contre l'attaque des phages et des contaminants

• Métabolisme peut être modifié par l’immobilisation

DÉSAVANTAGES • Cellules peuvent se séparer du support

et ainsi contaminer le produit • Stabilité mécanique et chimique de

certains supports peut être insuffisante (cisaillement, dissolution, décompo-sition par le produit)

• Prolifération cellulaire peut détruire la matrice du support et les cellules se libèrent par la suite

• Limitations de diffusion peuvent restreindre la bioconversion

• ICT peut être trop chère pour une utilisation à grande échelle

• Métabolisme peut être modifié par l’immobilisation

• Nécessite d'ajouter une étape de production des cultures immobilisées au procédé

• Nécessite d'entreposer les cellules ou de prévenir leur mortalité lors des périodes d'arrêt de production

• Complexité de l'assainissement du bioréacteur si des contaminations se produisent

1.3.1 Techniques et procédures d'immobilisation

En raison des avantages importants de l'ICT, comparé avec des cultures utilisant des

cellules planctoniques, plusieurs techniques d'immobilisation ont été développées. Toutes

ces techniques imitent ce qui se passe dans la nature, où les cellules des microorganismes

croissent presque toujours dans un biofilm, associées entre elles et avec des surfaces

(Dunne 2002). Afin d'immobiliser des cellules, on peut les attacher à des surfaces, les

inclure dans des matrices poreuses, les retenir derrière des barrières ou les faire floculer

(Fig. 1.6). Nous avons concentré notre travail sur les systèmes dans lesquels les cellules

sont immobilisées par adhésion ou inclusion. Les systèmes où les cellules sont

immobilisées derrière une barrière (ex. réacteurs avec membrane) et ceux où la barrière est

formée autour des cellules (ex. microcapsules) présentent souvent des problèmes de

38

transfert de matière et d'encrassement des membranes (Gonçalves et al. 1992) et ne

semblent pas être adéquats pour l'immobilisation des cellules productrices d’EPS.

Adsorptionnaturelle

Adsorptioninduite

artificiellement

Attachées à la surface

Inclusiondans gel

Supportpréformé

Inclusion dansdes matrices poreuses

Immobilisationderrière une barrière

Aggrégationnaturelle

Aggrégationinduite

artificiellement

Floculation

Cellules immobilisées vivantes

Fig. 1.6 Classification des systèmes d’immobilisation selon quatre classes (adapté de

Willaert et Baron 1996).

L’immobilisation des cellules peut être réalisée par adhésion à la surface de différents

supports. Dans cette étude, ce procédé a été choisi en raison du caractère mucoïde de la

souche de travail, Lb. rhamnosus RW-9595M. La production par les cellules de

polysaccharides capsulaires et d'EPS libre contribue à l'adsorption au support et à sa

colonisation subséquente (Dunne 2002). Les forces participant à l'adhésion d'une cellule au

support sont la force de Van der Waals, les liaisons ioniques, les ponts hydrogènes et les

interactions covalentes. Pour comprendre les mécanismes de l’adsorption microbienne, la

structure de la paroi cellulaire doit être connue. La distribution des groupes carboxyliques

et aminés dans les composantes de la paroi déterminent la charge de la cellule. En général,

la plupart des microorganismes sont chargés négativement. Également, un grand nombre

d'EPS et ainsi de capsules portent une charge légèrement négative. Pour cette raison, il est

préférable d’utiliser des supports chargés positivement.

Un autre moyen d’immobilisation est l’inclusion des cellules dans une matrice poreuse qui

peut être soit un gel, soit un support préformé. Dans le premier cas, la matrice poreuse est

formée in situ autour de la cellule. Avec cette technique, les cellules sont incluses dans un

polymère. Ensemble, ils forment le biocatalyseur avec lequel la fermentation est exécutée.

Ce biocatalyseur est souvent obtenu par dispersion d'une solution de polysaccharides et/ou

de protéines contenant les cellules et ensuite par solidification de cette solution. La

dispersion peut être réalisée par extrusion ou par émulsification. Une bonne vue d’ensemble

39

de ces procédés est donnée par Groboillot et al.(1994), Champagne et al. (1994) et de

Prenosil et al. (1995).

Dans le cas d’un support poreux préformé, on ajoute la matrice d'immobilisation au début

d’une fermentation. On laisse diffuser les cellules dans les espaces libres du support où

elles commencent à proliférer. Puisque la croissance des colonies est rapidement limitée par

le support et les colonies voisines, elles sont alors retenues dans le biocatalyseur (Karel et

al. 1985). Afin d'obtenir des biomasses immobilisées élevées, les surfaces intérieures ainsi

qu'extérieures doivent être accessibles pour les cellules et les supports avec une porosité

élevée sont les plus appropriés. Au début, les forces d'adhésion décrites précédemment,

déterminent la vitesse de la colonisation du support. Quand les premières cellules sont

adhérées et les colonies se sont formées, le diamètre des pores du support devient

important. Il existe une grandeur idéale de pores qui est déterminée par un équilibre entre

deux effets: les pores doivent être assez grands pour permettre la pénétration et la

croissance des cellules à l’intérieur de la matrice, mais ils doivent être assez petits pour

empêcher la perte des cellules en croissance (Prenosil et al. 1995). Messing et al. (1979a;

1979b) ont déterminés la grandeur optimale des pores pour plusieurs microorganismes. Ils

ont trouvé un rapport optimal pour les bactéries de 4 à 5 entre la taille du pore et celle de la

cellule. L'utilisation des supports avec des pores plus grands que 100 µm représente une

forme d'immobilisation se situant entre la floculation et l'inclusion (Karel et al. 1985).

La matrice préformée protège les cellules contre les forces de cisaillement à l’extérieur du

biocatalyseur tout en permettant une bonne diffusion des nutriments et des produits

métaboliques (De Backer 1996). Ce procédé d'immobilisation n’est pas nuisible pour la

prolifération des cellules, comme ça peut être le cas pour certaines techniques d’inclusion

dans des billes de polymères formées in situ. Cependant, les densités de cellules sont en

général moins élevées qu’avec l’inclusion in situ (Klein et Vorlop 1985). En raison de la

forte résistance du support à la compression, cette méthode d’immobilisation est adéquate

pour l’utilisation dans des réacteurs comme le réacteur agité ou le réacteur de type lit fixe.

Les supports solides sont en général physiquement et chimiquement résistants envers

l'usure par la croissance des microorganismes, ils sont souvent stérilisable par la vapeur et

réutilisable. La simplicité du procédé et le faible coût rendent l'immobilisation par

40

adsorption sur des supports solides poreux très intéressante pour l’application industrielle.

Dans ce travail, la souche Lb. rhamnosus RW-9595M a été immobilisée par adsorption sur

des supports poreux solides, car son caractère mucoïde favorise fortement son adhésion aux

surfaces.

1.3.2 Choix du support

Pour l'utilisation de l'ICT dans l'industrie agroalimentaire, il existe des exigences

concernant la nature du support. Premièrement, il ne doit pas être toxique, ni pour l’homme

ni pour les bactéries, et son utilisation dans le domaine alimentaire doit être permis. En

outre, il doit montrer des propriétés physiques et chimiques favorisant l’immobilisation. Un

support préformé est caractérisé par sa densité, sa taille et sa forme, sa résistance à la

friction, sa capacité de rétention des cellules (diamètre des pores et porosité) et sa charge de

surface. De plus, il doit être stérilisable.

Le Tab. 1.3 donne une vue d'ensemble sur les matériaux de supports poreux solides

rapportés en littérature. Par exemple, Senthuran et al. (1997) ont choisi des billes de verre

(foam-glass-particles, Pora-bact A®) pour immobiliser Lb. casei. Ils ont comparé ce

matériel avec les mêmes billes prétraitées avec du polyéthylèneimine et ont constaté, d’une

part, un rallongement de la phase de latence et, d’autre part, une rétention des cellules

améliorée. Gonçalves et al. (1992) ont comparé des supports inertes en verre et en

céramique en utilisant un réacteur en régime turbulent en continu avec recyclage. Les

supports se sont distingués quant à la densité, au diamètre des particules, et des pores et à la

porosité. Les auteurs ont observé un meilleur attachement en conduisant des fermentations

en continu, comparé avec un procédé en batch et ont identifié un support en verre

aggloméré (Sikug) et un support en céramique (Bi86) comme étant les supports avec la

capacité de rétention de biomasse la plus élevée.

41

Tab. 1.3 Immobilisation par inclusion dans des supports solides poreux.

Matériel du support Microorganisme Référence cellulose Saccharomyces cerevisiae (Szajani et al. 1996) cubes d'éponge Aureobasidium pullulans (West et Strohfus 1996)

(Ho et al. 1997) plastique composite (50% polypropylène) Lactobacillus casei (Velazquez et al. 2001)

Leuconostoc mesenteroides (El-Sayed et al. 1990) Xanthomonas campestis (Robinson et Wang 1987) Celite Aureobasidium pullulan (Mulchandani et Luong 1989)

chitosane calcium pectate Lactobacillus casei (Kosseva et al. 1998)

"type-Z" Celite R635 Flexirings

Pseudomonas aeruginosa (Durham et al. 1994)

fibre de verre et polyester céramique mouse de polyuréthane

Aureobasidium pullulan (Mulchandani et Luong 1989)

aluminium bactéries lactiques (Iwasaki et al. 1992) polypropylène traité avec chitosane Lactobacillus plantarum (Krishnan et al. 2001)

Lactobacillus casei (Senthuran et al. 1997) verre Lactobacillus rhamnosus (Gonçalves et al. 1992)

céramique Lactobacillus rhamnosus (Gonçalves et al. 1992) Leuconostoc mesenteroides (El-Sayed et al. 1990) acier inoxydable Trichoderma viride (Webb et al. 1986)

caoutchouc de silicone Saccharomyces cerevisiae (Knights 1996)

Il y a peu de travaux dans la littérature sur la production d'EPS avec des cellules

immobilisées, la plupart portant sur la production des homopolysaccharides (impliquant des

enzymes extracellulaires). Par exemple, le pullulane a été produit par la moissisure

Aureobasidium pullulans immobilisée par inclusion dans des cubes d'agar ou de calcium

alginate (West et Strohfus 1998; West and Strohfus 2001), dans des billes de gel d'agarose

et de carraghénane (West 2000) et dans des cubes d'éponge (West et Strohfus 1996). Lors

de deux fermentations en batch successives, les auteurs ont trouvé des productions d'EPS

plus élevées pour les cultures immobilisées qu'avec des cellules libres. El-Sayed et al.

(1990) ont comparé la production de dextrane et de dextranesucrase par Ln. mesenteroides

immobilisée dans trois types de supports Celite de différents diamètres et tailles de pores et

42

dans des billes de gel d'alginate de calcium. Les auteurs ont trouvé la production de

dextranesucrase la plus élevée avec le support Celite R648, qui était 64% supérieure à celle

des cultures avec des cellules libres. Robinson et Wang (1987) ont aussi utilisé le support

Celite pour immobiliser la bactérie Xanthomonas campestris pour la production de

xanthane dans un réacteur de 16 l. Les auteurs ont observé une forte rétention du

biopolymère dans la matrice d'immobilisation qui a atteint une concentration de 50 g/l.

Le support solide poreux ImmobaSil® utilisé dans cette thèse pour l'immobilisation de

Lb. rhamnosus RW-9595M est fait en caoutchouc de silicone. Il est disponible dans une

forme d'anneau appelé Raschig Ring et offre une taille de pores uniforme de 50 à 150 µm et

une fraction vide d'environ 40%.

1.3.3 Analyse des cellules immobilisées

Afin d'élucider les effets de l'immobilisation sur les cellules, des techniques d'analyse du

système à cellules immobilisées, idéalement non-destructives, sont nécessaires. Il y a

maintenant plusieurs techniques biophysiques disponibles et l'instrumentation pour diverses

techniques spectroscopiques s'améliore constamment. Les mesures d'intérêt dans l'examen

des systèmes avec cellules immobilisées sont, par exemple, la concentration des cellules

immobilisées et les cinétiques de croissance, de consommation de substrat et de formation

de produits. Une caractérisation morphologique et physiologique des cellules immobilisées,

de même que de leur environnement direct, est aussi d'un grand intérêt. Les méthodes

comme la microscopie optique et électronique, le marquage avec des radioisotopes et

l'autoradiographie, la microfluorimétrie, la spectroscopie infrarouge et la résonance

magnétique nucléaire (RMN) peuvent être utilisées pour étudier des cellules immobilisées

(Clark 1989).

La RMN est un outil très puissant pour suivre les processus métaboliques des cellules

immobilisées. Cette méthode est non-destructive et a été utilisée, par exemple, pour

comparer le métabolisme de levures (Lohmeier-Vogel et al. 1995; 1996; Taipa et al. 1989)

et de propionibactéries (Santos et al. 1989) libres et immobilisées. La 31P-RMN permet de

mesurer le pH intracellulaire, les sucres phosphatés, l'ADP et l'ATP tandis que la 13C-RMN

peut donner des informations sur le métabolisme des sucres (Lohmeier-Vogel et al. 1989).

43

Avec la RMN il est aussi possible de mesurer la quantité des cellules immobilisées (Clark

1989), mais l'application de cette méthode est très limitée à cause de son coût élevé, des

interférences avec le support et le milieu, un équipement sophistiqué et dispendieux et une

mise au point de méthode très longue.

La quantité de biomasse est un paramètre très important pour l'analyse et le contrôle d'un

système de fermentation. Cependant, la quantification précise de la biomasse immobilisée

peut être très difficile, surtout si elle est immobilisée sur des supports solides et poreux

(Wang 1988). Si les cellules sont incluses dans des billes de gel, la matrice du support est

communément détruite ou dissoute et les cellules vivantes sont ensuite comptées. Pour des

supports solides, cette méthode ne peut pas être utilisée car la destruction du support

résulterait en un stress mécanique trop grand pour les cellules et, conséquemment, en un

taux de mortalité des cellules élevé. Un autre moyen de quantifier la biomasse immobilisée

est la mesure de la différence de poids du support avant et après colonisation. Cette

technique est très souvent utilisée pour des supports solides (Gonçalves et al. 1992;

Senthuran et al. 1997), mais elle a le désavantage de doser également les substances

accumulées dans la matrice du support pendant la fermentation, comme, par exemple, les

EPS. De plus, cette méthode donne seulement une information sur la biomasse totale, sans

tenir compte de sa viabilité, et dose alors aussi la biomasse morte. Comme l'immobilisation

cellulaire résulte souvent en un changement majeur de la taille des cellules immobilisées

(voir chapitre 1.3.4), avec des cellules immobilisées généralement plus petites que leur

contre-parties planctoniques, la valeur de biomasse des cellules immobilisées ne peut pas

estimer précisément le nombre de cellules vivantes, en utilisant une courbe de calibration

déterminée avec des cultures planctoniques.

La spectroscopie diélectrique et la résonance magnétique nucléaire sont deux méthodes

non-destructives pouvant servir à doser des cellules microbiennes immobilisées, déjà

mentionnées et discutées auparavant. Ces méthodes permettent de suivre la biomasse en

ligne. La spectroscopie diélectrique se base sur la mesure de la capacitance qui est une

fonction de la concentration des cellules microbiennes dans un champs électrique. Elle est

surtout appliquée dans la fabrication de la bière pour le contrôle de biomasse de la levure

(Austin et al. 1994). Un avantage de cette méthode est qu’elle n’est pas influencée par la

44

présence de solides dans le champs électrique, ce qui la rend particulièrement intéressante

pour des systèmes avec des cellules immobilisées. Cependant, il y a des difficultés à utiliser

cette méthode pour la mesure de la concentration en bactéries, car sa sensibilité est

directement proportionnelle à la grandeur (le volume) des cellules. Mishima et al. (1991)

ont ainsi mesuré, entre autres, la concentration de Saccharomyces cerevisiae, incluse dans

des billes de calcium alginate, et de cellules libres de Escherichia coli.

Un autre moyen de quantifier les cellules immobilisées est le dosage d'un de leurs

composants. Ce composant doit être spécifique pour des microorganismes et ne pas se

trouver dans le support non-colonisé, comme les protéines (Moreira et al. 1978; Robinson

et Wang 1987), l'adénosine triphosphate (ATP) (Gikas et Livingston 1993; 1998) et l'acide

désoxyribonucléique (ADN) (Buchtmann et al. 1997; Raebel et Schlierf 1980; Wang 1988;

Wang et Wang 1989). Si la quantité d'un composant par unité de biomasse ou par cellule

est connue, le contenu de ce composant dans un support peut être mesuré et corrélé avec le

contenu en cellules immobilisées. Cette approche a été testée pour les protéines, l'ATP et

l'ADN et les résultats sont discutés au Chapitre 3.

1.3.4 Effets physiologiques et morphologiques de l'immobilisation

L'immobilisation cellulaire résulte pour les bactéries immobilisées en des conditions

environnantes différentes de celles des cellules planctoniques. Une limitation du transfert

de masse crée un micro-environnement autour des cellules affectant la diffusion de

nutriments vers la cellule mais aussi l'élimination des produits comme l'acide lactique

(Champagne et al. 1994). Les propriétés du support, les conditions hydrodynamiques dans

le fermenteur, mais aussi la production et l’excrétion de substances extracellulaires, en

particulier des EPS, sont des facteurs qui affectent la résistance à la diffusion (Karel et al.

1985). L'accumulation des produits métaboliques peut diminuer le taux de croissance et

changer la physiologie et la morphologie des bactéries lactiques immobilisées (Cachon et

al. 1998; Champagne et al. 1994; Krishnan et al. 2001).

Karel et al. (1985) ont déjà constaté que la voie métabolique des cellules attachées à des

surfaces peut être différente de celle des cellules libres. Des travaux plus récents ont

démontré l'existence de mécanismes de reconnaissance de surface pour les bactéries

45

(Prigent-Combaret et al. 1999; Wen et Burne 2002) et des changements physiologiques dus

à la présence de surfaces (O'Toole et al. 2000a; 2000b; Parsek et Greenberg 2000; Rashid

et al. 2000). Entre-temps, plusieurs travaux ont rapporté de tels changements lors des

fermentations avec des cellules immobilisées, notamment une tolérance accrue envers

l'inhibition par le produit (Fortin et Vuillemard 1989; Krisch et Szajani 1997; Teixeira de

Mattos et al. 1994) ou même envers d'autres facteurs de stress environnementaux (Doleyres

et al. 2002a; Jouenne et al. 1994; Keweloh et al. 1989; Keweloh et al. 1990; Trauth et al.

2001).

1.4 Problématique

Depuis une dizaine d’années, le consommateur a développé son intérêt pour des aliments

naturels, sans additifs et de haute qualité. À cause d’une prise de conscience pour une

alimentation équilibrée, des produits avec un taux de matière grasse moins élevé sont

préférés. De plus en plus, des produits avec une allégation santé et des denrées

fonctionnelles percent sur le marché. Ces dernières années, l’industrie laitière a commencé

à utiliser des bactéries lactiques produisant des exopolysaccharides parce qu’elles

améliorent les caractéristiques rhéologiques des laits fermentés, ce qui permet d'éviter

l’utilisation des additifs épaississants, de réduire la matière grasse dans les produits et

même la teneur en solides du lait pour une même fermeté ou viscosité du produit.

La faible production des exopolysaccharides par les bactéries lactiques et l’instabilité du

phénotype mucoïde est un problème reconnu et la raison pour laquelle, jusqu'à maintenant,

ces EPS sont exclusivement produit in situ dans des produits comme le yogourt ou les laits

fermentés. L’incorporation d'un agent fonctionnel issu des bactéries lactiques permettrait de

standardiser le produit, mais l'exploitation d’une fermentation pour produire des

exopolysaccharides comme bioingrédients fonctionnels sera fortement dépendante du

rendement du procédé. L’immobilisation de la souche est un moyen efficace d'augmenter la

productivité et de stabiliser biologiquement des fermentations en continu. Parce que les

propriétés mucoïdes des souches productrices d'EPS favoriseraient fortement

l’immobilisation par adhésion dans des supports poreux, c'est cette dernière qui est étudiée

dans cette thèse.

46

Le nouveau bioingrédient fonctionnel devra faire face à la concurrence de polysaccharides

d'autres origines comme le xanthane et la gomme de caroube. Afin de rendre les EPS des

bactéries lactiques concurrentiels, il est important de trouver les conditions optimales

(température, pH, taux de dilution) des fermentations en continu avec des cellules

immobilisées pour la production d'EPS. Pour l'optimisation des fermentations, plusieurs

échantillons doivent être pris et la quantité d'EPS doit être déterminée. Cependant, les

méthodes existantes pour l’isolement et la purification des EPS sont de longue durée, et

nécessitent un volume important d'échantillon. Ceci rend la détermination de la quantité et

de la qualité des EPS laborieuse et difficile. Le développement d'une nouvelle méthode

fiable, simple et nécessitant un faible volume d'échantillon pour le dosage des EPS est alors

nécessaire.

