Production d'exopolysaccharides par fermentation avec des cellules

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  • DIRK BERGMAIER

    PRODUCTION D'EXOPOLYSACCHARIDES PAR

    FERMENTATION AVEC DES CELLULES

    IMMOBILISES DE LB. RHAMNOSUS RW-9595M

    D'UN MILIEU BASE DE PERMAT DE

    LACTOSRUM

    Thse

    prsente

    la Facult des tudes suprieures

    de l'Universit Laval

    pour lobtention

    du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

    Dpartement des sciences des aliments et de la nutrition

    FACULT DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION

    UNIVERSIT LAVAL

    QUBEC

    AOT, 2002

    Dirk Bergmaier, 2002

  • Rsum court Une mthode de dosage des EPS base sur l'ultrafiltration (UF) du milieu ferment a t mise au point. Cette mthode rcupre entre 83 et 104% de l'EPS ajout d'une solution avec une concentration d'EPS connue (40-1500 mg/l). La production d'EPS a t suivie avec la nouvelle mthode lors de fermentations en batch. La mthode d'UF a t rapide (8h), prcise et simple, et a requis seulement un petit volume d'chantillon (1 5 ml). Des fermentations dans un milieu de permat de lactosrum supplment (SWP) avec 5 ou 8% (w/w) de permat de lactosrum un poudre (WP), 1% (w/w) d'extrait de levure, des minraux et du Tween-80 ont t conduites. Des comptes cellulaires (1.3 1010 CFU/ml) et une production d'EPS (2350 mg/l) trs levs ont t obtenus lors de fermentations en batch avec des cellules libres dans le SWP. Une mthode de mesure de la biomasse immobilise, base sur l'analyse d'ADN microbien a t mise au point. Cette mthode a dos une biomasse immobilise trs leve de 8.5 1011 CFU/ml lors des cultures en batch rpt avec des cellules immobilises. Une concentration leve d'EPS (1808 mg/l) a t mesure aprs le quatrime cycle, avec un temps d'incubation trs court (7 h) rsultant en une productivit volumtrique d'EPS leve de 258 mg/l h. Lors d'une culture continue avec des cellules libres, une production d'EPS de 1808 mg/l et une productivit volumtrique de 542.6 mg/lh ont t obtenues pour un taux de dilution (D) de 0.3 h-1. Une fermentation continue avec des cellules immobilises dans un systme deux tages a t conduite pendant 32 jours. L'influence de la concentration en extrait de levure, de la temprature et du taux de dilution sur les productions de cellules, d'EPS et d'acide lactique a t tudie. Un effet significatif (P

  • iv

    Abstract A new method for EPS quantification based on ultrafiltration (UF) of fermented broth was developed. This method recovered between 83 and 104% of EPS in a solution with known concentration (40-1500 mg/l). The EPS production during batch fermentations was followed using the new method. The UF method was fast (8 h), accurate and simple, and required only small sample volumes (1 to 5 ml). Cultures were conducted in a supplemented whey permeate (SWP) medium containing 5 or 8% (w/w) whey permeate, 1% (w/w) yeast extract, minerals and Tween-80. Very high cell counts (1.3 1010 CFU/ml) and EPS productions (2350 mg/l) were obtained during batch fermentations with free cells. The cells were immobilized on solid supports and a method for immobilized biomass quantification, based on DNA analysis, was developed. This method measured a very high immobilized biomass of 8.5 1011 CFU/ml of support during repeated batch cultures. A high EPS concentration (1808 mg/l) was measured after the fourth cycle, with a very short incubation time (7 h) resulting in a high EPS volumetric productivity of 258 mg/l h. During continuous culture with free cells, an EPS production of 1808 mg/l and a volumetric productivity of 542.6 mg/l h was obtained for a dilution ratio (D) of 0.3 h-1. A 32-day continuous fermentation with cells immobilized in a two-stage bioreactor system was conducted. The influence of yeast extract concentration, temperature and dilution rate on the production of biomass, EPS and lactic acid was studied. A significant effect (P

  • v

    Rsum long Le but de cette thse a t de dvelopper un procd d'immobilisation cellulaire et de l'exploiter afin de produire des exopolysaccharides lors de fermentations d'un milieu base de permat de lactosrum par Lactobacillus rhamnosus RW-9595M. Des fermentations en continu avec des cellules immobilises sur des supports poreux solides en caoutchouc de silicone (ImmobaSil) ont t compares avec des fermentations avec des cellules planctoniques. Diffrentes stratgies (cultures en batch, cycles rpts et continue) de fermentation avec cellules libres ou immobilises ont t testes pour la production d'EPS.

