Preparation Des Milieux de Culture

Laboratoire d’expertises et d’analyses alimentaires

LEAA-REF-MIC-550 de 17 AEV 2013-05-06

PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE1

LEAA-REF-MIC-550

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PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE

TABLE DES MATIÈRES

1. INTRODUCTION ....................................................................................... 4

2. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT DE BASE........................................................... 4

3. RÉCEPTION, ENTREPOSAGE ET DÉCONGÉLATION DES ÉCHANTILLONS............ 5

3.3.1 Généralités .................................................................................. 5

4. PRÉLÈVEMENT ET PESÉE ........................................................................... 6

4.3.1 Tous les aliments .......................................................................... 7

4.3.2 Aliments liquides ou semi-liquides ................................................... 8

4.3.3 Regroupement des unités d’analyse (unité composite) pour la recherche de bactéries pathogènes (exemple : Salmonella, Listeria monocytogenes, etc.).................................................................... 8

4.3.4 Viandes en bloc ............................................................................ 8

4.3.5 Poisson entier cru ......................................................................... 8

4.3.6 Mollusques crus ............................................................................ 8

4.3.7 Crustacés non décortiqués crus ou cuits ........................................... 9

4.3.8 Volaille crue avec peau .................................................................. 9

4.3.9 Œufs........................................................................................... 9

4.3.9.1 Procédure de prélèvement pour la recherche des salmonelles sur la coquille et à l'intérieur des œufs ............................................... 9

4.3.9.1.1 Extérieur........................................................................... 9

4.3.9.1.2 Intérieur ........................................................................... 9

4.3.9.2 Procédure de prélèvement pour l’analyse de l’intérieur de l’œuf seulement ........................................................................... 10

4.3.10 Laits secs................................................................................... 10

4.3.11 Produits chambrés ...................................................................... 10

4.3.12 Produits gras (beurre, margarine, saindoux, etc.) et fromages gras.... 10

4.3.13 Produits secs déshydratés (exemples : épices, céréales, légumineuses sèches, riz sec)........................................................................... 10

4.3.14 Procédure de prélèvement pour la recherche de salmonelles dans les graines de germes (luzerne, radis, etc.) ......................................... 11

4.3.15 Produits très salés (5 %) ............................................................ 11

4.3.16 Produits très sucrés (miel, sucreries, sirop d’érable, etc.) ................. 11

4.3.17 Conserves.................................................................................. 11

4.3.18 Procédure pour la recherche des bactéries pathogènes à la surface des fruits frais entiers (cantaloups, melons, etc.) .................................. 11

4.3.19 Écouvillons................................................................................. 12

4.3.19.1 Écouvillon reçu dans un tube contenant 10 ml de tampon neutralisant : ....................................................................... 12

4.3.19.2 Écouvillon reçu dans un tube contenant moins de 1 ml de tampon neutralisant: ........................................................................ 12

4.3.20 Éponges .................................................................................... 12

5. DILUANTS..............................................................................................12

6. BROYAGE ET HOMOGÉNÉISATION .............................................................13

7. DILUTIONS DES ÉCHANTILLONS ...............................................................14



7.1.1 Définition................................................................................... 14

7.1.2 Procédure .................................................................................. 14

7.2.1 Définition................................................................................... 14

7.2.2 Procédure .................................................................................. 15

8. BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................16

9. APPROBATION ........................................................................................17



1. INTRODUCTION

Le prélèvement des échantillons effectué dans le but de réaliser une analyse microbiologique est une étape très importante de la chaîne analytique. Il est primordial de s'assurer de l'intégrité et de la représentativité des échantillons. Le prélèvement des échantillons peut grandement influencer les résultats obtenus. La préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique comprend plusieurs étapes : la réception des échantillons, le prélèvement et la pesée, le broyage et l’homogénéisation et la dilution des échantillons (solution mère et dilutions décimales suivantes). Les échantillons doivent être en tout temps minutieusement manipulés en respectant l’ensemble des règles d’asepsie de manière à éviter toute contamination.

L’ensemble des protocoles pour la fabrication des diluants mentionnés dans ce document se retrouve dans le document LEAA-REF-MIC-100.

2. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT DE BASE

- Appareil à dilution automatique (ex: Dilumat AES laboratoire) ou balance analytique de portée suffisante avec une précision de lecture de 0,1 g;

- Diluants ou bouillons d'enrichissement;

- Instruments de prélèvement (couteaux, fourchettes, spatules, pinces, ciseaux, scalpels, cuillères, etc., stériles);

- Alcool 95 % pour flambage, si nécessaire;

- Alcool 70 %;

- Homogénéisateur de type péristaltique avec des sacs stériles de plastique;

- Pipettes sérologiques stériles;

- Réfrigérateurs 1 à 6 oC;

- Congélateurs -9 à -30 oC;

- Micropipettes;

- Tubes 9 ml de peptone-sel ±2 %;

- Bain-marie;

- Savons et détergents germicides.



3. RÉCEPTION, ENTREPOSAGE ET DÉCONGÉLATION DES ÉCHANTILLONS

3.1 VÉRIFICATION DES CONDITIONS DE TRANSPORT ET DE L’INTÉGRITÉ DES CONTENANTS

Lorsque les délais de transport (≤ 36 heures) et que la température de conservation (≤ 6 °C) des échantillons sont adéquats, vérifier les contenants afin de détecter tout défaut physique. Inspecter minutieusement les sacs de plastique, les bouteilles et autres contenants afin de vérifier s'il y a présence de trous, de fissures ou de perte de liquide. Vérifier si l'eau de la glacière ne s'est pas infiltrée dans l'échantillon. S'assurer que les sacs de plastique (type Whirl-pak) sont très bien roulés et fermés hermétiquement. Vérifier que les échantillons d’eau ne sont pas congelés lors de leur réception au laboratoire. N'importe laquelle des irrégularités citées précédemment invalide l'échantillon pour l’analyse microbiologique et le client concerné doit en être informé afin de procéder à un autre prélèvement, si nécessaire.

3.2 IDENTIFICATION ET ENREGISTREMENT DES ÉCHANTILLONS

S'assurer que chaque échantillon est étiqueté et accompagné d'une demande de service analytique (demande d’analyse électronique Hermès ou formulaire procès-verbal de prélèvement) lui attribuant un numéro de laboratoire officiel et renfermant l'ensemble des informations y étant rattachées. Vérifier la correspondance entre la description de l'échantillon sur la demande et la nature des échantillons expédiés. Compléter la description, particulièrement si elle a un impact sur l’interprétation des résultats (exemples : produit cru, cuit, congelé, fermenté, etc.). Procéder à la détermination et à l’enregistrement des paramètres analytiques.

3.3 ENTREPOSAGE DES ÉCHANTILLONS

3.3.1 GÉNÉRALITÉS

Dans des conditions optimales, on doit toujours analyser les échantillons immédiatement, ou dans le plus court délai après leur réception au laboratoire. À moins d’indication contraire, les échantillons d’aliments périssables doivent être analysés dans un délai maximal de 36 heures entre le prélèvement et l’analyse au laboratoire. Si exceptionnellement l'analyse doit être reportée, entreposer les échantillons au congélateur, à la température de la pièce, ou au réfrigérateur, selon la nature de l’échantillon. L'interprétation des résultats devra tenir compte de cette période d’entreposage.

Pour les Campylobacters thermotolérants et les bactéries anaérobies strictes, ainsi que pour tout autre microorganisme dont la survie est susceptible d'être fortement



compromise par des conditions d'entreposage prolongées ou par une congélation, l'analyse doit être effectuée le plus rapidement possible.

Les produits non périssables, les conserves ou les aliments secs doivent être conservés à la température de la pièce. Les aliments reçus congelés au laboratoire doivent être entreposés congelés jusqu'au moment de l'analyse.

Pour la réalisation des prélèvements, les échantillons doivent être sortis du réfrigérateur pendant un maximum de 15 minutes à la température de la pièce. Lorsque le prélèvement est terminé, les échantillons sont immédiatement réfrigérés. Par la suite, ils sont conservés pendant une période à déterminer en fonction des besoins. Les échantillons doivent toujours être classés et conservés dans un endroit propre et à l'abri de toute contamination extérieure.

3.4 DÉCONGÉLATION DES ÉCHANTILLONS

Les échantillons sont décongelés au réfrigérateur jusqu’au lendemain.

