Prélèvements d'environnement dans les établissements de santé ...

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Prélèvements d'environnement dans les établissementsde santé : Modes opératoires

Juin 2001


AVANT PROPOS

Malgré l’absence d’indicateur permettant de mesurer le rôle de l’environnement hospitalier dans lasurvenue des infections nosocomiales, il est établi que la biocontamination à l’hôpital constitue unrisque majeur pour les patients fragilisés ainsi que pour certains lieux où sont pratiqués des soins ouactes invasifs. La maîtrise de cette contamination dont dépend la sécurité des patients a donc étéélevée au rang de « vigilance environnementale ».

Nous assistons depuis quelques années à une montée en charge de la réglementation dans ce domaine,néanmoins les textes officiels et les recommandations restent souvent imprécis et il demeuredifficile de proposer des normes. Le guide des 100 recommandations pour la surveillance et laprévention des infections nosocomiales (CTIN 1999) rappelle que l’hygiène de l’environnementhospitalier s’inscrit dans un cadre préventif et qu’elle se place sous la responsabilité du CLIN del’établissement.

Ce guide régionalement sous l’égide de l’ARECLIN s’appuie sur une recherche bibliographique et surl’expérience acquise par des microbiologistes et des hygiénistes hospitaliers, il se propose d’apporterune aide méthodologique destinée aux établissements de soins pour la surveillance environnementale.

Gilles BEAUCAIRE Christian CATTOEN Thierry LEVENT


SOMMAIRE

Introduction…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..1Objet Champ d'applicationLe groupe de travail

1° Le contrôle microbiologique des surfacesFiche Technique n° 1 : contrôle microbiologique des surfaces………………………………………………..2-3

2° Le contrôle microbiologique du lingeFiche Technique n° 2 : contrôle microbiologique du linge……………………………………………… …..4-5Plan d’échantillonage : proposition d’une fiche type ………………………………………………………. ……….6

3° Le contrôle microbiologique de l'eauEaux et usages : typologie…………………………………………………………………………………………………………………7Fiche Technique n° 3 : contrôle microbiologique de l'eau non filtrée……………………………………..8-9Fiche Technique n° 4 : contrôle microbiologique de l'eau filtrée……………………………….…………….10-11Fiche Technique n° 5 : contrôle microbiologique de la désinfection des endoscopes …….12-13Fiche Technique n° 6 : contrôle microbiologique de l'eau des piscines de rééducation …….14-15Fiche Technique n° 7 : recherche de Legionella dans une eau ………………………………………………….16-17

Fiche Technique n° 8 : contrôle microbiologique des eaux d'hémodialyse……………………………… 18-19 Fiche technique n° 9 : contrôle microbiologique pour la pratique de l’hémo(dia) filtration 20-21

4° Le contrôle microbiologique de l’airFiche technique n°10 : Le contrôle microbiologique de l’air …………………………………….. ……………. 22-23Fiche technique n°11 : risque aspergillaire – surveillance de l’environnement ……………………….24-25-26

5° LexiqueGlossaire des milieux de culture utilisés dans les modes opératoires……………………………………..27-28-29

6° Annexe 1 : les germes de l’hospitalisme 30Annexe 2 : Recherche d’une Legionella dans une eau selon la norme NFT 90-431 :

le mode opératoire 31


1° Introduction

Un groupe de travail de microbiologistes issus du réseau des microbiologistes de l'ARECLIN(Association Régionale des CLIN du Nord Pas de Calais) en partenariat avec l'Institut Pasteur de Lillea réfléchi sur la gestion et la maîtrise du risque infectieux lié à la biocontamination del'environnement dans les établissements de santé.Ce groupe a établi une liste de protocoles sous forme de fiches techniques relatives à la surveillancemicrobiologique de l'environnement hospitalier.Un des objectifs est de proposer une standardisation des techniques de prélèvement et d'analyses,rendant possible l'interprétation des résultats de chaque établissement au sein d'un observatoirerégional d'hygiène hospitalière.

2° Objet :

Chaque protocole précise les modalités de prélèvement, les aspects méthodologiques et les critèresd'interprétation.Le prélèvement est effectué hors présence humaine, si possible.Chaque protocole sera actualisé régulièrement, en fonction de l'évolution du cadre réglementaire etdes éventuelles réflexions du réseau des microbiologistes.

3° Champ d'application :

Le protocole est à appliquer par toute personne impliquée dans la surveillance microbiologique del'environnement hospitalier.

4° Circuit de diffusion :

• Microbiologistes• Médecins hygiènistes• Infirmier(e)s hygiènistes• Techniciens de laboratoire• Président du CLIN• ARIH (Association Régionale des Infirmières Hygiénistes)• ARECLIN Pharmacien

5° Groupe de travail

Laurence BOUILLETMichèle CAILLAUXSylvie HENDRICXChristiane KREMBELThierry LEVENTFrançoise MARSYBetty MORINJean Gabriel PAULDominique TRIVIERAnne VACHEE

Biologiste - CH de VALENCIENNESBiologiste - CH de TOURCOINGBiologiste - CH de DOUAIMédecin Hygièniste - ULIN CHRU de LILLE et Institut Pasteur de LilleMédecin Hygièniste - CH de MAUBEUGEInstitut Pasteur de LILLEInstitut Pasteur de LILLEBiologiste - CH de BOULOGNE SUR MERMédecin Hygièniste - CH de LENS et Groupe AHNACBiologiste - CH de ROUBAIX

Avec la participation de : Sylvie MEMBRE Pharmacien - CH de DUNKERQUE Colette SAVAGE, Biologiste, CHRU de LILLE Catherine COIGNARD, Biologiste, CH de Tourcoing Edith MAZARS, Biologiste, CH de Valenciennes

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CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DES SURFACES

N° de Fiche :1Version :1Date : Juin 2001Pagination :1/2

1° Objet :

Quantifier voire qualifier la flore microbienne pour une surface donnée.


Surfaces des zones à risque (risque 4 éventuellement 3, hors activité ou en activité) Surfaces des autres zones, en situation épidémique ou en situation particulière

3° Prélèvements :

Le plan d'échantillonnage

Etablir une liste des points critiques (points les plus salissables, les plus manipulés, les plus proches du patient)

A titre indicatif, 8 points pour une salle de bloc opératoire, 5 points pour une chambre

La fréquence Zone à haut risque : 4 fois par an Autre zone : fréquence à discuter

Les modalités

Préciser le secteur, le local, la date et l'heure du prélèvement ainsi que lenom du préleveur.Indiquer s'il s'agit d'un secteur en activité ou non, la date et l'heure dunettoyage, le type de nettoyage (courant ou après sortie) et le type deproduit utilisé.

Le matériel

gélose contact contenant 4 neutralisants (Lecithine, Polysorbate, Thiosulfate de sodium, L-Histidine).

Applicateur ou poids de 500 grammes Ecouvillon stérile humidifié

Le mode de prélèvement

Par contact : A l'aide de Gélose contact maintenue sous une pression de

500 grammes pendant 10 secondes (à l'aide d'un applicateur ou d'un poids de 500 grammes)

Après avoir réalisé le prélèvement, ne pas oublier de nettoyer la surface afin d'éliminer les traces de géloses résiduellesIndirect (écouvillon) :

non recommandé si on peut utiliser la méthode précédente. Cette technique est réservée aux petites surfaces ne permettant pas l’utilisation de gélose contact ou les surfaces absorbantes ou irrégulières

écouvillonner approximativement 10 cm2.

