Premières Expériences Diagnostiquessur Séquenceur Roche GS Junior

Tonio Lovecchio

Institut de Prestations Communes.

Plateforme de Prestations Communes de Biologie Moléculaire.

Centre de Biologie Pathologie.CHRU de Lille.

Cancéropôle Nord-Ouest Deauville – 16 décembre 2011

•Enjeux de l’intégration

Premières Expériences Diagnostiquessur Séquenceur Roche GS Junior

•Enjeux de l’intégration•Principe du GS Junior Roche

•Les Projets en cours de développement•Conclusions

•Enjeux de l’intégration

Le Centre de Biologie Pathologie de Lille : regroup er les thématiques pour partager les ressources technologiques.

Maladies Rares (hors cancer)

-Retard mental (Dr. J.Andrieux)

-Syndromes malformatifs d’origine génétique (Dr. F.Escande)

-Maladies hémorragiques familiales (Dr. C. Zawadski)

Cancers Familiaux

-Oncogénétique digestive (Drs. M.P. Buisine, J. Leclerc)

-Oncogénétique endocrinienne (Pr P. Pigny, Pr. N. Porchet, Dr. M.F. Odou)

Pharmacogénétique-Maladies héréditaires du métabolisme lipidique (Dr. P. Benlian)

-Maladies neurosensorielles héréditaires (Dr. C.M. Dhaenens, Pr. F. Broly)

-Mucoviscidose et autres maladies inflammatoires héréditaires (Dr. G. Lalau)

-Maladies Neurologiques héréditaires (Pr B. Sablonnière, Drs. I. Vuillaume, S. Schraen, N. Rouaix)

-Arythmies Cardiaques, Cytopathies mitochondriales (Dr. C.M. Dhaenens)

-Maladies héréditaires rares du métabolisme (Drs M. Balduyck, M.F. Odou, Pr. N. Porchet)

Pharmacogénétique

- Génétique moléculaire des accidents thérapeutiques (Pr. F. Broly)

Biologie Moléculaire des Tumeurs

-Tumeurs hématologiques (Pr. C. Preudhomme)

-Tumeurs solides (Drs F. Escande, M.P. Buisine, F. Zerimech, F. Révillon, C. Descarpentries, )

-Pathologie Moléculaire (Pr. M.C. Copin)

HLA-Greffes (Pr. M. Labalette)

Enjeux •Enjeux de l’intégration

De nombreuses thématiques de diagnostic moléculaire 25 Biologistes, 9 Ingénieurs et plus de 60 Technici ens

Maladies Rares Hors Cancer

Cancers Familiaux

Pharmacogénétique Biologie Moléculairedes Tumeurs

HLA-Greffes

P.P.C.B.M

Un Plateau de Prestations communes en Biologie molé culaire regroupantles ressources technologiques en biologie moléculai re.

Enjeux

Une plateforme de Séquençage Capillaire

•Enjeux de l’intégration

Un Plateau de Prestations communes en Biologie molé culaire regroupantLes ressources en biologie moléculaire.

Une plate-forme de PCR Temps réel

Un Pyroséquençeur

Une plate-forme de Robotique

Enjeux�Permettre d’augmenter les débits par rapport au séq uençage classique,

tout en maitrisant les coûts d’analyse .

�Rechercher des variations causales dans des séquenc es

de gène inaccessibles au séquençage classique.

�Rechercher des populations minoritaires.

•Enjeux de l’intégration

�Rechercher des populations minoritaires.

Créer une plate-forme de diagnostic

moléculaire approfondi

Le GS Junior : historique du choix.

Dès l’été 2010 Recherche d’une solution de séquença ge haut débit

Le GS Junior vient de faire son apparition sur le m arché.

Il est présenté comme une adaptation de la technolo gie GS FLEX

à destination des laboratoires de diagnostic.

