Plateforme d’Analyse et de Caractérisation – P.A.C. Balard€¦ · Plateforme d’Analyse et...

Dr. Jean-Claude [email protected]

Tél. : 04 67 14 33 09

Pr. Christine [email protected]

Tél. : 04 67 14 38 19

CONTACT

Fédération de Recherche Chimie Balard - FR3105

http://www.fed-chimiebalard.cnrs.fr

Plateforme d’Analyse et de Caractérisation – P.A.C. Balard

• Mutualisation des équipements mi-lourds

• Organisation par nacelles technologiques autour d’un centre de compétences sous la responsabilité de scientifiques spécialistes du domaine et d’une assistance par personnel technique dédié

• Instrumentation performante pour une recherche de qualité

• Prestations de service haut de gamme


Ouverture aux secteurs publics et privés


P.A.C. Balard

Fédération de Recherche Chimie Balard - FR3105

http://www.fed-chimiebalard.cnrs.fr

Plateau Technique

ICGM-IEM

Service Commun UM2

RXγγγγ

Laboratoire de Mesures Physiques (LMP)Service Commun UM2

Plateau TechniqueIBMM

Christine EnjalbalUniversité Montpellier 2, Institut des Biomolécules Max Mousseron (UMR 5247)

CC 1703, Place Eugène Bataillon, 34095 Montpellier Cedex [email protected]

PAC BALARD - DLV 19-01-2011 4

1- Diffraction X/Diffusion X/Fluo. X 2- IR/Raman 3- RMN 4- Mössbauer5- XPS 6- Magnétisme/RPE 7- MEB/AFM 8- Analyses texturales9- Analyses thermiques 10- Analyses élémentaires/mesures chiroptiques

11- Spectrométrie de masse 12- Nanoséparation et analyses

2

12 nacelles àvotre service

1

3 45

6

89

10

11

12

127


Un des services de la Plateforme d’Analyse et Caractérisation:

Nacelles 11 et 12

Laboratoire de Mesures Physiques / Institut des Biomolécules Max Mousseron

Les Rencontres 2012

"A quoi sert… la spectrom étrie de masse"

Localisation: Université Montpellier 2,

Bâtiment 17, Rez-de-chaussée

http://www.univ-montp2.fr www.ibmm.univ-montp1.fr

Nacelle 11 – Spectrométrie de masse

AppareillagesESI-QToFMaldi-Tof-TofESI-QqQEI/CI-Q

• Mode d’ionisation : Maldi, ESI, APCI, CI, EI (+/-)

• Analyse MS/MS

• Analyse Haute résolution

[email protected]@univ-montp2.fr

Nacelle 12 – Séparation et analyses

Appareillages : HPLCUPLC

Chromatographie liquide

• Double détection UV/MS

• Couplage HPLC-QToF

• Couplage UPLC-QqQ

[email protected]@univ-montp2.fr

Chromatographie gazeuse

Appareillage : GC / MS


Conditions d’accès

au service de SPECTROMETRIE DE MASSE

- Accès aux prestations du service sur simple rendez-vous

[email protected] 04 67 14 38 [email protected] 04 67 14 38 [email protected] 04 67 14 38 04

- Tarifs des prestations HT selon techniques analytiques requises

� Tarification Académique (UM2/Pôle Chimie Balard/autres)� Tarification Industrielle

- Contrats de prestations:

Devis selon le type d’étude et le nombre d’échantillons

�Service�Recherche

A quoi sert… la spectrométrie de masse ?

Technologies disponibles

Gilles Valette

[email protected]

Tél: 04-67-14-38-36

Définition: spectrométrie de masse

�C’est une balance moléculaire: elle

mesure des rapports masse-sur charges

(m/z) de molécules ionisées à l’état

gazeux et de leurs produits de

fragmentations.

Historique rapide

• 1912: Premiers spectres de masses de gaz (N2, O2, CO, …) par THOMPSON.

• 1918: construction par DEMPSTER du 1er SM à secteur magnétique (commercialisé qu’en 1942).

• 1922: Première source à Impact électronique par DEMPSTER• 1948: Analyseur par mesure du temps de vol (tof)• 1953: Analyseur quadripolaire• 1957: Couplage de la SM avec la GC• 1967: Ionisation chimique• 1981: Source à bombardement d’atomes rapides (FAB)• 1984: Commercialisation de l’analyseur trappe ionique• 1985: Source désorption laser assistée par matrice (MALDI)• 1988: Source electrospray (ESI)• 2001: Imagerie par SM

Quelles informations peut on tirer d’un spectromètre de masse ?

