PRINCIPALES TECHNIQUES DE SERODIAGNOSTIC
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PRINCIPALES TECHNIQUES DE SERODIAGNOSTIC TD de Microbiologie 4 ème année Pharmacie Année Universitaire 2019-2020 Par : Dr Y. Lombarkia Pr S. Benammar
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PRINCIPALES
TECHNIQUES DE
SERODIAGNOSTIC
TD de Microbiologie
4ème année Pharmacie
Année Universitaire 2019-2020
Par : Dr Y. Lombarkia
Pr S. Benammar
PLANIntroduction
Prélèvements
Principales techniques de sérodiagnostic
1.Agglutination
2. Réaction de fixation du complément
3. Immunofluorescence indirecte
4. Technique immuno-enzymatique (ELISA)
5. Western blot (immunoblot)
6. Séroneutralisation
7. Inhibition de l’hémagglutination
8. Technique radioimmunologique
Conclusion
Bibliographie
INTRODUCTION
Le diagnostic sérologique ou diagnostic indirect ou sérodiagnostic en microbiologie : repose sur la mise en évidence chez l'hôte d'une réaction immunitaire spécifique de l'agent infectieux consistant en la production d'anticorps généralement détectables au bout de 8 à 10 jours.
Les sérologies figurent parmi les outils utiles au diagnostic des maladies infectieuses.
Elles ne remplacent pas la mise en évidence du pathogène qui reste la meilleure technique diagnostique mais n’est cependant pas réalisable en routine pour tous les agents infectieux.
La nécessité dans la plupart des cas de faire une analyse comparative de 2 échantillons espacés de 10 à 20 jours limite considérablement l’intérêt des sérologies dans le cadre de l’urgence.
INTRODUCTION
la cinétique de la réponse humorale comporte d'abord l'apparition d'anticorps de classe immunoglobulines M (Ig M), progressivement remplacés par des anticorps de classe Ig G, produits très longtemps, dont certains ont un rôle protecteur.
La sérologie dans le diagnostic des maladies infectieuses doit être envisagée dans un contexte clinique précis, en raison :
des problèmes liés aux réactions croisées,
à la cinétique et au délai d’apparition des anticorps,
à la séroprévalence élevée de certains anticorps
et à la persistance des anticorps au long cours.
INTRODUCTION
Pour le diagnostic des infections bactériennes, la
sérologie garde une place lorsque la culture
conventionnelle n'est pas réalisable ou délicate :
Coxiella burnetii, Chlamydophila pneumoniae,
brucellose, syphilis,rickettsioses,…,,,,
Pour les infections virales, la sérologie représente toujours l’outil de première intention du
diagnostic de nombreuses infections : HIV,
hépatites, rubéole, rougeole,……….
Plusieurs techniques de détection des anticorps
sont actuellement disponibles.
PRELEVEMENTS Le prélèvement doit être réalisé :
Avant toute thérapeutique susceptible de modifier
l'interprétation du sérodiagnostic telles que sérothérapie,
transfusion...,
Types : Sang
Un sérum précoce et un sérum tardif 15 jours plus tard .
Le sang ou le sérum peuvent être conservé au plus 24 à 48
heures à + 4 °C.
Le sérum aliquoté est conservé à - 20 °C au moins 1 an.
Un stockage du sérum aliquoté à -80 °C est recommandé si
conservation sur plusieurs années (sérothèques).
PRINCIPALES TECHNIQUES DE
SERODIAGNOSTIC
On distingues des techniques détectant des:
Anticorps avec propriétés définies
(Exp:neutralisation, hémagglutination);
Anticorps sans propriétés définies (Exp: ELISA,
immunofluorescence indirecte, Western Blot).
PRINCIPALES TECHNIQUES 1.Agglutination:
Principe Avantages Inconvénients Applications
Elle met en jeu des
particules (latex,
gélatine, hématies)
sensibilisées par un
antigène dont
l'interaction avec l'Ac
(IgG et IgM) du sérum à
tester conduit à une
agglutination
macroscopique.
NB : si on utilise des
hématies on parle
d’hémagglutination.
*Simple
*rapide
(qlq minutes
à 2h)
Peu sensible,
peu spécifique
et sujette à la
subjectivité du
lecteur
* Sérodiagnostic
de Widal et Félix;
*Sérodiagnostic
de Wright;
*TPHA (bonne
spécificité).