    Tout d'abord, une nouvelle mthode de dosage d'EPS a t mise au point. Cette mthode utilise l'ultrafiltration dans des cellules agites pour l'limination des hydrates de carbone simples du milieu de culture. Ensuite, les exopolysaccharides (EPS) restant dans le rtentat sont doss par la mthode phnol-sulfurique. La production d'EPS pendant des fermentations en batch dans divers milieux de culture (milieu dfini BMM, permat de lactosrum et permat de lactosrum supplment) a t dtermine par la nouvelle mthode UF et par une mthode conventionnelle. Le taux de rcupration des EPS ajouts une solution de 0.1 M NaCl ou des chantillons de milieu de culture par la nouvelle mthode s'est situ entre 83 et 104% pour une concentration d'EPS entre 40 et 1500 mg/l. La mthode d'UF est rapide (8 h), prcise et simple, et ne requiert qu'un petit volume d'chantillon (1 5 ml). Lors des fermentations pH 6 et 37C du permat de lactosrum supplment avec de l'extrait de levure, des minraux et de Tween-80 (SWP), une production maximale d'EPS trs leve a t mesure par les mthodes UF et conventionnelle (1718 et 1755 mg/l).

    Par la suite, d'autres cultures en batch pH contrl ont t ralises avec des cellules libres, et compares avec des cultures en batch cycles rpts avec des cellules immobilises. Les cellules ont t immobilises par adsorption sur des supports poreux solides en caoutchouc de silicone (ImmobaSil). Les cultures ont t conduites un pH de 6 et 37C dans le SWP, contenant du permat de lactosrum une concentration de 5% ou de 8% (w/w). Pour des cultures en batch avec cellules libres dans le milieu SWP 8%, des comptes cellulaires (1.3 1010 CFU/ml) et une production d'EPS (2350 mg/l) trs levs ont t mesurs. Plusieurs mthodes de mesure de la biomasse immobilise, bases sur l'analyse des composants de la biomasse (protines, ATP et ADN) ont t examines. La mthode d'analyse d'ADN s'est avre la plus approprie dans les conditions testes. Cette mthode a dos une biomasse immobilise trs leve de 8.5 1011 CFU/ml aprs la colonisation des supports ImmobaSil. Pendant les cultures rptes avec des cellules immobilises dans le milieu SWP 5%, une concentration leve d'EPS (1808 mg/l) a t mesure aprs le quatrime cycle, avec un temps d'incubation trs court (7 h). La biomasse leve dans le systme cellules immobilises a augment la productivit volumtrique

  • vi

    maximale d'EPS (258 mg/l h aprs 7 h) en comparaison avec les cultures en batch avec des cellules libres (110 mg/l h aprs 18 h).

    Une culture continue avec les cellules libres a t conduite pendant 9 jours des taux de dilution (D) entre 0.3 et 0.8 h-1. Une production d'EPS (1808 mg/l) et une productivit volumtrique maximales (542.6 mg/lh) leves ont t obtenues pour un bas D de 0.3 h-1, tandis que la productivit spcifique en EPS tait maximale (9.80 1.01 10-11 mg/CFU h) pour un D intermdiaire de 0.7 h-1. Ensuite, une fermentation continue dans un systme de bioracteurs deux tages a t conduite pendant 32 jours. Le fermenteur du premier tage contenait des cellules immobilises par adsorption sur des supports ImmobaSil. Le deuxime tage de fermentation en srie tait constamment inocul par les cellules produits dans le premier tage. L'influence de la concentration en extrait de levure, de la temprature et du taux de dilution sur les productions de cellules, d'EPS et d'acide lactique dans le milieu a t tudie, en utilisant un plan central composite rotatif avec une analyse de surface de rponse. Un modle statistiquement significatif (P

  • vii

    agrgats produits pendant la culture en continu avec des cellules immobilises dans un milieu de permat de lactosrum supplment, peuvent tre facilement spars et pourraient avoir un grand potentiel d'exploitation comme produit synbiotique, avec des concentrations en cellules actives et en EPS trs leves.

    _______________________ ________________________ Dirk Bergmaier Christophe Lacroix Directeur de recherche

  • Avant-propos Le corps de cette thse est compos de cinq chapitres. Le premier chapitre, intitul "Revue

    de littrature", donne une vue d'ensemble des connaissances actuelles sur les

    exopolysaccharides en gnral et les htropolysaccharides des bactries lactiques en

    particulier. Dans ce mme chapitre, l'immobilisation cellulaire est galement introduite et

    une vue d'ensemble des techniques et des effets de l'immobilisation sur la culture

    immobilise est donne. Les rfrences bibliographiques des chapitres sont prsentes la

    fin de la thse.

    Les chapitres suivants sont prsents sous forme d'articles scientifiques. Le travail rapport

    dans le chapitre 2, intitul "New Method for Exopolysaccharide Determination in Culture

    Broth using Stirred Ultrafiltration Cells", a permis de raliser le premier objectif spcifique

    de mon projet de doctorat: dvelopper une mthode prcise et rapide de mesure des EPS

    produits dans le milieu de fermentation. Les rsultats de ce travail ont t publis dans le

    journal "Applied Microbiology and Biotechnology". J'ai planifi l'ensemble des

    exprimentations et je suis l'auteur principal de cette publication. J'ai excut les

    fermentations dans le milieu base de permat de lactosrum et les expriences

    d'ultrafiltration. J'ai bnfici de l'aide de Maria Guadalupe Macedo qui a excut les

    fermentations dans le milieu BMM et a mis ma disposition les milieux ferments.