3) Information sur la composition élémentaire grâce à la précision de mesure

1) La masse moléculaire grâce à la valeur du rapport m/z du pic moléculaire.

m/z

Nombred’ions

2) Informations sur la structure grâce aux pics de fragmentation.

La présence d’isotopes

A cause de l’existence d’isotopes , on observe, non pas un pic moléculaire, mais un groupe de pics moléculaires

Massif isotopique du Cl Massif isotopique du C Massif isotopique de C100

Quelle masse mesure-t-on ?

�Masse monoisotopique : C’est la masse du pic du profil isotopique qui ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stables

(12C, 1H, 16O, 32S, 14N, 35Cl, …).

Pic monoisotopique

m/z

Pic P

P+1

P+2

P+3

P+4

P+5

Quelle masse mesure-t-on?

�Masse chimique ou moyenne : C’est le barycentre (centroïde) des masses des pics constituant le profil isotopique, c’est-à-dire la masse qui prend en compte la masse des éléments donnée par le tableau périodique (C=12,011).

Masse moyenne

L’unité de mesure

• La masse M s’exprime en Dalton (Da) ou l’unité de masse atomique unifiée (u).

• Ces 2 unités sont parfaitement identiques.

• Da = 1/12 de la masse d’un atome de 12C soit 1,66 .10-27 kg.

Source

Création des ions

Analyseur

Tri des ions en phase gaz: détermination du rapport m/z

Détecteur

Comptage des ions

Enregistreur

Traitement informatique -Visualisation du spectre

Schéma général d’un MS

Les performances d’un spectromètre de masse dépendent du mode d’ionisation , de la nature de l’analyseur , et du détecteur .

Enregistreur

Source

Création des ions

Analyseur

Tri des ions en phase gaz: détermination du rapport m/z

Détecteur

Comptage des ions

Enregistreur

Traitement informatique -Visualisation du spectre

Schéma général d’un MS

Enregistreur

Les performances d’un spectromètre de masse dépendent du mode d’ionisation , de la nature de l’analyseur , et du détecteur .


Les sources d’ionisation

Rôle de la source

�Volatiliser : la source doit permettre le passage de l’état de matière condensée àun état gazeux.

� Ioniser : Transformer les molécules en ions, produire des espèces chargées car un spectromètre de masse (analyseur) fonctionne grâce à des champs électriques.

Exemples de sources d’ionisation les plus courantes

• La source à Impact Electronique (EI)• La source par Ionisation Chimique (CI)• L’ionisation par thermospray (TSP)• L’ionisation par bombardement d’ions ou atomes rapides

(LSIMS, FAB)• La désorption par plasma (PD)• La désorption par laser (LD)• L’ionisation chimique à pression atmosphérique (API ou

APCI)• L’ionisation laser assistée par matrice (MALDI)• Electronébulisation (electrospray: ES ou ESI)• …

L’impact électronique (EI)Echantillon

Faisceau

d’électron à 70eV Enceinte sous vide

Principe général: e- (70eV) + M 2e- + M+

M+ est un ion: radical-cation

M+

B+ + RPerte d’un radical

D+ + NPerte d’une molécule neutre et réarrangement

B+ C+ + N’

D+E+ +R’

F+ + N’’

• L’ionisation en EI est une ionisation forte mettant en jeu beaucoup d’énergie et entraînant de nombreuses fragmentations.

• La grande reproductibilité de la fragmentation a permis la construction de nombreuses bibliothèques spectrales (librairie NIST).

• Source particulièrement adaptée à l’analyse de composés apolaires de faible poids moléculaire (<1000 Da).

• L’introduction de l ’échantillon sous vide permet un couplage facile avec la chromatographie en phase gazeuse (GC/MS)

• Il est souvent difficile de détecter l’ion moléculaire.

Spectre de masse EI du 2-pentatone

m/z = 86m/z = 71

m/z = 58

m/z = 43

L’ionisation chimique (CI)

Echantillon

Faisceau

d’électron à 70eV Enceinte remplie

de gaz réactant* (CH4)

(=10-3 mbar)

Principe général: CH4 + e- CH4+ + 2e-

�Technique basée sur l’IE, mais avec une étape intermédiaire.