Le substrat de la fermentation choisi est à base de perméat de lactosérum, un sous-produit

de l’industrie laitière, contenant la quasi totalité du lactose du lait. Si le perméat de

lactosérum n'est pas traité, il présente une source importante de pollution de l'industrie

fromagère. Il est disponible en grande quantité et de valorisation limitée mais est une

excellente source de carbone et de minéraux pour des fermentations avec des bactéries

lactiques.

La souche Lactobacillus rhamnosus RW-9595M a été choisie comme souche de travail à

cause de ses propriétés technologiques (viscosité, arômes), nutritionnelles (fibre

alimentaire, probiotique) et éventuellement nutraceutiques associées à une forte synthèse

d'EPS. Cette souche a démontré une forte production d'EPS de 2775 mg/l dans un milieu à

base de perméat de lactosérum (Macedo et al. 2002b).

1.5 Hypothèse et objectifs de travail

Jusqu'à maintenant, aucune étude à été réalisée sur la production d'un hétéropolysaccharide

par des bactéries lactiques immobilisées. L'hypothèse que l'immobilisation cellulaire

permettra d'augmenter la productivité en EPS lors des fermentations en batch et en continu

conduit directement à la formulation de l'objectif général de ce travail.

47

1.5.1 Objectif général

L’objectif général de ce travail est de développer et d’optimiser une technologie de

production d'exopolysaccharides, basée sur la fermentation avec des cellules immobilisées,

d’un milieu à base de perméat de lactosérum (PLS).

1.5.2 Objectifs spécifiques

Les objectifs spécifiques sont :

• Développer une méthode précise et rapide de mesure des EPS produits dans le

milieu de fermentation.

• Évaluer l’aptitude de plusieurs supports, compatibles avec une utilisation

alimentaire, pour l’immobilisation par adhésion de Lactobacillus rhamnosus

RW-9595M.

• Développer une méthode précise de dosage des cellules immobilisées dans des

supports solides poreux.

• Exécuter et caractériser des fermentations avec des cellules planctoniques en batch

et en continu pour la production de biomasse, de produits métaboliques et d'EPS

dans le PLS.

• Exécuter et caractériser des fermentations en batch répété et en continu avec des

cellules immobilisées dans le PLS et comparer la production d'EPS avec les

fermentations avec des cellules planctoniques. Lors des fermentations en continu,

nous avons étudié particulièrement l’effet du taux de dilution, de la température et

de la concentration en extrait de levure en rapport avec la cinétique des

fermentations et la productivité en EPS.

Chapitre 2

New method for exopolysaccharide determination in

culture broth using stirred ultrafiltration cells

Dirk Bergmaier1, Christophe Lacroix1, Maria Guadalupe Macedo1 and Claude P.

Champagne2

1 STELA Dairy Research Centre, Pavillon Paul Comtois, Université Laval, Québec, PQ,

Canada, G1K 7P4

2 Food Research and Development Centre, Agriculture and AgriFood Canada, St-

Hyacinthe, PQ, Canada, J2S 8E3

Part of these results were published in Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 57

(3), 401-406.

49

2.1 Résumé

Une nouvelle méthode pour éliminer les sucres simples du milieu de culture avant la

quantification des exopolysaccharides (EPS), a été développée et validée pour une souche

productrice d'EPS, Lactobacillus rhamnosus RW-9595M. Cette méthode emploie

l'ultrafiltration (UF) dans des cellules agitées, suivie de la détection des polysaccharides

dans le rétentat par la méthode phénol-acide sulfurique. La méthode UF a été comparée à

une méthode conventionnelle basée sur l'extraction à l'éthanol, la dialyse, la séparation des

protéines par précipitation avec le TCA et la lyophilisation. Des fermentations en batch

avec pH contrôlé dans des milieux divers (le milieu minimum basique (BMM), le perméat

de lactosérum (WP), et le perméat de lactosérum supplémenté avec l'extrait de levure, les

minéraux et le Tween-80 (SWP) ont été conduites et la production d'EPS a été déterminée

par la nouvelle méthode UF et par une méthode conventionnelle. La récupération d'EPS par

la nouvelle méthode a été entre 83 et 104% pour une concentration d'EPS entre 40 et 1500

mg/l supplémenté à une solution de 0.1 M NaCl ou un milieu de culture. La méthode d'UF

était rapide (8 h), précise et simple, et a requis seulement un petit volume d'échantillon (1 à

5 ml). Une production maximale d'EPS très élevée a été mesurée dans le SWP par les

méthodes UF et conventionnelle (1718 et 1755 mg/l).

2.2 Abstract

A new method to remove simple carbohydrates from culture broth prior to the

quantification of exopolysaccharides (EPS) was developed and validated for the EPS-

producing strain Lb. rhamnosus RW-9595M. This method uses ultrafiltration (UF) in

stirred cells followed by polysaccharide detection in the retentate by the phenol-sulfuric

acid method. The UF method was compared to a conventional method based on ethanol

extraction, dialysis, protein removal by TCA and freeze-drying. EPS production during pH-

controlled batch fermentations in basal minimum medium (BMM), whey permeate (WP),

and whey permeate supplemented with yeast extract, minerals and Tween-80 (SWP) was

determined by the new UF and conventional methods. EPS recovery by the new method

ranged from 83 to 104% for EPS added in the concentration range from 40 to 1500 mg/l in

0.1 M NaCl solution or culture medium. The UF method was rapid (8 h), accurate and

50

simple, and required only a small sample volume (1 to 5 ml). A very high maximum EPS

production was measured in SWP by both the UF and conventional methods (1718 and

1755 mg/l).

2.3 Introduction

During the last decade, exopolysaccharides (EPS) produced by lactic acid bacteria (LAB)

have attracted attention as potential thickening, gelling, stabilizing and emulsifying agents

in fermented dairy products (Cerning et al. 1994). Concentrations of EPS produced by LAB

cultures are generally very low. Production in liquid media is often monitored by viscosity

measurements, which are not necessarily proportional to EPS yields (Cerning et al. 1986;

Sebastiani and Zelger 1998). Very little has been reported on quantification of LAB-

produced EPS and routine quantification methods may be questionable (De Vuyst and

Degeest 1999b). These methods usually involve numerous purification steps such as

polysaccharide-precipitation with ethanol, elimination of contaminating carbohydrates by

dialysis, precipitation of proteins with trichloroacetic acid and freeze-drying prior to total

carbohydrate detection by the phenol-sulfuric acid test (Cerning et al. 1994; Gassem et al.

1997b; Sebastiani and Zelger 1998). These methods are very laborious, time-consuming

and require large sample volumes, which limits the number of samples which can be

analyzed during fermentation.

Nakajima et al. (1990) used ultrafiltration for the recovery of a phosphopolysaccharide

from a slime-forming Lactococcus lactis strain while Toba et al. (1992) first introduced a

method for EPS quantification based on ultrafiltration in a disposable unit. The latter study

did not include a demonstration of complete separation of polysaccharide from interfering

carbohydrates such as lactose and the method was not compared with a conventional

method based on extraction and purification.

The aim of this study was therefore to develop a rapid and accurate method, based on

ultrafiltration in stirred cells, for the determination of EPS produced by Lactobacillus

rhamnosus RW-9595M in culture supernatant and to compare this method with a

conventional method based on EPS extraction and purification (Cerning et al. 1994).

51

2.4 Materials and methods

2.4.1 Microorganism

Lb. rhamnosus RW-9595M, obtained from the Lactic Acid Bacteria Research Network

(RBL Network) culture collection (Dairy Research Centre STELA, Université Laval,

Québec, PQ, Canada) was isolated from reference culture Lb. rhamnosus ATCC 9595 and

shown to produce very high EPS concentrations in defined BMM medium (Dupont et al.

2000). The strain was subcultured aerobically in supplemented whey permeate for 36 h at

37°C. The stock culture was kept frozen in 6% (v/v) rehydrated skim milk and 10% (v/v)

glycerol at -80°C.

2.4.2 Culture media

Basal minimal medium (BMM) was prepared according to Morishita et al. (1981), and

supplemented with lactose (50 g/l). Whey permeate (WP) medium (Foremost, Baraboo,

WI, USA) was reconstituted in distilled water at 5% (w/w), adjusted to pH 5.0 with

1N HCl, autoclaved (121°C, 15 min), cooled to room temperature, filtered on an AP25

prefilter (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) and autoclaved again (121°C,

15 min). Supplemented whey permeate (SWP) medium was prepared as described for WP,

but 0.5 g/l MgSO4 · 7H2O, 0.05 g/l MnSO4 · H2O, 1 ml/l Tween-80 and 1% (w/w)

ultrafiltered (10 kDa) yeast extract (YE) (type: 19512, Organotechnie, La Courneuve,

France) were added after filtration. This YE did not contain high molecular weight

components such as galactomannans which can interfere with EPS quantification. The SWP

medium was sterilised for 15 min at 121°C.

2.4.3 Fermentations

Fermentations were carried out in BMM, WP and SWP media at 37°C and pH 6. The pH-

controlled batch cultures were performed in a 1.5 l bioreactor (Biogénie, Ste-Foy, PQ,

Canada) with BMM and in a 1.5 l bioreactor (Bioflo III, New Brunswick Scientific, Edison,

N.Y., USA) with WP and SWP, respectively. The pH was controlled by addition of

52

6N NH4OH. Inocula were prepared in culture tubes containing 10 ml reconstituted WP

(5% w/w) supplemented with 1% (w/w) YE (Rosell Institute Inc., Montreal, PQ, Canada)

inoculated (10% v/v) with deep frozen stock culture and incubated for 16 h at 37°C. The

resulting culture was then used to inoculate (1% v/v) a second tube with the same medium

and incubated for 10 h at 37°C. This subculturing step was repeated once and the resulting

culture was used to inoculate the bioreactor (2% v/v in BMM and 1.5% v/v in WP and

SWP). Fermentations were carried out for 60 h, 42 h and 26 h in BMM, WP and SWP,

respectively. Samples were taken at different time intervals, depending on base addition

rate for analysis of residual sugar, lactic acid, biomass and EPS concentrations.

2.4.4 Cell enumeration

Viable cell counts (CFU per milliliter) were estimated by plating diluted samples on solid

MRS agar (Difco Laboratories, Richmond, CA, USA). Plates were incubated aerobically at

37°C for 36 h. Reported data are means for duplicate analyses.

2.4.5 EPS purification and quantification by the conventional method

Culture samples were heated to 100°C for 15 min to denature EPS-degrading enzymes.

After cooling, samples were centrifuged (13200 g at 4°C for 25 min) and the supernatants

were stored at -20°C. The conventional method used for EPS extraction and purification

was that of Cerning et al. (1994). Polysaccharides in 50 ml of supernatant were precipitated

by addition of three volumes of chilled absolute ethanol. The mixture was held at 4°C

overnight and centrifuged (13200 g at 4°C for 15 min). The resulting pellet was dissolved

in distilled water, dialysed for 48 h against distilled water (Spectra/Por Membrane, MWCO

3500 Da, Spectrum Laboratories Inc., CA, USA) and freeze-dried. Residual polypeptides

were then removed by precipitation with 10% (v/v) TCA and centrifugation after which the

EPS-containing supernatant was re-dialysed for five days and freeze-dried. The resulting

powder was accurately weighed and stored until total carbohydrate analysis by the phenol-

sulfuric acid test (Dubois et al. 1956).

53

2.4.6 EPS purification and quantification using stirred ultrafiltration

cells

Up to six stirred cells (Omegacell™, Filtron Technology Corporation, Northborough, MA,

USA) with 30 kDa molecular weight cut-off membranes were connected to a reservoir

(RC800 mini-reservoir, Millipore, Bedford, MA, USA) as illustrated in Fig. 2.1. The

reservoir was filled with 0.1 M NaCl solution which was used to reduce hydrophobic

interactions with the membrane. Compressed air regulated at 100 kPa provided the driving

force for filtration. Stopcocks allowed alternating between pressurized air or NaCl solution

to drive either concentration or diafiltration respectively. A 1 to 10 ml accurately measured

volume of supernatant was added per stirred cell. After fitting the stirring bar/pressure cap

assembly onto the cell, filtration was conducted with agitation provided by a multiple

magnetic stirring plate at 650 rpm. Agitation created turbulence and prevented the build-up

of a macromolecular layer at the membrane surface. In order to avoid the formation of a

fouling layer, a high agitation speed and a low pressure (permeation rate) were selected.

The filtration was carried out until no carbohydrate could be detected visually in the filtrate

stream by the colorimetric phenol-sulfuric acid test (Dubois et al. 1956). A sample of final

filtrate stream was taken for subsequent accurate analysis. The carbohydrate concentration

in the final filtrate was always less than 12 mg/l. The retentate was collected, weighed,

stored at -20°C and analysed by the phenol-sulfuric acid test. The retentate EPS

concentration was measured as the carbohydrate concentration minus that of the final

filtrate sample. After use, the cells were filled with 1.0 N NaOH, stirred for 15 min, washed

with distilled water and stored filled with 0.05 N NaOH until the next filtration.

54

Air

Reservoir

Multiple magnetic stir plate

Water(NaCl0.1M)

Stirred cellStopcock

Air

Liquid Stir bar

Manometer

Filtrate

Retentate

Membrane

Fig. 2.1 Schematic diagram of the laboratory device used for ultrafiltration experiments in

stirred cells.

2.4.7 Validation of the ultrafiltration method for EPS analysis

A stock solution of purified EPS was prepared (EPS 1). Fermentation was carried out in

WP, supplemented with 1% (w/w) polysaccharide-free yeast nitrogen base (YNB; Difco

Laboratories, Richmond, CA, USA). After 60 h culture at 32°C with pH controlled at 6.0,

the broth was collected and EPS was purified with the conventional method. The powder

thus obtained was redissolved in distilled water, giving a polysaccharide concentration of

754 mg/l measured by the phenol-sulfuric acid test (Dubois et al. 1956). The stock solution

was diluted 10 and 20-fold in 0.1 M NaCl. A 10 ml volume of these dilutions was

diafiltered in stirred cells, using pressurized 0.1 M NaCl solution, as described above. The

amount of EPS in the retentate was determined by the phenol-sulfuric acid test and

compared with the initial quantity in the sample to calculate product recovery rate (R).

A second EPS stock (EPS 2) was prepared from fermentations carried out in WP

supplemented with YE (SWP), as described before. After 16 h fermentation, a sample of

culture broth was taken and EPS was purified with the conventional method. Diafiltration

experiments as with EPS 1 were repeated with EPS 2 in 0.1 M NaCl in duplicate using 5 ml

of solutions of 68.1 and 180.3 mg/l EPS.

55

To test the effect of culture medium on UF purification, EPS 2 powder was dissolved in 5%

WP solution to a concentration of 1500 mg/l. This EPS stock solution was then diluted with

5% WP to give final EPS concentrations of 0, 50, 100, 400, 1000 and 1500 mg/l. Stirred

cells received 1, 2 or 5 ml of these solutions and ultrafiltration was carried out. The

retentate polysaccharide concentration was then determined by the phenol-sulfuric acid test

and recovery rate was calculated, taking into account the polysaccharide content of the 5%

WP solution without added EPS. Experiments were carried out in triplicate for each

concentration and initial volume in the stirred cells.

Finally, the new method was validated with samples from pH-controlled batch

fermentations with Lb. rhamnosus RW-9595M carried out in BMM, WP and SWP media

and data were compared with that obtained with the conventional method.

2.4.8 Sugar and lactic acid analysis

Total carbohydrate concentration was determined by the phenol-sulfuric acid test (Dubois

et al. 1956). The EPS-content was calculated in glucose equivalents from glucose standard

curves. Reported data are means for triplicate analyses.

Samples of culture broth were centrifuged (13200 g at 4°C for 25 min) and residual sugar

and lactic acid concentrations in the supernatant were determined by HPLC (Waters,

Millipore Co. Montreal, QC, Canada) using a Phenomenex ion column (Phenomenex,

Torrance, CA) and H2SO4 0.0064N as eluent at a flow rate of 0.4 ml/min. Analysis was

performed in duplicate.

2.4.9 Statistics

ANOVA, Tukey-Kramer HSD multiple mean comparison and linear regressions were

carried out using the software JMP IN (SAS Institute Inc., version 3.2.6, Cary, NC) with a

level of significance at 0.05. EPS data was transformed (arcsin(sqrt(X/10000)) to stabilize

the variance and normalize the residuals.

56

2.5 Results

2.5.1 Characterization of the UF method

First, ultrafiltration and quantification of EPS was carried out with aqueous solutions of

known concentration (Tab. 2.1). For EPS 1 samples containing 37.7 and 75.4 mg/l EPS,

high mean recovery rates of 85.7 and 86.7%, respectively, were measured. The method was

highly repeatable as indicated by the low standard deviation of 0.4% and 0.7% calculated

for 2 repetitions. For EPS 2 solutions containing 68.1, 205.7 and 1095.8 mg/l, similar

results were obtained, with mean recovery rates between 83.1 and 87.6% with standard

deviations lower than 1% calculated for 2 repetitions. There was no significant difference in

recovery rate from EPS solutions of differing concentrations nor for different EPS powders.

Subsequently, the effects of sample volume and EPS concentration on the UF method were

also examined using solutions of purified EPS 2 powder prepared in 5% WP. Analysis of

variance showed that there was no statistically significant effect (P = 0.198) of initial

sample volume in the stirred cell on measured EPS concentration. The polysaccharide

concentration in the 5% WP solution without added EPS was 14.4 mg/l (±3.7). This amount

was subtracted from polysaccharide concentrations measured in EPS samples to obtain the

EPS recovery rates shown in Tab. 2.1. A linear relationship (R2 = 0.98; p<0.001) existed

between the measured (EPSm) and the initial (EPSi) EPS concentrations:

Eq. 1:

EPSm = 9.60 + 1.04 · EPSi

High EPS recovery rates (96 to 105%) and low standard deviations (4 to 36 mg/l) for EPS

concentration were observed. The absence of sugars in the filtrates suggested complete

elution of lactose, although some retention of low molecular weight sugars due to

membrane fouling could also occur. Thus, three retentate samples were ultrafiltered in new,

never used stirred cells and filtration was carried out in the concentration mode with air

pressure. No carbohydrates were detected by the phenol-sulfuric acid test in the resulting

filtrates (data not shown).

57

Tab. 2.1 EPS concentration and recovery rate (R) determined by the UF method for 0.1 M

NaCl and 5% WP solutions spiked with EPS.

EPS

concentration (mg/l) Solution

initial measured

R

(%)

37.7 32.3 ± 0.4 85.7 ± 1.1 EPS 1 75.4 65.4 ± 0.7 86.7 ± 0.9

68.1 56.6 ± 0.7 83.1 ± 1.0

205.7 180.3 ± 0.001 87.6 ± 0.0005

0.1 M

NaCl EPS 2

1095.8 912.2 ± 7.7 83.2 ± 0.7

0 14.4 ± 3.7 ---

50 62.4 ± 7.5 95.9 ± 22.4

100 98.2 ± 13.8 83.8 ± 17.6

400 423.4 ± 31.0 102.2 ± 8.7

1000 1038.5 ± 45.8 102.4 ± 4.9

5%

WP EPS 2

1500 1586.7 ± 35.8 104.8 ± 2.6

2.5.2 EPS quantification during batch cultures

To examine the possible influence of the culture medium on EPS determination, batch

fermentations were carried out in BMM, WP and SWP media with Lb. rhamnosus RW-

9595M at 37°C and pH controlled at 6.0. The mean profile for three fermentations in BMM

is shown in Fig. 2.2. The viable cell concentration increased exponentially with no apparent

lag growth phase for nearly 16 h culture and peaked at 6.9 ± 1.8 · 109 CFU/ml at 32 h,

remaining stable until the end of the 60 h culture. All lactose was consumed by this time

and about 41 g/l lactic acid was produced. The two methods used for estimating EPS

concentration gave significantly different values, the UF method resulting in higher values

than the conventional method. A high maximum EPS production of 1053 ± 98 mg/l and

530 ± 173 mg/l was measured in BMM after 56 and 48 h culture by the UF and

conventional method, respectively. Determination of EPS by the UF method was done in

58

triplicate but the high sample volume of 50 ml required for the conventional method

precluded such repetition.

Fig. 2.2 Change in viable cell count ( ), lactose ( ) and lactic acid ( ) concentrations,

and EPS production measured by the UF ( ) and conventional ( ) methods during pH-

controlled batch cultures with Lb. rhamnosus RW-9595M in BMM. Means and standard

deviations for three fermentations.

A batch fermentation with pH controlled at 6 was carried out in WP medium (Fig. 2.3).

After approximately 24 h, the viable cell concentration reached a maximum of

1.9x108 CFU/ml. The polysaccharide concentration, determined by the UF method,

continuously increased from 13.09 ± 1.22 mg/l in the freshly inoculated medium to a

maximum of 44.0 ± 0.9 mg/l after 42 h culture. The conventional method indicated 8 mg/l

at time zero and a maximum polysaccharide concentration of 22.3 mg/l after 42 h.

59

Fig. 2.3 Change in viable cell count ( ), volume of base consumed (―), and EPS

production measured by the UF ( ) and conventional ( ) methods during a pH-controlled

batch culture with Lb. rhamnosus RW-9595M in WP. Means and standard deviations for

duplicate analyses by the UF method.