4. PRÉLÈVEMENT ET PESÉE

4.1 DÉFINITIONS

ÉCHANTILLON : Quantité de produit prélevé d’un lot et soumis à des analyses en laboratoire. Un échantillon peut consister en une ou plusieurs unités d’échantillonnage.

UNITÉ D’ÉCHANTILLONNAGE : Portion ou contenant individuel de produit prélevé au hasard dans un lot. Une unité d’échantillonnage peut correspondre à un échantillon.

UNITÉ D’ANALYSE : La quantité de produit prélevée de l’unité d’échantillonnage pour analyse.

UNITÉ COMPOSITE : Regroupement des unités d’analyse ou d’échantillonnage pour l’analyse.

4.2 MESURES D’HYGIÈNE ET DE SALUBRITÉ

La salle de prélèvement (murs et planchers) doit être propre en tout temps. Les surfaces de travail doivent être lavées et désinfectées à l'aide d'un détergent germicide. Des contrôles de la qualité de l'air et des surfaces de travail doivent être effectués régulièrement.

Les manipulations doivent être effectuées de façon aseptique afin d’éviter la contamination des produits étudiés. La propreté des mains et des ongles est primordiale et le personnel n'oubliera pas que les vêtements, les cheveux, les mains et l'air expiré contiennent ou supportent toujours des microorganismes.



Le prélèvement comprend la pesée et l’ajout du diluant. L’enceinte de sécurité biologique (ESB) doit être utilisée pour les échantillons nécessitant une asepsie plus rigoureuse, un environnement stérile - comme dans le cas d’une conserve - ou lorsque le prélèvement est susceptible de produire des aérosols infectieux, des concentrations élevées ou de grands volumes de matières infectieuses, comme c’est le cas avec le lait cru, la moulée, un essai d’aptitude, un aliment déshydraté ou en poudre, etc.

Les instruments utilisés pour le prélèvement doivent toujours être stériles et ne servir que pour un seul échantillon. Ils doivent être nettoyés et stérilisés à nouveau avant chaque utilisation. Certains instruments (pince, ciseau, etc.) peuvent être stérilisés par flambage à l’alcool 95%.

4.3 PRISE DE L'UNITÉ D'ANALYSE ET PESÉE

4.3.1 TOUS LES ALIMENTS

Toute observation anormale constatée lors du prélèvement d’un échantillon (exemples : mauvaise odeur, couleur anormale, présence de moisissures, etc.) doit être signalée à un professionnel.

Pour chaque pesée, les informations suivantes doivent être enregistrées : le numéro de l’échantillon, le nom du technicien qui prélève, la date et l’heure du prélèvement, la quantité d’échantillon prélevée, le nom et le numéro de lot du diluant utilisé, la quantité de diluant utilisée, le poids total de l’échantillon avec le diluant, le facteur de dilution et l’identification de l’appareil à dilution automatique utilisé.

L'extérieur des contenants des échantillons doit toujours être propre avant le prélèvement. Si nécessaire, nettoyer et désinfecter avec de l’alcool 70 %.

Peser environ 25 g de l'échantillon (au minimum 10 g) dans un sac stérile de polyéthylène préalablement taré. Il est important de prélever à 4 ou 5 endroits dans l'échantillon afin d'obtenir un échantillonnage représentatif. Lorsque la quantité d'aliment prélevée diffère de 25 g, la raison doit être enregistrée et un professionnel doit être avisé, sauf pour le prélèvement des épices et assaisonnements pour lesquels l’unité d’analyse est toujours réalisée à partir d’une pesée de dix grammes.

Si l’échantillon est composé de plusieurs éléments, chaque élément sera prélevé dans une proportion sensiblement équivalente à celle qu'il représente; l'unité d'analyse devra comporter des prélèvements en surface et en profondeur, dans les mêmes proportions que dans l'aliment, sauf lors de spécifications particulières.

L’analyse de certaines portions de l’échantillon peut être réalisée séparément, à la demande du professionnel (exemple : analyser seulement la garniture d’un gâteau).

Si la totalité de l'échantillon est de moins de 25 g, peser l'échantillon au complet et additionner le diluant requis jusqu’à l’obtention d’une dilution 10-1. Le volume total de liquide doit couvrir l'échantillon.



4.3.2 ALIMENTS LIQUIDES OU SEMI-LIQUIDES

Mélanger jusqu’à homogénéisation complète et prélever 25 g.