•Enjeux de l’intégration

Mise en application simplifiéeRessources humaines moindres

Jusqu’à 70 Mb par RunReads d’une moyenne de 400 pb

Le GS Junior arrive en mai 2011

Le Plateau est pleinement opérationnel en septembre 2011

Premières Expériences Diagnostiquessur Séquenceur Roche GS Junior

•Enjeux de l’intégration•Principe du GS Junior Roche

•Les Projets en cours de développement•Conclusions

Préparation de la Librairie

EmPCR(amplification clonale)

•Principe du GS Junior Roche

Préparation de la Librairie

Séquençage

Analyse des données

Origine variable de l’ADN

T

AATT

T

•Principe du GS Junior Roche

LR-PCR

Capture

Amplicons

T

Purification par billes magnétiques

Ligation

Des adaptateursFragmentation

Préparation des Librairies

LIBRAIRIE PRETE POUR L’emPCR

Quantification par fluorométrie, normalisation

AmpliconsContrôle qualité par Bioanalyseur

Amplification par amorces contenant les adaptateurs

Amplicons ~ 500 pb

Adaptateurs = sites de fixation aux billes de captu re

+ site de fixation des amorces de séquencage

+ M.I.D (Barcode d’identification des échantillons)

EmPCR

POINT CRITIQUE : RATIO du nombre de molécules de la librairie / nombre de billes

EmulsionCapture sur billes

•Principe du GS Junior Roche

PCR clonale

Enrichissement

Chargement sur PTP pour séquençageUNE BILLE = 1 CLONE = 1 PUITS

•Principe du GS Junior Roche

Séquençage

Pyroséquençage:

•Circulation (flux) des 4 nucléotides

pendant 200 cycles

•Incorporation de base = génération

d’un signal chemoluminescent

•Traitement du signal détermine la séquence

•Pyrogramme = 1 séquence

•Enjeux de l’intégration

Premières Expériences Diagnostiquessur Séquenceur Roche GS Junior

•Enjeux de l’intégration•Principe du GS Junior Roche

•Les Projets en cours de développement•Conclusions

Les Projets en cours de développement

Projet Amplicons : Evaluation de la technique.

Objectifs : Prise en main de la technique de Sequençage haut dé bit

3 Runs d’essai avec une librairie de quelques ampli cons (n=10) afin de:

-S’approprier la technologie.-Vérifier le matériel et les réactifs-Evaluer le workflow et le logiciel d’analyse.

-Dans cette librairie 6 ADN porteurs chacun d’un SNV ou d’une indel -Dans cette librairie 6 ADN porteurs chacun d’un SNV ou d’une indel dans l’un des amplicons.

Conclusions :

-Nombreuses étapes.Robotique nécessaire dès que le nombre d’amplicons sera important

-100% des SNV testés sont retrouvés, mais…

-Le Logiciel AVA ne détecte pas les indels de petite taille.correctif en cours de test

Projet Amplicons : Evaluation pour analyse de gènesimpliqués dans les tumeurs endocrines familiales.

Objectif: Analyser les séquences codantes et introniques flan quantes dedeux groupes de 3 gènes (pour un panel de 8 patient s pour chaque groupe) :

NEM1 (10 exons)AIP (6 exons)HRPT2 (17 exons)

SDHB (8 exons)SDHC (6 exons)SDHD (4 exons)

Nouveau design d’amorces

Les Projets en cours de développement

Projet 1

Nouveau design d’amorces nécessaire : équilibrer la librairie

Cette libraire nous permettra de tester le workflow robotiqueElle sera optimisée par la suite en fonction de la profondeur atteinte.

408 amplifiats par run, 816 amorces.

Perspectives :

En Pré-PCR : Programmes permettant de conduire les amplification s.

En Post-PCR : Double purification des amplicons .

Projet Amplicons : Evaluation pour analyse de gènesimpliqués dans les tumeurs endocrines familiales.

Les Projets en cours de développement

Projet 1

Double purification des amplicons .Quantification et Normalisation des amplicons.

Mise en place du module REMe pour permettre l’automatisation de l’étape d’enrichissement.

Afin de réduire les coûts, une solution de multiple xagedes amplicons est envisagée.

Partenariat avec une société prestataire de service ?Externaliser le design et la mise au point des étap es de préparationde la librairie amplicon ?

Projet Shotgun: Evaluation pour analyse de gènesimpliqués dans les cancers du côlon familiaux par L R-PCR.

Objectif: Séquencer des gènes dans leur intégralité.

