Mathieu JOUVRAY

Dr Thomas Guerrier - Pr David LAUNAY – Pr Sylvain DUBUCQUOI Projet de recherche : Master II biologie de la santé

Lauréat bourse GFRS 2016-2017

Analyse des voies de signalisation associées à la

production d’interleukine-6 et d’interleukine-10 par les

lymphocytes B au cours de la sclérodermie systémique

Journée scientifique du GFRS 2017 - Marseille

UMR 995

INTRODUCTION MÉTHODES RÉSULTATS DISCUSSION CONCLUSION

Sclérodermie systémique et LB

Fibrose

Dysimmunité

Vasculopathie

Images : Club Rhumatismes et Inflammation

LB

Anomalies de

l’homéostasie

Auto-anticorps

Activation

survie

Surexpression et

polymorphisme

des TLR

Altération de

production des

cytokines

IL-6

IL-10

Reviewed by Sanges, 2016

Production d’IL-10 par les LB des patients SSc

Etudes IL-10 Stimulations utilisées

Dumoitier et al., 2017 ↓ CpG 72h

Soto et al., 2015 ↓ PMA/ionomycine 5h

Forestier et al., 2017

(Lauréat 2014 GFRS) ↓ CpG + PMA/ionomycine 5h

Etudes IL-6 Stimulations utilisées

Dumoitier et al., 2017 ↑ CpG 72h

Soto et al., 2015 NS PMA/ionomycine 5h

Forestier et al., 2017

(Lauréat 2014 GFRS) ↓ CpG + PMA/ionomycine 5h

Production d’IL-6 par les LB des patients SSc

HC : témoin ; SSc : sclérodermie systémique ; * p<0,05 ; NS : non significactif

3

TLR 9 CpG

PMA ionomycine

PKC Ca++

Régulation génique

Stimulations utilisées

PKC : protéine kinase C

PMA : Phorbol myristate acetate

INTRODUCTION MÉTHODES RÉSULTATS DISCUSSION CONCLUSION

LB : Production IL-6 et IL-10

% IL

-10+

cells

B cells

p=0.00004

Forestier et al., 2017

Forestier et al., 2017

% IL

-6+

cells

B cells

p=0.001

Hypothèse

Anomalies des voies de signalisation impliquées dans la production d’IL-6

et/ou d’IL-10 au sein des lymphocytes B, chez les patients sclérodermiques

TLR 2

Production d’IL-6

Agrawal et Gupta., 2011

PI3K/Akt

mTOR

MAPK

JNK p38

STAT3

Erk1/2

Production d’IL-10

Liu et al., 2013

Identification des phospho-protéines, au sein des grandes voies de

signalisation, impliquées dans la production d’IL-6 ou d’IL-10, dans les LB de

sujets sains

4 1 4

INTRODUCTION MÉTHODES RÉSULTATS DISCUSSION CONCLUSION

Voies de signalisation

JAK

STAT5

_

Li et al., 2015 Ziegler et al., 2014

TLR BCR

CD40 Cytokine-R

Objectifs de l’étude

Etudier la production d’IL-6 et d’IL-10 par les LB des patients

sclérodermiques

Identifier les anomalies de phosphorylation de ERK, mTOR,

STAT3 et STAT5 au sein des LB des patients sclérodermiques.

INTRODUCTION MÉTHODES RÉSULTATS DISCUSSION CONCLUSION

Population / Matériels / Statistiques

Purification

des LB Stimulation par: - CpG ± PMA/ionomycine

- Pam3Csk4

- antiBCR/CD40L/IL-4

Culture

cellulaire

Etude de

P-Erk, P-mTOR,

P-STAT3, P-STAT5

par CMF

Pour chaque condition :

Quantification des

ARNm de

l’IL-6 et de l’IL-10

par qRT-PCR

Quantification de

l’IL-6 et de l’IL-10

par CMF et ELISA

Critères d’inclusion - > 18 ans

- ACR/EULAR 2013

Critères d’exclusion - Corticoïdes ou IS dans l’année

- Épisode infectieux

- chevauchement

Ficoll

Sélection négative

(billes magnétiques)

Statistiques GraphPad – Prism 6®.

Test t de Mann-Whitney.