Dans les deux cas, transmettre les prélèvements au laboratoire dans lesmeilleurs délais.

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4° Le mode opératoire :

Celui-ci consiste à rechercher les germes de l'hospitalisme et à dénombrer la flore totale selon latechnique suivante :

5° La restitution des résultats et leur interprétation :

5.1 La restitution des résultats :

Rendre les résultats en UFC/16cm2. Si plus de 100 colonies ont été comptabilisées, rendre le résultatsous l'intitulé suivant : > 100 UFC/16 cm2. Rendre l'identification des germes de l'hospitalismeaccompagnée d'une appréciation semi quantitative.

5.2 Interprétation :

L'interprétation de la bio-contamination des surfaces doit être réalisée au regard des valeursindicatives définies dans le tableau ci-dessous [1] :

Hors activité : bio-contamination des surfaces après nettoyage et désinfection : valeurs indicativesSecteurs 1 2 3 4Surfaces < 5 UFC /cm2 < 2 UFC/cm2 < 0,2 UFC/cm2 < 0,2 UFC/cm2

Alors que les modes opératoires, des prélèvements en activité sont les mêmes qu’hors activité, lescritères d’interprétation restent à définir.

Annexe : proposition de sectorisationSecteur 1 Risques minimes :

Maison de retraite, bureau …Secteur 2 Risques moyens :

maternité, psychiatrie, service de long et moyen séjour, consultation externe…

Secteur 3

Risques sévères : Pédiatrie, soins intensifs, urgences, salles de travail, médecine, radiologie, hémodialyse, réanimation, exploration fonctionnelle, hématologie, chimiothérapie, bloc opératoire septique et obstétrical, stérilisation centrale, salles d'eau, toilettes, cuisines, biberonnerie…

Secteur 4Très haut risques : Néonatologie, bloc opératoire aseptique, service de brûlés, immunodéprimés, service de greffe, chimiothérapie, oncologie, onco-hématologie…

Bibliographie :

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Les boîtes de contact sont ensemencées sur site. Si l'on utilise des écouvillons, les décharger dans 1 ml d'une solution neutralisante

contenant au moins 3 des 4 inhibiteurs cités dans le tableau ci-dessus. Ensemencer 0,1 ml sur une gélose d'un milieu équivalent à celui de la boîte de contact (PCA, TCS ou TS…).

Incuber 24 h à 37°C et relever la présence ou l'absence de germe de l'hospitalisme. Incuber à nouveau 2 jours à température ambiante de façon à dénombrer la flore totale.

Dénombrer le nombre total de colonies sur les 16 cm2 centraux de la boîte de contact. Pour les écouvillons, dénombrer le nombre total de colonies et le ramener en densité

pour 16cm2. Identifier les germes de l'hospitalisme par les méthodes standards.

[1] Bio-décontamination des surfaces après nettoyage et désinfection. Guide du bio-nettoyage n°5670.[2] Décontamination, bio-nettoyage, désinfection, stérilisation. Guide pratique 2e édition. Editions hospitalières 1995.[3] Contrôles de l’environnement dans les zones à haut et très haut risque infectieux. ASPEC juin 1999


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DU LINGE(articles textiles traités en blanchisserie)

N° de Fiche :2Version :1Date : juin 2001Pagination :1/2

1° Objet :

Quantifier voire qualifier la flore microbienne pour une unité de surface donnée d'un article textile.


En blanchisserie, en secteur de finition au niveau de l’expédition Dans les services, pendant l'activité.



Exemples : Les articles textiles compris dans le plan d'échantillonnage sont les suivants :

• Grand plat : draps….• Petit plat : alèses, champs opératoires, torchons…..• Linge en forme : tenues personnelles, tenues cuisines,

Tenues de bloc• Linge séché : éponges, linge personnel, couches,

couvertures…. La proportion d'échantillons de chacune des quatre

Catégories citées est fonction de la proportion de chacune d'elle traitée en blanchisserie (en %). Associer au plus petit pourcentage le prélèvement de deux boites.

Associer un facteur de multiplication 2 pour le linge souillé et pour le linge fragile lavé à basse température ( < 60°)Un exemple d’un plan d’échantillonnage vous est proposé dans le tableau 1,page 6.

La fréquence Elle est fonction du niveau de maîtrise des process et des bonnes pratiquesd'hygiène en blanchisserie.

Les modalités

Préciser le type d'article textile concerné, la date et l'heure du prélèvement, le nom du préleveur.

Utiliser de préférence 2 boîtes par article textile, et Prélever sur la surface externe du linge.

Le matériel

Boîte de contact contenant 4 neutralisants (Lecithine, Polysorbate, Thiosulfate de sodium, L-Histidine).

Applicateur ou poids de 500 grammes


A l'aide de la boîte de contact maintenue sous une pression de 500 grammes pendant 10 secondes (à l'aide d'un applicateur ou d'un poids de 500 grammes).

Tout linge analysé doit être relavé.Transmettre les prélèvements au laboratoire dans les meilleurs délais

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4° Mode opératoire

Celui-ci consiste à rechercher les germes de l'hospitalisme et à réaliser un dénombrement de la floretotale selon la procédure définie ci-dessous :

5° La restitution des résultats et leur interprétation

5.1 La restitution des résultats

Rendre les résultats en UFC par 16 cm2. Si plus de 100 colonies ont été comptabilisées, rendre lerésultat sous l'intitulé suivant : > 100 UFC/16 cm2.Rendre l'identification des germes de l'hospitalisme accompagnée d'une appréciation semi-quantitative.

5.2 Interprétation

En fin de traitement, et immédiatement avant expédition : < 8 UFC /16 cm2

Cette valeur doit être préservée jusqu’à utilisation (notamment dans les services à haut risque).

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Incuber 24 h à 37°C, relever la présence ou l'absence de germes de l'hospitalisme, puis incuber à nouveau 2 jours à température ambiante de façon à dénombrer la flore totale.

Dénombrer le nombre total de colonies sur les 16 cm2 centraux de la boîte contact. Identifier les germes de l'hospitalisme par les méthodes standards.