4.3.3 REGROUPEMENT DES UNITÉS D’ANALYSE POUR LA RECHERCHE DE BACTÉRIES

PATHOGÈNES

La recherche de bactéries pathogènes telles que Salmonella, Listeria monocytogenes, etc. peut être faite sur une unité composite, c’est-à-dire le regroupement de deux unités d’analyse. Éviter de regrouper des échantillons relatifs aux toxi-infections, aux plaintes de consommateurs et aux saisies.

Protocoles :

Ne regrouper que des produits de composition et de caractéristiques physico-chimiques similaires (Exemple : pH). Respecter les numéros de lots s'il y a lieu.

Peser 25 g de chacun des 2 échantillons dans un même sac à homogénéisateur de type péristaltique. Ajouter environ 225 ml du diluant approprié et homogénéiser les 2 prélèvements ensemble. Par la suite, compléter à environ 500 g avec le diluant et homogénéiser manuellement. Incuber et poursuivre l’analyse.

Si le résultat s'avère positif, il peut être nécessaire de reprendre l'analyse des 2 échantillons séparément ou de refaire prélever par le client.

4.3.4 VIANDES EN BLOC

Prélever le premier centimètre de surface à 4 ou 5 endroits à l'aide d'un instrument stérile.

4.3.5 POISSON ENTIER CRU

Enlever la peau à l'aide d'instruments stériles et prélever le premier centimètre de surface à 4 ou 5 endroits.

4.3.6 MOLLUSQUES CRUS

- Trier et écarter les coquillages morts ou ayant la carapace abîmée. Les mollusques vivants se ferment complètement et rapidement avec une pression. Dans le cas contraire, ils ne doivent pas être utilisés pour l’analyse.

- Les coquilles des mollusques doivent être lavées et brossées à l'eau potable courante, principalement au niveau de la zone d’ouverture. Éviter de rincer l’intérieur des coquilles.

- Égoutter les mollusques propres et assécher avec un papier absorbant.

- Utiliser des instruments stériles pour ouvrir les coquilles. Récupérer le liquide et détacher la chair avec un couteau et des pinces en évitant toute contamination par l’extérieur de la coquille.

- S’il y a présence de byssus, le couper avec un ciseau stérile (flambé à l’alcool) avant ouverture, mais ne pas l’arracher.

- L’analyse des mollusques prend en compte la chair et l’eau intervalvaire.

- Regrouper plusieurs mollusques pour constituer l’unité d’analyse (5 à 7 au minimum).



- Les mollusques doivent être homogénéisés manuellement deux minutes pour éviter de perforer le sac de prélèvement.

4.3.7 CRUSTACÉS NON DÉCORTIQUÉS CRUS OU CUITS

Les crustacés tels que le homard et le crabe sont décortiqués avec des instruments stériles et la chair est prélevée à 4 ou 5 endroits de l'échantillon (pinces, abdomen, pattes, etc.).

Les petites crevettes sont décortiquées et la chair est prélevée. Plusieurs crevettes constituent alors l’unité d’analyse.

4.3.8 VOLAILLE CRUE AVEC PEAU

En général, prélever une proportion de peau avec les premiers centimètres du muscle, à 4 ou 5 endroits sur la coupe de volaille.

4.3.9 ŒUFS

4.3.9.1 Procédure de prélèvement pour la recherche des salmonelles sur la coquille et à l'intérieur des œufs

Grouper 4 à 6 œufs par échantillon. Ceux-ci ne doivent présenter aucune craquelure.

4.3.9.1.1 EXTÉRIEUR

Manipuler les œufs l'aide d'une pince stérile. Déposer délicatement les œufs dans un sac stérile contenant 225 ml d'eau peptonée tamponnée. Laver les coquilles avec le diluant, retirer les œufs un à un et les déposer dans un contenant d'alcool 70 %.

Incuber l'eau peptonée tamponnée selon le protocole de la méthode d’analyse utilisée.

4.3.9.1.2 INTÉRIEUR

Les 4 à 6 œufs préparés selon la méthode précédente (4.3.9.1.1) sont immédiatement retirés du bain d'alcool 70 % et déposés sur un papier absorbant pour enlever l'excès d'alcool. Ne pas laisser tremper les œufs dans l’alcool. Par la suite, lorsque l’alcool est évaporé, les œufs sont cassés dans un sac stérile. Le technicien doit porter une nouvelle paire de gants pour prélever un nouvel échantillon (composé de 4 à 6 œufs).