CH4+ + CH4 CH5

+ + CH3

Impact électronique

Auto-protonation

CH5+ + M CH4 + MH+ Ion moléculaire à M+1

* : Gaz réactants possibles: H2, CH4, C2H4, NH3, …

• On observe l’ion pseudo-moléculaire: M+1• Il n’y a quasiment pas de fragmentation• Possibilité de faire du mode négatif (M-H-, M+X-)• Source particulièrement adaptée à l’analyse de

composés apolaires de faible poids moléculaire (<1000 Da).

• L’introduction de l ’échantillon sous vide permet un couplage facile avec la chromatographie en phase gazeuse (GC/MS).

• EI et IC sont des techniques d’ionisation complémentaires: EI donne des informations structurales, et l’IC confirme la masse moléculaire d’un composé.

• Il n’existe pas de bibliothèque de spectre.

Spectre de masse de la benzophénone obtenu par ionisation chimique.

C13H10CO M = 182,2 g/mol

M + H+

m/z 105Ion acylium

L’Ionisation ElectroSpray (ESI)

Pression atmosphérique Vide poussé

- Techniques d’ionisation à pression atmosphérique.

- Introduction de l ’échantillon en phase liquide permet un couplage facile avec

la chromatographie liquide (LC/MS).

- Méthodes d’ionisation douces : Peu de fragmentation. L’ionisation par

electrospray conduit ainsi à un spectre assez simple, avec la présence d’ion

moléculaire : [M+H]+ ou [M-H]-.

- Elle est utilisée pour l’étude de biomolécules comme des peptides, proteines,

sucres, carbohydrates, …

- Accès à l’analyse de macromolécules par la formation d’ions multichargées

[M+xH]x+ même si l’analyseur est limité en masse.

- Les solvants protiques utilisés doivent être volatils (MeOH, ACN, H2O).

- A proscrire: DMSO, DMF, ...

Exemple d’un spectre obtenu en ESI d’une petite molécule.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z0

100

%

2.55e3284

285

Molécule organique

MW = 283 g/mol

[M+H]+ observé = 284 Da

Exemple de spectre obtenu en ESI d’ions multichargés

PeptideMW = 1667,8 g/mol

Masses Observées :1667,8 Da = [M+H]+

834,9 Da = [M+2H]2+

556,9 Da = [M+3H]3+

M = (1667,8 + 1) / 1= 1668,8 DaM = (1667,8 + 2) / 2 = 834,9 DaM = (1667,8 + 3) / 3 = 556,9 Da

[M+H]+

[M+2H]2+

[M+3H]3+

Exemple de spectre obtenu en ESI de molécule de masse élevée.

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400m/z0

100

%

9.271925

1137

1112

1137 1364

13301143

1684

1663

1434

1692

1931

22471934

1939

1975 2217

2256

2263

2282

Comment déterminer la masse molaire de cette macromolécule ?

Exemple de spectre obtenu en ESI de molécule de masse élévée.

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400m/z0

100

%

9.271925

1137

1112

1137 1364

13301143

1684

1663

1434

1692

1931

22471934

1939

1975 2217

2256

2263

2282

Méthode de déconvolution

2247 = (M-xH) / x

1925 = (M-(x+1)H) / (x+1)

Etat de charge: x

Etat de charge: x+1Masse de la molécule à déterminer: M

Exemple de spectre obtenu en ESI de molécule de masse élévée.

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400m/z0

100

%

9.271925

1137

1112

1137 1364

13301143

1684

1663

1434

1692

1931

22471934

1939

1975 2217

2256

2263

2282

Méthode de déconvolution

2247 = (M-xH) / x

1925 = (M-(x+1)H) / (x+1)

X = 6M = 13482 Da

Etat de charge: x

Etat de charge: x+1

L’ionisation MALDI

Source la

ser

Pla

que

MA

LDI

Mélange matrice-échantillon

+

++

++

+

+

+

++

+ +

+

+

+

+

+

+

++

+

+

+

++

++

+

Désorption Ionisation

Ions moléculaire

Vers l’analyseur

E

Paramètres influençant l’ionisation:

• Les spectres MALDI sont très dépendants de la matrice utilisée. Un composé pourra très bien être détecté avec une matrice donnée, et pas avec une autre.