Proposition d’une fiche de contrôle microbiologique des articles textiles

Plan d’échantillonnage

Articles % Nombre dePvts

Linge souillé(excrétats)

Linge fragileLavage < 60°C

Total

Grand plat

DrapsPetit platAlésesChamps opératoiresTorchonsLinge en formeTenues personnelTenues cuisineTenues de blocLinge séchéEpongesLinge personnelCouchesCouverturesTOTAL

Aide au remplissage de la fiche considérer la répartition des articles textiles associer au plus petit pourcentage le prélèvement de 2 boites ajuster approximativement le nombre de prélèvements des autres articles au prorata du

nombre d’articles associer un facteur de multiplication 2 pour le linge souillé associer un facteur de multiplication 2 pour le linge fragile lavé à basse température

Exemple de contrôles microbiologiques des articles textiles

Articles %Nbre deboites

Linge souilléx 2

Linge fragileX 2

Total

Grand plat 37 20 20Petit plat 8 4 8 8

(alèses, torchons)Linge en forme 10.7 6 6Linge séché 20

Eponges 5 2 2Linge personnel 11 6 12 24 24

Couches 3.2 2 2Couvertures 4.2 2 4 4

TOTAL 66

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EAUX ET USAGES : TYPOLOGIE

Typologie Utilisation Dénomination

Eaux potables

Eaux destinées àl'alimentation humainerépondant aux normesen vigueur

Eau du réseau d'adduction Eau embouteillée Eau des fontaines réfrigérées

Eauxbactériologiquement

maitrisées

Eaux destinées auxsoins

Eau "propre" Eau "ultra propre"

Eaux stérilesconditionnées

Eaux exemptes demicro-organismesvivants, répondant auxnormes de lapharmacopée

Eau purifiée stérile Eau stérilisée pour préparation injectable

Autres eaux à usage de soins

Eau pour hémodialyse Eau des piscines de rééducation ou de

balnéothérapie

Les eaux techniques Eau chaude sanitaire Eau de la climatisation Eau pour la production de la glace

Bibliographie

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[1] L'eau dans les établissements de Santé COTEREHOS. DRASS Rhône Alpes mars 1995.


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L'EAU NONFILTREE AUX POINTS D’EAU

N° de Fiche : 3Version : 1Date : juin 2001Pagination :1/2

1° Objet :

Quantifier voire qualifier la flore microbienne dans l'eau délivrée par le point d’eau.Cette eau doit respecter les critères microbiologiques de l’eau d’adduction publique dans le cadre d’unusage courant et ne pas contenir de germes de l’hospitalisme.


Point d'eau des salles de soins et des postes infirmiers des unités de soins, ainsi que les chambresdes patients. Consultations externes, points de lavage des mains, biberonneries…


Le plan d'échantillonnageet la fréquence

Etablir un plan d'échantillonnage représentatif des points d'eau non filtrée du réseau de l'établissement.

Intervenir au moins une fois par an dans les unités suivantes : chirurgie viscérale, traumatologie, urologie, pneumologie, néonatologie, réanimation et soins intensifs …

Réaliser en outre un écouvillonnage des siphons et des robinets une fois par trimestre. Ces prélèvements sont des indicateurs de la contamination par les germes de l’hospitalisme

Les modalités Préciser le secteur, le local, la date et l'heure du prélèvement ainsi que lenom du préleveur.

Le matériel Flacon stérile contenant du thiosulfate de sodium (10 à 50 mg/ 500 ml)


Siphons et robinets (indicateur de la contamination par les germes del’hospitalisme) : Utiliser un écouvillon sec.Eau non filtrée (vérification de l’eau du réseau) :

Détartrer la robinetterie par grattage et désinfection de Celle-ci à l'aide d'une compresse imbibée d'alcool à 95° ou d'eau de Javel ou d'un détergent désinfectant. Le temps de désinfection est d'au minimum 30 secondes.

Laisser couler l'eau pendant au minimum une minute. Recueillir 500 ml d'eau dans le flacon stérile contenant du

Thiosulfate de sodium. Si l'analyse est différée, il est impératif de garder le

prélèvement à basse température (2 à 8°C). Dans tous les cas, le délai d'acheminement doit être le plus court possible

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Celui-ci consiste à rechercher la présence des germes de l'hospitalisme dans l'eau du réseau nonfiltrée selon la technique suivante :



Celle-ci se fera en UFC/100 ml.

5.2 L'interprétation :

Les germes de l'hospitalisme doivent être inférieurs à 1/100ml.

Annexe : contenu des analyses microbiologiques des échantillons d’eau potable distribuée par un réseau collectif ou privé

Réduite B1 Sommaire B2 Complète B3• Coliformes

thermotolérants• Streptocoques fécaux

• Coliformes thermotolérants• Streptocoques fécaux• Dénombrement des bactéries

aérobies revivifiables à 22°et à37° C

• Coliformes totaux etthermotolérants

• Streptocoques fécaux• Dénombrement des bactéries

aérobies revivifiables à 22°et à37° C

• Spores de bactéries anaérobiessulfito-réductrices

Bibliographie :Décret 89-3 du 3 janvier 1989 modifié relatif aux eaux destinées à la consommation humaine à l'exclusiondes eaux minérales naturelles.

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Filtrer 100 ml sur membrane à 0,45 microns et la déposer sur PCA ou à défaut BCP Déposer la membrane sur le milieu. Incuber 24 heures à 37°C puis 48 heures à

température ambiante Lecture et dénombrement des germes après 24 heures d’incubation à 37°C puis

48 heures d’incubation à température ambiante Identifier les germes de l'hospitalisme par les méthodes standards.


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L'EAU FILTREE

N° de Fiche : 4Version : 1Date : juin 2001Pagination : 1/2

1° Objet :

Quantifier voire qualifier la flore microbiologique de l'eau filtrée.


Nous retiendrons ici l'eau dite de niveau 2 c'est à dire obtenue par microfiltration terminale à 0,2microns absolu. (typologie : cf page n°7)



Etablir la liste exhaustive des points d’eau filtrée pour les services à risques suivants : bloc opératoire, chambre stérile, réanimation, stérilisation et service de brûlés.

Avant toute chose, il est nécessaire :• De contrôler si le filtre est bien adapté.• De vérifier la fiche de traçabilité d’entretien du filtre• De respecter les règles d'utilisation et d'entretien du filtre

La fréquence Une fois/trimestre ou au minimum 2 fois/an Ponctuellement sur intervention des services techniques.

Les modalités Préciser le secteur, le local, la date et l'heure du prélèvement ainsi que lenom du préleveur.

Le matériel Un flacon stérile par point d'eau contenant du thiosulfate de sodium (10 à 50 mg/500ml)


Laisser couler l'eau 3 minutes Recueillir 500 ml Si l'analyse est différée, il est impératif de garder le

prélèvement à basse température (2 à 8°C). Dans tous les cas, le délai d'acheminement doit être le plus court possible.

Prélèvement complémentaire

Il est conseillé de compléter les prélèvements d'eau par : Un écouvillonnage de la face externe du filtre avant le

prélèvement d’eau si nécessaire Un écouvillonnage du siphon.

Se référer au mode opératoire défini dans la fiche précédente.

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4° Mode opératoire :



Celle ci se fera en UFC pour 100 ml.

5.2 L'interprétation :

Les critères microbiologiques retenus sont les suivants :Absence de germes de l'hospitalisme(< 1/100ml) et moins de 10 UFC/100ml pour les germes totaux.

Annexe : Typologie de l'eau bactériologiquement maîtrisée

L'eau bactériologiquement maîtrisée à l'hôpital est une appellation instaurée par le COTEREHOS (Comité Technique Régionalde l'Environnement Hospitalier - DRASS Rhône Alpes) pour désigner l'eau à usage hospitalier, produite dans l'établissement àpartir d'eau d'adduction publique.

