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PROCEDES POST-FERMENTATIONDOWN-STREAM PROCESSING

Universit de Lige - Facult Universitaire des Sciences Agronomiques de Gembloux

*Objectifs principaux des oprations en aval des fermenteursObtenir un taux de rcupration lev du produit recherch avec le moins possible de contaminants (attention, ne pas confondre taux de rcupration lev et puret leve la puret dun produit est une notion variable lie la nature du produit et son conomie).

Mettre en uvre des techniques fiables, sadaptant de faibles variations dans la nature et les proprits physico-chimiques du flux traiter

*Microorganismes et insolublesProduit en solutionImpuretsProduit diluProduit concentrMot ferment

Elimination des insolubles

Extraction

Concentration

Purification

Produit purFig. 1.1. Diverses phases de lextraction dun produit extracelllulaire

*Mot ferment

Rcupration des cellules

Rupture des parois cellulaires

Elimination des insolubles

Extraction

Concentration

Purification

Produit purMilieuParois cellulairesImpuretsProduit diluFig. 1.2. Diverses phases de lextraction dun produit intracellulaire

*Caractristiques des mots de fermentation

Concentration faibleBiodgradabilit (enzymes, microorganismes)Tabl. 1.1. Concentration typiques de produits de fermentation dans les bouillons de fermentation

SubstancesConcentration (g/l)GlucoseEthanolAcides organiques (ac. actique, citrique,)a-amylaseAntibiotiqueRiboflavineVitamine B12Glutamate de sodiumActone-alcool butyriqueLipideSCP5070-12040-150204-3010-150.023518-2010-3030-50

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Opration brutale et dlicate

Disruption mcanique

Ultrasons : actuellement petits volumes bruitsDisruptions cellulaires

*Presse de French et homognisateurFig. 1.3. Schma de la presse de FrenchFig 1.4. Configuration de la vanne de dcharge dun homognisateur du type Manton-Gaulin

*La suspension cellulaire est place dans le cylindre, vanne ferme. Aprs mise en place du piston, lappareil est retourn, la vanne ouverte et lair contenu dans le cylindre est expuls.

La vanne est alors referme et lensemble plac sur une presse hydraulique puissante qui, par lintermdiaire du piston, soumet la suspension une pression importante (gnralement suprieure 1000kg/cm2). La vanne aiguille est nouveau ouverte et la suspension est littralement extrude au travers de cet orifice.

Ce systme prsente divers inconvnients :

Un chauffement parfois important du milieu (risque de dnaturation des substances biochimiques)

Une capacit trs rduite (volume trait en une fois de lordre de 50 ml, dbit travers la vanne de lordre de quelque ml par minute)

Systme discontinu

*Au niveau industriel, les homognisateurs de type Manton-Gaulin, sont les appareils les plus rpandus pour la disruption cellulaire.

Ils se composent pour lessentiel, dune pompe haute-pression quipe dune vanne orifice de dcharge ajustable.

Lilly et ses collaborateurs ont tudi les performances dun tel systme pour la disruption dune levure de boulangerie. Ils ont montr que la disruption cellulaire, mesure par la proportion de protines solubles libres, tait indpendante de la concentration en levure, tait proportionnelle au nombre de passes dans lappareil et dpendait de la pression opratoire.

*En fait, ils ont mis en vidence la loi suivante :

Log --------- = K N P

O R = proportion de protines solubles libresRm = proportion maximale de protines solubles librables (ici 96 mg par g de levure)N = nombre de passesP = pressionK = constante dpendant de la configuration de la vanne de dcharge et de la tempratureR

Rm2.9

*Moulins billes

Divers types de moulins billes, notamment utiliss dans lindustrie de la peinture, ont t tests pour la disruption cellulaire.

Ces appareils sont gnralement constitus dune chambre cylindrique comportant un arbre central quips de plateaux cylindriques rgulirement espacs. Les espaces annulaires compris entre les plateaux, le rotor et la paroi de lappareil sont partiellement remplis de billes dont la granulomtrie peut varier dune chambre lautre. Ce sont ces billes qui constituent lagent de broyage proprement dit.Fig.1.5. Moulin bille de Netzsch LM-20 A- cylindreB- agitateurC- sparateurD- moteur1&2 entre et sortie des cellules3&4 refroidissement agitateur5&6 refroidissement du cylindre

*Pression

La presse-X due Ebedo se compose dun cylindre divis en deux parties spares par un disque perc dun petit orifice.

Une pte cellulaire gele est force un grand nombre de fois au travers de lorifice entre les deux parties du cylindre. La disruption cellulaire qui en rsulte est probablement due la dformation des organismes enrobs de glace (la glace subit lors du passage de lorifice des modifications cristallines). Cet appareil est uniquement utilis au laboratoire.