• Le type de dépôt sur la plaque: goutte séchée, couche mince, sandwich.

• Le choix des solvants utilisés pour préparer le dépôt (compatibilité du solvant de la matrice avec celui du produit à étudier).

• La présence de sel. Il faut utiliser de l’eau désionisée, ou alors ajouter un agent de cationisation comme Na+, K+, Ag+, …

Le choix de la matrice• Petit composé organique, photosensible (cycle

aromatique).

• Compatible avec le solvant utilisé pour solubiliser le composé à étudier.

• Bonne absorbance à la longueur d’onde du laser.

• Capable de transférer une ou plusieurs charges à l’analyte.

• Cristalisation aisée.

• Faible volatilité (10-7 mbar).

HOCN

OH

O

α-Cyano-4-HydroxyCinnamic Acid(HCCA)

OHO

HO

OH

2,5-DiHydroBenzoic acid(DHB)

H3CO

HO

OCH3

OH

O

Sinapinic Acid(SA)

Exemple de matrices

1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one (Dithranol)

HCCA peptides, petites protéines, glycoprotéinesSA protéines, glycoprotéines, polymères polairesDHB peptides, peptides glycosylés, polymères polaires, glycanesDitranol polymères.

• L’ionisation MALDI génère des ions monochargés [M+H]+, [M-H]-

• L’ionisation est douce. Il n’y a pas de fragmentation.

• Le dépôt étant solide, l’ionisation MALDI n’est pas compatible avec le couplage LC/MS.

• C’est une technique qui est souvent couplée avec un détecteur à temps de vol.

• C’est une technique très utilisée pour l’analyse protéomique.


Les analyseurs

Caractéristiques d’un analyseur:

�La résolution R.�La gamme m/z qu’il peut étudier.�La rapidité de balayage en m/z.

� En général, chaque type d’analyseur àses points forts et ses faiblesses..� Plusieurs configurations possibles

• Analyseur simple (Q, Tof…)• En tandem (Triple Quad, Q-Tof…)

La résolution (R)

Inte

nsité

rela

tive

H

H/2

lH/2

m/z

mlh/2

R =

Attention: Ne pas confondre résolution et exactitude de la mesure.

R = 2000 R = 5000 R = 20000

m

L’analyseur quadripolaire (Q)• Le quadripôle est constitué de quatre électrodes métalliques parallèles

raccordées électriquement deux à deux, de section idéalement hyperbolique

• La stabilité des ions dans le quadripôle dépend des paramètres U et V

• Un balayage des tensions (U et V) permet l'observation successive de tous les ions

Caractéristiques d’un Q

� Résolution: faible (1000 max)� Gamme m/z: limité (0-4000)� Vitesse de balayage: 5000 Da/s max

� Deux modes de détection:

• fullscan : Balayage d’une gamme de masse (par exemple de 50 à 500 Da) . On observe la totalité des ions formés dans cette gamme.

• SIM ou SIR (Single Ion Monitoring ou Recording) : Le quadripôle fonctionne en filtre de masse réglé pour ne laisser passer que les ions d’un rapport m/z donné. Méthode plus sélective et plus sensible que le fullscan.C’est le mode utilisé pour la quantification.

�Avantages:• Analyseur simple, peu couteux• Peu encombrant• Analyse ciblée (SIM / SIR)

�Inconvénients:• Faible résolution• Limité en gamme de masse

Analyseur à temps de vol (TOF)

• L'analyseur à temps de vol consiste à mesurer le tempsque met un ion, accéléré préalablement par une tension, à parcourir une distance donnée. Le rapport masse sur charge est directement mesurable à partir du temps de vol (t).

m = t2 x Cte

z• Les ions de masses différentes se déplacent à des

vitesses différentes.• Il existe deux modes d’utilisation de ces analyseurs:

� le mode linéaire� le mode réflectron

Analyseur linéaire

� Pas de limite de masse � Couplage avec le MALDI

� Grande sensibilité.

� Résolution moyenne (5000).

Les masses les plus faibles, parcourent le trajet le plus rapidement.

Analyseur avec réflectronIons identiques avec des vitesses initiales égales, mais initialement à deux endroits différents. Ou ions identiques mais avec vitesses et donc des énergies différentes.

Phénomène de focalisation. Les ions de même masse arriveront sur le détecteur en même temps Meilleure résolution qu’en mode linéaire

• Résolution: linéaire 5000, Réflectron 20000.