Data obtained for three fermentations in SWP are presented in Fig. 2.4. Viable cell

concentrations were very high (1.1 ± 0.1 · 1010 CFU/ml) after approximately 16 h culture

with no lag growth phase. All lactose was consumed after 16 h and approximately 36 g/l

lactic acid was produced. Very high and similar EPS productions were measured by both

the UF and conventional methods. The conventional method indicated a significant level of

polysaccharide (332 ± 75 mg/l) in the freshly inoculated fermentation medium at time zero

and a maximum concentration of 2087 ± 287 mg/l after 26 h culture, for a calculated EPS

production of 1755 mg/l. The UF method gave an initial polysaccharide concentration of

430 ± 35 mg/l and a maximum concentration of 2148 ± 134 mg/l after 16 h culture, for a

calculated EPS production of 1718 mg/l.

60

Fig. 2.4 Change in viable cell count ( ), lactose ( ) and lactic acid ( ) concentrations,

and EPS production measured by the UF ( ) and conventional ( ) methods during pH-

controlled batch cultures with Lb. rhamnosus RW-9595M in SWP. Means and standard

deviations for three fermentations.

2.6 Discussion

In this study, a new method for the quantification of EPS produced by Lb. rhamnosus RW-

9595M, using ultrafiltration and diafiltration in stirred cells with a 30 kDa MWCO

membrane is described. To investigate the suitability of this system, filtration experiments

with aqueous solutions of known EPS concentrations prepared with purified EPS from two

different fermentations (EPS 1 and EPS 2) were conducted. A high EPS fraction of 83.1%

to 87.6% was retained by the membrane and measured in the retentate (Tab. 2.1). The high

EPS recoveries and reproducibility of the method suggest that quantitative separation of

EPS from interfering low molecular weight carbohydrates may be achieved.

To simulate the use of a complex growth medium containing a high amount of simple

sugars, filtrations were conducted with EPS solutions in 5% WP, containing approximately

61

40 g/l lactose and EPS concentrations between 0 and 1500 mg/l. For each concentration,

three different volumes (1, 2 and 5 ml) were used in the stirred cells, filtration was carried

out in triplicate and EPS concentrations were determined (Tab. 2.1). The measured EPS

concentration was not influenced by the initial sample volume in the stirred cells

(P = 0.198) but highly correlated with the initial EPS concentration (P < 0.0001; Eq. 1).

The high EPS recoveries from WP solutions between 96 and 105% show that under the

conditions used, low molecular weight (MW) carbohydrates (lactose) are eliminated

through the membrane and do not interfere with the determination of EPS concentration in

the retentate, using the phenol-sulfuric acid test. Thus, low MW carbohydrates should be

found in the filtrate. Unfortunately, a complete material balance is not possible because the

error of the carbohydrate quantification in the filtrate is in the range of the actual

concentration in the retentate. The possibility of membrane fouling during filtration, which

could lead to retention of low MW sugars, was tested by processing retentates obtained at

the end of filtration in a new ultrafiltration cell. The absence of carbohydrates in the filtrate

indicated that the retentate at the end of the first filtration did not contain detectable low

MW sugars. Data from this study demonstrate that the UF method quantitatively separated

EPS produced by Lb. rhamnosus RW-9595M from interfering low MW carbohydrates in a

complex fermentation broth and yielded accurate measurements of EPS concentration.

Toba et al. (1992) used a disposable ultrafiltration unit with a MWCO of 5000 Da and

reported recovery rates close to 100% for polysaccharide standards, such as pullulan and

dextran. However, these data were obtained with polysaccharide standards having little

variation in their molecular weights. In contrast, EPS produced by LAB have different

structures and molecular weights (De Vuyst and Degeest 1999b). In addition, EPS with the

same structure but very different size are produced during fermentation (Degeest and de

Vuyst 1999; Grobben et al. 1997). In this study, EPS purification by the conventional

method to produce EPS powders was done using dialysis membranes of 3500 Da.

Carbohydrates in the 3500 Da to 30 kDa range which were retained during this purification

could have crossed the 30 kDa UF membrane, thereby decreasing EPS recovery rates in the

retentate. This could explain some observed data with recovery rates lower than 100%.

62

The UF method was then directly compared with the conventional method of Cerning et al.

(1994) in measuring EPS production during pH-controlled batch cultures with

Lb. rhamnosus RW-9595M. To examine possible effects of the fermentation medium

composition, cultures were carried out in BMM, WP and SWP media. The basal minimum

medium was chosen for the absence of interfering polysaccharides and because it gave high

biomass and EPS productions during pH-controlled batch fermentations with this strain

(Dupont et al. 2000). A maximum EPS concentration of 1053 mg/l was measured by the

UF method after 56 h of culture in BMM compared to only 530 mg/l by the conventional

method after 48 h (Fig. 2.2). This difference may be partly explained by losses of EPS

during the numerous purification steps of the conventional method, due to sticking of the

EPS to the dialysis membrane and incomplete precipitation in ethanol (Kimmel et al.

1998). However, the time change in EPS concentration indicated by both methods was

similar, reaching 88 and 72% of the maximum EPS concentration after 32 h of culture,

which corresponded to the end of cell growth.

Fermentations in WP media yielded very low maximum EPS concentrations of 30.1 and

14.3 mg/l, measured by the UF and conventional methods, respectively. Repetitions of EPS

analysis by the UF method had a very low standard deviation in this low concentration

range. Freshly inoculated WP medium contained only a small amount of polysaccharide

(13.9 and 8 mg/l by the UF and conventional methods, respectively), partly due to EPS

transferred with the inoculum. The low EPS production maybe explained by the limited cell

growth in this medium.

Supplementation of WP with minerals, Tween-80 and YE increased both biomass and EPS

production (Fig. 2.4) by Lb. rhamnosus RW-9595M with biomass rapidly reaching a very

high maximum of 1.1 ± 0.1 · 1010 CFU/ml. Lactose as carbon source at an initial

concentration of 40 g/l was completely consumed after 16 h of culture, when maximum

viable biomass was measured. Both the UF and conventional methods indicated large

amounts of polysaccharide in the freshly inoculated fermentation medium (430 ± 35 and

332 ± 75 mg/l, respectively). Since freshly inoculated WP medium contained only traces of

EPS, polysaccharide levels in inoculated SWP medium may be due to YE supplementation.

In this study, ultrafiltered YE containing no components larger than 10 kDa was used. Any

63

polysaccharides contributed by this YE should therefore cross the 30 kDa MWCO UF

membrane. The large amount of polysaccharide found in the inoculated SWP medium

could be due to reactions between YE components and sugars during medium sterilization.

Torino et al. (2000) reported this type of interaction as well as the formation of nitrogen-

sugar complexes which may precipitate with ethanol but are not completely removed by

TCA precipitation by the conventional method. These complexes may have a high

molecular weight since they are retained by the 30 kDa UF membrane.

The kinetics of EPS production in SWP are very similar whether measured by the

conventional or the UF method (Fig. 2.4). The maximum polysaccharide concentration was

2148 ± 134 mg/l by the UF method after 16 h culture and 2087 ± 287 mg/l by the

conventional method after 26 h. By subtracting the polysaccharide content in the freshly

inoculated medium, a maximum EPS production of 1718 and 1755 mg/l was determined by

the UF and conventional methods, respectively. This is the highest EPS production reported

in the literature for lactobacilli.

Under the experimental conditions tested, EPS production in SWP was coupled with

growth. The EPS concentration measured by both methods did not change significantly

(P > 0.05) after 16 h of culture which could indicate the absence of glycohydrolase activity.

Degradation of EPS has been observed during prolonged incubation (Gassem et al. 1997a;

Mozzi et al. 1996a) and attributed to glycohydrolase activity (Pham et al. 2000). The

difference in EPS concentrations (355 mg/l) indicated by the two methods after 16 h of

incubation in SWP, corresponding to the end of the growth phase, is similar to this

difference for maximal EPS concentration in the BMM medium (523 mg/l). Although this

difference was not statistically significant in SWP (P = 0.25), it may indicate a constant and

considerable EPS loss during the various steps of the conventional method.

Stirred cells were used for ten analyses and then discarded. However, there was no

difference in the flux measured with water for new cells or for cells after ten uses.

Membrane pores were therefore not blocked after ten filtrations under the operating and

cleaning conditions used and stirred cells could probably be used for more than ten analyses

without significant changes in membrane permeability.

64

2.7 Conclusions

Data from this study show that the new method based on UF separation of EPS from simple

sugars in culture broth allows accurate monitoring of EPS production by LAB during

fermentations. Compared with the conventional method, quantification by the UF method is

much less time-consuming (8 h compared to about 10 days). Furthermore, this method is

simple and requires only small sample volumes, as low as 1 to 5 ml, which allows for more

analyses and test repetitions to be performed during fermentations.

Chapitre 3

Exopolysaccharide production during batch cultures

with free and immobilized Lactobacillus rhamnosus

RW-9595M

Dirk Bergmaier1, Claude P. Champagne2 and Christophe Lacroix3

1 STELA Dairy Research Centre, Pavillon Paul Comtois, Université Laval, Québec, PQ,

Canada, G1K 7P4

2 Food Research and Development Center, Agriculture and AgriFood Canada, St-

Hyacinthe, PQ, Canada, J2S 8E3

3 Laboratory of Food Biotechnology, Institute of Food Science and Nutrition, Swiss Federal

Institute of Technology, ETH Zentrum, LFO F18, CH-8092 Zurich, Switzerland

66

3.1 Résumé

La production d'exopolysaccharide (EPS) par Lactobacillus rhamnosus RW-9595M a été

étudiée lors des cultures en batch à pH contrôlé avec des cellules libres et lors des cultures

en batch répété avec des cellules immobilisées par adsorption sur des supports poreux

solides (ImmobaSil®). Les cultures ont été conduites à pH 6 dans un milieu de perméat de

lactosérum supplémenté (SWP), contenant du perméat de lactosérum à une concentration

de 5% ou de 8% (w/w). Pour des cultures en batch avec les cellules libres dans le milieu de

8% SWP, des comptes cellulaires (1.3 · 1010 CFU/ml) et une production d'EPS (2350 mg/l)

très élevées ont été mesurées après respectivement 18 et 32 h de culture. Plusieurs

méthodes pour la détermination de la biomasse immobilisée sur des supports solides basées

sur l'analyse des composants de biomasse (protéines, ATP et ADN) ont été examinées. La

méthode d'analyse d'ADN s'est avérée la plus appropriée dans ces circonstances. Cette

méthode a dosé une haute biomasse immobilisée de 8.5 · 1011 CFU/ml après la colonisation

des supports ImmobaSil®. Pendant les cultures en batch répété avec des cellules

immobilisées, une concentration élevée d'EPS (1808 mg/l) a été mesurée après quatre

cycles pour une courte période d'incubation de 7 h dans 5 % de SWP. La biomasse élevée

dans le système de cellules immobilisées a augmenté la productivité volumétrique

maximale d'EPS (258 mg/l·h après 7 h) comparée aux cultures en batch avec des cellules

libres (110 mg/l·h après 18 h). Notre étude montre clairement le potentiel élevé de la

souche et de la technologie des cellules immobilisées pour la production d'EPS comme

ingrédient fonctionnel alimentaire.

3.2 Abstract

The production of exocellular polysaccharides (EPS) by Lactobacillus rhamnosus

RW-9595M was investigated during pH-controlled batch cultures with free cells and

repeated-batch cultures with cells immobilized by adsorption on solid porous supports

(ImmobaSil®). Cultures were conducted at pH 6 in supplemented whey permeate (SWP)

medium containing 5% or 8% (w/w) whey permeate. For free-cell batch cultures in 8%

SWP medium, very high maximum cell counts (1.3 · 1010 CFU/ml) and EPS production

(2350 mg/l) were measured after 18 and 32 h, respectively. Several methods for the

67

determination of immobilized biomass on solid supports based on analysis of biomass

components (proteins, ATP and DNA) were tested. The DNA analysis method proved to be

the most appropriate under these circumstances. This method revealed a high immobilized

biomass of 8.5 · 1011 CFU/ml support after colonization of the ImmobaSil® supports.

During repeated immobilized cell cultures, a high EPS concentration (1808 mg/l) was

measured after four cycles for a short incubation period of 7 h in 5 % SWP. The high

biomass in the immobilized cell system increased maximum EPS volumetric productivity

(258 mg/l·h after 7 h culture) compared with free cell batch cultures (110 mg/l·h after 18 h

culture). Our study clearly shows the high potential of the strain and immobilized cell

technology for production of EPS as a functional food ingredient.

3.3 Introduction

Polysaccharides are widely used in the food industry as thickeners, viscosifiers, stabilizing

or emulsifying agents, gelling agents or texturizers (Sutherland 1998). The majority of

these additives are of plant origin, such as starch, locust bean gum and alginate. Until now,

xanthan, curdlan and gellan have been the only FDA approved microbial polysaccharides

although they are produced by non-GRAS (Generally Recognized As Safe) bacteria. Many

food-grade microorganisms, such as lactic acid bacteria (LAB), also produce exocellular

polysaccharides (EPS) (Cerning 1990; De Vuyst and Degeest 1999b). In situ-produced EPS

play an important role in the manufacture of fermented dairy products such as yogurt,

drinking yogurt, cheese, fermented cream and milk-based desserts (Duboc and Mollet

2001). They contribute to the texture, mouthfeel, taste perception and stability of the final

products. EPS act as texturizers and stabilizers and so decrease syneresis and improve

product stability. Furthermore, some EPS classified as prebiotics could contribute to human

health and positively affect gut microflora (Ruas-Madiedo et al. 2002a).

In spite of these interesting properties, EPS from LAB are not yet exploited by food

manufacturers as food additives (De Vuyst and Degeest 1999a). Their use could result in

safe, natural end-products with improved rheological properties and enhanced stability,

especially for the dairy industry. However, compared with dextran-producing Leuconostoc

or Gram-negative EPS producers, the low production of EPS by LAB is a constraint for

68

their commercial use as food additives. In this respect, fermentation technologies that can

be used in the industry need to be developed in order to enhance EPS production and

develop new EPS bioingredients.

It has been shown that immobilized cell technology (ICT) with LAB could increase the

biomass concentration maintained in the fermentation system (Champagne et al. 1994;

Norton et al. 1994a). Coupled with repeated-batch or continuous culture, ICT could largely

increase process productivity and cell stability (Bertrand et al. 2001; Lamboley et al. 1997).

Cell immobilization also protects cells against shear damage. Furthermore, reuse of cells

and more constant product characteristics could facilitate downstream processing of EPS.

Immobilization by adsorption on porous preformed and inert supports could be an

immobilization technique suited for EPS-producing cultures. The production of capsular

and free EPS by the cells may promote their adsorption to the support and subsequent

colonization (Dunne 2002). However, it is difficult to accurately determine the

concentration of immobilized cells in solid supports, an important parameter of the

fermentation process (Wang 1988). Disruption of the immobilization matrix and viable cell

enumeration, commonly used with gel beads, will result in very high shear stress and

mortality of cells, whereas biomass dry weight determinations will quantify not only

biomass but also substances accumulated in the support matrix, such as EPS.

In this study, different methods for quantification of immobilized biomass, based on the

extraction and analysis of specific components or molecules of the biomass such as

proteins, adenosine triphosphate (ATP) and deoxyribonucleic acid (DNA), were compared.

Bacterial growth and EPS production during batch and repeated-batch cultures with free

and immobilized cells of Lb. rhamnosus RW-9595M, a strain that has shown very high

EPS production in a whey permeate-based medium (Bergmaier et al. 2001; Macedo et al.

2002b) was studied. The mucoid properties of Lb. rhamnosus RW-9595M were used to

promote adsorption on solid porous supports (ImmobaSil®) for cell immobilization.

69

3.4 Materials and Methods

3.4.1 Strain and culture media

Lb. rhamnosus RW-9595M, obtained from the Lactic Acid Bacteria Research Network

(RBL Network) culture collection (Dairy Research Centre STELA, Université Laval,

Québec, PQ, Canada), was isolated from reference culture Lb. rhamnosus ATCC 9595 and

shown to produce very high EPS concentrations in the defined BMM medium (Dupont et

al. 2000) and in supplemented whey permeate medium (Bergmaier et al. 2001; Macedo et

al. 2002b). The strain was subcultured aerobically in supplemented whey permeate for 36 h

at 37°C. The stock culture was kept frozen in 6% (v/v) rehydrated skim milk and 10% (v/v)

glycerol at -80°C. For inoculum preparation, a fresh culture was propagated twice in 5%

whey permeate with 1% yeast extract at 37°C for 10 h or until pH 4.8 was reached.

The supplemented whey permeate (SWP) medium was prepared as follows. Whey

permeate powder (Foremost, Baraboo, WI, USA) was rehydrated to give a final

concentration of 5% or 8% (w/w) and the pH was adjusted to pH 5.0 with 1 N HCl. The

solution was autoclaved (121°C, 15 min), cooled to room temperature and filtered on a

AP25 prefilter (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). The other components

MgSO4 · 7H2O, MnSO4 · H2O and Tween-80, were added to give final concentrations of

0.5 g/l, 0.05 g/l and 1 ml/l, respectively, and the solution was autoclaved again. A yeast

extract (YE) solution was prepared by adding 40 g of YE (Rosell Institute Inc., Montreal,

PQ, Canada) to 100 ml deionized water. This YE concentrated solution was autoclaved

(121°C, 15 min) and added to the whey permeate medium to give a final YE concentration

of 1%.

3.4.2 Fermentation techniques

Fermentations were carried out in a 1.5 l bioreactor (Bioflo III, New Brunswick Scientific,

Edison, NY, USA) with a total working volume of 1.2 l. Temperature was controlled at

37°C and pH at 6 by addition of 6 N NH4OH. Free-cell batch cultures were performed in 5

or 8% SWP medium with 1.5% (v/v) inoculum size. Samples of culture broth were taken

70

for analysis at different time intervals, depending on the base addition rate. Cells for DNA

analysis were sampled during exponential growth phase as estimated by the observed base

addition rate.

For repeated batch cultures with immobilized cells in 5% SWP medium, the bioreactor was

filled with 150 ml ImmobaSil® supports (Ashby Scientific Ltd., Coalville, Leicestershire,

UK). After support conditioning according to the manufacturer's instructions, the bioreactor

was filled aseptically with 500 ml SWP and inoculated at 4% (v/v). A stirring regime of

5 min at 50 rpm followed by 30 min with no stirring was applied for 4 h. After this time,

the first fermentation was started with stirring set at 100 rpm and pH controlled at 6. After

8 h, fresh medium was added to the bioreactor for a total volume of 1.2 l. The fermentation

medium was totally replaced when a volume of 80 ml 6 N NH4OH was used for pH

control, which corresponded to late exponential growth phase of the culture. A total of four

repeated batch cultures were performed.

3.4.3 Cell enumeration and biomass determination

Viable cell counts (CFU per milliliter) were estimated by plating diluted samples on solid

MRS agar (Difco Laboratories, Richmond, CA, USA). Plates were incubated aerobically at

37°C for 36 h. Reported data are means for triplicate analyses. For determination of the cell

dry weight in the broth, 10 ml of broth were centrifuged at 10,000 g for 15 min at 4°C

(Sorval Instrument, Dupont, Newtown, CO, USA). The cell pellet was washed twice with

distilled water and then transferred to a preweighed aluminium dish. The cells were dried to

a constant weight in a vacuum oven at 70°C. Reported data are means for duplicate

analyses.

3.4.4 Immobilized biomass determinations

3.4.4.1 DNA extraction

The immobilized cell concentration was determined by measuring the DNA content using

the method described by Wang (1988) with some modifications. For calibration, the DNA

content of cells was correlated with viable cell counts and biomass dry weight using

71

effluent samples from free-cell pH-controlled batch cultures with cells in the exponential

growth phase. As a consequence of the high EPS production by Lb. rhamnosus

RW-9595M, it was impossible to accurately determine the cell dry weight (fluffy pellet and

obstruction of filters). Therefore, the strain Lb. rhamnosus ATCC 9595 was used for this

part of the study. This strain is the parent strain from which the variant strain

Lb. rhamnosus RW-9595M was isolated and it produces only a very small amount of EPS

(Dupont et al. 2000).

For DNA extraction, the fermented medium was centrifuged (10,000 g at 4°C for 15 min).

The pellet was resuspended in 10 ml of a saline-citric solution (SCS) containing 8.77 g/l

NaCl and 1.47 g/l Na3C6H5O7 · 2H2O at pH 7 and centrifuged again. The pellet was

resuspended in 2 ml of SCS solution with 0.25 N perchloric acid (pH 1.45) and incubated

for 30 min at 0°C. After centrifugation (10,000 g at 0°C for 10 min), 4 ml 0.5 N perchloric

acid solution was added to the pellet, the tube was sealed and incubated in a water bath at

70°C for 30 min. The tubes were cooled to room temperature for exactly 25 min and

centrifuged (5,000 g, 10 min, 20°C). The supernatant was kept at 4°C for a maximum of

1 day until analysis. The DNA concentration was determined by the diphenylamine method

(Burton 1956). The supernatant was diluted with 0.5 N perchloric acid to be in the standard

curve concentration range. Two ml of diphenylamine reagent, prepared the same day with

1.5 g diphenylamine in 100 ml demineralized water, 1.5 ml concentrated H2SO4 and 0.5 ml

1.6% acetaldehyde, were added to a 1-ml diluted sample. A standard curve of deoxyribose

in a concentration range from 0 to 50 µg/ml was prepared. Standards and samples were

incubated at 30°C for 17 h. Absorbance was measured spectroscopically at 595 nm with

background correction at 650 nm. Linear correlations between DNA content, cell dry

weight and cell counts were determined.