Dénomination Usage Exigences de qualité

Niveau 1 : "eau propre" Rinçage coloscope et gastroscope Toute utilisation dans les services de

soins

Inférieur ou égal à 100 UFC/100 ml après 24h à 37° et 72 h à 22°

Absence de P. aeruginosa dans 100 ml

Niveau 2 : "eau ultra-propre" Secteurs protégés : unité brûlés,

greffés… Rinçage bronchoscope Lavage chirurgical des mains

Inférieur ou égal à 10 UFC /100 ml après 24h à 37° et 72 h à 22°

Absence de P. aeruginosa dans 100 ml

Niveau 3 : "eau stérile" Rinçage arthroscope et coelioscope Humidificateur d'oxygène Aérosols

Eau exempte de micro-organismes vivants,répondant aux normes de la pharmacopée.

Bibliographie :

[1] L'eau dans les établissements de santé. Commission technique régionale de l'environnement hospitalier. DRASSRhöne-Alpes mars 1995.[2] Eau à usage médical. Définition; Interprétation pratique. Groupe eau santé. Janvier 1998

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Les milieux de culture utilisés seront le PCA ou à défaut le BCP Filtrer 100 ml sur une membrane à 0,45 microns et la déposer sur le milieu de culture. Incuber 24 heures à 37°C puis 48 heures à température ambiante. Le dénombrement

se fera à 24 heures et 72 heures. Une identification devra être menée en présence de plusieurs colonies identiques ou

devant toute suspicion de germes de l'hospitalisme.


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE LA DESINFECTIONDES ENDOSCOPES

N° de Fiche : 5Version : 1Date : juin 2001Pagination :1/2

1° Objet :

Quantifier, voire qualifier la flore microbiologique de la lumière de l’endoscope après désinfection.

2°Champ d'application :

Endoscopes souples (fibroscopes) ou rigides non "stérilisables", les "laveurs-désinfecteurs".



Etablir un plan d'échantillonnage Faire préciser le type de rinçage (eau filtrée, eau stérile, eau

d'adduction) et le produit désinfectant utilisé En cas d'utilisation d'un lave endoscope, réaliser des

prélèvements d'eau en amont de la machine.La fréquence Une fois par trimestre

Les modalités Préciser la date et l'heure du prélèvement ainsi que le nom du préleveur.Indiquer l'identification de l'endoscope ou du fibroscope contrôlé.

Le matériel

Gants stériles 1 flacon stérile (500 ml par endoscope) 3 flacons stériles par endoscope contenant une solution

neutralisante pharmacopée (DNP) disponible en flacon de 90ml (exemple : AES). Cette solution permet de décoller le biofilm (support des micro-organismes) et d'inhiber les traces éventuelles de désinfectant

Une seringue de 60 ml


Il s'effectue dans le local de stockage. Réaliser un lavage simple des mains, enfiler les gants

Stériles, et saisir l'endoscope. Introduire stérilement la seringue à l'extrémité du canal de

l'endoscope et y injecter les 3 fois 90 ml de la solution neutralisante. Récupérer celle-ci stérilement dans le flacon stérile en évitant que le tuyau de l'endoscope ne touche l'intérieur du flacon.

Refermer rapidement le flacon et l'adresser le plus rapidement possible au laboratoire (sinon, le maintenir à 4°C°).

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4° Le mode opératoire



Celle ci se fera en UFC pour 200 ml ou 10 ml selon la quantité filtrée.

5.2 L'interprétation des critères microbiologiques de l'eau de rinçage

Type d'eau de rinçage Les critères microbiologiquesRinçage en eau filtrée ouen eau stérile

Germes < 20UFC/200 ml Absence de bactéries du tube digestif ou des bactéries

de la cavité explorée Absence de germes de l'hospitalisme

Rinçage en eau d'adduction Germes < 100UFC/10 ml Absence de bactéries du tube digestif ou des bactéries

de la cavité explorée Absence de germes de l'hospitalisme

Bibliographie

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Les germes à rechercher : ceux de l'hospitalisme et les bactéries de la cavité explorée.

La méthodologie : Filtrer 200 ml sur une membrane à 0,45µm si le rinçage de l'endoscope a été réalisé en

eau filtrée ou stérile. Filtrer 10 ml si le rinçage de l'endoscope a été réalisé en eau d'adduction. Rincer la membrane avec 3X50 ml d'eau stérile et la déposer sur PCA. Incuber à 37°C pendant 48 heures. Observer les boîtes ayant cultivé et effectuer une première lecture à 24 heures. Réaliser la lecture définitive à 48 heures.

[1] Circulaire DGS/BH n°236 du 02 avril 1996 relative aux modalités de désinfection des endoscopes dans les lieuxde soins.[2] DRASS Rhône-Alpes. COTEREHOS. L'eau dans les établissements de santé. 1995[3] CTIN. Désinfection des dispositifs médicaux. Guide des bonnes pratiques. 1998[4] Groupe eau-santé. Eau à usage médical. Qualité de l'eau et endoscopie. Mai 1999


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L'EAUDES PISCINES DE REEDUCATION


1° Objet :

Quantifier voire qualifier l'existence de germes dans l'eau des bassins de rééducation.


Tous les bassins utilisés pour la rééducation ou la balnéothérapie.


Le plan d'échantillonnageLa fréquence Au moins une fois par mois.

Les modalités Préciser la date et l'heure du prélèvement ainsi que le nom dupréleveur.

Le matériel Un flacon de 500 ml stérile contenant du thiosulfate de sodium ( 50à 60 mg/500ml ).


Prélèvement des eaux de bassin dans les flacons stériles à 10 cmsous l'eau de surface.

Si l'analyse est différée, il est impératif de garder le prélèvement à basse température (2 à 8°C). Dans tous les cas, le délai d'acheminement doit être le plus court possible.

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4°Lemode opératoire

Recherche à effectuer

Germes viables à 37°C et à température ambiante Coliformes totaux et thermotolérants Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Legionella (si nécessaire)

Méthode d'ensemencement

Pour la recherche des germes totaux : filtrer 1 ml sur membrane à 0,45µm avec 50 ml d'eau stérile puis

rincer la membrane avec 50 ml d'eau stérile. Sinon, utiliser laméthode par inclusion avec 1 ml d'eau sur PCA. Pour les autres germes : Filtrer 100 ml d'eau sur membrane à 0,45µm .

Incubation

Germes totaux : Incubation à 37°C pendant 48 heures et incubation à température ambiante pendant 72 heures sur PCA.

Coliformes totaux : Incubation à 37°C pendant 24 heures puis 48 heures sur milieu TTC et TERGITOL 7.

Coliformes thermotolérants : Incubation à 44°C pendant 24 heures puis 48 heures sur milieu TTC et TERGITOL 7.

Staphylococcus aureus : Incubation à 37°C pendant 24 heures puis 48 heures sur milieu CHAPMAN.

Pseudomonas aeruginosa : Incubation à 37°C pendant 24 heures puis 48 heures sur gélose cetrimide.

Legionella : Voir fiche Legionella.

Lecture

Germes viables : dénombrement au bout de 24 heures à 37°C et à 72 heures à température ambiante.

Autres germes : dénombrement à 48 heures.