• Au-delà de 10 000 Da, linéaire seulement.• Gamme de masse illimitée (en théorie).• Grande sensibilité, mais moins bonne en

mode réflectron.

Spectrométrie de masse en tandem -MSMS

Premier analyseur

Sélectionne l’ion « parent / précurseur »

Cellule de collision

Fragmentation induite par collision

Second analyseur

Analyses les ions « fils / fragments»

Les différentes configurations disponibles dans la nacelle : � Triple Quad (QqQ)� Q-Tof� Tof-Tof

Cellule de collision

Triple Quad

• Q1 fonctionne comme un filtre et permet de sélectionner l’ion parent.

• Q2 sert de cellule de collision pour fragmenter l’ion parent (présence de gaz inerte).

• Q3 sert d’analyseur des ions fils.

Mode MRM (Multiple Reaction Monitoring)

�Q1 et Q3 fonctionnent comme des filtres:• Q1sélection de l’ion parent.• Q3 sélection de l’ion fils.

�Suivie de transition de manière très spécifique Technique très sensible utilisée pour la quantification.

Q-Tof

• Sélection de l’ion parent par le quadripôle.

• Analyse des ions fils dans le temps de vol

• Très bonne résolution sur la mesure des ions fils grâce au réflectron.

• Technique dédiée à la stucturale.

Quadripôle Cellule de collision

Tof-Tof

Ions métastables: ions formés dans la source qui ont suffisamment d’énergie pour se décomposer, mais des durées de vie suffisamment grandes pour qu’ils rentrent dans l’analyseur avant de se décomposer.

Reflectron: focalise dans le temps et l’espace des ions qui ont des énergies relativement proches.

Tof-Tof

� PCIS: Sélection de l’ion parent et des ses ions fils

� Cellule LIFT: Redonne de l’énergie au ions de manière à ce qu’ils se séparent en fonction du rapport m/z dans le reste du détecteur.

� PLMS: supprime l’ion parent par déflection

� Technique utilisée en structurale.

Couplages disponibles

Source

• CI

• EI• ESI

• MALDI

Analyseur

• Q

• QqQ• TOF

• Q-TOF• TOF-TOF

Techniqueséparative

GC

LC

Ultraflex III

Source d’ionisation

ESI APCI

ESIEI

CI (Méthane)MALDI

AnalyseurTemps de vol (TOF) (QqTof)

Triple Quadripôle(QqQ)

Quadripôle(Q)

Temps de vol (TOF) (TOF/TOF)

Mode d’analyse

+/-MS-MS

Haute résolution

+/-MS-MS

SRM/MRM

EI : +CI : +/-

+/-MS-MS

Haute résolution

Couplage HPLC UPLC GC

Applications

Molécules organiques polaires

(ou peu polaires)50 – 3000 g/mol

Etudes structurales


50 – 1000 g/mol

Quantification

Petites molécules apolaires, volatiles30 – 1000 g/mol

Recherche en bibliothèque (NIST)

Molécules de haute masse (peptides, protéines, ADN, polymères….)

500 – 100 000 g/molMacromolécules

Sequençage peptidique

Solvants compatibles

H2O, Acétonitrile, MeOHA éviter : DMSO, DMF, solution tampon

CHCl3, CH2Cl2, MeOH, Hexane

A éviter : DMSO, DMF, H2O, AcOEt

Solvant à éviter : DMSO, DMF, solution

tampon

Q-TofTSQ

Quantum DSQ II

Prix des prestations

Prestations académiquesPrestations industrielles (analyses ponctuelles)

EI/CI 4 € spectre (Basse Résolution)30 € le spectre

ESI-QqQ 4 € spectre (Basse Résolution)

ESI-Q-Tof

4 € spectre (Basse Résolution) 12 € le spectre MSMS 16 € le spectre Haute Résolution (HR-MS)

30 € le spectre BR100 € le spectre MS/MS100 € le spectre HR

Maldi-Tof/Tof

8 € le spectre (Basse Résolution)12 € le spectre MS/MS

30 € le spectre BR100 € le spetre MS/MS

LC/MS 8 € l’analyse 100 € l’analyse

LC/MS/MS 16 € l’analyse 150 € l’analyse

GC/MS 8 € l’analyse 50 € l’analyse


Exemples d’application

Guillaume Cazals

[email protected]