INTRODUCTION MÉTHODES RÉSULTATS DISCUSSION CONCLUSION

Population

Forme diffuse Forme limité

ScS

n=10

Témoins

n=10

Age,année 52,2+/-13,4 48,4+/-11,4

Genreféminin 7 5

FormedeScS

limitée 7

diffuse 3

Traitements

corticoïdes 0 0

IS 0 0

Pas de différence significative entre les groupes

- -

INTRODUCTION MÉTHODES RÉSULTATS DISCUSSION CONCLUSION

Production d’IL-6 et d’IL-10

RT-PCR 12

NS

antiB

CR+C

D40

L+IL4

Pam3C

sk4

CpG

CpG

+PI PI

0

500

1000

1500

IL-6

pg

/ml

Sécrétion d'IL-6 à H5

Témoins

Patients

CMF

Pas de différence significative

PIB CpG+PIB BCR+CD40L+IL4+PIB

0

2

4

6

8

10

%L

B IL

-10

+

IL-10 intracellulaire à H5

Témoins

Malades

NS

antiB

CR+C

D40

L+IL4

Pam3C

sk4

CpG

CpG

+PI PI

0

500

1000

1500

IL-6

pg

/ml

Sécrétion d'IL-6 à H5

Témoins

Patients

Concentrations

trop faibles pour

être détectées

ELISA

Pas de différence significative

NS

antiB

CR+C

D40

L+IL4

Pam3C

sk4

CpG

CpG

+PI PI

0

500

1000

1500

IL-6

pg

/ml

Sécrétion d'IL-6 à H5

Témoins

Patients

p=0,1

p=0,1

p=0,2

p=0,2

p=0,2

p=0,2

INTRODUCTION MÉTHODES RÉSULTATS DISCUSSION CONCLUSION

Voies de signalisation

P-Erk

NS H2 H50

5

10

15

20

Temps (h)

%L

B

TM CMF % CpG Erk

Témoins

Patients

CpG

NS H2 H50

20

40

60

80

100

%L

B

TM CMF % CpG+PI Erk

témoin

ScS

CpG + PMA/ionomycine

NS H2 H50

20

40

60

80

100

%L

B

TM CMF % PI Erk

témoin

ScS

PMA/ionomycine

NS H2 H50

5

10

15

20

Temps (h)

%L

B

TM CMF % CpG Erk

Témoins

Patients

2h

Absence de détection de phosphorylation avec les autres stimulations

P-E

RK

hi B

cell

s (

%)

P-E

RK

hi B

cell

s (

%)

P-E

RK

hi B

cell

s (

%)

Overlay

P-STAT3 P-STAT5

NS H2 H51.0

1.5

2.0

2.5

3.0

ratio

IMF

TM CMF MFI BCR, hCD40L, IL4 STAT3

témoin

ScS

antiBCR/CD40L/IL-4

NS H2 H50.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

ratio

IMF

TM CMF MFI BCR, hCD40L, IL4 STAT5

témoin

ScS

antiBCR/CD40L/IL-4

NS H2 H50

5

10

15

20

Temps (h)

%L

B

TM CMF % CpG Erk

Témoins

Patients

Overlay Overlay

P-ERK

P-STAT3 P-STAT5

INTRODUCTION MÉTHODES RÉSULTATS DISCUSSION CONCLUSION

Cas particulier de mTOR Défaut de phosphorylation de mTOR après stimulation de la voie TLR9

mTOR : histogramme représentatif

Après stimulation par CpG

P-m

TO

Rh

i B c

ell

s (

%)

P-mTOR : LB naïfs et mémoires, sujets sains

neg +

NS

5H

2H

P-mTOR

Isotype control

Healthy control

SSc patient

hi

p=0.052

p=0.001

P-m

TO

Rh

i B c

ell

s (

%)

Pourcentage de P-mTORhi

SSc HC

INTRODUCTION MÉTHODES RÉSULTATS DISCUSSION CONCLUSION

Production d’IL-6 et d’IL-10

Tendance à une diminution d’expression d’IL-6 et d’IL-10 (RT-PCR)

Pas de différence de production d’IL-6 et d’IL-10 (CMF et ELISA)

au sein des LB des patients / témoins

Dans la littérature

Manque de puissance (10 patients/10 témoins)

&

Défaut de phosporylation de mTOR au sein des LB des patients.

Défaut à priori non expliqué par des anomalies de répartition des LB naïfs et

mémoires décrit chez les patients sclérodermiques

INTRODUCTION MÉTHODES RÉSULTATS DISCUSSION CONCLUSION

Voies de signalisation

&

Dans la littérature

Dans la ScS :

- pas d’étude dans le LB

- augmentation de la phosphorylation dans le LT et le fibroblaste (Ponticos, 2015)

- Rapamycine, peu efficace (chez l’homme) (Su, 2009)

LB sujets sains :

- Rapamycine diminution d’IL-10 (Ziegler, 2014)

mTOR

• ScS : (Mavropoulos, 2016)

• Lupus et GVH chronique : (Menon 2016 et de Masson 2015)

STAT3

FORCES

Première étude à observer

mTOR dans les LB des

patients sclérodermiques

INTRODUCTION MÉTHODES RÉSULTATS DISCUSSION CONCLUSION

Forces et limites

LIMITES

Manque de puissance

Lien de causalité entre

mTOR et la production

de cytokines

&

Travail sous presse dans Autoimmunity Reviews

(bourse GFRS 2014 et 2016)

Remerciements

Mathilde Bas

Julie Boucher

Anaïs Hujeux

Nathalie Journiac

Caty Lee Chang

Lennart Mars

Olivier Outteryck

Bénédicte Vanteghem

Patrick Vermersch

Hélène Zéphir

Maïté Balden

Sylvain Dubucquoi

Thomas Guerrier

Carine Hauspie

Manel Jendoubi

Myriam Labalette

David Launay

Guillaume Lefebvre

Vincent Sobanski

Jacques Trauet

Merci au soutien financier du GFRS

Merci aux membres du LIRIC