5.1 La restitution des résultatsCelle ci se fera en UFC /ml pour les germes totaux et pour 100 ml pour tous les autres (coliformestotaux, coliformes thermotolérants..)

5.2 Les critères microbiologiques

Germes Critères retenusGermes totaux < 100/mlColiformes totaux < 10 dans 100 mlColiformes thermotolérants < 1 dans 100 mlStaphylococcus aureus < 1 dans 100 mlPseudomonas aeroginosa < 1 dans 100 mlLegionella < 103 dans 1 litre

Bibliographie

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[1] décret 1981 modifié en 1989 et 1991 : règlement des piscines publiques.[2] normes NFT 90 401 - 402, 90 414, 90 416,90 420 , 90 421[3] norme NF en ISO 6622


RECHERCHE DE LEGIONELLA DANS UNE EAUSELON LA NORME NFT 90 431


1° Objet :Quantifier voire qualifier l'existence de legionelles dans l'eau du réseau de l'établissement.

2° Champ d'applicationMéthode applicable à tous les types d'eau

3° Les prélèvements :


Points critiques à définir avec l'équipe technique. Prélèvement effectué dans tous les réservoirs, ballons d'eau

chaude et installations à risques. Au niveau de deux points d'usage par tranche de 100 lits (et

au minimum 10 points d'usage pour les établissements de moins de 500 lits).

La fréquence Au moins une fois par an.

Les modalités Préciser la date, l'heure, et le site du prélèvement ainsi que le nom dupréleveur.

Le matériel 2 flacons de 500 ml contenant du thiosulfate de sodium (environ 10 à50mg/500 ml).


Après décontamination du robinet( flamber l'embouchure du robinetou désinfecter l'extrémité du robinet à l'alcool à 95°, à l'eau de Javelou à l'aide d'un détergent-désinfectant) , laisser couler l'eau chaudependant une minute au minimum. Prélever alors un litre d'eau.

Si l'analyse est différée, il est impératif de garder le prélèvement àbasse température (2 à 8°C). Dans tous les cas, le délai d'acheminementdoit être le plus court possible


4.1 La méthodeEnsemencer par étalement 0,2 ml et 0,2 ml d'une dilution à 1/10 dans du tampon phosphate PBS del'eau à analyser. Filtrer un litre d'eau (le reste) sur membrane de polycarbonate. Mettre la membranedans 5 ml d'eau stérile, et la placer dans une cuve à ultrasons pendant 2 minutes.Etaler 0,1 ml sur gélose BcyE + ATB + L.cysteine (GVPC).

Traitement acide Traitement thermique Prélever 2 ml du mélange Centrifuger 10 minutes à 60 000 g Enlever 1 ml du surnageant Agiter puis ajouter 1 ml de tampon PH 2.2* (vérifier le PH

du tampon tous les 15 jours). Agiter doucement Laisser en contact 5 minutes Etaler 0,1 ml sur gélose BcyE + ATB L.cysteine (GVPC). Il est possible de ne pas centrifuger . Dans ce cas , ajouter à

2 ml d’échantillon , 2 ml de tampon acide. Après un temps decontact de 5 min ± 0,5 min , ensemencer immédiatement 0,2 mlsur une boite de milieu sélectif ou ensemencer 2 boites avec0,1 ml par boite de milieu sélectif .

Prélever 2 ml du mélange Chauffer à 50°C pendant 30 minutes Etaler 0,1 ml sur gélose BcyE + ATB +

L.cysteine (GVPC).

*Composition du tampon PH 2,2 : HCL 0,2 mol/litre …3,9 ml , KCL 0,2 mol/litre…25 . Ajuster à PH 2,2 avec KOH 1 mol/l16


4.2 L'incubation

Incuber les 5 boîtes à 37°C jusqu'à 10 jours en atmosphère humide (sachet + papier type absorbanthumidifié). Surveiller après 3 jours d'incubation.

4.3 La lecture

Dénombrement de Legionella

Dénombrer les colonies ayant apparu. Repiquer en quartier sur une boîte de milieu BcyE + L.cysteine,

BcyE et gélose au sang. Si 1 < N < 5 : repiquer toutes les colonies Si 5 < N < 50 : repiquer 5 à 7 colonies

Dénombrement de Legionellapneumophila

Rechercher en fluorescence (cf. annexe 1). Les colonies ayant cultivé en milieu selectif BcyE + L.cysteine

sont mises en contact avec un sérum fluorescent polyvalentanti-Legionella pneumophila.. La réaction d’immuno-fluorescenceest validée par un témoin positif qui est une souche deLegionnella pneumophila de sérogroupe 1 et un témoin négatifqui est une souche de Pseudomonas fluorescens.

Déterminer la proportion de Legionella et de Legionella pneumophila.


5.1 La restitution des résultats des résultats

Eau non concentréeEau non concentrée diluée

au 1/10Eau concentrée

Nombre de LegionellaUFC / litre

N* > 4 N x 10.3/0.2 = Nx5x10.3N* > 4 4 < N1 < 100 N +N1/0.22x10.3

N* non exploitable N non exploitable N = nombre de coloniesconfirmées le plus élevé Nx50

Absence de coloniesconfirmées < 50

N*= nombre de colonies sur boîte.

5.2 Interprétation

Rendre le nombre de Legionella dont le nombre de Legionella pneumophila. Les recommandations OMSsont de moins 103 Legionella par litre.

Bibliographie

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[1] circulaire DGS n° 98-771 du 31 décembre 1998 relative à la mise en œuvre des bonnes pratiques d'entretien desréseaux d'eau dans les établissements de santé et aux moyens de prévention du risque lié aux Legionelles dans lesinstallations à risque et dans celles des bâtiments recevant du public[2] Norme AFNOR NFT 90431[3] qualité de l’eau – recherche et dénombrement des legionella – ISO. 11731 :1998 (F)


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DES EAUXD'HEMODIALYSE CONVENTIONNELLE

N° de Fiche :8Version : 1Date : juin 2001Pagination : 1/2

1° Objet :

Quantifier voire qualifier la flore microbienne dans les eaux d'hémodialyse.


Eau pour hémodialyse : appellation codifiée par une monographie de la pharmacopée Européenne dontl'intitulé exact est " eau pour dilution des solutions concentrées pour hémodialyse".Cette eau est produite à partir d'eau potable , le plus souvent par des centrales comportant plusieursétapes : filtration, filtration sur charbon actif, adoucissement, osmose inverse et /ou échange d'ions,microfiltration et ou ultra filtration….

3° Prélèvement :


Points de contrôle à discuter avec l'ingénieur technique. Pour l'eau osmosée, prélever en sortie d'osmoseur, au

départ et en retour de boucle. Si appareil mobile autonome : prélever à la sortie du système

avant ajout du dialysat.

La fréquence

Une fois par semaine au maximum ou une fois par mois au minimum.

Pour l'eau d'adduction, réaliser un prélèvement une fois par trimestre et réaliser une analyse de type B2.


Le matériel Flacons stériles.


Le volume minimal à prélever :• 500 ml (1 flacon par site de prélèvement)• 30 ml (1 flacon pour la recherche d'endotoxines)

Flamber l'embouchure du robinet ou désinfecter l'extrémité du robinet à l'alcool à 95°, à l'eau de Javel ou à l'aide d'un détergent-désinfectant.