Tél: 04-67-14-38-04

ESI

Temps de vol (TOF) (QqTof)

+/-MS-MS

Haute résolution

HPLC

Molécules organiques polaires (ou peu polaires)

50 – 3000 g/mol

Etudes structuralesSolvant compatible : CHCl3,

CH2Cl2, MeOH, Hexane

A éviter : DMSO, DMF, H2O,

AcOEt

- Analyse par Q-Tof

Appareil offrant de multiples possibilités :- Mesure de masse exacte (HRMS)- Fragmentation (MSMS)- Couplage chromatographique (LCMS)

• Avantage de la résolution

Résolution du Tof = 5000 Information sur le massif isotopique Précision de la mesure de masse

Quelques exemples :

0,33

0,33

Ecart entre P et P+1 = 0.33 donc z = 3

56Fe

54Fe

Signature isotopique de certains éléments

723 724 725 726m/z0

100

%

X-MI12022202 25 (0.474) Sm (Mn, 10x1.00); Cm (24:30) TOF MS ES+ 384724.02

723.68

724.36

724.69

725.03

725.35

724.02

308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322m/z0

100

%

y-jv12020701 14 (0.264) Cm (13:15) TOF MS ES+ 1.28e3313.1

311.1

314.1

315.1

Massif isotopique d’un composédichargé contenant du Zinc

Isotope du Zinc :64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn, 70Zn

517 518 519 520 521 522 523 524 525m/z0

100

%

x-av11121303 18 (0.369) Sm (Mn, 10x1.00); Cm (17:19) 1: TOF MS ES+ 454519.1

520.1

519.6

521.1520.6

521.6

522.1

522.6

190 195 200 205 210 215 220 225 230 235m/z0

100

%

y-mt05071028 36 (0.384) Cn (Cen,4, 80.00, Ar); Sm (SG, 10x1.00); Cm (35:42) TOF MS ES+ 495228.1016

196.9616

187.0585 196.1430216.0802

197.0454214.1047200.0714 203.8533 217.0784 227.1024

229.1000

237.9766230.1021

• Mesure de masse exacteAjout d’un standard interne qui va servir à calibrer le temps de vol

Calcul des formules brutes compatibles avec la masse mesurée :

Single Mass Analysis Tolerance = 3.0 mDa / DBE: min = -5.0, max = 100.0

Monoisotopic Mass, Even Electron Ions207 formula(e) evaluated with 2 results within limi ts (all results (up to 1000) for each mass)

Minimum: -5.0Maximum: 3.0 100.0 Mass Calc. Mass mDa PPM DBE Score Formula228.1016 228.1025 -0.9 -3.7 8.5 1 C14 H14 N O2

228.1043 -2.7 -11.9 -4.5 2 C2 H18 N3 O9

CH3

O

NH

O[M+H]+

- Exemple avec la fragmentation de peptides

Nomenclature des ions fragments de peptides, schéma général :

� 2 séries d’ ions

Ions b : partie N-terminale

Ions y : partie C-terminale

� 2 séries d’ ions





H2NNH

HN

NH

HN

OH

O

O

O

O

O

R1

R2

R3

R4

R5

H2N

OH

1 2 3 4 5

12345

b4

a4

y1

Ions b Ions a- CO

Ions y

H2NNH

HN

NH

HN

OH

O

O

O

O

O

R1

R2

R3

R4

R5

H2N

OH

1 2 3 4 5

12345

b4

a4

y1

Ions b Ions a- COIons b Ions a- CO

Ions y

“Proteomics, peptide sequencing and the fragmentation mechanisms of small organic ions” Journal of massspectrometry (2000), 35

Roepstorff P., Fohlman J. Biomed. Mass Spectrom. 1984; 11: 601

• Fragmentation (MSMS)

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z0

100

%

X-GC12022203 11 (0.218) Sm (Mn, 10x1.00); Cm (8:30) TOF MSMS 482.00ES+ 1.18e4173.1