A terme créer des protocoles de préparation de libr airiespour analyser dans un même Run:

MLH1/PMS2

Les Projets en cours de développement

Projet 2

MLH1/PMS2

MSH2/MSH6

APC/MUTYH…

Approche par LR-PCR : amplifier des fragments cheva uchants de grande taille recouvrant l’ensemble du gène.

Alternative aux amplicons ?

Projet Shotgun: Evaluation pour analyse de gènesimpliqués dans les cancers du côlon familiaux par L R-PCR.

Premiers essais sur une librairie recouvrant le gèn e MLH1 :

MLH1EPMAIP1 LRRFIP2

NT_02251736950000 37050000

Les Projets en cours de développement

Projet 2

5 Patients apparentés

Famille dans laquelle a été mise en évidence une hyperméthylation constitutive du promoteur de MLH1

Recherche d’une anomalie pouvant expliquer l’origine de cette hyperméthylation.

11 kb

Les Projets en cours de développement

Résultats :

Ratio du nombre de molécules / billes : 0.7 trop fa ible

~ 56000 séquençes ont passé les filtres soit 24 Mb de données disponibles.

Déséquilibre dans le nombre de séquences disponible s pour chaque patient :

Patient 1 : 12163 séquences Patient 2 : 18048Patient 3 : 11870

Projet 2

Patient 3 : 11870Patient 4 : 1784Patient 5 : 11620

Couverture et profondeurs inégales sur l’ensemble d e l’étude : Certaines avec peu de profondeur (20x) Certaines plus couvertes (jusqu’à 300x)

En partie à cause du chevauchement !

Réévaluer la quantité de chaque produit de long ran ge pour assurer une couverture suffisante et uniforme

Projet Capture : Evaluation pour l’applicationau diagnostic du retard mental.

Screening de gènes décrits comme associés au retar d mental chez des patients :- Sans anomalies de caryotype- Sans anomalies en CGH-Array

Objectif: Séquencer des régions non contigües réparties sur tous les chromosomes:

Les Projets en cours de développement

Projet 3

• 117 Gènes dans la première version d’évaluation de la technique (Soit 1975 exons répartis sur l’ensemble du génome)

• comparer les différentes solutions de capture (coût , efficacité…)

• évaluer la couverture de la zone capturée• multiplexer les patients (rentabilité)

Choix technologique testé : Capture en milieu liquide NimbleGen

+• Design réalisé par le fournisseur (gain de temps)

• Prise en main facile de la technique

Projet Capture : Evaluation pour l’applicationau diagnostic du retard mental.

Les Projets en cours de développement

Projet 3

-• capture = Workflow assez long (mini 1 semaine)

• Taux de couverture parait faible (seulement 15x en moyenne)

• Analyse compliquée avec les outils et connaissances actuelles.

• Peu d’équipements supplémentaires requis

• Bon rendement / junior (>50 MB)

•Enjeux de l’intégration

Premières Expériences Diagnostiquessur Séquenceur Roche GS Junior

•Enjeux de l’intégration•Principe du GS Junior Roche

•Les Projets en cours de développement•Conclusions

•Conclusions

Représente un défi pour l’adaptation au diagnostic :

Permettra d’augmenter les débitsOptimisation permettra aussi de diminuer les coûts.

Devrait permettre la détection d’événements supplém entaires par rapport au séquençage classique

Workflow différent de celui du séquençage Sanger, N’en est qu’au début de son optimisation .

Analyse des résultats plus difficile : Outil informatique remplace la visualisation des él ectrophérogrammes

Nécessité d’avoir confiance en cet outil : -Bioinformaticien-Plusieurs logiciels pour combler les défauts (algor ithmes différentspour les alignements, la détection des SNP, des ind els…)

•Remerciements

Le Centre Régional Hospitalier Universitaire de Lil le

Le Cancéropôle Nord Ouest

Les Prs. N. Porchet, P. Pigny, C. Preudhomme, Les Drs M.P Buisine, M.F Odou, J. Leclerc.

Les Ingénieurs impliqués dans le Projet :C. GrutzmacherS. GeffroyC. ThuillierM. Crepin

La société Roche