To determine the DNA concentration in the solid supports, a sample of about 3 to 4

supports was taken and the wet weight was determined. The supports were washed twice

with SCS solution and dried on a filter paper. The supports were transferred into glass tubes

with 3 ml SCS and 2.5 N perchloric acid was added to give a final concentration of 0.25 N

(pH 1.45). After incubation at 0°C for 30 min, the excess liquid was removed on a filter

paper. For DNA extraction the supports were transferred to a 10 ml centrifugation tube and

72

3 ml 0.5 N perchloric acid were added. The samples were incubated in a water bath at 70°C

for 25 min and cooled to room temperature for 25 min. The DNA content of the clear

supernatant was analyzed by the diphenylamine method, as described above.

As only wet weight of colonized supports was determined during the DNA extraction

method, a correlation between support wet and dry weights and support volume was

established. The wet weight of SCS washed colonized supports was determined in the same

way as during DNA extraction. Support volume was measured by water displacement in a

graduated cylinder and the supports were dried in a vacuum oven at 70°C until constant

weight was obtained.

The immobilized cell concentration was calculated with the correlation between DNA

content, viable cell counts and biomass, assuming that the DNA content per cell of

immobilized Lb. rhamnosus RW-9595M and free cells of Lb. rhamnosus ATCC-9595 is

the same per cell. Immobilized cell concentration was expressed as colony-forming units or

cell dry weight per support dry weight (CFU/g or g/g, respectively). Each analysis was

repeated three times.

3.4.4.2 ATP extraction

The quantity of ATP in a sample containing planktonic cells was determined using the

firefly bioluminescence method as described by Gikas and Livingston (1993). For ATP

extraction from cells, one ml of sample was mixed with 9 ml of a Tris-EDTA buffer and

incubated at 100°C for 3 min. Then the extracted ATP reacted with luciferin (LH2) in a

reaction catalyzed by the luciferase enzyme and produced luminescence that was measured

using a Wallac Victor-1420 microplate reader. The ATP Bioluminescence Assay Kit CLS

II (Boehringer Mannheim GmbH, Germany) was used according to the manufacturers

standard protocol.

3.4.4.3 Protein extraction

Broth samples (25 ml) were centrifuged (7500 g at 4°C for 15 min) and the pellet was

washed three times with 0.95% NaCl solution. For protein extraction, 10 ml 0.1 M NaOH

were added to the pellet and the sample was heated at 100°C for 30 min. After

73

centrifugation (7500 g at 4°C for 15 min) the protein concentration in the supernatant was

determined using the DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) with

bovine serum albumin as standard. For determination of protein content of immobilized

cells, 1 g of support was treated as described for cell pellets except that cells were

ultrasonicated (Aquasonic Model 250T, VWR Scientific, West Chester, PA) for 2 h in

0.1 M NaOH before the heating step.

3.4.5 EPS concentration analysis

Homogeneous culture broth samples were heated to 100°C for 15 min, cooled and

centrifuged (13,200 g at 4°C for 25 min). Supernatants were stored at -20°C.

Polysaccharides in supernatant were partially purified by a new ultrafiltration method

(Bergmaier et al. 2001) (Chapitre 2), and total carbohydrate was quantified by the phenol-

sulfuric acid method (Dubois et al. 1956) with glucose as standard. The concentration of

EPS produced during fermentation was calculated by subtracting the polysaccharide

concentration in the fresh medium from that measured in the fermented broth.

3.4.6 Sugar and organic acid analysis

Culture broth samples were centrifuged (13,200 g at 4°C for 25 min), diluted and filtered

on an Acrodisc LC13 filter (0.2 µm; Gelman Sciences, Ann Arbor, MI, USA). Residual

sugars and lactic acid concentration in the supernatant were determined by HPLC (Waters,

Millipore Co. Montreal, QC, Canada) using a Phenomenex ion column (Phenomenex,

Torrance, CA) and H2SO4 0.0064N as eluent at a flow rate of 0.4 ml/min. Analysis was

performed in duplicate.

3.5 Results and Discussion

In this study, pH-controlled batch cultures in a whey permeate based medium with

Lb. rhamnosus RW-9595M were carried out. Bacterial growth and EPS production during

free-cell batch cultures were compared with repeated-batch cultures with cells immobilized

on solid porous supports.

74

3.5.1 Cell and EPS production during free-cell batch cultures

Data obtained for two free-cell batch fermentations in 8% SWP medium are presented in

Fig. 3.1. The free-cell counts increased rapidly during the pH-controlled culture and

reached a very high maximum value of 1.31 ± 0.05·1010 CFU/ml after 18 h. This data

shows the suitability of the whey-permeate-based medium for biomass growth. Lactose as

the only carbon source in this medium with an initial concentration of 64.9 ± 0.3 g/l was

completely consumed after 32 h culture. Lactic acid was the only organic acid produced,

for a final concentration in the fermented broth of 58.7 ± 0.8 g/l. When the maximum

population was reached (18 h), only 43 g/l of lactic acid had been produced (Fig. 3.1).

Uncoupling between growth and lactic acid production was thus observed after 18 h of

fermentation, and approximately 25% of acid production occurred during this phase. Such

uncoupling between growth and acidification has been reported with lactobacilli (Oyaas et

al. 1996). Although EPS production kinetics were similar to that of lactic acid production,

it is noteworthy that little EPS production was observed after 18 h of fermentation.

Therefore, in free-cell fermentations, EPS production appeared more closely linked to

growth than was acidification. After 32 h culture, a high total polysaccharide concentration

in the fermented broth of 2728 ± 38 mg/l was measured. The final EPS production

calculated by subtracting the initial polysaccharide content in the medium (378 ± 13 mg/l),

which is mainly due to YE supplementation (Bergmaier et al. 2001; Torino et al. 2000),

was 2350 ± 51 mg/l. The EPS volumetric and specific productivities were maximum after

18 h, equal to 110.3 mg/l·h and 8.45·10-12 mg/CFU·h, respectively.

75

Fig. 3.1 Viable cell counts (●), lactose (■) and lactic acid (♦) concentrations, and EPS

production (▲) during pH-controlled batch cultures with Lb. rhamnosus RW-9595M.

Means and standard deviations for two fermentations.

The EPS production obtained in this study, more than 2.3 g/l, is one of the highest reported

for lactobacilli in the literature. Only Macedo et al. (2002b) reported higher values

(2775 mg/l) for the same strain in a complex and rich medium composed of whey permeate

supplemented with yeast extract and vitamins, salts and amino acids of the defined BMM

medium (Morishita et al. 1981). However, the EPS production by Lb. rhamnosus

RW-9595M is still much lower than the high yields obtained with dextran-producing LAB

and Gram-negative EPS producers such as X. campestris with very high productions of 10-

25 g/l (Becker et al. 1998). De Vuyst and Degeest (1999b) stated that, from an economic

point of view, a production of 10-15 g/l would be required in order to use EPS from LAB

as functional (thickener, gelling agent) food additives.

76

3.5.2 Cell production during repeated batch cultures with immobilized

cells.

In order to increase biomass in the fermentation system, and thus achieve higher

productivity, Lb. rhamnosus RW-9595M cells were immobilized on ImmobaSil® solid

porous supports which were used during repeated pH-controlled cultures. Data obtained for

four consecutive batch cultures with immobilized cells in 5% SWP medium are presented

in Fig. 3.2. Each culture was carried out until about 80 ml of 6 N base was used to control

pH at 6. This base volume corresponds to a theoretical lactic acid production of about

41 g/l, and to nearly complete conversion of lactose in the medium (43 g/l) into lactic acid

(Bergmaier et al. 2001) (Chapitre 2). This was verified by HPLC analysis of samples taken

at the end of the four consecutive batch cultures. In these samples, residual lactose

concentration ranged between 0 and 5 g/l and a high concentration of lactic acid between

33 and 38 g/l was tested.

With this repeated-cycle batch fermentation strategy, a decrease of fermentation time was

observed with an increase in the cycle number, with 16, 9, 7, and 7 h from the first to the

fourth batch culture. The enumeration of free-cells in the fermentation broth showed very

high cell concentrations at the end of incubation before medium change, with a mean of

1.02 ± 0.14·1010 CFU/ml (Fig. 3.2). This cell concentration is equal (p<0.05) to that

obtained during batch cultures in 8% SWP medium in this study

(1.31 ± 0.05 · 1010 CFU/ml) and to that measured during batch fermentations in 5% SWP

(1.1 ± 0.1 · 1010 CFU/ml) (Bergmaier et al. 2001) (Chapitre 2). Between two consecutive

cultures the medium was completely changed and the new medium was mixed with the

supports. The mean free-cell count in the broth after this change was high

(3.9 ± 0.5 · 108 CFU/ml) probably due to incomplete broth removal in the void spaces of

the support and cell release from the support. The rapid build up of free cells during

incubation resulted from both free cell growth and immobilized cell growth associated with

cell release from the solid supports (Lamboley et al. 1997).

77

Fig. 3.2 Free-cell counts (●), immobilized cell concentration measured by DNA extraction

method (■) and polysaccharide concentration in the broth (vertical bars) during four

repeated batch cultures with Lb. rhamnosus RW-9595M immobilized on ImmobaSil®

silicone rubber solid supports.

3.5.3 Immobilized cell concentration in the solid supports

The knowledge of the content of immobilized biomass in solid supports is important for

process analysis and optimization. However, conventional methods such as dry weight or

viable cell enumeration are not suitable for cells immobilized in solid supports, particularly

for EPS-producing strains. Biomass dry weight determination is greatly influenced by

products accumulated in the porous support and viable cell count determination requires an

initial step to release immobilized cells with no loss of viability before cell enumeration,

which is not possible with solid supports. Therefore, several methods for immobilized

biomass estimation were tested in this study. Specific cell components, proteins, ATP and

DNA, were quantified during free-cell cultures and calibration curves were developed to

relate the component concentration with viable cell counts or biomass concentration. These

78

calibrations could then be used to estimate the immobilized biomass or cell concentration

from the specific component concentration tested in the solid support.

One major constituent of microbial cells are proteins. About 57% of the dry weight of a

typical bacterium is protein (Atkinson and Mavituna 1991). In the present study, the

amount of proteins in planktonic cells was determined and correlated with biomass. An

amount of 252.4 mg proteins per g dry weight of bacteria was determined (results not

shown). However, protein extraction experiments with colonized carriers resulted in an

important variance for the value of immobilized biomass (results not shown), probably due

to incomplete removal of contaminating proteins contained in the medium or to interference

of peptidoglycans. Similar results were also observed for immobilized Acinetobacter

calcoaceticus cells (Wang 1988). In contrast, Chen et al. (1998) evolved and successfully

used a protein detection method for sludge biomass estimation of cells immobilized in

phosphorylated polyvinyl alcohol gel beads. Also Freeman et al. (1982) developed and

used an assay based on protein content determination in order to quantify immobilized

biomass in synthetic and native polymer-gel beads.

In ecological research the extraction and analysis of ATP is often used for biomass

estimation (Holm-Hansen and Karl 1987; Karl 1980). There are two important assumptions

for the use of this method: first, that ATP exists only in viable cells and is rapidly degraded

after the cell dies (Holm-Hansen and Karl 1987); and second, that the quantity of ATP in

the bacterial cell does not vary significantly for a particular strain (Stanley 1986). Thus, the

viable cell concentration can be estimated by the amount of cellular ATP. Gikas and

Livingston (1993) used ATP content and the dry weight of planktonic and immobilized

cells growing on 3,4-dichloraniline to evaluate cell viability. The biomass during

continuous culture on whey permeate of Lb. casei cells immobilized on sintered glass

particles was estimated by the estimation of cellular ATP (Krischke et al. 1991).

In our study, culture broth samples from free-cell cultures with Lb. rhamnosus RW-9595M

were analyzed for ATP content. Preliminary data showed that the amount of ATP per cell

decreased dramatically (from 1.2 · 10-19 to 2 · 10-20 mol ATP/CFU) during the exponential

growth phase (see Annexe 1 ). For this reason no further experiments were made with this

79

method. Chappelle et al. (1987) also pointed out that the ATP concentration in bacterial

cells varies over the growth cycle and decreases as the population ages.

Another important component of viable cells is DNA. The DNA extraction method was

used for biomass determination in the domain of waste water treatment (Raebel and

Schlierf 1980) and marine sediment characterization (Dell'anno et al. 1998). The

quantification of Acinetobacter calcoaceticus immobilized on Celite (Wang 1988) and

Comamonas acidovorans immobilized on different supports (Buchtmann et al. 1997) was

also tested by a DNA method.

In this study, the microbial DNA extraction and quantification method was used to estimate

biomass immobilized on ImmobaSil® carriers. Correlations between DNA content, dry

weight and free-cell counts of Lb. rhamnosus ATCC-9595 were first established. This low

EPS producer was used because Lb. rhamnosus RW-9595M, a natural mutant isolated from

Lb. rhamnosus ATCC-9595, produces very high amounts of EPS that interfere with cell

separation. Cell samples from the exponential growth phase of free-cell pH-controlled

batch cultures with concentrations from 1.7·108 to 1.3·1010 CFU/ml were used to develop

calibration curves between DNA content and dry weight or viable cell counts. Highly

significant (p<0.001) correlations were obtained:

Xw = 2.9594·109 · CDNA R2 = 0.9779 (2)

Xc = 1.2888 · CDNA R2 = 0.9739 (3)

where Xw and Xc are the viable cell count (CFU/ml) and dry biomass concentration

(mg/ml), respectively, and CDNA is the DNA concentration (µg/ml).

After extraction, the amount of DNA in colonized supports during the four consecutive

cultures was measured and used to estimate biomass growth in the supports. After only a

4-h stirring regime, an immobilized biomass of about 1.1 · 109 CFU/ml support was

measured, indicating the good adhesion properties of Lb. rhamnosus RW-9595M cells on

the silicon rubber supports (Fig. 3.2). The immobilized biomass grew continuously during

the four successive batch cultures and reached a very high value of

8.5 · 1011 CFU/ml support at the end of the fourth culture.

80

This result was obtained with the assumptions that DNA content of parental strain,

Lb. rhamnosus ATCC-9595, used for calibration of this method was the same as for the

EPS producing variant Lb. rhamnosus RW-9595M and that DNA content of immobilized

cells was the same as for cells produced during free-cell cultures. Lb. rhamnosus

ATCC 9595 was used for method calibration, because it produced only very low amounts

of EPS compared with the variant strain RW-9595M. The high production of EPS by this

strain prevented the separation of cells from the broth medium by physical techniques

(filtration, centrifugation), which is required for the development of a calibration curve for

the method. A very rapid degradation of DNA was observed for this culture with cell death

as a result of a very active DNA degrading enzyme (Peant and LaPointe 2001). Therefore,

the immobilized cell content estimated with this method mainly corresponded to living cell

DNA that was not degraded.

The viable immobilized biomass tested in our study (8.5 · 1011 CFU/ml support) is high,

compared with data previously reported for other LAB, although it is difficult to compare

data for immobilized biomass, because different microorganisms, immobilization

procedures, reactor designs and measurement methods were used. For example,

immobilized viable cell counts of 2.7 · 1011 CFU/ml gel beads for Lactobacillus casei

subsp. casei (Arnaud et al. 1992) and of 1.3 · 1011 CFU/g beads for three strains of

lactococci (Lamboley et al. 1997) immobilized in κ-carrageenan/locust bean gum gel beads

were measured during continuous fermentation. Modelling of the density of Lactococcus

lactis cells in gel matrix indicated that cell concentration at the bead periphery could reach

maximum values as high as 1 · 1012 cells/ml support (Cachon et al. 1995). Doleyres et al.

(2002b) also reported high bifidobacteria viable counts (6.8 · 1010 CFU/g) in gellan gum gel

beads during continuous cultures.

The established correlation between DNA content and dry biomass concentration was used

to estimate the bacterial dry weights in the carriers. The highest immobilized biomass value

of 384.9 ± 1.7 mg/ml was obtained after the fourth batch culture. This data is in agreement

with data on immobilized biomass dry weights in porous solid supports reported in the

literature. Lb. casei immobilized by adsorption on porous glass/ceramic beads for lactic

acid fermentation reached a biomass concentration of 0.105 g/g support during continuous

81

culture in whey permeate (Krischke et al. 1991). For Lb. casei cells immobilized on

polyethyleneimine-coated foam glass particles in a recycle batch reactor with a whey-based

medium, biomass concentration reached 0.490 g/g support after 12 cycles (Senthuran et al.

1997). In a study with Lb. rhamnosus immobilized on different inert adsorbent supports,

mainly made of porous glass, in a continuously recycled packed reactor, a maximum

immobilized biomass load of the support of 34.4 g dry weight/l was tested (Gonçalves et al.

1992).

The calculated total population in the ICT system after the first batch fermentation

(1.09 · 1014 CFU) was approximately eight fold higher than that for the free-cell system

(1.57 · 1013 CFU). This is unusual, since total populations in ICT systems are generally

lower than those in free-cell systems after a single batch fermentation (Champagne et al.

1993). This suggests that DNA data used to estimate the CFU population slightly

overestimates Lb. rhamnosus RW-9595M viable cell counts. It must be remembered that

the DNA-CFU relationship was established with the parent ATCC 9595 strain. After the

first batch, immobilized cells represented approximately 60% of the total population in the

ICT system. This is typical of data obtained in ICT systems following a first batch

fermentation (Champagne et al. 1993).

3.5.4 EPS production during repeated batch cultures with immobilized

cells

At the end of the fourth consecutive culture, which lasted only 7 h, a high total

polysaccharide content in the broth of 2176 ± 95 mg/l was obtained (Fig. 3.2), which

corresponded to an EPS production of 1808 ± 107 mg/l. At this time, the carbon source in

the medium, lactose, was completely consumed and the culture entered stationary growth

phase. It can be presumed that cell growth and/or EPS production could be further

enhanced by using a higher carbon concentration in SWP medium, such as 8% instead of

5% whey permeate in SWP. Even though batch cultures with immobilized cells were

limited by the carbon source, the high biomass maintained in the system more than doubled

the maximum EPS volumetric productivity (258 mg/l·h after 7 h during the fourth batch

culture) compared with free-cell batch cultures in 8% SWP (110 mg/l·h, calculated for an

82

EPS production of 1985.2 mg/l after 18 h culture). Considering interruption periods for

equipment cleaning and inoculum preparation, the EPS volumetric productivity of repeated

immobilized cell batch cultures is approximately 4–5 fold higher than for free-cell batch

cultures. Taking into account free and immobilized biomass, a specific productivity of

6.24·10-12 mg/CFU h was calculated for the fourth immobilized cell fermentation, which is

approximately 20% lower than that for free-cell batch fermentations (8.45·10-12 mg/CFU h).

This data can be explained by mass transfer limitations due to immobilization which create

a different microenvironment for immobilized cells compared with that for planktonic cells,

affecting not only nutrient uptake but also removal of products like lactic acid (Champagne

et al. 1994; Lamboley et al. 1997). Product accumulation may lower growth rate and

change the physiology of immobilized LAB cells (Cachon et al. 1998; Champagne et al.

1994; Krishnan et al. 2001).

3.6 Conclusions

In this study, a whey permeate-based medium was fermented by Lb. rhamnosus

RW-9595M for high EPS production. This is a promising approach for using whey

permeate, a by-product of the dairy industry available in large amounts and with limited

value. A method for biomass determination, based on extraction and quantification of

microbial DNA, was developed. This method was useful for the estimation of biomass in

solid supports, which cannot be quantified by traditional methods, such as biomass dry

weight or cell enumeration. Repeated batch cultures clearly showed the high potential of

immobilized cells on solid supports for EPS production, increasing the maximum

volumetric productivity compared with free-cell cultures. In addition, this technology

results in shorter shut-down periods of fermentation systems, with more than three

production batches per day, and reuse of microbial cells, which further enhances industrial

productivities. Our data shows the great potential of an immobilized cell system with this

strain for the production of EPS-type functional and eventually nutraceutical food

ingredients in a whey permeate-based medium. This system is currently being studied for

continuous EPS production in supplemented whey permeate medium.