129.1

763.3201.1

650.3

260.2

228.1

382.2

314.2

262.1 375.1

536.2482.2389.2

504.2 632.3 651.3

764.3

y6

y5

y4

y3

y2

b2

b3

a2

a4-H2O

y5-H2O

i lysineIN

y1

b3

S – I – I – N – F – E – K y6 y5 y4 y3 y2 y1

b2

INFE

Fragmentation d’un heptapeptide MW = 962,3 g/mol [M+2H]2+ = 482.2 Da

[M+2H]2+

- Fragmentation de petites molécules organiques

Etude d’une benzylamine

C23H41N Mmonoisotopique = 331,3 g/mol

NCH3

CH3

HH7C3

C13H27

N+

Molecular Formula = C23H42NMonoisotopic Mass = 332.331177 Da

CH2+

+

Molecular Formula = C 7H7

Monoisotopic Mass = 91.054227 Da

H

C13H27

N+

CH3

Molecular Formula = C 16H34NMonoisotopic Mass = 240.268576 Da

H

HN

+CH3

Molecular Formula = C 3H8NMonoisotopic Mass = 58.065126 Da

332.3

240.3

91.1

58.1

[M+H]+

• Couplage chromatographique (LCMS et LCMSMS)

- Possibilité de couplage du Q-Tof à une chaîne HPLC

- Etude de milieu complexe : � Séparation chromatographique des différents composés d’un mélange� Spectre de masse de chaque pic chromatographique� Fragmentation MSMS des ions observés

-Applications :� Suivi de synthèse� Analyse extrait naturel� Analyse milieu biologique

- Exemple : analyse d’un extrait naturel de jujube

- Objectif : appréhender les différences entre les différents stades de maturation

Chromatogramme UV obtenu par LC/MS

Spectre de masse du composé à 20,8 min :15-DEC-2011P5.1 F2Q-TOF

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950m/z0

100

%

Z-SZ11121501 1064 (20.796) Sm (Mn, 10x1.00); Cm (1049:1069-(842:903+1224:1303)) 1: TOF MS ES+ 689307.1

308.1

355.1406.1

P 5 . 1 F 2 1 5 - D E C - 2 0 1 1Q - T O F

2 . 0 0 4 . 0 0 6 . 0 0 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 3 2 . 0 0 3 4 . 0 0 3 6 . 0 0 3 8 . 0 0 4 0 . 0 0 4 2 . 0 0 4 4 . 0 0 4 6 . 0 0 4 8 . 0 0 5 0 . 0 0T im e0

1 0 0

%

Z - S Z 1 1 1 2 1 5 0 1 2 : D io d e A r r a y T I C

1 . 2 3 e 84 . 2 5

6 . 8 5

5 . 5 7

6 . 3 0

1 0 . 3 8

9 . 6 7

4 3 . 4 3

4 1 . 9 52 0 . 7 8

1 6 . 1 0

1 3 . 1 7

1 9 . 4 73 6 . 8 7

2 1 . 7 2

3 2 . 9 23 2 . 4 72 5 . 7 2

2 4 . 5 73 1 . 5 7

2 6 . 5 2 2 8 . 1 32 9 . 7 8

3 4 . 6 53 9 . 8 0

4 3 . 9 3

4 5 . 6 2

4 5 . 2 5 4 8 . 6 5

Molécules attendues de la famille des flavonoïdes.La masse mesurée peut correspondre à la gallocatéchine

Etude par LC/MS/MS

307.1

[M+H]+

5-JAN-2012P5.1Q-TOF

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340m/z0

100

%

Z-SZ12010307 164 (21.336) Sm (Mn, 10x1.00); Sm (Mn, 10x1.00); Sm (Mn, 10x1.00); Cm (161:165) 3: TOF MSMS 307.00ES+ 382x24139.1

163.1

151.1181.1 195.1 307.1223.1

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O

223

181

139

- CO

- H2O

Spectre MS/MS de l’ion détecté à 307 Da

A B

C

[M+H]+

Composés [M+H]+ m/z obtenus en MS/MS

Gallocatéchine 307139, 151, 163, 181, 223,

195

Catéchine 291123 ,139, 147, 165, 179,

207, 273

Quercétine 303137, 153, 165, 229, 257,

274, 285

Quercétine hexoside 611 303

-Identification de la gallocatéchine grâce à son spectre de fragmentation

- D’autres composés sont identifiés de la même façon :

EI

CI (Méthane)

Quadripôle

(Q)

EI : +

CI : +/-

GC

Petites molécules apolaires,

volatiles

MW : 30 – 1000 g/mol

Recherche en bibliothèque

(NIST)

Solvant compatible : CHCl3,

CH2Cl2, MeOH, Hexane

A éviter : DMSO, DMF, H2O,

AcOEt

DSQ II

- Analyse par GC/MS

Exemples d’analyse :