*Fig. 1.6. Schma de la presse X de Ebedo

*Disruption non mcanique

La lyse physique

Les mthodes physiques de lyse cellulaire sont essentiellement des techniques de laboratoire.

Ainsi, le refroidissement et la conglation lente de cellules suivis de leur dgel (rupture de lenveloppe cellulaire par des cristaux de glace) se rvle en pratique une technique lente, coteuse et peu efficace.

Plus prometteuse mais encore inutilis industriellement est la technique du choc osmotique qui pourrait, dans certaines conditions, conserver les cellules sous un forme viable tout en les forant relcher certaines enzymes de faon slective.

*La lyse chimique

Certains dtergents anioniques et cationiques, des alcalis et divers solvants endommagent srieusement les composants lipoprotiques de la membrane cellulaire conduisant la lyse cellulaire.

Ces agents chimiques cependant dnaturent gnralement par la mme occasion le matriel endocellulaire. Seul lextraction de composs particulirement rsistants peut tre envisage par ces techniques.

Lemploi dantibiotiques (tyrocidine, amphotricines) permet daccrotre la permabilit cellulaire des bactries mais lemploi de ces agents est fort limit cause de leur cot.

*La lyse enzymatique

Le lysosyme et dautres enzymes du mme type sont capables de provoquer la lyse des bactries gram-positives et, sous certaines conditions, de bactries gram-ngatives. Certains antibiotiques (pnicilline,) peuvent interfrer dans les tapes de synthse des parois cellulaires conduisant des cellules anormales particulirement faciles lyser.

Ces techniques prometteuses sont gravement handicapes par le cot des agents utiliss.

*Sparations liquide-solideFaisant suite la disruption cellulaire, si elle a t effectue, la premire tape du traitement des bouillons de fermentation consiste gnralement en une sparation liquide-solide dont le but peut tre :de sparer le ou les produits recherchs des autres composs indsirables tout en oprant une rduction importante du volume traiter;dliminer les dbris cellulaires rsultant de la disruption avant dextraire le ou les produits intracellulaires recherchs. On en facilite ainsi la concentration et la purification en vitant, par exemple, le colmatage des membranes dultrafiltration ou des colonnes dadsorption;de rcuprer les cellules en tant que biomasse pouvant tre utilise comme source de protines (SCP), comme pied de levain dans lindustrie alimentaire ou encore lors du dmarrage de lpuration biologique de certaines eaux rsiduaires;Dliminer, par lavage multitag les traces de divers substrats indsirables

*Diffrentes techniquesDcantation

Centrifugation

Filtration

Ultrafiltration

Moussage

*SdimentationLors de la sdimentation, deux forces verticales agissent sur les particules (que nous considrons sphriques et de diamtre uniforme) :

la force de gravit Fg = (rp rf) g -------

la force rsultant du frottement visqueux fluide-particule

FD = CD --------- rf -------

avec CD = coefficient de trane de la particule *V = vitesse verticale relative fluide-particule

pdp3

6pdp2

4V2

2*Le coefficient de trane dpend du rgime hydrodynamique de lcoulement vertical voir cours de gnie chimique. Gnralement, en sdimentation, on se trouve dans le rgime de Stokes :

CD = ---- = --------24Re24f

rfVdp

*La vitesse de sdimentation, ici la vitesse terminale de chute libre, est atteinte lorsque les deux forces verticales agissant sur la particule squilibrent :

Fg = FD => =

Dou en rgime de Stokes : Vg = ---------- g dp2

Il est clair que la vitesse de sdimentation, dont dpend directement les performances du sdimenteur, est lie lintensit de la force volumique (gravit) agissant sur les particules. Do lide daccrotre artificiellement cette force en plaant le flux sdimenter dans un champ dacclration suprieur celui de la pesanteur et plus particulirement dans un champ dacclration centrifuge.(rp rf) g -------pdp3

6CD --------- rf -------pdp2

4Vg

2rp-rf

18 f2

*DcantationBien que la sdimentation classique dans le champ de la pesanteur soit peu utilise en biotechnologie (sauf en puration des eaux), il est utile den rappeler les principes car ils sont la base de la dfinition des critres dextrapolation pour la sdimentation centrifuge.Considrons le cas de la sdimentation discrte idale dans un tank ayant la forme dun paralllpipde droit.

On dfinit, pour un type de particules donn (dp, rp), un dbit critique Qc qui est celui pour lequel 50% des particules de type considr auront sdiment dans le tank;

On montre facilement que :

Qc = 2 Vg A

O Vg = vitesse de sdimentation dans le champ de la pesanteurA = aire du tank de sdimentation