Présenté par Olivier DELORME

Laboratoire de Biologie Moléculaire et Séquençage, IBGC, UMR CNRS 5095/Université Victor Segalen Bordeaux 2

Sous la direction de MM. François DOIGNON et Didier THORAVAL

Étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4:

recherche des kinases responsables de la phosphorylation de

la RhoGAP Rgd1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Le cycle de régulation des protéines Rho3 et Rho4

Rho3/4

Rho3/4

GDP

GTP

Rgd1 GEF

Forme active

Forme inactive

Pi GDP

GTP

La protéine Rgd1 (Related GAP Domain 1)

FCH RhoGAP

Fes-CIP4 Homology

Coiled-coil

Rho GTPase Activating Protein 

D’après Roumanie et al., 2000

La protéine Rgd1 est phosphorylée

H. Fernandes.2005

Où se trouvent les sites de phosphorylation ?

S336

? ?

La phosphorylation régule l’activité de Rgd1p

H. Fernandes. 2005

L’activité RhoGAP augmente lorsque Rgd1 est sous forme non phosphorylée

Rgd1

Rho3

Rho4

Kinases?

Phosphatases?

Quels sont les mécanismes qui régulent Rgd1p ?

Objectifs

Participation à l’étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4

Etude de la régulation de Rgd1p

Recherche des kinases

Recherche des kinases de Rgd1p

– Approche ciblée : • Analyse des souches mutées pour les gènes codant

pour les kinases potentielles de Rgd1p

– Approche globale:• Analyse des souches mutées pour les gènes codant

pour les kinases• Approche par la protéomique : le Proto-Array

Approche ciblée : les kinases potentielles

Mkk2p et Bck1pRgd1pMkk2pBck1p

Complexe protéique

PKA (Tpk1, Tpk2, Tpk3)

Ipl1p

Ipl1 Aurora B

?

GAPRgd1p GAP MgcRacGAPp

Activité AMPc dépendante, la quantité d’AMPc varie au cours de la croissance

Stratégie d’analyse

Extraction Protéines totales

Western Blot

Prélèvement des cellules

Détection et Quantification par caméra CCD

Détection des bandes présentes sur la membrane

Acquisition d’une image

Acquisition des valeurs d’intensité des bandes

Calculs des rapports P/nP pour chaque extrait et détermination du seuil

Méthode de calculWT rgd1Δ1Δ 2Δ 3Δ 4Δ 5Δ 6Δ

P

nP

P/nP P/nP P/nP P/nPP/nP P/nP P/nP P/nPP/nP P/nP P/nP

Moyenne P/nPEcart-type

Seuil=(moyenne)-(écart-type)

P/nP<Seuil => la souche est sélectionnée

Approche Ciblée

Seuil

tpk1Δ, tpk2Δ, tpk3Δ

Valeur P/nP

2,11,9

2,2

bck1

Δ

mkk2Δ

1,8

2,9

1,7

1,2

WT

2,4

3,3

3

WT WT

ipl1-

322

ipl1-

322

2,5

WT WT

Extraits protéiques1

Approche globale

Extraits protéiques

ymr2

91wΔ

1

Valeur P/nP

2

3

2,5

1,5

6,5

WT2

WT4

WT1

WT3

WT5

ypl2

36cΔ

ypk2

Δyn

r047

wΔya

k1Δ

ypk1

Δyd

l025

cΔ

ssk1

Δ

ygr0

52cΔ

yck2

Δ

ste7Δ

yil04

2cΔ

rgd1

Δ

Seuil

ssk1

Δ

Approche globale

Quelles sont les kinases retenues?

Dig1p, Tpk3p

Yck1p, Yck2p

Bub1p, Fus3p, Pho85p

Bud32p

Ssn8p

Endocytose, cytocinèse

Mécanismes du cycle cellulaire

Sélection du site de bourgeonnement

Mck1p, Dun1p

Croissance invasive

Régulation de l’ARN polymérase II

Régulation des mécanismes de réparation de l’ADN

L’analyse des souches mutées par Western Blot est elle suffisante ?

• Le crible permet de sélectionner les kinases candidates

• Il est impossible de déterminer les kinases qui interagissent physiquement avec Rgd1p

Recherche des kinases en utilisant le proto-array

Protéine de fusion purifiée

Puce Invitrogen™  contenant 4088 protéines de S. cerevisiæ

(70% des protéines totales)

Localisation des protéines qui

interagissent avec Rgd1p

Utilisation Anticorps Anti-V5

fluorescent

Rgd1 V5 6xHis

Incubation des protéines de fusion sur la puce

Comment obtenir la protéine de fusion ?

Amplification de la séquence codante de RGD1

Clonage du produit de PCR dans un vecteur navette

Transformation de bactérie avec le vecteur contenant la séquence codante

Production du vecteur dans la bactérie, puis transformation des levures avec le vecteur

Purification de la protéine de fusion

Le vecteur utilisé pour effectuer la construction

Invitrogen

Conclusions générales

• Le crible des kinases ciblées a permis de sélectionner Ipl1

• A partir des 140 protéines testées, 11 kinases ont été retenues. Parmi ces 11 kinases Yck1, Yck2, Bud1 et Fus3 sont les meilleures candidates

• La construction plasmidique contenant la séquence codante fusionnée aux étiquettes V5 et 6xHis a été effectuée

Perspectives

• A court terme :– Terminer l’approche par le proto-array– Effectuer des tests d’activité sur les 11 kinases retenues

• A long terme :– Étudier les kinases et leur implication dans la régulation

des protéines Rho3 et Rho4– Effectuer les cribles pour rechercher les phosphatases

de la protéine Rgd1

Merci de votre attention

Laboratoire de Biologie Moléculaire et Séquençage, IBGC, UMR CNRS 5095/Université Victor Segalen Bordeaux 2