Chapitre 4

Exopolysaccharide production during chemostat

cultures with free and immobilized Lactobacillus

rhamnosus RW-9595M

Dirk Bergmaier1, Claude P. Champagne2 and Christophe Lacroix3

1 STELA Dairy Research Centre, Pavillon Paul Comtois, Université Laval, Québec, PQ,

Canada, G1K 7P4

2 Food Research and Development Center, Agriculture and AgriFood Canada, St-

Hyacinthe, PQ, Canada, J2S 8E3

3 Laboratory of Food Biotechnology, Institute of Food Science and Nutrition, Swiss

Federal Institute of Technology, ETH Zentrum, LFO F18, CH-8092 Zurich, Switzerland

84

4.1 Résumé

La production d'exopolysaccharide par Lactobacillus rhamnosus RW-9595M a été étudiée

lors des fermentations continues dans un milieu à base de perméat de lactosérum. Lors

d'une culture avec des cellules libres à des taux de dilution (D) entre 0.3 et 0.8 h-1, une

production d'EPS (1808 mg/l) et une productivité volumétrique (542,6 mg/l·h) maximales

élevées ont été obtenues pour un bas D de 0.3 h-1, tandis que la productivité spécifique en

EPS était maximale (9.80 ± 1.01·10-11 mg/CFU·h) pour un D intermédiaire de 0.7 h-1. Une

fermentation continue dans un système de bioréacteurs à deux étages, avec les cellules

immobilisées, a été conduite pendant 32 jours. Le fermenteur du premier étage contenait

des cellules immobilisées par adsorption sur des supports poreux solides en caoutchouc de

silicone (ImmobaSil®). Le deuxième étage de fermentation en série a été constamment

inoculé par les cellules produites dans le premier étage. L'influence de la concentration en

extrait de levure, de la température et du taux de dilution sur les productions de la

biomasse, d'EPS et d'acide lactique dans les deux réacteurs a été étudiée, en utilisant un

plan central composite rotatif avec une analyse de surface de réponse. Un modèle

statistiquement significatif (P<0.05) a été trouvé seulement pour la production d'acide

lactique mais pas pour la production de biomasse ou d'EPS. Des concentrations moyennes

de cellules libres de 1.36 · 109 et 2.26 · 109 CFU/ml ont été déterminées dans le premier et

le deuxième réacteur. Une biomasse immobilisée très élevée et stable, égale à

5.3 ± 1.8 · 1011 CFU/g, a été mesurée par le dosage de l'ADN dans les supports solides. En

dépit de ces concentrations élevées en cellules libres et immobilisées, la production

moyenne en EPS soluble dans le milieu fermenté a été très basse (138 mg/l). Ce résultat

peut être expliqué par les changements morphologiques et physiologiques majeurs de

Lb. rhamnosus RW-9595M qui conduisent, après dix jours de fermentation, à la formation

d'agrégats d'une forte taille (1.2 millimètres) contenant des cellules. La perte de la capacité

des cellules à produire des EPS solubles, observée dans le système à cellules immobilisées,

était réversible et la production d'EPS a été entièrement récupérée après quatre cultures

successives en batch à pH contrôlé.

85

4.2 Abstract

Exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus RW-9595M was studied during

continuous fermentations in whey-permeate-based medium. A continuous culture with free

cells was conducted for 9 days at dilution rates (D) between 0.3 and 0.8 h-1. High maximum

EPS production (1808 mg/l) and volumetric productivity (542.6 mg/l h) were obtained for a

low D of 0.3 h-1, whereas the EPS specific productivity was maximum

(9.80 ± 1.01·10-11 mg/CFU h) for an intermediate D of 0.7 h-1. A continuous fermentation in

a two-stage bioreactor with immobilized cells was carried out for 32 days. The first

fermentation stage contained cells immobilized by adsorption on silicone rubber solid

porous supports (ImmobaSil®). The second fermentation stage in series was continuously

inoculated by cells released from the first stage. The influence of yeast extract

concentration, temperature and dilution rate on biomass, EPS and lactic acid production in

both reactors was investigated, using a central composite rotatable design and response

surface analysis. A statistically significant model (P<0.05) was found only for lactic acid

production but not for biomass and EPS production. The mean free cell concentrations,

measured by plate counts, in the first and second reactor was 1.36 · 109 and

2.26 · 109 CFU/ml, respectively. A very high and stable immobilized biomass was tested by

DNA quantification analysis in the solid supports, equal to 5.3 ± 1.8·1011 CFU/g support.

Despite these high free and immobilized cell concentrations, the mean soluble EPS

production in the fermented broth was very low (138 mg/l). This was explained by marked

morphological and physiological changes of Lb. rhamnosus RW-9595M that lead to the

formation of very large cell-containing aggregates (1-2 mm) after 10 days. The loss of

soluble EPS production capacity of cells in the effluent of the immobilized cell system was

reversible and EPS production was fully recovered after four successive pH-controlled

batch cultures.

4.3 Introduction

Exopolysaccharides (EPS) produced by lactic acid bacteria (LAB) have received

considerable attention in recent years. They play an important role in the manufacturing of

fermented dairy products such as yogurts, fermented milks, cheeses, fermented creams and

86

milk-based desserts (Duboc and Mollet 2001). The EPS are very attractive for use as food

additives because of their contribution to the texture, mouthfeel, taste perception and

stability of the final product. They may act as texturizers and stabilizers, decreasing

syneresis and improving product stability. Furthermore, EPS can contribute to human

health as prebiotics or due to their anti-tumor, anti-ulcer, immunomodulating or

cholesterol-lowering activities (Ruas-Madiedo et al. 2002a). However, compared to

dextran-producing or Gram-negative EPS producers, the low production of EPS by most

LAB is a constraint for their commercial use as food additives (De Vuyst and Degeest

1999b).

Immobilized cell technology (ICT) could be an attractive solution to overcome this

constraint. The retention of high biomass densities in continuous cultures can generate an

uncoupling between microbial growth and product synthesis and largely increases process

productivity (Norton et al. 1994a). Other advantages of ICT are the reuse of cells,

protection against shear damage and the high biological stability during long-term

continuous fermentation (Champagne et al. 1994; Lamboley et al. 1999; Lamboley et al.

1997). Furthermore, immobilized cell systems show enhanced tolerance for inhibiting

substances like acids, salts or antibiotics (Fortin and Vuillemard 1989; Jouenne et al. 1994;

Trauth et al. 2001). ICT results in more constant product characteristics and, in addition,

local accumulation of produced extracellular polysaccharides in the immobilization support

may facilitate their recovery and hence downstream processing for EPS production (Wang

and Wang 1989).

There are numerous studies with different techniques for immobilizing cells and, in this

way, to increase cell concentration in the bioreactor. Cell recycling with membrane

separation techniques (e.g. hollow fibre systems, membrane reactors) often encounter mass

transfer and membrane fouling problems (Gonçalves et al. 1992). These systems seem to be

unsuitable for the production of high molecular mass EPS. Polysaccharide gel entrapment

techniques have been extensively studied, especially with LAB, but the gels generally

exhibit limited mechanical stability over extended fermentation periods (Champagne et al.

1994). This limitation may be exacerbated during EPS fermentations that produce a highly

viscous medium. Immobilization by adsorption on porous preformed and inert supports can

87

solve this problem. Bergmaier et al. (2002a) (Chapitre 3) immobilized Lb. rhamnosus RW-

9595M cells by adsorption on ImmobaSil® porous solid supports during repeated batch

cultures in a whey-permeate-based medium. Immobilized biomass reached

8.5 · 1011 CFU/ml support after only four fermentation cycles and a very high maximum

EPS volumetric productivity of 258 mg/l·h was obtained for the forth cycle which lasted

7 h. This data shows potential for the use of immobilized cells on solid supports during

continuous fermentations for EPS production.

Whey is a by-product of cheese production which can be separated by ultrafiltration into

high-grade proteins and permeate. The whey permeate contains almost all the lactose of

milk and, if not treated, represents an important part of the polluting effluents of dairy

industries. Due to its high biological oxygen demand, its treatment by sewage plants is

expensive. This by-product could provide a carbon and mineral-rich substrate for microbial

fermentations. Whey-permeate-based media were used recently for high EPS production by

Lactobacillus rhamnosus RW-9595M (Bergmaier et al. 2001; Macedo et al. 2002b).

In this work, EPS production during chemostat cultures with free and immobilized

Lactobacillus rhamnosus RW-9595M at different dilution rates was studied in a

supplemented whey permeate medium. Cells were immobilized by adsorption on a food-

grade porous support of silicone rubber, ImmobaSil®. A second stage free-cell bioreactor

(FCB) attached in series with the immobilized cell bioreactor (ICB) was used to finish the

fermentation and to increase cell and product concentrations in the fermented broth. The

effects of yeast extract concentration (CYE), temperature (T) and dilution rate (D) and their

interactions were investigated on biomass, lactic acid and EPS productions during a 32-day

continuous immobilized-cell fermentation using a central composite rotatable design and

response surface analysis.

4.4 Material and Methods

4.4.1 Microorganism

Lb. rhamnosus RW-9595M, obtained from the Lactic Acid Bacteria Research Network

(RBL Network) culture collection (Dairy Research Centre STELA, Université Laval,

88

Québec, PQ, Canada), was isolated from reference culture Lb. rhamnosus ATCC-9595. It

was shown to produce very high EPS concentrations in BMM defined medium (Dupont et

al. 2000) and in supplemented whey permeate medium (Bergmaier et al. 2001; Macedo et

al. 2002b). The strain was subcultured aerobically in supplemented whey permeate for 36 h

at 37°C. The stock culture was kept frozen in 6% (v/v) rehydrated skim milk and 10% (v/v)

glycerol at -80°C. For inoculum preparation, a fresh culture was propagated twice in 5%

whey permeate with 1% yeast extract at 37°C for 10 h or until pH 4.8 was reached.

4.4.2 Culture media

The supplemented whey permeate medium (SWP) was obtained by rehydration of whey

permeate powder (8% w/v, Foremost, Baraboo, WI, USA), and addition of 0.5 g/l MgSO4 ·

7H2O, 0.05 g/l MnSO4 · H2O and 1 ml/l Tween-80. The pH was adjusted to 4.9 with HCl

6 N and the suspension was filtered on a filter press Flojet (Buon Vino, Cambridge, Ont,

Canada) with number 4 filters. The medium was heat-treated with a induction heat

exchanger (Chalinox; Sorel, Québec, Canada) at 140°C for 8 s, then cooled to 6°C. It was

stored at 4°C and supplemented with a concentrated sterile yeast extract (YE) solution prior

to use at a final concentration in the broth medium ranging from 0 to 1.37 % (w/v). The YE

solution was prepared by adding 400 g of YE (Rosell Institute Inc., Montreal, PQ, Canada)

to 1 l deionized water and autoclaved for 15 min at 121°C.

4.4.3 Fermentation techniques

4.4.3.1 Free-cell continuous culture

A continuous culture with free cells was carried out in SWP medium containing 1.1% YE

in a 0.5 l bioreactor (Model C30, New Brunswick Scientific Co. Inc., Edison, NJ), with a

fermentation volume of 0.5 l, temperature controlled at 37°C and pH at 6 by addition of 7 N

NH4OH. The reactor was inoculated at 1.5% (v/v) and batch fermentation was carried out

for 21 h. Then fresh medium was added at a dilution rate of 0.3 h-1 and the system was

equilibrated for 1 day. During the following 9-day continuous fermentation, dilution rates

between 0.3 and 0.8 h-1 were applied in randomized order. After at least ten reactor-volume

89

changes, steady-state conditions were considered established and effluent samples were

taken.

4.4.3.2 Immobilized-cell continuous culture

The immobilized cell fermentation was carried out in a two-stage system consisting of a

1.5 l Bioflow III bioreactor (New Brunswick Scientific Co. Inc., Edison, NJ) and a second

1.5 l bioreactor (Biogénie, Ste Foy, Qc, Canada). These reactors were set for a total culture

volume of 0.7 and 1.4 l, respectively. Temperature in both reactors was controlled at the

set-point selected in the range from 24 to 44°C. The pH was controlled on-line at 6 by

automatic addition of 7 N NH4OH. The first bioreactor (ICB) was operated with

immobilized cells, and the second reactor (FCB) in series was operated with free cells

released from the ICB.

The ICB was filled with 210 ml (corresponding to 30% of the total culture volume) silicone

rubber solid carriers (ImmobaSil®, Ashby Scientific Ltd., Coalville, Leicestershire, UK)

and 500 ml PBS at pH 7. Designed as Raschig-rings, these solid supports offer a uniform

pore size from 50 to 150 µm and a void fraction larger than 40% for colonization. The PBS

was replaced aseptically by fresh medium with a composition corresponding to the central

point of the experimental design (CYE = 0.7%). The pH was adjusted to 6 and the medium

was agitated for 20 min. This step was repeated once and the ICB was refilled with fresh

media. The pH was adjusted and controlled at 6 and temperature was set to 34°C with mild

agitation (25 rpm). The reactor was then inoculated (1.5% v/v) with a fresh culture. The

ICB was operated in batch mode under these conditions for 9 h, until optical density

(620 nm) of the media reached a value of 9. Then the medium feed was started at a dilution

rate of 0.5 h-1. When the medium volume in the second stage FCB reached the working

volume (1.4 l), pH and temperature were controlled at the same set-point as in the ICB and

the system was operated for 48 h with agitation at 110 rpm and for another 24 h under the

same conditions but with a D of 0.8 h-1. After this initial colonization period, the set points

for CYE, T and D were set to the central point values of the experimental design and the

system equilibrated for an additional 4 days. The values for D in this study are calculated

for the ICB working volume (0.7 l).

90

The set points for CYE, T and D in both reactors were changed every 24 h according to the

central composite experimental design (Tab. 1) and the fermentation was allowed to

stabilize for 20 h under the new conditions. After 20 and 22 h, samples were taken from the

effluent of the two reactors for cell enumeration, and sugar and lactic acid determinations.

At day 3 no sample was taken because the pH in the FCB differed by more than 0.1 from

the set point due to pH-probe deviation. The probe was changed and the system was re-

equilibrated for 24 h. Hence, the entire culture experiment lasted 32 days, 8 days for

colonization and equilibration and 24 days for the experimental design. Cell enumerations

were performed immediately after sampling. Samples were kept frozen at -18°C for the

determination of lactic acid and sugar concentrations. A sample of 15 colonized carriers

was taken 21 h after the set point changes and kept frozen at -80°C for determination of

immobilized biomass.

4.4.3.3 Successive free-cell batch cultures

Batch cultures with free cells were carried out in 0.5 l SWP medium with YE concentration

of 1.1% in a 0.5 l bioreactor (Model C30, New Brunswick Scientific Co. Inc., Edison, NJ).

Temperature was controlled at 37°C and pH at a value of 6 by addition of 7 N NH4OH. At

day 19 of the continuous immobilized cell culture, an effluent sample of the ICB was taken

to inoculate (1% v/v) the first batch culture. When the base consumption ceased, the batch

culture was stopped and the fermented broth was immediately cooled in ice-water. This

culture was taken to inoculate a second identical batch culture, and with the broth of the

second, a third identical batch culture was inoculated. At the end of each batch culture, the

viable cell and EPS concentrations were measured in the fermented broth.

4.4.4 Cell enumeration and biomass determination

Free-cell concentration in the effluent was estimated by the pour plate method on solid

MRS agar (Difco Laboratories, Richmond, CA, USA), after aerobic incubation at 37°C for

36 h. Reported data are means for triplicate analysis.

91

4.4.5 Determination of immobilized biomass concentration in solid

supports

For immobilized cell concentration determination, microbial DNA was extracted and

quantified as previously described (Bergmaier et al. 2002a) (Chapitre 3). Immobilized cell

concentration was expressed as colony-forming units or cell-dry-weight per support dry

weight (CFU/g or g/g, respectively). Each analysis was repeated three times.

4.4.6 EPS concentration analysis

Homogeneous culture broth samples were heated to 100°C for 15 min, cooled and

centrifuged (13,200 g at 4°C for 25 min). Supernatants were stored at -20°C.

Polysaccharides in supernatant were partially purified by a new ultrafiltration method

(Bergmaier et al. 2001) (Chapitre 2), and total carbohydrate was quantified by the phenol-

sulfuric acid method (Dubois et al. 1956) with glucose as standard. The concentration of

EPS produced during fermentation was calculated by subtracting the polysaccharide

concentration in the fresh medium from that measured in the fermented broth. Each

analysis was repeated at least three times. The experimental error was always less than

10%.

4.4.7 Sugar and organic acid analysis

Culture broth samples were centrifuged (13,200 g at 4°C for 25 min), diluted and filtered

on an Acrodisc LC13 filter, 0.2 µm (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI, USA). Residual

sugar and lactic acid concentrations in the supernatant were determined by HPLC (Waters,

Millipore Co. Montreal, QC, Canada) using a Phenomenex ion column (Phenomenex,

Torrance, CA) and H2SO4 0.0064 N as eluent at a flow rate of 0.4 ml/min. Analyses were

performed in duplicate.

4.4.8 Microscopy observations

Microscopic preparations of free cells were stained with methylene blue and observed using

optical microscopy. Samples of support were fixed for 24 h in 0.1 M cacodylate buffer at

92

pH 7.3 with 1.5% paraformaldehyde, 2.5% glutaraldehyde, 0.5 mM CaCl2 and 0.12 M

sucrose. The samples were rinsed three times (20 min) with 0.1 M cacodylate buffer, and

treated with 1% osmium tetroxide in 0.1 M cacodylate buffer, for two hours at room

temperature and rinsed again three times with cacodylate buffer. The samples were

dehydrated using an ethanol dehydration series with 10 min each in 75, 80, 90, 96% ethanol

and three changes of 10 min in 99% ethanol. The dehydrated supports were embedded in

epon and sections (about 100 µm thick) were post-stained with methylene blue before

optical microscopy examination.

4.4.9 Experimental design and statistical analysis

A central composite rotatable design composed of 8 factorial points, 6 star points and 1

central point was used to study the effect of fermentation parameters on the continuous

immobilized cell fermentation. To estimate the experimental error and the time stability of

the fermentation, the central point was repeated 9 times. The experimental points were

randomized. Using response surface analysis, the effects of three factors, CYE, T and D,

with five levels each, and their interactions were examined. The real and coded values of

the independent variables are shown in Table 1. The statistical analysis was carried out

using the software JMP IN (SAS Institute Inc., version 3.2.6, Cary, NC). Two covariates

were used for the ANOVA. The first covariate (age) accounted for the time change of the

culture and corresponded to the time elapsed (days) since the first experimental point,

which was set to one. The second covariate (stop) accounted for an interruption of the

fermentation due to pumping problems and a change of the ICB outlet geometry at age 12.

This covariate was equal to 0 or 1, before or after the interruption, respectively. The

covariates were used to maximize the adjusted R2. The adjusted R2 was used instead of R2

to describe the total variance of the model because when the number of regressors is close

to the sample size, R2 is biased (SAS/STAT® 1989). A second order model was used to fit

the responses:

stop age*age age 6543

1

2

1

3

1

23

10 βββββββ ++++++= ∑∑∑∑

+==== ijjiij

iiiii

iii XXXXY

93

where Y is the dependent variable, Xi are the independent variables, βi and βij are the

regression coefficients for main effects and interactions of the independent variables,

respectively.

Seven dependent variables were studied: free cell counts, EPS and lactic acid productions

in the fermented broth in both bioreactors and immobilized biomass concentration in the

solid supports. Cell counts were transformed to their base 10 logarithms to stabilize the

variance and normalize the residuals. A response surface model was calculated for each

response. The sum of square (SS) of the model was partitioned into linear, quadratic, and

crossproduct SS and further into the SS for each factor. The effect of each factor on the

model was estimated from the fraction in the total SS that was associated with this effect.

The coefficients (βi and βij) were determined by the least square method of fitting.

4.5 Results

4.5.1 Free-cell chemostat cultures

Biomass and EPS production by Lb. rhamnosus RW-9595M in SWP medium were studied

during a 9-day chemostat culture with free cells, operated with different dilution rates

between 0.3 and 0.8 h-1 (Fig. 4.1). The cell concentration in the fermented broth decreased

from 1.44 · 1010 to 1.52 · 109 CFU/ml with D in the tested range. The fermentation product

concentrations, lactic acid and EPS, decreased from 33.2 to 12.1 g/l (data not shown) and

from 1808 ± 125 to 125 ± 100 mg/l, respectively, for increasing D from 0.3 to 0.8 h-1. On

the other hand, lactose concentration increased from 20.4 to 43.9 g/l with increasing D,

corresponding to lactose utilization of 51 and 19%, respectively. The EPS production was

significantly (p<0.001) correlated with cell concentration with a Pearson correlation

coefficient r of 0.9997. The EPS volumetric productivity was maximum

(542.6 ± 37.5 mg/l h) for a low D of 0.3 h-1, which corresponded to maximum EPS

production (1808 ± 125 mg/l). However, the specific productivity increased with D up to a

maximum of 9.80 ± 1.01·10-11 mg/CFU·h for a D of 0.7 h-1, and then decreased with further

increase in D to 0.8 h-1.

94

Fig. 4.1 Viable cell counts (vertical bars), EPS concentration (●), and EPS volumetric (■)

and specific productivities (▲) during free-cell chemostat culture with Lb. rhamnosus

RW9595M for different dilution rates. Means and standard deviations for two replications

of D.