Bien mélanger les œufs avec l’homogénéisateur de type péristaltique pendant environ 15 secondes. Pour un échantillon composé de 4 à 6 œufs, prélever 50 g du mélange et ajouter environ 200 ml d’eau peptonée tamponnée préchauffée à 35°C. Agiter avec l’homogénéisateur de type péristaltique pendant un minimum de 30 secondes, compléter à environ 500 g avec le diluant afin d’obtenir une dilution 10-1 et agiter manuellement.



4.3.9.2 Procédure de prélèvement pour l’analyse de l’intérieur de l’œuf seulement

Laver les œufs à l'eau et au savon germicide. Mettre les œufs dans l’alcool 70 % et les retirer immédiatement pour les déposer sur un papier absorbant pour enlever l'excès d'alcool. Lorsque l’alcool est évaporé, poursuivre le prélèvement tel qu’indiqué précédemment (section 4.3.9.1.2).

4.3.10 LAITS EN POUDRE

Mélanger soigneusement le contenu du récipient fermé en le secouant de façon répétée. L’échantillon (pesée et ajout du diluant) doit être prélevé dans une ESB. Laisser tremper l’échantillon dans le diluant 30 minutes à température de la pièce avant d'homogénéiser, afin de revivifier les cellules microbiennes endommagées.

4.3.11 PRODUITS CHAMBRÉS

Les produits chambrés doivent être entreposés à la température de la pièce jusqu’au moment de l’analyse. Les diluants utilisés pour les produits chambrés doivent également être à la température de la pièce.

4.3.12 PRODUITS GRAS (BEURRE, MARGARINE, SAINDOUX, ETC.) ET FROMAGES GRAS

Utiliser un diluant contenant du citrate de sodium 2 % comme dispersant pour le prélèvement des fromages gras et des produits gras tels le beurre, la margarine, le saindoux, etc. Le diluant doit être préalablement chauffé à 45 oC pour permettre une émulsion complète du gras avant l'homogénéisation. Homogénéiser et prélever dans la phase aqueuse en évitant de prélever du gras.

Lorsqu’elle est consommée, la croûte des fromages doit être prélevée en fonction de la proportion qu’elle représente.

4.3.13 PRODUITS SECS DÉSHYDRATÉS (ÉPICES, CÉRÉALES, LÉGUMINEUSES SÈCHES, RIZ

SEC, ETC.)

Mélanger soigneusement l’échantillon de produits secs avec un ustensile stérile avant de prélever. Un pré-trempage dans le diluant de 30 minutes à température de la pièce est nécessaire avant d'homogénéiser, afin de revivifier les cellules microbiennes endommagées

Pour connaître le bouillon non–sélectif approprié à la recherche de Salmonella spp., se référer au Tableau 1 de la méthode MFHPB-20 de Santé Canada (Isolement et identifications des salmonella dans les aliments et les échantillons environnementaux). Par exemple, le bouillon trypticase renfermant 0,5 % de K2SO3

doit être utilisé pour les oignons et l’ail, tandis que les produits laitiers (à l’exception des fromages) doivent être dilués avec une solution aqueuse de vert brillant.

Pour la recherche de Salmonella spp. ou autre pathogène nécessitant une étape de pré-enrichissement, des rapports de dilution (poids/volume) entre les épices ou assaisonnements et le bouillon d’enrichissement sont recommandés (autre que



10-1). Certaines épices sont bactéricides ou bactériostatiques, c’est pourquoi une dilution supérieure est nécessaire. Pour connaître les rapports recommandés entre les épices et assaisonnements et le bouillon de pré-enrichissement, se référer au Tableau III de la méthode MFHPB-20.

4.3.14 PROCÉDURE DE PRÉLÈVEMENT POUR LA RECHERCHE DE SALMONELLES DANS LES

GRAINES GERMÉES (LUZERNE, RADIS, ETC.)

Peser de façon stérile 125 g de graines dans un contenant stérile (par exemple, un sac à homogénéisateur péristaltique inséré dans un bécher) et ajouter de l'eau déminéralisée stérile jusqu'à ce que le niveau dépasse les graines. Recouvrir de façon stérile et incuber à 30 °C pendant trois jours.