Laisser couler l'eau quelques minutes et recueillir le liquide dans un flacon stérile de façon aseptique et l'étiqueter en mentionnant le site prélevé.

Prélèvement à conserver entre 4°C et 8°C pendant 2 à 4 heures maximum.

18





Dénombrement pour 100 ml d'eau.

5.2 L'interprétation des résultats

Les germes aérobies totaux revivifiables doivent être inférieurs à 100 UFC/ml à températureambiante et à 30°C.Pas d'identification sauf cas particulier (ex : infection ou choc chez le dialysé, interventiontechnique sur le circuit).Contrôler l'efficacité des milieux, l'absence d'inhibiteur dans l'eau de dialyse ainsi que la validité dela méthode de dénombrement des germes ( cf. annexe).Les endotoxines bactériennes ne doivent pas dépasser 0,25 UI/ml .

Annexe

Méthodologie

Ce contrôle doit être réalisé lors de chaque manipulation.Préparer une suspension de germes : E.coli de préférence (souche ATCC) ou S.aureus.

Culture de 24 heures de la souche (E. coli ou S.aureus) sur gélose TCS. Emulsionner la souche dans un tube d'eau distillée pour obtenir 108 /ml (soit une valeur Do

comprise entre 0,2 et 0,3 à la longueur d'onde 620 nm plus ou moins 20 nm). Diluer jusqu'à -6,pour obtenir 102 /ml.

Filtrer 100 ml d'eau osmosée à analyser et ajouter 50 ml d'eau stérile contenant 1 ml de lasuspension à 100 germes par ml.

Faire un témoin positif (1 ml de suspension à 100 germes par ml + eau stérile) et filtrer surmembrane.

Incubation Incuber à 30 - 35°C.

Interprétation

Dénombrer en 24 - 48 heures. Témoin positif : environ 100 colonies. L'essai est non valable si le nombre de colonies est

inférieur à 20 ou 30. Eau osmosée à analyser : théoriquement voisin de 100 colonies. Il faut au moins 50% de colonies

par rapport au témoin positif ; si le nombre de colonies est insuffisant, il y a présenced'inhibiteur dans l'eau.

Bibliographie

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Rechercher et dénombrer les germes aérobies viables totaux sur milieu trypticase soja etrechercher les moisissures et levures sur milieu sabouraud 40g/litre de glucose.

La méthodologie :• Filtrer 100ml d'eau osmosée à analyser sur membrane 0,45 µm.• Rincer avec 100ml d'eau stérile. Déposer la membrane sur la gélose.• Eventuellement, ensemencer en parallèle 0,1 ml par étalement sur gélose.

L'incubation :• Sabouraud à température ambiante pendant 5 jours.• TRYPTO-CASEINE SOJA à 30-35°C pendant 5 jours.

La lecture :• Lecture chaque jour jusqu'à 5 jours.• Dénombrement pour 100ml d'eau.

[1] pharmacopée Européenne 1997 (paragraphes 2 , 6, 12)[2] groupe Eau Santé - eau à usage médical définitions et interprétations pratiques Janvier 1998


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE POUR LA PRATIQUE DEL’HEMO(DIA) FILTRATION

N° de Fiche :9Version : 1Date : juin 2001Pagination : 1/2

1° Objet :

Quantifier voire qualifier la flore microbienne dans les eaux destinées à la pratique del’hémo(dia)filtration.


La circulaire n°2000-311 du 7 juin 2000 définit les conditions de sécurité sanitaire de pratique del’hémofiltration et hémodiafiltration en ligne.Dans l’hémofiltration, le transfert des solutés est convectif et la balance volémique du patient estmaintenue en réinjectant une solution de substitution.Dans l’hémodiafiltration , le transfert des solutés est convectif et diffusif et nécessite un dialysatet une solution de substitution

3° Prélèvement :

Le plan d'échantillonnage Points de contrôle à discuter avec l’ingénieur technique

La fréquence

Eau d’alimentation des générateurs de dialyse : contrôlemicrobiologique et endotoxinique une fois par semaine au maximum et unefois par mois au minimum

Dialysat : contrôle microbiologique et endotoxinique, effectué àl’entrée du dialyseur sur chaque générateur une fois par mois au minimum.

Solution de substitution : contrôle microbiologique et endotoxiniqueune fois par mois au minimum et par générateur. L’échantillon est prélevé endehors d’une séance d’hémo(dia) filtration.


Le matériel Flacons stériles.


Le volume minimal à prélever :• 30 ml (1 flacon pour la recherche d'endotoxines)• 1 l d’eau d’alimentation des générateurs• 100 ml de dialysat• 50 ml de solution de substitution

Flamber l'embouchure du robinet ou désinfecter l'extrémité du robinet à l'alcool à 95°, à l'eau de Javel ou à l'aide d'un détergent-désinfectant.

Laisser couler l'eau quelques minutes et recueillir le liquide dans un flacon stérile de façon aseptique et l'étiqueter en mentionnant le site prélevé.

Prélèvement à conserver entre 4°C et 8°C pendant 2 à 4 heures maximum.

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Eau d’alimentation des générateurs : les germes aérobies totaux revivifiables doivent êtreinférieurs à 100 UFC/l .. Les endotoxines bactériennes de l’eau d’alimentation des générateurs nedoivent pas dépasser 0.25 UI/ml (pharmacopée européenne).

Dialysat : mêmes normes que l’eau d’alimentation des générateurs .

Solution de substitution : elle ne doit contenir aucune bactérie dans l’échantillon prélevé et moins de0,05 Ul/ml d’endotoxines.

Bibliographie

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Rechercher et dénombrer les germes aérobies viables totaux sur milieu pauvre (R2A ouPCA )

La méthodologie :• Filtrer 1 l d'eau sur membrane 0,45 µm.• Rincer avec 100ml d'eau stérile. Déposer la membrane sur la gélose.

L'incubation :• pendant 7 jours à température ambiante

La lecture :• Lecture chaque jour jusqu'à 7 jours.• En cas de culture positive, l’identification des germes est indispensable

Circulaire DGS/DH/AFSSAPS n ° 2000-311 du 7 juin 2000 relative aux spécifications techniques et à la sécuritésanitaire de la pratique de l’hémofiltration et de l’hémodiafiltration en ligne dans les établissements de santé


LES PRELEVEMENTS MICROBIOLOGIQUES DE L’AIR


1° Objet :

Quantifier la teneur de l'air en bactéries revivifiables, voire qualifier la flore microbienne pour unvolume d'air prélevé dans une atmosphère maîtrisée.


L'étude de la contamination bactérienne de l’air n'a d'intérêt que dans les zones sensibles ouprotégées pour lesquelles la contamination doit être faible. Les prélèvements se limiteront donc auxblocs opératoires, aux unités "stériles" (onco-hématologie, service de transplantation,conditionnement et stock stériles en stérilisation…) ou tout autre secteur bénéficiant d’airmicrobiologiquement maîtrisé.