4.5.2 Immobilized-cell chemostat cultures

A continuous culture was carried out in a two-stage fermentation system with cells

immobilized on solid supports in the first reactor (ICB) and the second reactor (FCB)

continuously inoculated with cells released from the ICB. The influence of yeast extract

concentration, temperature and dilution rate on biomass, EPS and lactic acid production in

both bioreactors and on immobilized biomass was investigated during continuous

fermentation in SWP, by changing fermentation conditions every 24 h according to the

rotatable central composite experimental design (Tab. 4.1). The results are shown in

Annexe 2 .

95

Tab. 4.1 Real and coded values of the central composite experimental design for the continuous immobilized cell fermentation.

Coded values Real values

CYE T D CYE

(% w/v)T

(°C) D*

(h-1) Factorial points - - - 0.3 28 1.2 - - + 0.3 28 2.4 - + - 0.3 40 1.2 - + + 0.3 40 2.4 + - - 1.1 28 1.2 + - + 1.1 28 2.4 + + - 1.1 40 1.2 + + + 1.1 40 2.4 Star points 0 0 + 0.7 34 2.8 0 0 - 0.7 34 0.8 0 + 0 0.7 44.1 1.8 0 - 0 0.7 23.9 1.8 - 0 0 0 34 1.8 + 0 0 1.37 34 1.8 Central points ** 0 0 0 0.7 34 1.8 * D is calculated for the ICB culture volume of 0.7 l. ** The central point was repeated 9 times to estimate experimental error and time stability during the 32-day culture.

4.5.2.1 Free and immobilized biomass production

The colonization of the ImmobaSil® carrier was analyzed by optical microscopy

observations of semi-fine slices of the carrier which were stained with methylene blue (Fig.

4.2). A very good colonization of the pores near the surface with a clear cell concentration

gradient within the support was observed. Nevertheless, a high cell density was also

visualized in the inner pores of the Raschig-Rings shaped support.

96

Fig. 4.2 Optical micrograph (10X) of a semi-fine slice (methylene blue staining) of the

ImmobaSil® support colonized with Lb. rhamnosus RW-9595M after 7 day chemostat

culture.

The immobilized biomass on ImmobaSil® carriers was estimated by extraction and

quantification of DNA. Correlation between DNA content, dry weight and cell counts

calculated by Bergmaier et al. (2002a) (Chapitre 3) were used to convert DNA data to

viable cell and biomass concentration. Immobilized biomass concentration was very stable

during continuous fermentation, with a mean of 5.3 ± 1.8·1011 CFU/g or 0.23 ± 0.08 g/g

support dry weight corresponding to 3.7 ± 1.2·1011 CFU/ml support. There was no

significant change of these parameters with time and no significant effect (p<0.1) of the

independent variables on immobilized biomass.

Immediately after the colonization and equilibration period, a morphological change of the

cells in the medium in both reactors was observed by optical microscopy. Especially in the

FCB, the normally short chains of lactobacilli of up to 4 cells (Fig. 4.3b) became more

elongated and formed a network-like structure (Fig. 4.3a). After 10 days of culture, the

massive formation of aggregates, very similar in appearance to kefir grains, was observed

in both bioreactors. These aggregates with a size of about 1-2 mm could be harvested by

simply sieving the effluent of the FCB on a screen (0.5 mm mesh size).

97

The mean viable free-cell concentrations were 1.36 ± 0.91 · 109 and

2.26 ± 1.96 · 109 CFU/ml in the ICB and FCB, respectively. For viable-cell counts in the

medium of the ICB, the addition of any covariate did not result in an increase in the

adjusted R2, which was only 0.21. The addition of the covariates stop, age and age2 to the

model for viable-cell counts in the medium of the FCB increased the adjusted R2, but only

to 0.12. In both cases, the regression models were not significant (p>0.1).

a) b)

Fig. 4.3 Photomicrograph of Lb. rhamnosus RW-9595M: a) in the FCB effluent after

14 days of chemostat culture (63X) b) in the fermented medium at the end of a free-cell

batch culture (100X).

4.5.2.2 Sugar and product concentration

Lactose was the only carbon source for fermentation, with an initial concentration in the

fresh medium of 63.0 ± 0.9 g/l. Lactic acid was the only organic acid produced by the

strain, with concentrations in the range from 4.0 to 38.1 and 5.2 to 51.4 g/l in the ICB and

FCB, respectively, with no lactic acid detected in the fresh medium by HPLC. For the ICB,

the addition of covariates age and stop in the model for lactic acid concentration resulted in

a high adjusted R2 of 0.94. The model was highly significant (p<0.001) and explained 97%

of the observed variations. Main effects of CYE and D and the covariate age were highly

significant (p<0.001), whereas the interaction D* CYE and covariate stop were significant at

a level of 99 and 95%, respectively. The linear factors CYE and D explained 13.6 and 41.1%

of the total variation, respectively. The covariates explained 59.3% with the covariate age

98

alone explaining 54.9% of the total variation. The effect of age on lactic acid concentration

in the ICB was linear, with a maximum correction of 30.3 g/l at age = 24 days, i.e. at the

end of the continuous culture. The covariate stop subtracted a constant equal to 6.2 g/l from

lactic acid concentration after age = 12 days. To illustrate the effect of the significant

factors CYE and D on lactic acid concentration in the ICB, a response surface was plotted

for T = 34°C and age = 12 days (Fig. 4.4). Lactic acid concentration increased with

increasing CYE at low D to a maximum of 32 g/l for CYE = 1.37% and D = 0.8 h-1, whereas

at high D, it decreased with increasing CYE. For high CYE, a drastic decrease in lactic acid

concentration was observed with increasing D.

For lactic acid concentration in the FCB, the addition of covariates stop, age and age2

resulted in a model with an adjusted R2 of 0.92. The regression model was highly

significant (p<0.001) and explained 96% of the observed variations. The main factors D

and CYE were significant at a level of p<0.001 and p<0.05, respectively. Also, the

covariates age and stop significantly (p<0.05) affected lactic acid concentration in the FCB.

The main effects of D and T explained 35.9 and 6.7%, respectively, whereas the covariates

together accounted for 24% of the observed total variation. The parabolic time correction

for lactic acid concentration was maximum for age 24 days (end of culture), adding 29.3 g/l

to the lactic acid concentration in the FCB, whereas covariate stop added 12.1 g/l after

age = 12 days. The response surface model for lactic acid concentration in the FCB was

plotted as a function of CYE and D, for T = 34°C and age = 12 days (Fig. 4.5). Lactic acid

concentration increased with increasing CYE and decreased with increasing D, with a

maximum of 46.5 g/l for CYE = 1.37% and D = 0.8 h-1.

The regression models for soluble EPS production in the ICB and FCB were not significant

(p>0.1), with very low adjusted R2 of –0.09 and 0.07, respectively. Mean soluble EPS

production in the ICB and FCB calculated for the entire experiment were very low, equal to

108 ± 90 and 30 ± 142 mg/l, respectively.

99

Fig. 4.4 Response surface of lactic acid concentration in the first immobilized-cell

bioreactor (ICB) for T = 34°C, covariates stop = 0.5 and age = 12 days.

100

Fig. 4.5 Response surface of lactic acid concentration in the second free-cell bioreactor

(FCB) for T = 34°C, covariates stop = 0.5 and age = 12 days.

101

4.5.3 Successive batch fermentations with cells from immobilized cell

culture

An effluent sample of the ICB was taken at age 19 days to inoculate (1% v/v) a 500 ml

batch fermentation with the same medium and incubation was carried out at pH 6 and

37°C. After 22 h the base consumption ceased and the culture was stopped. During the 22-h

culture, the viable cell concentration increased from 1.38 · 107 to 1.05 · 1010 CFU/ml.

Subsequently, this culture was used to inoculate a second batch (18 h) and then a third

batch culture (19 h). The maximum cell concentration at the end of the second and third

batch culture was 1.12 and 1.75 · 1010 CFU/ml, respectively. The EPS production in the

fermented broth increased progressively with the number of batch cultures, with 677 ± 14,

1044 ± 19 and 1742 ± 96 mg/l for the first, second and third culture, respectively.

4.6 Discussion

A continuous free-cell chemostat culture for EPS production was conducted in a

supplemented whey permeate medium, with pH and temperature set-points (6 and 37°C)

chosen from a previous study for high cell growth and EPS production with Lb. rhamnosus

RW-9595M (Macedo et al. 2002b). The high D values tested (between 0.3 and 0.8 h-1)

resulted in high residual lactose concentrations in the broth between 20 and 44 g/l, and

lactic acid production up to 33 g/l. In this range neither lactose nor lactic acid concentration

were inhibitory, as the strain showed good growth in lactose rich medium (62 g/l) and for

lactic acid concentrations above 41 g/l (Macedo et al. 2002b). In this study, a high EPS

production of 1808 mg/l for a low D of 0.3 h-1 was obtained and EPS concentration

decreased with increasing D (Fig. 4.1).

There are only a few reports on continuous cultures of LAB for EPS production. Grobben

et al. (1997) investigated the continuous EPS production with Lactobacillus delbrueckii

subsp. bulgaricus NCFB 2772 on different carbon sources. A maximum EPS concentration

of only 95 mg/l was obtained at a very low dilution rate of 0.075 h-1. Marshall et al. (1995)

studied EPS production by Lactococcus lactis subsp. cremoris LC330 during chemostat

culture. The production of two EPS was observed, one with a low (<10 kDa) and one a high

102

molecular mass (>106 Da). The maximum concentration for the high molecular mass EPS

of 92 mg/l was measured for low temperature and under nitrogen limitation, but the dilution

rate was not given. Gassem et al. (1997b) studied chemostat cultures for EPS production

with Lactobacillus debrueckii subsp. bulgaricus RR in a sweet whey based medium. The

maximum EPS concentration was 2130 mg/l for the higher tested D of 0.055 h-1,

corresponding to a volumetric productivity of 0.11 g EPS/l h. One has to be careful when

comparing EPS production between different studies because different quantification

techniques may result in considerable differences in EPS measures (De Vuyst and Degeest

1999b). In our study we used an accurate EPS quantification technique which is based on

the partial purification of the polymer by ultrafiltration and takes into account the

polysaccharide concentration in the fresh medium (between 0 and 573 mg/l, depending on

yeast extract supplementation level). Compared with that of Cerning et al. (1994), this

method has the advantages of accuracy and rapidity, and requires only small sample

volumes of 1 to 5 ml (Bergmaier et al. 2001) (Chapitre 2).

Both very high EPS production and volumetric productivity (542.6 mg/l h) were obtained

during chemostat culture with free cells of Lb. rhamnosus RW-9595M for a D of 0.3 h-1

(Fig. 4.1). This is by far the highest productivity reported in the literature for lactobacilli.

The specific productivity was maximum (9.80 · 10-11 mg/CFU·h) for a D of 0.7 h-1, and

decreased for higher D of 0.8 h-1. This decrease is supported by the theory of Sutherland

(1982) stating that there is a competition between EPS and cell-wall polymer

(peptidoglycan, teichoic acids, lipopolysaccharides) biosynthesis for the isoprenoid

glycosyl lipid carriers, and consequently EPS production is not growth-associated. For

mesophilic LAB strains, EPS production kinetics is generally not growth-associated (De

Vuyst and Degeest 1999b). In contrast, in our study EPS production during continuous

culture at different D was highly correlated with that for the viable cell concentrations, with

a Pearson correlation coefficient of 0.9997. This data indicates growth-associated EPS

production kinetics in these conditions.

The high EPS production by Lb. rhamnosus RW-9595M during batch cultures in whey

permeate based medium, up to 2775 mg/l (Macedo et al. 2002b), and during free-cell

chemostat cultures in this study, shows the high potential of this strain for EPS production.

103

Furthermore, uncoupling between EPS production and cell growth was observed with this

strain at temperatures between 32 and 42°C (Macedo et al. 2002a). These characteristics

support the use of cell immobilization for EPS production in a high-cell density reactor.

Indeed, cell immobilization often results in enhanced productivities and permits the

uncoupling of cell growth and metabolite production, as demonstrated for lactic acid

production at low yeast extract concentrations (Norton et al. 1994a). Norton et al. (1994b)

showed that cell immobilization permitted lowering of the yeast extract concentration in the

medium which has a very large economic impact on industrial lactic acid production

(Norton et al. 1994b). This can be of advantage for the production of EPS, because YE and

other nitrogen-rich supplements often contain polysaccharides that are very difficult to

separate from EPS (Bergmaier et al. 2001; Torino et al. 2000).

In this study, the mucoid properties of the strain were used to immobilize the cells by

adsorption on food-grade porous supports made of silicone rubber, ImmobaSil®. There are

some advantages of cell adsorption on solid porous supports, compared to other

immobilization techniques and particularly entrapment in gel matrices, that is widely used.

The immobilization step can be carried out in situ, does not involve tedious techniques and

is not harmful for the micro-organisms. Moreover, the solid supports offer high mechanical

stability during long term fermentation in systems with high shear stress, they are more

resistant to the compression and disintegration that can occur in packed beds and stirred

vessels and can be easily separated from the viscous fermented broth containing EPS.

During the 32-day chemostat culture, no mechanical or chemical degradation of the

supports were observed.

The ImmobaSil® porous support offered a very high cell retention capacity. Microscopical

observations showed high biomass accumulation, even in the inner pores of the support

(Fig. 4.2). In fact, with large pores between 50 and 150 µm, immobilization on ImmobaSil®

lies between flocculation and entrapment. During the colonization step, cell adsorption on

the support matrix is an important first step. Growth and aggregation of cells in the

quiescent zones resulted in complete filling of the outer pores of the carrier with biomass.

In these aggregates, cells are immobilized by cell-to-cell interactions and entrapment in the

extracellular substances, such as EPS. The DNA extraction and quantification technique,

104

used in this study, measured a very high and stable biomass content in supports during the

experiment, equal to 5.3 ± 1.8·1011 CFU/g support or 0.23 ± 0.08 g dry weight/g support.

This result was based on the assumptions that the DNA content in the parental strain with a

very low EPS production, Lb. rhamnosus ATCC-9595, used for calibration, is the same as

in Lb. rhamnosus RW-9595M, and that the DNA content in immobilized cells is the same

as in cells from free-cell cultures (Bergmaier et al. 2002a) (Chapitre 3). A very rapid

degradation of DNA was observed for this culture with cell death as a result of a very

active DNA-degrading enzyme (Peant and LaPointe 2001). Therefore, the immobilized cell

content estimated with this method can be attributed mainly to living cells for which DNA

was not degraded. This method proved to be very useful for the estimation of biomass in

solid supports that cannot be quantified by more conventional methods, such as biomass

dry weight or cell enumeration.

The very high viable immobilized biomass tested in our study is in general agreement with

data reported in the literature as previously discussed by Bergmaier et al. (2002a) (Chapitre

3). In this previous study of repeated-batch cultures with the same strain immobilized on

ImmobaSil® a maximum immobilized biomass concentration of 8.5·1011 CFU/ml support

was observed.

In the present study, immobilized cells were used in a two-stage fermentation system with a

first stage ICB and a second stage FCB, during a 32-day chemostat culture. The response

surface analysis of CYE, T and D did not show significant effects of these parameters on

free-cell biomass concentration in both reactors. This data was unexpected because a

similar design was used to study the production of concentrated mixed cultures in a

continuous reactor with three lactococcal strains immobilized separately (Lamboley et al.

1997). In addition, the independent variables, CYE, T and D, studied over wide value

intervals are known to have large effects on fermentation kinetics of LAB (Krischke et al.

1991; Lamboley et al. 1997; Norton et al. 1994a; Norton et al. 1994b). On the other hand,

the immobilization of living cells provides a cell reservoir for continuous fermentation and

allows stable operation of the continuous fermentation even at D higher than the maximum

specific growth rate of the culture. The absence of influence of D on free-cell counts

observed in this study, could partly be due to a large morphology change of the culture as a

105

result of immobilization. The extensive chain length elongation (Fig. 4.3a), similar to that

observed with different immobilized cell cultures (Barbotin et al. 1989; Gonçalves et al.

1992; Norton et al. 1993; Senthuran et al. 1997), resulted in underestimation of biomass by

the pour plate enumeration method. One counted colony corresponds to approximately two

to four cells with normal cell morphology produced during batch and continuous free-cell

cultures (Fig. 4.3b). However, it corresponded to a much larger number of cells that are

contained in one chain or aggregate during continuous immobilized cell culture. The

statistical model could not describe the viable cell count data even with the addition of a

covariate age. Nevertheless, the average free-cell concentrations in the fermentation broth

of the ICB (1.36 · 109 CFU/ml) and the FCB (2.26 · 109 CFU/ml) were high, showing the

high cell production capacity of the immobilized cell system.

Among the dependent variables tested, the response surface analysis found a statistically

significant model only for lactic acid concentration in the two reactors. In both reactors the

main factors CYE and D significantly influenced the lactic acid concentrations, whereas T

had no effect (see Annexe 3 ). Lactic acid concentration in the fermentation broth of both

reactors was maximum at low D and high CYE (Fig. 4.4 and Fig. 4.5), which is consistent

with literature data on lactic acid production with immobilized cells (Norton et al. 1994a).

The maximum predicted lactic acid volumetric productivity of the two stage fermentation

system (14.4 g/l h) was obtained for high D (2.8 h-1) and CYE (1.4 %) values, and was much

higher than that measured during free-cell continuous (9.9 g/l h for D = 0.3 h-1) or batch

culture with the same strain (2.75 g/l h after 20 h culture; (Bergmaier et al. 2002a)

(Chapitre 3). The covariate age, which accounted for time change during the continuous

fermentation, explained a large fraction of the total variation of lactic acid concentration in

the ICB (54.9%) and FCB (11.4%). This large effect of time on lactic acid production in

this study is different from the high stability observed during 5-7 week continuous cultures

with immobilized lactococci (Lamboley et al. 1997; 1999; 2001) and 90-day continuous

culture with immobilized Lb. helveticus (Norton et al. 1994a; 1994b). This difference could

be explained by changes in morphology of the culture which resulted in the retention of cell

aggregates and increased cell load in both reactors with time.

106

As for free-cell concentration, the models for soluble EPS production in both bioreactors

were not statistically significant. The mean soluble EPS productions of 108 ± 90 and

30 ± 143 mg/l in the ICB and FCB, respectively, were very low compared with that

obtained during batch and continuous free-cell cultures with the same strain. Lb. rhamnosus

RW-9595M has been shown to produce high amounts of EPS of 1718 mg/l during pH-

controlled batch cultures in the same medium (Bergmaier et al. 2001) (Chapitre 2) or

2775 mg/l in whey permeate supplemented with yeast extract and with components of the

BMM defined medium (Macedo et al. 2002b), and up to 1808 mg/l during continuous free-

cell cultures in this study. Even though the error on EPS quantification was low (<10%), a

large variation of EPS concentrations was observed. This variation could be explained by

the complex effects of the independent variables and time, the low EPS production and the

significant amount of polysaccharide, introduced by YE supplementation of the medium,

resulting in 0 to 572 mg/l polysaccharide concentration in the fresh medium, according to

the YE supplementation level. These high variations and low production could partly

explain the absence of a significant model for EPS production.

However, a main explanation for the very low EPS production with immobilized cells in

this study could be associated with a physiological change of the culture due to

immobilization, which resulted in the formation of macroscopic aggregates containing a

large amount of insoluble EPS (Bergmaier and Lacroix 2002) (Chapitre 5). To test the

hypothesis of a reversible physiological change, a pH-controlled batch culture in the same

medium was inoculated with cells from the immobilized cell system. The EPS

concentration at the end of the first batch culture was 677 ± 14 mg/l, which is intermediate

between that for immobilized cells and that for batch fermentations with free cells

(1718 mg/l). Cells from the first batch culture were then used to inoculate a second batch

and then a third batch culture. The EPS production increased progressively with the number

of batch cultures, with 1044 ± 19 and 1742 ± 96 mg/l at the end of the second and third

culture, respectively. These data clearly showed the reversibility of the physiological

changes of the culture caused by cell immobilization. In contrast, a gradual and irreversible

change in the production of a rhamnose-containing cell wall polysaccharide by different

Lactobacillus casei subsp. rhamnosus strains was observed during continuous free-cell

fermentations (Wicken et al. 1983). The authors hypothesized that the phenotypic

107

variability and the gradual loss of ability to produce this EPS on prolonged cultivation may

both depend on a common genetic feature, which is only found in certain strains of Lb.

casei subsp. rhamnosus.

A clear morphological change of the cells was also observed during the early phase of the

continuous immobilized cell culture. This resulted in the formation of a network-like

structure at the microscopic scale but also in the formation of large aggregates. After

12 days, these aggregates obstructed the outlet screen of the ICB which had to be changed

for a larger one that did not retain the aggregates. In the FCB these aggregates, similar in

appearance to kefir grains, grew to a size of about 1-2 mm and could be harvested simply

by sieving the fermented medium on a screen (0.5 mm mesh size). A spontaneous

formation of aggregates by Clostridium butyricum and Lactobacillus laevolacticus at high

D during prolonged continuous free-cell culture was also reported by Teixeira de Mattos et

al. (1994). The authors also observed a decreased sensitivity to the adverse effects of

butyric acid for aggregated Clostridium butyricum. In contrast to free cells of Lactobacillus

laevolacticus, for which lactic acid is a positive effector of its own production, the

aggregated cells did not exhibit a relationship between the specific lactic acid production

rate and lactic acid concentration. The production and composition of aggregates by

immobilized Lb. rhamnosus RW-9595M have been reported in a separate paper (Bergmaier

and Lacroix 2002) (Chapitre 5).