2. Réaction de fixation du complément:
Principe Avantages Inconvénients Applications
Compétition du
Complément (Cp) pour
2 systèmes : (Ag-Ac et
GR de mouton/anti-
GR, l’Ag étant connu)
➙ Pas d'hémolyse : le
Cp est fixé sur Ag-Ac =>
présence d’Acs
spécifiques
➙ Hémolyse : le Cp est
fixé sur GR de
mouton/anti-GR =>
absence d’Acs
spécifiques
*Spécifique,
*Peu
coûteuse.
*longue
et délicate à
mettre en
œuvre,
* difficile à
standardiser,
*peu sensible,
*faux positifs par
activation
spontanée du
complément.
*technique
ancienne, de
moins en moins
utilisée.
infections
récentes, surtout
viroses
respiratoires
(grippe A, B, virus
respiratoire
syncitial,
adénovirus,
paramyxovirus)
1ère étape : Fixation
METHODE
Mise en contact : Sérum + Ag + C’
C’
C’
Sérum positif Sérum négatif
C’ fixé : activité résiduelle nulle
C’ libre : activation possible par un complexe
immun
Réaction de fixation du complément:
2ème étape :Révélation
Ajout du système hémolytique
C’
Sérum positif Sérum négatif
Pas d’hémolyse (NH)
C’
Hémolyse (HT)
Résultats
Sédimentation= NH
Hémolyse partielle = HP
Hémolyse totale = HT
Fixation complète du C’
Fixation partielle du C’
C’ non fixé
Présence d’Ac spécifiquesAbsence d’Acspécifiques
DIAGNOSTIC DES INFECTIONS VIRALES Cours 3ème année de Médecine Dr.
M. SEGHIER, Faculté de Médecine d’Alger 2016
3. Immunofluorescence indirecte:Principe Avantages Inconvénients Applications
*Support sensibilisé :
Antigène connu fixé
sur une lame.
* La technique :
- Sérum à tester
- Utilisation d’un
immun-sérum anti-
globulines humaines
(totales ou
spécifiques de
classe) conjugué à
un fluorochrome.
- La lecture est
effectuée en
microscopie optique
à fluorescence
*La mise en
œuvre de
IFI est
rapide,
(1à2
heures)
*Sensible.
*Spécificité
imparfaite
(interprétation
subjective);
*Absence
d'automatisati
on,
*Techniques
réservées à de
petites séries.
Technique de
référence pour
le diagnostic
indirect des
infections à
bactéries
intracellulaires:
Brucella,
Coxiella,
Rickettsia, ,
Bartonella, etc.
*EBV, Grippe,
Paramyxovirus.
*détection des
anticorps anti-
VCA de
l’Epstein-Barr
virus.
4. Technique immuno-enzymatique (ELISA=Enzyme Linked
Immunosorbent Assay):
Principe Avantages Applications
l’Ag viral est adsorbé sur
un support solide
sensibilisé pour fixer l’Ac
spécifique;
- Anti-Ig humaines ou Ag
viral couplés à une
enzyme forment le
conjugué;
- Le substrat de l'enzyme
peut être fluorogénique,
chimioluminescent ou
Chromogénique.
*Sensible et spécifique,
*Détection des classes
d'Ac : IgG, IgM
*Automatisation : bonne
reproductibilité, grandes
séries et faibles volumes
réactionnels adaptées au
dépistage (HIV, hépatite
C)
*Quantification des Ac :
sérums étalons de
référence (Rubéole)
-Avidité des IgG :
distinguer primo-infection
et infection ancienne.
Virus (rougeole,
rubéole oreillons,
varicelle, hépatites A,
C, D, HIV,…)
Principe: Elisa indirecte
L’antigène de référence est fixé sur un support solide (puit d’une
microplaque, bille, membrane).
Les anticorps du liquide biologique testé se fixent sur cet
antigène au cours d’une phase d’incubation, les anticorps non
spécifiques étant éliminés ensuite par des lavages itératifs.
Le complexe antigène-anticorps est ensuite révélé grâce à un
conjugué couplé à une enzyme (E) qui transforme in substrat
incolore en un produit coloré.
ELISA for HIV antibody
DIAGNOSTIC DES INFECTIONS VIRALES Cours 3ème année de Médecine Dr.
M. SEGHIER, Faculté de Médecine d’Alger 2016
5. l'immuno-empreinte (Western-blot):
Principe Avantages Inconvénien
ts
Applications
*Les protéines
virales natives sont
séparées par
électrophorèse puis
transférées sur
membrane de
nitrocellulose
• Les Ac spécifiques
éventuellement
présents dans le
sérum se fixent sur
ces protéines.