Le premier volume d'eau ajouté sera absorbé rapidement. Après environ deux heures, ajouter encore de l'eau pour rétablir le niveau et continuer de surveiller le niveau d'eau pendant le reste de la période d'incubation. Ajouter de l’eau déminéralisée stérile au besoin.

Le processus de germination devrait débuter après trois jours d'incubation, selon la variété de graines: les enveloppes devraient avoir éclaté et une certaine germination devrait être apparente. Peser de façon stérile 25 g du mélange de graines germées et d'eau et ajouter 225 mL de diluant. Incuber de 18 à 24 heures à 35 °C. Poursuivre l’analyse selon la méthode MFHPB-20, à partir de l’étape de l’enrichissement en milieu sélectif.

4.3.15 PRODUITS TRÈS SALÉS (5 %)

Pour le dénombrement de la microflore générale (bactéries, levures et moisissures), le diluant utilisé doit contenir 5 % de NaCl. Utiliser ce diluant pour la suspension mère et les dilutions décimales subséquentes.

4.3.16 PRODUITS TRÈS SUCRÉS (MIEL, SUCRERIES, SIROP D’ÉRABLE, ETC.)

Pour la recherche d’une microflore générale (bactéries, levures et moisissures), lorsqu’un aliment renferme plus de 25 % de sucre, utiliser un diluant à 40 % de sucre (exemple : peptone sel + 40 % dextrose) afin d’éviter la perte des cellules osmophiles. Utiliser ce diluant pour la suspension mère et les dilutions décimales subséquentes. Le milieu de culture devra aussi contenir 40 % de sucre (exemple : Sabouraud dextrose agar 40%).

4.3.17 CONSERVES

Se référer à la méthode LEAA-M-MIC-020.

4.3.18 PROCÉDURE POUR LA RECHERCHE DES BACTÉRIES PATHOGÈNES À LA SURFACE DES

FRUITS FRAIS ENTIERS (CANTALOUPS, MELONS, ETC.)

Déposer l’échantillon en entier dans un sac stérile. Le diluant est déterminé selon la méthode utilisée et est préchauffé à la température d’incubation de l’échantillon.



Recouvrir entièrement l’échantillon avec le diluant et incuber à la température demandée par la méthode d’analyse.

4.3.19 ÉCOUVILLONS

4.3.19.1 Écouvillon reçu dans un tube contenant 10 ml de tampon neutralisant :

À la réception de l’échantillon, il est considéré que la dilution est 10-1. Ce tube est utilisé pour la préparation des dilutions décimales subséquentes.

4.3.19.2 Écouvillon reçu dans un tube contenant moins de 1 ml de tampon neutralisant:

À la réception de l’échantillon, il est considéré qu’il n’y a pas de facteur de dilution. Procédure :

1. À partir d’un tube 9 ml de peptone-sel, mettre 1 ml de diluant dans le tube contenant l’écouvillon;

2. Mélanger le tube au vortex;

3. Remettre tout le liquide dans le même tube de départ de 9 ml;

4. Toujours à partir du même tube de départ de 9 ml de peptone-sel, rincer l’écouvillon une deuxième fois en répétant les étapes 1 à 3;

5. Le tube ainsi obtenu correspond à la dilution 10-1;

6. Utiliser ce tube pour la préparation des dilutions décimales subséquentes.

4.3.20 ÉPONGES

Ce type de prélèvement est considéré comme une dilution de 10-1. Le diluant approprié est ajouté jusqu'à l’obtention d’un poids de 100 g (dilution 10-2).

5. DILUANTS

Le choix d’un diluant est fonction du microorganisme recherché et de la méthode d’analyse réalisée. La nature du produit à analyser peut également être un facteur déterminant dans le choix d’un diluant. La méthode d’analyse et les normes spécifiques aux produits servent à choisir le diluant approprié.

5.1 DILUANT D’EMPLOI GÉNÉRAL

Le diluant général « Peptone-Sel » semble le plus approprié pour la majorité des aliments lorsque la recherche de salmonelles n’est pas requise.