4.7 Conclusions

This study clearly showed the high EPS production by Lb. rhamnosus RW-9595M during

continuous free-cell chemostat cultures. Maximum EPS productions of 1808 ± 125 mg/l

and volumetric productivities of 542.6 ± 37.5 mg/l h were obtained for a dilution rate of 0.3

and 0.7 h-1, respectively, and are among the highest values reported in literature.

Lb. rhamnosus RW-9595M was successfully immobilized by adsorption on ImmobaSil®

solid porous carriers and used during long term chemostat culture. Despite the very high

immobilized and free-cell biomass attained in this system and the high metabolic activity of

the culture shown by lactic acid production data, a very low amount of soluble EPS was

produced. This low production could mainly be attributed to a physiological change in the

108

culture due to immobilization. Repeated batch cultures, inoculated with cells produced in

the immobilized cell system, showed that this physiological change was reversible.

Eventually, this feature can be exploited for the production of EPS producing starters. Low

EPS concentration in the fermented broth would result in lower viscosity and facilitate cell

propagation and separation. An important morphological change of the culture was also

observed. The normally short chains of lactobacilli grew and formed a network-like

structure. Furthermore, the formation of macroscopic aggregates was observed after 10

days.

Chapitre 5

Aggregate formation during chemostat culture with

immobilized Lactobacillus rhamnosus RW-9595M

Dirk Bergmaier1, and Christophe Lacroix2

1 Dairy Research Centre STELA, Pavillon Paul Comtois, Université Laval, Québec, PQ, Canada,

G1K 7P4

2 Laboratory of Food Biotechnology, Institute of Food Science and Nutrition, Swiss Federal

Institute of Technology, ETH Zentrum, LFO F18, CH-8092 Zurich, Switzerland

110

5.1 Résumé

Afin de produire des exopolysaccharides, une culture continue de 32 jours dans un système de

bioréacteurs à deux étages a été conduite dans un milieu de perméat de lactosérum supplémenté.

Le premier bioréacteur contenait des cellules de Lactobacillus rhamnosus RW-9595M

immobilisées sur des supports poreux solides en caoutchouc de silicone (ImmobaSil®). Le

deuxième bioréacteur a été continuellement inoculé avec des cellules produites dans le premier

réacteur. Un changement physiologique et morphologique majeur de la souche a été observé,

ayant pour résultat une production très basse d'EPS soluble et la formation d'agrégats

macroscopiques (1-2 millimètres) après 10 jours de culture en continu. Avec le temps, les

agrégats se sont accumulés dans le premier et dans le deuxième réacteur et ont atteint des

concentrations moyennes respectives de 33.9 et 54.8 g/l, lors des 5 derniers jours de la

fermentation. La concentration d'agrégats dans l'effluent du système à deux étages a variée entre

3.16 et 28.59 g/l selon les conditions et le temps de la fermentation, résultant en une productivité

volumétrique d'agrégats entre 5.68 et 49.54 g/l·h. L'analyse chimique des agrégats a indiqué une

teneur élevée en azote du 10.10 ± 0.1 % (w/w), ce qui correspond à une biomasse totale de

73.8 % du poids sec de l'agrégat. La teneur élevée des agrégats en polysaccharides (14.2 ± 1.6 %)

a été attribuée à la production d'un EPS non-soluble par la culture immobilisée. Une biomasse

viable très élevée et relativement stable dans les agrégats de 4.32 · 1012 ± 0.97 · 1012 CFU/g a

également été mesurée par une méthode d'extraction d'ADN. Les agrégats produits pendant la

culture continue avec des cellules immobilisées dans un milieu de perméat de lactosérum

supplémenté, peuvent être facilement séparés et employés comme produit synbiotique, avec des

concentrations en cellules actives et en EPS très élevées.

5.2 Abstract

A 32-day chemostat culture in a two-stage fermentation system was conducted in a supplemented

whey permeate medium for exopolysaccharide production. The first bioreactor contained

Lactobacillus rhamnosus RW-9595M immobilized on solid porous supports, made of silicone

rubber (ImmobaSil®). The second bioreactor was continuously inoculated with cells released

from the first reactor. A large physiological and morphological change in the strain was observed

resulting in a very low soluble EPS production and the formation of macroscopic aggregates

111

(1-2 mm) after 10 days continuous culture. Aggregates accumulated with time in the first and

second reactor and reached mean dry weight concentrations for the last 5 days of 33.9 and

54.8 g/l broth, respectively. Aggregate concentration in the effluent of the two-stage system

varied between 3.16 and 28.59 g/l, for an aggregate volumetric productivity of the two-stage

system ranging from 5.68 and 49.54 g/l h for different fermentation conditions and time.

Chemical analysis of aggregates indicated a high nitrogen content of 10.12 ± 0.1 % (w/w), which

corresponds to a total biomass of 73.8 % of aggregate dry weight. The high polysaccharide

content of the aggregates (14.2 ± 1.6%) was attributed to the production of a non-soluble

exopolysaccharide by the immobilized culture. A very high and relatively stable viable biomass

in aggregates of 4.32·1012 ± 0.97·1012 CFU/g was also measured by a DNA extraction method.

The aggregates produced during continuous immobilized cell culture in supplemented whey

permeate can be easily separated and used as a symbiotic product with very high active cell and

EPS concentrations.

5.3 Introduction

Immobilization has been used for a long time for the production of vinegar with acetic acid

bacteria immobilized on wood chips (Ramakrishna and Prakasham 1999) or in Kefir production

with co-immobilized yeast and lactic acid bacteria (Champagne et al. 1994). Immobilized cell

technology (ICT) offers many advantages when compared with free-cell cultures like enhanced

fermentation productivity and cell stability via continuous operation and reuse of cells, retention

of plasmid bearing cells, enhancement of the production of secondary metabolites and protection

of cells against shear damage (Champagne et al. 1994). Furthermore it has been reported that

immobilized cell systems may be less susceptible to phage attack (Champagne et al. 1994) and

contaminating microorganisms (Navrátil and Sturdíc 1999). Due to these advantages of

immobilized cell technology (ICT) compared with free-cell cultures, various immobilization

techniques have been developed. To immobilize living cells, cells can be attached to a surface,

entrapped within a porous matrix, contained behind a barrier or self-aggregated. All these

immobilization techniques imitate what takes place in a natural environment, where cells are

almost always associated with surfaces and grow in a biofilm (Dunne 2002).

112

Cell immobilization has been shown to result in large physiological changes of the culture,

including shift from homo- to heterofermentative behavior (Krishnan et al. 2001; Smith et al.

1993), increased tolerance to product inhibition (Fortin and Vuillemard 1989; Krisch and Szajani

1997; Teixeira de Mattos et al. 1994) or even increased resistance to an antibiotic (Jouenne et al.

1994). Morphological changes of immobilized cells have also been observed (Gonçalves et al.

1992; Norton et al. 1993; Senthuran et al. 1997). Recent works on biofilm formation have

identified many surface-sensing mechanisms of bacteria (Prigent-Combaret et al. 1999; Wen and

Burne 2002). It has been shown that the interaction with surfaces can change microbial

metabolism, phenotype and morphology (O'Toole et al. 2000b; Parsek and Greenberg 2000;

Rashid et al. 2000) which may result in an increase in the glycocalyx production, which is mainly

composed of bacterial exopolysaccharides (Dunne 2002).

In a previous paper a chemostat culture for exopolysaccharide production with immobilized

Lb. rhamnosus RW-9595M was described (Bergmaier et al. 2002b) (Chapitre 4). The continuous

culture was carried out in a two-stage fermentation system with immobilized cells in the first

reactor (ICB) and the second reactor (FCB) was continuously inoculated with cells released from

the ICB. Despite the very high immobilized and free-cell biomass attained in this system and the

high metabolic activity of the culture shown by high lactic acid production, a very low amount of

soluble EPS was produced. This low production was mainly attributed to a physiological change

of the culture due to immobilization. In this paper, we report the morphological change observed

during a 32-day culture, with increased bacterial chain length and formation of large (1-2 mm)

cell-containing aggregates. The production of these aggregates was measured during continuous

culture with the two-stage ICB/FCB system operated with different conditions and the aggregate

structure and composition were analyzed.

5.4 Material and Methods

5.4.1 Microorganism and culture conditions

A 32-day continuous culture with Lb. rhamnosus RW-9595M was carried out in a two stage

fermentation system consisting of two stirred-tank reactors in series, as described previously

(Bergmaier et al. 2002b) (Chapitre 4). The first immobilized cell bioreactor (ICB) contained 210-

ml solid carriers (ImmobaSil®; Ashby Scientific Ltd., Coalville, Leicestershire, UK)

113

immobilizing cells, for a total fermentation volume of 0.7 l. The second free-cell bioreactor

(FCB) of a working volume of 1.4 l, was continuously inoculated by cells released from the ICB.

Fermentation was carried out in a supplemented whey permeate (SWP) medium. Whey permeate

powder (Foremost, Baraboo, WI, USA) was rehydrated (8% w/v), 0.5 g/l MgSO4 · 7H2O, 0.05 g/l

MnSO4 · H2O and 1 ml/l Tween-80 were added, pH was adjusted at 4.9, and the medium was

filtered and sterilized, as previously described (Bergmaier et al. 2002b). A sterile yeast extract

(Rosell Institute Inc., Montreal, PQ, Canada) solution (400 g/l) was added to give a final

concentration in the SWP between 0 and 1.37 % (w/v).

After a colonization and equilibration period (8 days), continuous culture with Lb. rhamnosus

RW-9595M was conducted with pH controlled at 6 (Bergmaier et al. 2002b). The set points for

yeast extract concentration (CYE, 0-1.37 % w/v), temperature (T, 24-44°C) and dilution rate (D,

0.8-2.8 h-1) were changed every 24 h according to a central composite experimental design. The

values for D in this study are calculated with respect to the total fermentation volume of the ICB

(0.7 l). Samples of the effluent of the two bioreactors were taken for each tested condition, after a

20-h stabilization period following the condition change, and used for cell enumeration, sugar,

and lactic acid determinations. A sample of about 15 colonized carriers was also taken and kept

frozen at -80°C for determination of immobilized biomass as described previously (Bergmaier et

al. 2002b). After day 10, the formation of large aggregates was observed. After this time,

additional samples of the homogenous culture broth, including floating aggregates were taken

from both bioreactors and from the effluent of the FCB for aggregate analysis and concentration

measurement.

5.4.2 Biomass concentration determinations

Free-cell concentration in the broth was estimated by viable cell counts (CFU per millilitre) or by

dry weight (g/l) as previously described (Bergmaier et al. 2002b). Reported data are means for

duplicate analysis.

Immobilized cell concentration was determined by measuring the DNA content as previously

described (Bergmaier et al. 2002a), using the method of Wang (1988) with some modifications.

A calibration curve with cell counts, biomass dry weight and DNA content of free cells of

114

Lb. rhamnosus ATCC-9595 was used to correlate these biomass measures. DNA of free and

immobilized cells was extracted with 0.5 N perchloric acid at 70°C for 30 min. The DNA

concentration was determined by the diphenylamine method (Burton 1956). Each analysis was

repeated three times.

For viable biomass content determination, the aggregates were washed with distilled water and

dried on a filter paper. A sample of about 0.1 g (wet weight) of aggregates was accurately

weighed. The cell concentration in the sample was determined by measuring the DNA content in

the aggregate using the diphenylamine method, as described before for cell concentration

determination in the solid supports. Biomass content was expressed in colony forming unit or cell

dry weight per aggregate dry weight (CFU/g or g/g, respectively). Reported data are means for

duplicate analysis.

5.4.3 Microscopy observations

Preparations of cells in the fermented broth were stained with methylene blue and observed using

a Leitz Weltzlar microscope. Samples of colonized support and aggregates were fixed and

ethanol dehydrated as described previously (Bergmaier et al. 2002b). They were embedded in

epon, semi-fine sectioned (about 100 µm) and post-stained with methylene blue for optical

microscopy examination. For scanning electronic microscopy, samples were dried in a critical

point drier, mounted onto copper stubs and coated with gold (~ 300 Å) in a sputter coater. These

stubs were scanned at different angles under scanning electron microscope (Jeol JSM35; Jeol,

Tokyo, Japan) at 15 kV.

5.4.4 Aggregate dry weight determination

For determination of the dry weight of aggregates in the broth, a homogeneous sample of 10 ml

of fermented broth was taken. The aggregates were allowed to sediment and the supernatant was

discarded. The aggregates were washed twice with 10 ml distilled water and then transferred to a

preweighed aluminium dish. They were dried to a constant weight in a vacuum oven at 70°C.

Reported data are means for duplicate analyses.

115

5.4.5 Chemical analysis of aggregates

For chemical characterization, about 2-g wet weight of aggregates were thoroughly washed three

times with 8 ml 80% ethanol in order to eliminate low molecular weight sugars, and centrifuged

(5,000g, 10 min, 4ºC). The aggregates in aluminium weighing dishes were dried in a vacuum

oven until constant weight (4 h, 60ºC).

For polysaccharide quantification, a sample of about 0.02 g of dried aggregates was accurately

weighed and crushed. Ten ml H2SO4 0.1 M was added to 0.01 g aggregate sample and

homogenized with an Ultraturrax (IKA Labortechnik, Germany; 13500 rpm, 30s). This solution

was heated in closed tubes (60ºC, 3 h) and centrifuged (8,000g, 10 min, 20ºC). Total sugars in the

supernatant were quantified by the phenol-sulfuric acid method (Dubois et al. 1956) with glucose

as standard. The analysis was repeated two times.

For total nitrogen determination, about 0.08 g of dried aggregates were analysed with a

protein/nitrogen analyser (LECO FP-528, LECO, St Joseph, MI, USA). A standard of EDTA

(LECO, 9.56% nitrogen) was used. The total nitrogen content of aggregates was expressed as

percentage of dry weight. Analysis was repeated two times.

Samples for the measurement of phosphorus, potassium, calcium, magnesium and sodium ions

were digested using the method of Isaac and Johnson (1976). About 0.1 g of sample were mixed

with 2 ml of a mineralization solution (97 g H2SeO3, 100 ml H2O, 4 l H2SO4) and 2 ml H2O2, and

incubated at 400°C for 20 min. After cooling, 4 ml water and 1 ml of a lanthanum solution (5%)

were added and the volume was completed to 100 ml with water. Phosphorus determination was

carried out with the method of Tandon et al. (1968). For determination of potassium, calcium,

magnesium and sodium ions, the solution was directly analyzed by atomic absorption

spectroscopy.

5.4.6 Experimental design and statistic analysis

The set points for CYE, T and D during the 32-day culture were changed every 24 h according to a

central composite rotatable design, as described previously (Bergmaier et al. 2002b). The effects

of these three factors and their interactions on the fermentation were analyzed with response

surface analysis. Two covariates were used in the analysis. The covariate age accounted for the

116

age of the fermentation and corrected for time evolution of the system. The second covariate stop

accounted for an interruption of the fermentation due to pumping problems and a change in ICB-

outlet geometry. These problems occurred as a result of the massive formation of aggregates after

12 days. This second covariate is equal to zero or one, before or after interruption, respectively.

The dependent variables tested in this work were the aggregate dry weights in the ICB and FCB.

5.5 Results

Continuous culture with Lb. rhamnosus RW-9595M for EPS production was carried out in a two-

stage fermentation system. Cells were immobilized on solid porous supports (ImmobaSil®) in the

first reactor (ICB) and the second reactor (FCB) was continuously inoculated with cells released

from the first ICB. A 32-day chemostat culture was conducted in a whey-permeate-based

medium with fermentation conditions changing every 24 h, according to the rotatable central

composite experimental design.

5.5.1 Microscopical and macroscopical observations

Immediately after colonization and equilibration of the fermentation system, a morphology

change in the culture was observed by optical microscopy. Particularly in the culture broth in the

second FCB bioreactor, the normally short chains of lactobacilli of up to 4 cells began to grow

and to form a network-like structure (Bergmaier et al. 2002b) (Chapitre 4). The colonization of

the supports was observed by scanning electronic microscopy. Observation of the pores near the

carrier surface (Fig. 5.1a) confirmed the morphological change of the culture, previously detected

by optical microscopy observation of released free cells. Very long chains were also seen in the

inner pores of the support (Fig. 5.1b), with dense cell packing and the presence of EPS on the cell

surfaces and cross-linking the cells (Fig. 5.1c).

At day 3 of the fermentation, small aggregates were clearly visible in the first reactor. Aggregates

progressively clogged the middle-hole of the Raschig-Ring formed supports at day 8, and were

released in the medium and obstructed the screen (0.5 mm mesh) of the first fermenter outlet used

to retain the supports. The fermentation was stopped and the outlet was replaced by a tapered

stainless steel tube which retained supports but not the aggregates. The fermentation was

restarted with central point settings and equilibrated for one day before continuing with the

117

experimental design. Subsequently, the aggregates were always present in both bioreactors.

Samples of aggregates were analyzed by optical microscopy. Semi-fine slices (Fig. 5.2a and b),

stained with methylene blue, showed the very high cell densities and the formation of channels

between the surfaces and the inner parts of the aggregates. This organisation of the microbial

community may facilitate the exchange of nutrients and products with the surrounding liquid

medium. Scanning electronic microscopy photographs of aggregates showed lactobacilli

entrapped in a network-like structure (Fig. 5.3a). Crystal-like structures entrapped in the

aggregates were observed as well (Fig. 5.3b).

118

a)

b)

c)

Fig.

5.1

Sca

nnin

g el

ectro

n m

icro

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b)

c)

Fig.

5.2

Opt

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(20

X),

b) a

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c) fo

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ion

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hann

els (

63 X

).

a) b)

Fig. 5.3 Scanning electron microscopy of a cut through the aggregate: a) at a magnification

of 11000 X, b) at a magnification of 7800 X with crystal.

5.5.2 Aggregate production

The aggregate production in both reactors was measured by the dry weight of washed

aggregates in the fermented medium (Fig. 5.4). The quantity of aggregates in the

bioreactors was apparently affected by the fermentation conditions which were changed

every 24 h according to the central composite design. Aggregate quantity increased with

time during the continuous fermentation with different patterns in the ICB and FCB.

During the first 11 days, aggregate concentration progressively increased in the FCB from 5

to 12.1 g/l. On day 12 corresponding to the day after fermentation interruption, a sharp

increase in aggregate concentration to 33.3 g/l was observed followed by a stable period

between day 12 and 18 (28.6 ± 2.2 g/l). Finally, for the last 5 days, a very high

concentration averaging 54.8 ±13.2 g/l, was determined. In the ICB aggregate

concentration was much lower than in the FCB, with a low concentration (2.5 ± 1.5 g/l)

until day 19. Between day 19 and 20, a large increase from 2.5 to 35.9 g/l was observed,

followed by a stable aggregate concentration of 33.8 ± 7.6 g/l. The maximum aggregate dry

weight in the ICB and FCB was measured at day 22, with 42.1 and 73.9 g/l, respectively.

Response surface analysis of dry weight did not reveal any statistically significant model at

a 90% confidence interval for the independent variable CYE, T, and D.

120

To estimate the productivity of the fermentation system for aggregate production, the

aggregate dry weight in the effluent of the two-stage fermentation system was also

determined (Fig. 5.5). Aggregate dry weight in the fermented broth varied between 3.16

and 28.59 g/l. Mean aggregate production before day 12 (18.33 ± 4.79 g/l) was higher than

after day 12 (8.21 ± 3.18 g/l). The aggregate volumetric productivity of the two-stage

fermentation system ranged between 5.68 and 49.54 g/l h (Fig. 5.5). As for aggregate

accumulation in the two bioreactors, no statistically significant model (p<0.1) was found

for this parameter as a function of the experimental factors yeast extract concentration,

temperature and dilution rate. However as for aggregate production, volumetric

productivity was higher before day 12 (31.58 ± 10.04 g/l) than after (14.15 ± 4.60 g/l).

5.5.3 Aggregate composition

Samples of aggregates, taken after day 12, were analysed for biomass, nitrogen and

polysaccharide contents. The viable biomass in the aggregates was determined by

extraction and quantification of microbial DNA. There was no statistically significant

(p<0.1) time evolution of biomass content in the aggregates, with extremely high values

varying between 3.27·1012 and 6.52·1012 CFU/g and a mean of

4.32·1012 ± 0.97·1012 CFU/(g aggregate dry weight). Using the biomass calibration curve of

the DNA method, an aggregate biomass content of 1.88 ± 0.42 g/g dry weight was

calculated. The mean total nitrogen and polysaccharide contents were 10.12 ± 0.1 % and

14.2 ± 1.6 % (w/w), respectively.

