Prix Nobel de Chimie Prix Nobel de Chimie 20082008

Découverte et utilisation de la Découverte et utilisation de la Green Fluorescent ProteinGreen Fluorescent Protein Osamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger TsienOsamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger Tsien

Une petite méduse Une petite méduse verdâtre!verdâtre!

• Aequorea sp.Aequorea sp.• Aequorea sp.Aequorea sp.

• Plus d’eau que dans Plus d’eau que dans une bière! une bière!

• Cellules urticantesCellules urticantes

Osamu ShimomuraOsamu ShimomuraMarine Biological Laboratory, BostonMarine Biological Laboratory, Boston

Etude de la bioluminescence Etude de la bioluminescence d’d’AequoreaAequorea

La bioluminescenceLa bioluminescence

Emission de lumière par des organismes vivantsEmission de lumière par des organismes vivants

Chémoluminescence biologiqueChémoluminescence biologique

Une réaction Une réaction bioluminescentebioluminescente

Luciférase (protéine)

O2

L u c i f é r i n e

N NO

H

NH

OH

HO

N N

OH

NHHOHO

COCO22

Le système luminescent Le système luminescent d’Aequoread’AequoreaShimomura & Johnson, 1960sShimomura & Johnson, 1960s

Head, Inouye, Shimomura. Nature 2000Head, Inouye, Shimomura. Nature 2000

Aequorine:Aequorine:

• Photoprotéine Photoprotéine • CaCa2+2+--dépendantedépendante

Photo : Protein data bankPhoto : Protein data bank

Utilisation de Utilisation de l’aequorinel’aequorine

Brini et al 1999Brini et al 1999

Cinétique du calcium Cinétique du calcium dans des embryonsdans des embryons

La découverte de la La découverte de la GFPGFPOsamu Shimomura,1962Osamu Shimomura,1962

““A protein giving solutions ..... exhibiting a A protein giving solutions ..... exhibiting a very bright, greenish fluorescence in the very bright, greenish fluorescence in the ultraviolet ... has also been isolated from ultraviolet ... has also been isolated from squeezates.” squeezates.” (Shimomura et al. 1962).(Shimomura et al. 1962).

J.Wiedenmann, S. Ivanchenko, F. Oswald, F. Schmitt, C. R!cker,J.Wiedenmann, S. Ivanchenko, F. Oswald, F. Schmitt, C. R!cker,A. Salih, K. D. Spindler, G. U. Nienhaus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 15905.A. Salih, K. D. Spindler, G. U. Nienhaus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 15905.

397- 475 nm397- 475 nm 504 nm504 nm

Le chromophoreLe chromophore

Campbell, 2008. ScholarpediaCampbell, 2008. Scholarpedia

GFP: le vert intenseGFP: le vert intense

Ions calciumIons calcium

A la fois mine....A la fois mine....

et alarme antivol!et alarme antivol!

Le clonage de la Le clonage de la GFPGFP

Douglas Prasher, 1992Douglas Prasher, 1992Woods Hole Oceanographic Woods Hole Oceanographic InstitutionInstitution

La séquence de la GFPLa séquence de la GFP

L’expression de la L’expression de la GFP GFP chez chez CaenorhabditisCaenorhabditisMartin Chalfie, 1994Martin Chalfie, 1994Columbia UniversityColumbia University

Caenorhabditis elegansCaenorhabditis elegans

nématode transparentnématode transparent

1 mm de long, 1031 1 mm de long, 1031 cellulescellules

Prix Nobel de Médecine Prix Nobel de Médecine 20022002Sydney Brenner, John Sydney Brenner, John Sulston, Bob HorvitzSulston, Bob Horvitz

Un travail fondateurUn travail fondateur

Science 1994Science 1994

Formation Formation autocatalytique du autocatalytique du chromophorechromophore

Campbell, 2008. ScholarpediaCampbell, 2008. Scholarpedia

Réaliser des protéines de Réaliser des protéines de fusionfusion

Les avantages de la GFP Les avantages de la GFP comme marqueur comme marqueur cellulairecellulaire

• Non-toxiqueNon-toxique• Absence de cofacteur Absence de cofacteur • StabilitéStabilité• Peu d’interactions avec Peu d’interactions avec constituants cellulaires constituants cellulaires

Des outils pour suivre la Des outils pour suivre la progression d’un cancerprogression d’un cancer

3 semaines3 semaines 5 semaines5 semaines 9 semaines9 semaines

Une nouvelle vision Une nouvelle vision des cellulesdes cellules

Hamamatsu.comHamamatsu.com

Fluorescence Recovery After Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)Photobleaching (FRAP)

Fusion GFP-E-cadherinFusion GFP-E-cadherin

Pre bleachPre bleach 15 sec15 sec 75 sec75 sec 300 sec300 sec

Fluorescence Recovery After Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)Photobleaching (FRAP)

Cliffe et al. 2004Cliffe et al. 2004

Les mutants Les mutants ccoolloorrééss

Roger Tsien, 1996Roger Tsien, 1996University of CaliforniaUniversity of California

Variants colorés de la Variants colorés de la GFPGFP

chromophorchromophoree

chromophorchromophoree

EnvironnemeEnvironnementnt

Chromophores mutants Chromophores mutants

Campbell, 2008. ScholarpediaCampbell, 2008. Scholarpedia

Des variations de Des variations de λλ d’excitation et d’excitation et

d’émissiond’émission

Trugnan et al 2004Trugnan et al 2004

De nombreuses De nombreuses applicationsapplications

Fluorescence Fluorescence Resonance Energy Resonance Energy Transfer (FRET)Transfer (FRET)

FRET: la protéine FRET: la protéine CaméléonCaméléon

Protéine CaméléonProtéine Caméléon

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Hamamatsu.comHamamatsu.com

Marquages multiples Marquages multiples des cellulesdes cellules

Une palette Une palette d’applications d’applications

Les FP chez des organismes Les FP chez des organismes non-bioluminescentsnon-bioluminescents

Une structure similaire Une structure similaire au nidogen-1au nidogen-1

NidogenNidogen

GFPGFP

Hopf et al 2001Hopf et al 2001

Le nidogen-1Le nidogen-1

Hopf et al 2001Hopf et al 2001

Böse et al 2006Böse et al 2006

Une méduse devenue Une méduse devenue princesseprincesse

Révolution en biologie cellulaireRévolution en biologie cellulaire

Une richesse inouïe d’applicationsUne richesse inouïe d’applications

Des perspectives éblouissantes!Des perspectives éblouissantes!

The future is bright!The future is bright!

Chromophores naturelsChromophores naturels

UVUVUVUV UVUVUVUV

GFPGFPGFPGFP

Campbell, 2008. ScholarpediaCampbell, 2008. Scholarpedia