• La liaison Ag-Ac
est révélée par une
anti-Ig marquée à
l'aide d'une
enzyme. On
ajoute le substrat =>
réaction colorée.
* Très spécifique car
elle distingue les
anticorps
réactifs vis-à-vis des
différents antigènes
cibles.
*Elle est
automatisable et
sert surtout de test
de confirmation.
*Réponse en détail
vis à vis des
protéines virales.
Moins
sensible
que l'ELISA
*Stratégie
diagnostique dans le
cadre du HIV :
- Le dépistage des
Ac anti-VIH doit
s’effectuer avec 2
réactifs mixtes (VIH 1
et VIH2);
- En cas de positivité
des résultats, un
western blot,
confirmera le
type de virus.
• Confirmation d'une
sérologie positive en
HTLV1 et 2.
• Dans le cadre de
la recherche :
CMV….
technique
Principe Avantages et limite Applications
*La réaction nécessite
une culture de cellules
pour la réplication du
virus,
-Les Ac présents dans
le sérum inhibent l'ECP
(donc l’infectivité)
- ces Ac, dits
neutralisants in vitro,
ont souvent une
activité protectrice in
vivo.
- Spécificité de la
technique.
Technique de référence
spécifique et sensible
mais de manipulation
longue, délicate, et
onéreuse .
*Elle ne s'applique
qu'aux virus induisant un
ECP d'apparition rapide :entérovirus humains ,
virus herpes simplex
*Technique de
référence pour mesurer
l'immunité anti-
poliomyélitique.
6. Séroneutralisation:
7.Inhibition de l’hémagglutination (IHA):
Principe Avantages Inconvénients Applications
*Virus (de la rubéole,
de la grippe...)
capable d'agglutiner
spécifiquement les
hématies (HA) de
certaines espèces
animales (cobayes,
poussins…)
*les Ac spécifiques
du virus se fixent sur
le virus => le virus n'a
plus accès à la
surface des hématies
=> il y a IHA donc
inhibition de la
formation d'un
agglutinat visible à
l'oeil nu.
*Spécifique
*Les anticorps mis
en évidence par
IHA sont
habituellement
protecteurs in
vivo.
*Moins
sensible
que l'ELISA
*L’interprétati
on peut être
subjective.
*Exige des
globules
rouges frais
de l'espèce
sensible.
*Risque de
faux positifs.
Rubéole, Grippe
pour le sous typage.
8. Techniques radio-immunologiques (RIA):
Le principe est proche de celui des techniques
ELISA.
le deuxième anticorps étant couplé à un radio
isotope.
La détection des immuns complexes marqués
est réalisée grâce à un compteur gamma.
les techniques RIA sont de moins en moins
utilisées dans les laboratoires de virologie du fait
de la difficulté de leur exploitation:
-radioprotection
-autorisations administratives
-instabilité relative des réactifs
CONCLUSIONLes méthodes de la sérologie infectieuse ont
beaucoup évolué depuis plus d’un siècle.
L’intérêt des sérologies dans le diagnostic d’une
infection est limité en raison d’une sensibilité et/ou
d’une spécificité non optimales.
Il faudra toujours privilégier la recherche directe
du germe (culture ou PCR) lorsque cela est
possible.
Poser le diagnostic d’une infection par sérologie
demande très souvent 2 sérologies espacées afin
d’objectiver une augmentation significative du
taux d’anticorps ou une séroconversion.
BIBLIOGRAPHIE1. François Denis, Marie-Cécile Ploy, Christian
Martin, Vincent Cattoir. Bactériologie médicale Techniques usuelles 3e édition ISBN : 978-2-294-74616-1 Elsevier Masson.
2. H. Agut, D. Boutolleau, S. Burrel. Diagnostic virologique. EMC - Maladies infectieuses Volume 11 > n◦1 > février 2014.
3. Dr. M. SEGHIER. DIAGNOSTIC DES INFECTIONS VIRALES. Cours 3ème année de Médecine Faculté de Médecine d’Alger 2016.
4. Dr C. FRANCOIS –Diagnostic indirect en microbiologie L3 médecine AMIENS 2012/2013–S5 UE 1. (https://studylibfr.com/doc/51284/diagnostic-indirect-en-microbiologie).