Aggregate samples of day 11 and 13 were also analyzed for their content in phosphorus and

other minerals. Phosphorus, potassium, calcium, magnesium and sodium content were

2.01 ± 0.35, 0.91 ± 0.51, 0.12 ± 0.20, 0.07 ± 0.06, 0.47 ± 0.34 g/100 g aggregate dry

weight, respectively.

121

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Age (d)

Agg

rega

te D

ry W

eigh

t (g/

L)

Fig. 5.4 Change of aggregate dry weight in the fermented broth in the first ICB (solid bars) and the second FCB (dashed bars) bioreactors as a measure of aggregate accumulation during the 32-day continuous culture. Age 1 day corresponds to the start of the experimental design after an 8-day initial stabilization period. Fermentation conditions were changed every day according to the central composite rotatable design.

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Age (d)

Agg

rega

te D

ry W

eigh

t (g/

L) /

Volu

met

ric P

rodu

ctiv

ity (g

/Lh)

Fig. 5.5 Change of aggregate dry weight in effluent samples (solid bars) and volumetric productivity of the two-stage continuous culture (dashed bars) during the 32-day experiment. Age 1 day corresponds to the start of the experimental design after an 8-day initial stabilization period. Fermentation conditions were changed every day according to the central composite rotatable design.

122

5.6 Discussion

Lb. rhamnosus RW-9595M was immobilized on solid porous supports and a continuous 32-

day culture was carried out in a two-stage fermentation system. In a previous paper

(Bergmaier et al. 2002b) (Chapitre 4), the influence of yeast extract concentration,

temperature and dilution rate on biomass, EPS and lactic acid productions in both reactors

and on immobilized biomass was reported. Despite the very high immobilized and free-cell

biomass in both bioreactors and the high metabolic activity of the culture, shown by high

lactic acid production, very low amounts of soluble EPS were produced in the fermented

broth, averaging 108 ± 90 and 30 ± 142 mg/l for the ICB and FCB, respectively. This low

production was mainly attributed to a physiological change of the culture due to

immobilization. A morphological change was also observed with increased cell-chain

length and formation of large (1-2 mm) cell-containing aggregates.

After only 3 days of culture, a morphological change of the culture was observed with

optical microscopy (Bergmaier et al. 2002b). The rod shaped cells transformed into thin

long cells and the chain length was elongated. Similar observations were made by

Senthuran et al. (1997), who described elongated cells with branched structures during

repeated batch fermentation with immobilized Lb. casei subsp. rhamnosus. Norton et al.

(1993) and Gonçalves et al. (1992) reported similar morphological changes for

Lb. helveticus immobilized in gel beads and Lb. rhamnosus immobilized on solid supports,

respectively, during continuous lactic acid fermentation. On the contrary, Lb. plantarum

cells immobilized on chitosan-treated polypropylene matrix underwent a change from rod

to coccoid shape during repeated batch lactic acid fermentation as observed by scanning

electronic microscopy.

In this study, the morphological change of immobilized Lb. rhamnosus RW-9595M was

characterized by scanning electronic microscopy (SEM) of the porous support. Cells at the

surface (Fig. 5.1a) and in the inner pores of the carrier (Fig. 5.1b) were elongated. In the

inner regions of the support (Fig. 5.1c), shorter cells and the production of extracellular

123

substances were observed. Similar observations with SEM also showed cell length

elongation for Zymomonas mobilis cells immobilized on Al2O3 granules (Bekers et al.

2001).

After 10 days of culture, the morphological change resulted in the formation of aggregates

in the two bioreactors that were clearly visible and progressively grew in size to

macroscopic grains of 1-2 mm. These aggregates were fixed, embedded in epon, semi-fine

sectioned (about 100 µm) and stained with methylene blue before observation with optic

microscopy (Fig. 5.2a and b). A cellular organization of the microbial community

facilitating the exchange of nutrients and metabolic products with the surrounding bulk

liquid, with a network-like channel system, was visually observed. Using scanning confocal

laser microscopy, Lawrence et al. (1991) were able to inspect three-dimensional biofilms of

P. aeruginosa, Pseudomonas fluorescens and Vibrio parahaemolyticus. All biofilms were

highly hydrated with open structures including water channels and exopolysaccharides. As

in the present study, the high porosity and channels in Pseudomonas and Vibro biofilms

allowed the free diffusion of low-molecular-weight compounds such as nutrients and

metabolic products. Observation of the aggregates with SEM showed their heterogeneity.

In some cases bacterial cells were embedded in a network-like structure (Fig. 5.3a). In other

regions the cell density was very high and EPS production was observed (Fig. 5.3b) as for

the presence of crystal bodies, entrapped in the aggregate (Fig. 5.3b).

The quantity of aggregates was measured by determining the dry weight of washed

aggregates in the fermented broth. The aggregate concentration in the two bioreactors

largely changed with culture conditions and increased with time during the continuous

fermentation (Fig. 5.4). A large increase of the aggregate concentration in the FCB from

12.1 to 33.3 g/l at day 12 coincided with a change in ICB reactor outlet geometry.

Afterwards, the aggregates formed in the ICB were less retained and were pumped with the

medium in the FCB where they continued to grow and were retained by the collecting tube

geometry (with a diameter of about 2.5 mm). Before day 12 the mean aggregate

concentration in the FCB was low, equal to 6.9 g/l and it reached a very high value of

124

54.8 g/l during the last 5 days of fermentation. An important increase in aggregate

concentration was also observed in the ICB at day 20 from 2.5 ± 1.5 g/l to 33.8 ± 7.6 g/l for

the periods before and after that time. This change could be explained by the specific

fermentation conditions applied on day 20 (CYE = 1.1, T = 28°C, D = 1.2 h-1) and by the

progressive growth of the aggregates with time in the ICB which reached a critical size for

the tube geometry. The aggregate concentrations for the final period of the fermentation in

both bioreactors were very high.

Accumulation of aggregates in the FCB progressively increased with time (Fig. 5.4). This

data could be explained by the retention of large aggregates that could not flow through the

outlet tubing of the FCB. These aggregates in the FCB effluent could be easily harvested by

simply sieving the effluent on a screen (0.5 mm mesh size). To estimate the productivity of

the fermentation system for aggregate production the aggregate dry weight in the effluent

of the fermentation system was determined (Fig. 5.5). Aggregate dry weight in the effluent

varied between 3.16 and 28.59 g/l depending on time and culture conditions and

corresponded to an aggregate volumetric productivity of the two stage-fermentation system

varying between 5.68 and 49.54 g/l h. The second order model of the central composite

design (Bergmaier et al. 2002b) could not fit (p<0.1) the variation of aggregate production

and productivity data. This result could be explained by the complex effects of many

factors, including the independent variables (CYE, T and D), culture time, aggregate size

and geometry of the reactors on aggregate production and retention in both reactors.

From day 12 on, samples of aggregates were analysed for biomass, nitrogen and

polysaccharide contents. The biomass in the aggregates was determined by extraction and

quantification of microbial DNA, with a method similar to that used for immobilized

biomass quantification in solid supports described in the previous paper (Bergmaier et al.

2002b). With Lb. rhamnosus RW-9595M, a very rapid degradation of DNA occurs with

cell death as a result of a very active DNA-degrading enzyme (Peant and LaPointe 2001).

The immobilized cell content measured with this method can consequently mainly be

attributed to living cells, in which DNA is not degraded. A very high viable biomass

125

content in aggregates of 4.32·1012 ± 0.97·1012 CFU/g dry weight and 1.88 ± 0.42 g/g was

calculated from calibration curves of the method determined with viable cell counts or

biomass measurements (Bergmaier et al. 2002a). This biomass value largely exceeding

100% of aggregate dry weight shows the approximative nature of the DNA-method for

immobilized biomass quantification. The DNA method is based on the assumptions that the

DNA contents of immobilized cells of Lb. rhamnosus RW-9595M and free cells of

Lb. rhamnosus ATCC-9595 are the same. However, immobilized cells showed very large

physiological and morphological changes when compared with planktonic cells. In

particular, immobilized cells were much smaller than planktonic cells resulting in higher

ratio extracted DNA per unit biomass, resulting in an overestimation of immobilized

biomass by this method. Nevertheless, our data clearly indicated the extremely high viable

cell content of aggregates.

The total nitrogen content of aggregates was 10.12 ± 0.1 % (w/w) expressed in dry weight.

With a typical composition of 13.7% (w/w) nitrogen in bacterial cell composition (van

Dijken and Harder 1975), this data translates to a total biomass content in aggregates of

approximately 74% (w/w). Also the phosphorus content of aggregates was high, with an

average of 2.01 % (w/w). Battley (1991) determined the elemental composition of

Escherichia coli K-12 and found a ratio between nitrogen and phosphorus of 5.25:1 which

is in agreement with the ratio in aggregates in our study (5.03:1), supporting the total

biomass calculation from the nitrogen content and the high viable biomass found with the

DNA extraction method.

Further chemical analysis of the aggregates showed a high polysaccharide content, equal to

14.2 ± 1.6 % (w/w). The polysaccharide content of typical bacteria is only about 5 %

(Atkinson and Mavituna 1991). Our data indicate that a high concentration of EPS is

accumulated in the aggregates and contributed to the formation of the network-like

structure entrapping cells, as observed by SEM (Fig. 5.3a). Atomic absorption spectroscopy

quantified relatively low concentrations of K+, Ca++, Mg++ and Na+, and gave no further

indication on the nature of the crystal substance observed by SEM in aggregates (Fig. 5.3b).

126

In this study, it was shown that the aggregates produced during continuous culture with

Lb. rhamnosus RW-9595M were mainly composed of viable biomass of this potentially

probiotic strain and its exopolysaccharide. Exopolysaccharides, especially from probiotic

bacteria, are potential prebiotics and, furthermore, may contribute to human health due to

their anti-tumour, anti-ulcer, immunomodulating and cholesterol-lowering activities (Ruas-

Madiedo et al. 2002a). The aggregates produced in this study, combining probiotic bacteria

and prebiotic polysaccharides, comply with the concept of synbiotics proposed by Gibson

and Roberfroid (1995). Furthermore, immobilization allowed to change cell physiology and

could improve the resistance of cells to physico-chemical stresses such as during freeze-

drying or transit of the gastro-intestinal tract (Doleyres et al. 2002a). The aggregates

produced in supplemented whey permeate medium could thus find application as synbiotic

food-ingredients for dairy and non-dairy products. A further potential application of the

technology presented in this paper is a continuous process for the production of

concentrated starters, without the use of centrifugation or filtration for cell concentration.

Furthermore, the particulate state of the biomass could enable the use of fluid bed drying,

as done with bakers yeast, in substitution to freeze-drying.

5.7 Conclusions

An extensive aggregation of Lb. rhamnosus RW-9595M was observed during a chemostat

culture with immobilized cells in a two-stage fermentation system. The aggregates grew in

size with time and reached a macroscopic size of 1 to 2 mm after about 14-day culture.

They showed a cellular organization facilitating nutrient and metabolic product exchange

with the bulk liquid. The aggregate concentration in the two bioreactors and the aggregate

volumetric productivity of the system (up to 49.54 g/l h) was extremely high. The viable

biomass content of aggregates estimated by a DNA extraction method was also very high

(4.32·1012 ± 0.97·1012 CFU/g). Aggregates were mainly composed of biomass and non-

soluble EPS (73.8% and 14.2% (w/w) on dry weight, respectively). The aggregates can be

easily separated from the medium and could be used as a synbiotic product with very high

active cell and EPS concentrations.

Conclusion générale L’objectif général de ce travail a été de développer et d’optimiser une technologie de

production d'exopolysaccharides (EPS), basée sur la fermentation, avec des cellules

immobilisées, d’un milieu à base de perméat de lactosérum. Pour arriver à cette fin, la

souche Lb. rhamnosus RW-9595M a été choisie comme souche de travail à cause de sa

forte production en EPS.

Dans un premier temps, une nouvelle méthode de dosage de biomasse a été mise au point.

Cette nouvelle méthode se base sur la séparation des EPS et des sucres simples dans le

milieu fermenté par l'ultrafiltration (UF). Elle permet un suivi précis de la production d'EPS

par des bactéries lactiques pendant des fermentations. Comparée à une méthode

conventionnelle impliquant une précipitation des macromolécules à l'aide d'un solvant

organique, une précipitation des protéines avec le TCA, une purification par la dialyse et

une lyophilisation, la quantification par la méthode UF prend beaucoup moins de temps

(8 h comparé à environ 10 jours). En outre, cette méthode est simple et exige des volumes

d'échantillon aussi bas que 1 à 5 ml, ce qui permet la réalisation d'un plus grand nombre

d'analyses et de répétitions des points pendant les fermentations.

Dans un deuxième temps, la production d'EPS a été suivie lors de fermentations en batch,

avec des cellules planctoniques et comparée avec la production d'EPS lors de fermentations

en batch répété avec des cellules immobilisées sur des supports poreux solides en

caoutchouc de silicone, ImmobaSil®. Une méthode de dosage de la biomasse immobilisée a

été développée, afin de pouvoir suivre son évolution durant les fermentations. Cette

méthode s'est basée sur l'extraction et la quantification de l'ADN microbien et n'est pas

troublée par la présence du support solide, contrairement à des méthodes traditionnelles

comme l'énumération sur plaque ou le poids sec. Les cultures en batch répété ont

clairement montré le potentiel de la technologie des cellules immobilisées sur des supports

solides pour la production d'EPS, augmentant la productivité volumétrique maximale de

110 à 258 mg/l h, comparées aux cultures avec des cellules planctoniques. En outre, cette

technologie résulte en des périodes plus courtes d'arrêt du système de fermentation,

128

permettant plus de trois cultures en batch par jour, et une réutilisation des cellules

microbiennes, ce qui augmente encore plus la productivité industrielle.

Lors de fermentations en continu avec des cellules planctoniques, une production maximale

élevée d'EPS égale à 1800 mg/l a été obtenue pour un taux de dilution (D) de 0.3 h-1. Une

productivité volumétrique maximale de 542.6 mg/l · h a été obtenue pour un D de 0.7 h-1.

C'est la productivité d'EPS des LAB la plus élevée en littérature. Les cellules ont été

immobilisées par adsorption sur ImmobaSil® et ont été employées pendant une culture en

continu à long terme. Cette culture a été réalisée dans un système de fermentation à deux

étages, le premier étage contenant les cellules immobilisées. En dépit de valeurs très

élevées pour la biomasse immobilisée et planctonique dans ce système et une activité

métabolique élevée, montrée par les données de production d'acide lactique, la production

d'EPS soluble a été très faible. Cette faible production a pu principalement être attribuée à

un changement physiologique de la culture due à l'immobilisation. Des cultures successives

en batch, inoculées avec des cellules du système en continu, ont prouvé la réversibilité de

ce changement physiologique. Un changement morphologique important de la culture a

également été observé. Les chaînes normalement courtes des lactobacilles ont accrues et

ont formé un réseau. De plus, la formation d'agrégats après 10 jours de culture a été

observée.

Avec le temps de fermentation, les agrégats se sont développés en taille et ont atteint une

taille macroscopique de 1 à 2 millimètres après environ 14 jours. Leur examen

microscopique a démontré une organisation cellulaire facilitant l'échange des nutriments et

des métabolites avec le milieu environnant. La concentration d'agrégats dans les deux

bioréacteurs et la productivité volumétrique d'agrégats du système (jusqu'à 49,54 g/l h)

étaient extrêmement élevées. La teneur en biomasse viable des agrégats, estimée par la

méthode d'extraction d'ADN, était également très élevée (4.32·1012 ± 0.97·1012 CFU/g). Les

agrégats se sont principalement composés de biomasse et d'EPS non-soluble

(respectivement 73.8% et 14.2% (w/w) du poids sec). Ils peuvent être facilement séparés du

129

milieu et pourraient être employés comme produit synbiotique, avec un contenu en cellules

actives et en EPS très élevé.

Dans ce travail, une approche prometteuse pour l'usage du perméat de lactosérum, un sous-

produit de l'industrie laitière disponible en grande quantité et avec une valorisation limitée

est proposée. Les EPS, produits dans des quantités appréciables, pourraient trouver leur

place comme bioingrédient dans des aliments nutraceutiques dont le marché est en forte

croissance. La rentabilité de la production d'EPS pourrait encore être haussée en optimisant

les conditions de culture des fermentations avec des cellules immobilisées.

Ce travail a mis en évidence des changements physiologiques et morphologiques majeurs

des bactéries lactiques lors des fermentations en continu avec des cellules immobilisées. Un

tel phénomène a aussi été observé par d'autres chercheurs de notre équipe de laboratoire.

Ceci a mené au dépôt d'une demande d'un brevet provisoire. Néanmoins, d'autres cultures

avec des cellules immobilisées doivent encore être réalisées et les cellules doivent être

caractérisées afin de mieux comprendre ce phénomène.

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Annexe 1 Concentration en ATP pendant une

fermentation avec des cellules libres de Lb. rhamnosus

RW-9595M

Annexe 2 Cell counts and lactic acid, soluble EPS and

immobilized cell concentration during a 32 day

continuous culture in a two stage bioreactor system. Variables Responses

Cell counts Lactic acid conc. EPS conc. Immobilized

ICB FCB ICB FCB ICB FCB Cell conc.

age stop (CFU/ml) (CFU/ml) (g/L) (g/L) (mg/L) (mg/L) (CFU/ml)

000 1 0 1,19E+09 1,09E+09 4,0 5,2 118,81 -58,15 2,86·1011

0+0 2 0 3,25E+08 6,63E+08 4,4 5,8 21,13 69,83 2,88·1011

000 4 0 1,01E+09 1,74E+09 7,5 13,9 55,31 161,87 3,03·1011

-++ 5 0 4,05E+08 1,29E+09 4,5 10,8 37,93 27,31 3,31·1011

00- 6 0 4,50E+09 8,65E+09 15,7 27,2 58,00 395,46 2,59·1011

000 7 0 2,67E+09 3,77E+09 9,0 14,5 51,01 274,93 4,90·1011

--- 8 0 1,40E+08 4,30E+08 8,0 16,6 55,49 211,72 4,60·1011

00+ 9 0 1,61E+09 3,03E+09 5,5 12,0 60,79 52,97 4,39·1011

+++ 10 0 1,02E+09 4,37E+09 7,1 19,8 -20,49 40,45 2,68·1011

-+- 11 0 1,71E+09 3,40E+09 15,5 29,7 175,58 7,89 4,04·1011

000 12 1 1,25E+09 6,00E+09 10,3 38,7 396,75 122,63 6,04·1011

+-+ 13 1 6,30E+08 9,90E+08 6,9 30,5 165,84 -131,23 3,84·1011

000 14 1 1,33E+09 1,70E+09 13,1 40,0 103,57 17,92 4,74·1011

--+ 15 1 9,15E+08 8,15E+08 7,7 26,0 99,16 27,76 3,57·1011

000 16 1 1,40E+09 1,60E+09 14,9 42,8 107,37 -234,99 2,77·1011

-00 17 1 6,12E+08 7,65E+08 9,3 33,6 119,17 27,78 2,06·1011

+00 18 1 1,16E+09 1,48E+09 19,3 48,9 46,33 8,97 3,26·1011

000 19 1 1,37E+09 1,23E+09 19,2 34,4 172,11 -100,58 4,18·1011

+-- 20 1 2,10E+09 2,87E+09 27,8 49,8 269,29 -181,09 1,58·1011

0-0 21 1 1,10E+09 1,22E+09 17,3 33,7 101,40 36,07 3,65·1011

000 22 1 1,38E+09 1,19E+09 27,4 51,4 15,88 80,21 6,27·1011

++- 23 1 2,17E+09 2,47E+09 38,1 51,0 163,72 -84,32 2,18·1011

000 24 1 1,25E+09 1,15E+09 22,9 43,5 105,25 -70,79 5,34·1011

Annexe 3 Analysis of variance and parameter estimates

for lactic acid concentration in the effluent of the ICB

and the FCB. ICB FCB

d Estimate SS d Estimate SS

Model 11 1688.5*** 12 4733.2***

Intercept -1.432 9.410

Covariates stop 1 3.091 29.110* 1 -6.038 90.890*

age 1 1.261 361.606*** 1 2.374 124.757*

age*age - 1 -0.048 47.221

Linear YE 1 2.725 89.539*** 1 3.021 102.267

T 1 1.415 18.233 1 2.838 73.342*

D 1 -4.593 271.110*** 1 -5.675 394.532***

Quadratic YE*YE 1 -0.859 10.638 1 -0.197 0.509

T*T 1 -0.489 3.671 1 -2.058 63.335

D*D 1 0.111 0.126 1 0.587 2.688

Cross-product T*YE 1 -0.313 0.764 1 -1.769 24.383

D*YE 1 -3.339 71.203** 1 -0.258 0.307

D*T 1 -1.142 8.208 1 0.872 4.692

Error 11 47.552 10 169.220

Total 22 658.883 22 1098.143

Adjusted R2 0.94 0.92

R2 0.97 0.96

Significance levels: ***P<0.001; **P<0.01; *P<0.05