Le plan d'échantillonnageDéfinir la zone préférentielle du ou de(s) prélèvement(s) près de la tabled'opération ou de radiologie interventionnelle (conditionnement et stockstérile…

La fréquence

une fois par trimestre, au minimum 2 fois par an après chaque opération nécessitant une interruption du traitement d'air (

alerte incendie avec mise en jeu du système de désenfumage, maintenancedes gaines ou des filtres….)

Les modalités

l'opérateur doit être en tenue de bloc (pyjama, masque, charlotte) etprocédera à un lavage des mains avant tout prélèvement

préciser le service, le local, la zone du local, la date et l'heure duprélèvement ainsi que le nom de l'opérateur.

Préciser l'heure du bio-nettoyage et/ou de la désinfection par rapport aumoment du prélèvement

Le matériel

Le bio-collecteur : appareil à prélèvement d'air fonctionnant par impaction(vitesse d'impaction inférieure à 20m/sec [5] ou à défaut à 100m /sec [2] ,débit d'aspiration supérieur à 100l/min [5] ou à défaut 50l /min [2]

Gélose trypto-caséïne soja


Placer le bio-collecteur à un mètre du sol au niveau de la zone préférentielleà prélever, fermer les portes ou le sas.

L'opérateur devrait quitter la salle et déclencher le bio-collecteur à l’aided’une télé-commande sinon celui-ci restera immobile pendant la durée duprélèvement. Il est souhaitable que les prélèvements soient toujourseffectués par la même personne.

Se munir de géloses témoins de façon à détecter des contaminations nonliées au(x) prélèvement(s)

Prélever au minimum 1m3 ( 1000 l ) par salle en deux fois ou si nécessaire enplusieurs fois

Se munir de lingettes à usage unique et d'un pulvérisateur contenant undétergent décontaminant de façon à traiter le bio-collecteur en cas deprélèvements successifs.

22





L'étude quantitative est réalisée par numération des colonies sur la boite gélosée,etexprimée en PNC/m3 ou UFC/m3 (en connaissant le volume analysé)

L'étude qualitative est réalisée par identification bactériologique de toute coloniesusceptible d'être incriminée dans un processus infectieux.


Hors présence humaine :

haut risque* tres haut risque*Bactéries Moisissures Bactéries Moisissures

Action 500 1 10 1Alerte 100 1 5 1Cible 10 <1 1 <1

En présence humaine :

haut risque* tres haut risque*Bactéries Moisissures Bactéries Moisissures

Cible 100 <1 10 <1

*niveau à définir localement (ex : chambre d’hématologie, salle d’opération porte fermée)

Bibliographie

23

Idéalement le(s) prélèvement(s) et la phase d'analyse microbiologique devraient êtreréalisés par la même personne.Les géloses ensemencées lors du prélèvement seront incubées rapidement dans unincubateur propre et si possible en l’absence des prélèvements cliniques en particulier pourune recherche mycologique. En effet, la contamination est facile et peut remettre en causela conformité du résultat.

L'incubation :Incuber 24h à 37°C puis 48 h à température ambiante

La lecture :Dès 24h, évaluer la flore totale et identifier les levures, moisissures etgermes de l'hospitalisme.Evaluer la flore totale accompagnée des recherches spécifiques éventuelles

[1] AUDURIER A. et col./l'air à l'hôpital. part.5, chap.2, 381-402 in : Hygiène Hospitalière, presses universitaires deLyon 1998[2] NFS 90.351 - procédures de réception et de contrôle des salles d'opérations. Qualité de l'air AFNOR 1987[3] EN X 44.111-4 projet : méthodes d'analyses et de mesurage de l'aéro-contamination en zones à risques.[4] Contrôle de l’environnement dans les établissements à hauts et très hauts risques ASPEC – 1999.[5] ISO 14698-1 Salle propre et environnement maîtrisé apparenté. Maîtrise de la bio contamination


RISQUE ASPERGILLAIRE : SURVEILLANCEDE L’ENVIRONNEMENT


1° Objet :

Surveiller et quantifier la présence éventuelle de spores d’Aspergillus dans l’environnement immédiatdes patients considérés à haut risque d’infection aspergillaire. Les spores ou conidies, forme dedissémination du champignon, se retrouvent aussi bien dans l’air que sur divers supports.La surveillance associera :

• Le contrôle de l’air qui appréciera la situation instantanée (qualité de l’air ambiant ou traité)• Le contrôle des surfaces qui est le reflet des anomalies survenues dans les jours

précédents le prélèvement.


La surveillance est ciblée sur les secteurs où sont hospitalisés les patients à risque d’infectionaspergillaire (neutropénie profonde et/ou prolongée, allogreffe, corticothérapie élevée et prolongée,retransplantation d’organes..)

En priorité, les secteurs bénéficiant d’un système de traitement d’air avec filtration HEPA(flux laminaires ou flux turbulents avec hyper pression) et accueillant des patients à hautrisque d’aspergillose invasive

Dans les unités sans traitement d’air ou avec qualité de filtration autre qu’HEPA, l’intérêt d’unesurveillance mycologique systématique, qui n’a plus un objectif assurance qualité n’est pasdémontrée.

3° Prélèvements :3.1 Le contrôle des surfaces


Définir la zone préférentielle du ou de(s) prélèvement(s). Réaliser 5 à 10 prélèvements par chambre le plus près possible du patient en

privilégiant les surfaces métalliques horizontales, les appareils électriques, lesrampes lumineuses et les zones humides. Les bouches d’arrivée et d’extractiond’air

En cas de travaux ou dans un contexte d’aspergillose invasive, élargir aux zonesfrontières entre chantiers et services d’hospitalisation , ainsi qu’aux secteurscontigus accueillant les patients à risque.

La fréquence

Calquée sur celui de la surveillance de l’aérobiocontamination : Trimestrielle en routine A la demande en cas de travaux ou de survenue d’aspergillose invasive

nosocomiale

Les modalités

L'opérateur doit être en tenue identique au service (si nécessaire pyjama,masque, charlotte) et procédera à un lavage des mains avant tout prélèvement

préciser le service, le local, la zone du local, la date et l'heure du prélèvementainsi que le nom de l'opérateur.

Le prélèvement doit être réalisé 4 heures après le bio- nettoyage et/ou la désinfection, sipossible avant l’entrée d’un nouveau malade

Le matériel Boîte de type contact avec milieu adapté à la croissance fongique pour les

surfaces planes (SABOURAUD, MALT-AGAR) Alternative : méthodes par écouvillonnage

24


3.2 Surveillance de la biocontamination aérienne :

Le plan d'échantillonnage Définir la zone préférentielle du ou de(s) prélèvement(s)

La fréquence

Calquée sur celui de la surveillance de l’aérobiocontamination : Trimestrielle en routine A la demande en cas de travaux ou de survenue d’aspergilose invasive

nosocomiale

Les modalités

L'opérateur doit être en tenue identique au service (si nécessaire pyjama,masque, charlotte) et procédera à un lavage des mains avant toutprélèvement

préciser le service, le local, la zone du local, la date et l'heure duprélèvement ainsi que le nom de l'opérateur.