5.2 DILUANT À UTILISER POUR LA RECHERCHE DE SALMONELLA SPP.



Le diluant utilisé pour la recherche de Salmonella spp est l’«eau peptonée tamponnée», sauf pour quelques aliments tels les confiseries, produits laitiers, épices et assaisonnements. Le Tableau 1 de la méthode MFHPPB-20 de Santé Canada indique le bouillon non-sélectif approprié au type d’aliment.

5.3 BOUILLONS D’ENRICHISSEMENT INITIAUX

Les bouillons d’enrichissement initiaux doivent toujours être utilisés à la température ambiante (jamais réfrigéré) sauf pour les méthodes d’isolement d’E.coli O157 (le bouillon Doyle doit être préalablement chauffé à 35 °C) et d’isolement de Listeria monocytogenes et autres Listeria spp. (méthode MFHPB-30; le bouillon LEB doit être préalablement chauffé à 30°C).

Lors du regroupement des unités d’échantillonnage et pour les unités d’échantillonnage d’un poids supérieur à 25 g, les bouillons d’enrichissement initiaux doivent être chauffés à la température d’incubation avant de procéder à la dilution des échantillons,

De plus, pour l’analyse des produits gras (beurre, fromage, etc.), le diluant contenant du citrate de sodium 2 % utilisé comme dispersant doit préalablement être chauffé à 45 °C (voir la section 4.3.12).

Les bouillons préchauffés doivent être utilisés dans la journée.

5.4 BOUILLONS D’ENRICHISSEMENT SECONDAIRES

Pour les bouillons d’enrichissement secondaire et pour les unités d’échantillonnage de 25 g ou moins, la température du bouillon doit être à la température ambiante avant de procéder à l’analyse.

6. BROYAGE ET HOMOGÉNÉISATION

Il est suggéré d'utiliser un homogénéisateur de type péristaltique plutôt qu'un mélangeur de type rotatif pour le broyage des échantillons. Une homogénéisation complète de l'aliment n'est pas nécessaire. Les microorganismes seront délogés de l'échantillon par de forts jets de liquide et par écrasement de l'aliment. L'aliment devrait normalement être homogénéisé pour une période de deux minutes. Il est important d’observer l’échantillon après l’homogénéisation pour vérifier l’efficacité du broyage. Dans le cas contraire, l’homogénéisation doit être recommencée.

L'homogénéisateur péristaltique ne doit pas être utilisé pour des produits alimentaires susceptibles d'entraîner des perforations du sac (présence de particules pointues, dures ou sèches) à moins d’utiliser deux sacs stériles ou plus afin d’empêcher la perforation et un débordement possible de l’échantillon. Une homogénéisation manuelle peut également être effectuée.



7. DILUTIONS DES ÉCHANTILLONS

7.1 SUSPENSION MÈRE (PREMIÈRE DILUTION)

7.1.1 DÉFINITION

Suspension, solution ou émulsion obtenue après qu’une quantité pesée (unité d’analyse) du produit à analyser ait été mélangée, avec un homogénéisateur si nécessaire et en observant des précautions appropriées, avec une quantité neuf fois égale de diluant, sauf exception, en laissant se déposer les particules grossières, s’il y en a.

7.1.2 PROCÉDURE

Prélever l’aliment de façon représentative et le peser tel qu’indiqué à la section 4.3. Ajouter une quantité de diluant égale à 9 fois la masse de l’aliment (généralement 25 g d’aliment avec 225 g de diluant). Cette première dilution correspond à la dilution 10-1.

Note 1 : Dans certains cas, il peut être nécessaire d’ajouter davantage de diluant, notamment en présence d’une suspension mère trop visqueuse ou trop épaisse avec la dilution 10-1. L’information doit être consignée et un professionnel doit être avisé afin d’en tenir compte dans la suite des opérations et dans l’expression des résultats.

Note 2 : S’il est souhaitable pour des dénombrements dans certains produits de

descendre au-dessous de ce seuil, il est possible de réaliser une suspension avec une quantité inférieure de diluant. Par exemple, la méthode MFLP-74 de Santé Canada (Dénombrement de Listeria monocytogenes dans les aliments) exige la préparation d’une dilution selon un rapport 1 :5. Par contre, il est convenu que l’ensemencement de cette suspension peut entraîner des difficultés liées au déséquilibre du rapport inoculum/milieu (inhibition de la croissance microbienne par une concentration accrue des composants de l’aliment).