Le prélèvement doit être réalisé 4 heures après l'heure du bio- nettoyage et/ou de la désinfection

Le matériel

Le bio-collecteur : appareil à prélèvement d'air fonctionnant par impaction(vitesse d'impaction strictement inférieure à 20m/sec et débit d'aspirationsupérieur à 100l/mn)

La durée du prélèvement doit être brève (temps optimal 2 minutes) Milieu de culture : gélose Sabouraud ou malt agar


Le volume d’air à prélever est d’au moins 1000 litres pour les unitéséquipées d’un filtre HEPA.

Le volume d’air à prélever sera de 250 à 500 litres pour les unités nonprotégées.


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Idéalement, le(s) prélèvement(s) et la phase d'analyse microbiologique devraient être réalisés parla même personne.Les géloses ensemencées lors du prélèvement seront incubées rapidement dans un incubateurpropre et si possible en l’absence des prélèvements cliniques en particulier pour une recherchemycologique. En effet, la contamination est facile et peut remettre en cause la conformité durésultat.

L’incubation :• incuber à température ambiante (reflet de la contamination fongique globale –

détection d’éventuelles anomalies de filtration).• Et/ou à 37° C pour cibler les espèces capables de se développer à température

corporelle en particulier Aspergillus fumigatus et Aspergillus flavus. La lecture :

• Réaliser une lecture précoce à 48 heures• Laisser incuber 5 à 7 jours




L'étude quantitative est réalisée par numération des colonies de champignonsfilamenteux sur la boite gélosée, exprimée en PNC/m3 ou UFC/m3 (en connaissant levolume analysé)

L'étude qualitative est réalisée par identification mycologique.


5.2.1 Blocs opératoires hors présence humaine

Le risque aspergillaire ne se justifie pas pour les blocs opératoires.

5.2.2 Chambre d’hospitalisation en présence humaine

Secteurs protégés HEPA Secteurs non HEPAAir Cible 0 UFC / m3 -

Alerte > 1 UFC / m3 pour A. fumigatus -Cible 0 UFC pour 6 points de prélèvement 5 UFC par chambre

Surface Alerte 1 UFC d’A. fumigatus -

Bibliographie

26

[1] LAJONCHERE JP, FEUILHADE DE CHAUVIN M – contamination aspergillaire : évaluation des mesures de préventionet surveillance de l’environnement. Pathol. Biol. 1994 ;42 :718-729[2] Groupe CLIOH. Réflexions sur la prophylaxie de l’aspergillose en onco-hématologie. La lettre de l’infectiologue 1995 ;14 :553-8[3] guidelines for prevention of nosocomial pneumonia. Centers for diseases control and prevention . Respiratory care,1994, 39 :1191-1230[4] FRIDKIN SK, JARVIS WR- epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin. Microbiol. Rev, 1996 ;9 499-511[5] GRILLOT R., NOLARD N. – méthodes de surveillance de l’environnement : techniques d’évaluation et utilité. Prévention du risque aspergillaire chez les patients immunodéprimés. Conférence de consensus, institut pasteur , Paris , 21 mars 2000[6] Conférence de consensus sur « prévention du risque aspergillaire chez les patients immuno-déprimés (hématologie,transplantation ) » - mars 2000


GLOSSAIRE DES MILIEUX DE CULTURE UTILISES DANS LES MODESOPERATOIRES

TCS (trypto-casèine-soja) Hydrolysat trypsique de caséine Peptone de soja Chlorure de sodium Agar pH = 7.3+ 0.2

15 5 515 en grammes par litre

PCA (Plant Count agar-standard méthods agar) Hydrolisat trypsique de caséine Extrait de levure Glucose Agar pH = 7

52.5115 en grammes par litre

BCP GELOSE (gélose lactosée au bromocrésol pourpre) Extrait de viande de bœuf Peptone Lactose Agar Bromocrésol pourpre pH = 6.8

351010 en grammes par litre25 en milligrammes par litre

TTC + TERGITOL (gélose de base lactosée) Peptone Extrait de viande Lactose Bleu de bromothymol Agar pH = 7.2 + 0,2 Ajouter :• 5ml d’une solution de chlorure de 2-3-5

triphenyl-tétrazolium (TTC) à 0.05%• 5ml d’une solution de tergitol 7 à 0.2%

105200.0512.75 en grammes par litre

27


Gélose Cétrimide Peptone Sulfate de potassium Chlorure de magnésium Cétrimide Agar

10 10 1,40,313,6 en grammes par litre

Milieu CHAPMAN Peptone Extrait de viande Chlorure de sodium Mannitol Rouge de phénol Agar

10175100,02515 en grammes par litre

Milieu BCYE sans L cystéine Charbon activé Extrait de levure Tampon ACES (acide 2 acetamido, 2

aminoéthane sulfonique) Pyrophosphate ferrique alphacétoglutarate Agar

21010


Milieu BCYE + L cystéineAjouter au milieu BCYE du chlorhydrate de Lcystéine


Milieu BCYE + L cystéine + antibiotiques (GVPC)Ajouter au milieu BCYE + L cystéine :

Glycine Vancomycine Polymyxine Cycloheximide

3179 200 UI80 en milligrammes par litre

28


Milieu SABOURAUD Peptone chapoteaut Glucose Agar pH 6 ± 0,2

102015 grammes par litre

Milieu MALT AGAR extrait de malt agar ph =5.5 + 0,5

3012 grammes par litre

Milieu Gélose R2A extrait de levure tryptone peptone glucose amidon phosphare dipotassique sulfate de magnésium pyruvate de sodium agar ph 7. 2 + 0.2

0.50.250.750.50.50.30.0240.315.0 grammes par litre

29


GERMES DE L’HOSPITALISME

Annexe 1Version : 1Date : juin 2001Pagination :1/1

• Staphylococcus aureus méticilline-résistant• Entérobactéries productrices de Bétalactamase à spectre étendu• Enterocoque résistant à la Vancomycine• D’autres germes peuvent être définis en fonction de l’écologie bactérienne et de la politique

d’isolement des Bactéries multirésistantes aux antibiotiques au sein de chaque établissement(Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia…)

30


RECHERCHE DE LEGIONELLA DANS UNE EAUSELON LA NORME NFT 90 431 : LE MODE OPERATOIRE

Annexe 2Version : 1Date : juin 2001Pagination : 1/1

Ensemencer 0,2 ml pur et dilution 1/10 sur GVPC

Filtrer 1 litre d'eau sur membrane 0,45µm

Eau concentrée

Mettre la membrane dans 5 ml d'eau stérilePlacer dans une cuve à ultra-sons pendant 2-10 minutes

Traitement acide Traitement thermique Pas de traitementPorter à pH = 2,2 50°C pendant 30 minutes

Etaler sur milieu complet (GVPC)

Incuber 3 - 10 jours à 37°C

Colonies grisâtres - bacille gram négatif

Repiquage

Gélose au sang BCYE sans cystéine BCYE avec cystéine

Incuber 3 jours à 37°C

Pousse non caractéristique de Legionella

31

0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml

2 ml 0,1 ml

2 ml

Pousse non caractéristique de Legionella

Recherche par immunofluorescence delegionella pneumophila

Eau à analyser

Prélèvements d'environnement dans les établissements de santé ...

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