7.2 DILUTIONS DÉCIMALES SUBSÉQUENTES

7.2.1 DÉFINITION

Suspensions ou solutions obtenues en mélangeant un volume déterminé de la suspension mère avec un volume neuf fois égal de diluant, et en répétant cette opération pour chaque dilution préparée, jusqu’à l’obtention d’une gamme de dilutions décimales appropriées pour l’inoculation des milieux de culture.



7.2.2 PROCÉDURE

Transférer à l’aide d’une micropipette 1 ml de la suspension mère dans un tube contenant 9 ml de peptone sel ou du diluant approprié. À l’aide d’un agitateur mécanique, mélanger le tube pendant 5 à 10 secondes afin d’obtenir la dilution 10-2. Si nécessaire, répéter ces opérations pour la dilution 10-2 et les dilutions décimales suivantes afin d’obtenir les dilutions 10-3, 10-4, 10-5, etc., jusqu’à l’obtention d’une gamme de dilutions décimales appropriées.

7.3 MESURE DU PH DES DILUANTS ET DES BOUILLONS D’ENRICHISSEMENT

Bien que cela ait été mentionné dans les versions précédentes de certaines méthodes, l’ajustement du pH du diluant avec la matrice alimentaire avant l’ensemencement n’est pas recommandé pour les méthodes quantitatives, sauf lorsque précisé par le fabricant. Ceci permet au produit d’être évalué tel que présenté au consommateur, empêchant tout biais (positif ou négatif) qui en découlerait si le pH était ajusté avant l’ensemencement.

Pour les méthodes qualitatives, l’ajustement du pH du bouillon d’enrichissement avec la matrice alimentaire doit être réalisé lorsque cela est indiqué dans la méthode utilisée.

7.4 DURÉE DES OPÉRATIONS

Après le broyage ou l'homogénéisation, la suite de l'analyse (les dilutions et l'ensemencement) doit avoir lieu le plus rapidement possible pour éviter une multiplication des microorganismes dans le liquide de dilution enrichi par le produit alimentaire. L’échantillon doit être ensemencé au maximum 10 minutes après la réalisation des dilutions décimales. L'ensemble des manipulations, de la préparation de la suspension mère jusqu'à l'ensemencement sur gélose ou bouillon, doit être effectué dans un délai maximum de 45 minutes.



8. BIBLIOGRAPHIE

LUECHTEFIELD, N.W., WANG, W.-L., BLASER, M.J., & L. RELLER, Evaluation of Transport and Storage Techniques for Isolation of Campylobacter fetus subsp jejuni from Turkey Meat Specimens, J Clin Microbiol. 1981 Mar ;13:438-43 Direction générale de la protection de la santé, Santé-Canada, Compendium de méthodes, volume 1 - MFHPB-20; Isolement et identification des Salmonella dans les aliments. Direction générale de la protection de la santé, Santé-Canada, Compendium de méthodes, volume 1 - Annexe I et supplément à l’annexe I. ISO 6887-1: 1999 -Microbiologie des aliments -- Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique -- Partie 1: Règles générales pour la préparation de la suspension mère et des dilutions décimales. ISO 6887-2: 2003 -Microbiologie des aliments -- Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique -- Partie 2: Règles spécifiques pour la préparation des viandes et produits à base de viande. ISO 6887-3: 2003 -Microbiologie des aliments -- Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique -- Partie 3: Règles spécifiques pour la préparation des produits de la pêche. ISO 6887-4: 2003 -Microbiologie des aliments -- Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique -- Partie 4: Règles spécifiques pour la préparation de produits autres que les produits laitiers, les produits carnés et les produits de la pêche. ISO 6887-4:2003/Amd 1:2011: Microbiologie des aliments -- Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique -- Partie 4: Règles spécifiques pour la préparation de produits autres que les produits laitiers, les produits carnés et les produits de la pêche – AMENDEMENT 1. ISO 6887-5: 2010 -Microbiologie des aliments -- Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique -- Partie 5: Règles spécifiques pour la préparation du lait et des produits laitiers.




9. APPROBATION

François Bigonnesse, Microbiologiste Service de microbiologie

Geneviève Bouchard, chargé qualité Service de microbiologie

Pascal Daigle, chef de service Service de microbiologie

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