- Qualitative : Dérivé de kérosène, extrait de Thym, extrait de jujube : complémentarité avec la LC/MS

- Quantitative : dosage de composés allergènes

Chromatogramme obtenu lors de l’analyse d’un dérivé de KérosèneRT: 0.00 - 36.84

0 5 10 15 20 25 30 35Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

4.20

7.65

2.61

5.096.11

8.85

14.15

9.3810.65

21.4012.94 31.5014.35 18.10 28.4019.25 22.40 32.3326.5423.81 35.95

NL:1.04E9TIC MS Z-DJ11051803

� Echantillon complexes : centaines de composés � Quelles informations en tirer ?

• Analyse Qualitative (GCMS)

Exemple d’identification à l’aide de la bibliothèque spectrale NIST

Temps de rétention

4,2 min 7,65 min

Spectre de masse

Identification

Nonane - Score : 935/1000 Décane - Score : 930/1000

Z-DJ11051803 #741 RT: 4.19 AV: 1 SB: 116 3.71-3.87 , 4.60-4.78 NL: 2.24E8T: + c Full ms [30.00-500.00]

40 60 80 100 120 140 160 180m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

57.1

43.1

85.2

41.1

71.2

56.170.1

84.255.1 99.2

39.1 98.2128.269.1

86.244.1 72.2 100.2 129.365.138.1 91.1 113.3 141.3 149.1 168.3117.9 191.0156.3 196.2178.3

Z-DJ11051803 #1906 RT: 7.65 AV: 1 SB: 116 3.71-3.87 , 4.60-4.78 NL: 2.26E8T: + c Full ms [30.00-500.00]

40 60 80 100 120 140 160 180m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bund

ance

57.1

43.1

71.1

41.1 85.2

56.1

70.255.1

84.299.2

69.139.0113.2 142.372.244.1 86.2

68.1 100.2 143.3114.332.0 140.2125.2 154.2 179.4167.3 195.0

RT: 1.32 - 15.60

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

4.20

7.65

2.61

5.096.11

3.656.01 7.36

3.508.855.79

6.364.79

3.09 5.14 6.77 14.152.29

2.05 9.388.20 10.65 11.149.6312.05 12.94

14.3513.26

NL:1.04E9TIC MS Z-DJ11051803

C8 C9 C10 C11

Démarche appliquée à l’ensemble du chromatogramme

Dérivés d’alcanes en

Même stratégie utilisée pour l’analyse d’une huile essentielle

extraite du thym

RT: 0.00 - 49.87

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

21.23

8.96

7.62

21.6810.717.356.45 28.36

13.91 18.28 31.9624.72 40.9733.92 43.2637.65 49.8347.043.592.61

NL:2.93E9TIC MS Z-JM11100402

Z-JM11100402 #3378 RT: 21.10 AV: 1 SB: 929 19.10-20.73 , 22.21-25.68 NL: 6.29E7T: + c Full ms [30.00-650.00]

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

135.0

150.1

91.0115.0

107.0

136.1117.1

77.0 105.065.0 151.139.0 121.151.0 92.189.0 137.1 152.2 255.1 267.2167.1 193.3 224.9209.9 239.4 284.6 298.9

Chromatogramme de masse

Spectre de masse du composé majoritaire Recherche dans la base de donnée et proposition de structure

Analyse d’un extrait de Jujube :

� Fraction organique apolaire issue du même fruit que pour l’analyse LC/MS

RT: 0.00 - 57.01

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ative

Abu

ndan

ce

48.31

48.55

31.0327.75

39.8631.54

47.5037.13

4.90 52.6828.36 47.08 53.2140.21

56.8823.6645.69

9.41 44.4125.91

41.1134.7913.45 18.093.53 5.31 19.2115.33

NL:1.41E9TIC F: + c Full ms [50.00-650.00] MS Z-SZ11061403

� Echantillon très complexe� L’identification pic par pic à l’aide de la bibliothèque ne suffit pas toujours

Exemple : spectre de masse du composé à 48,3 min

Z-SZ11061403 #11828 RT: 48.30 AV: 1 SB: 145 51.08-52.13 NL: 3.96E7T: + c Full ms [50.00-650.00]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

81.1 107.1

95.1

55.0145.1

57.1

119.1

159.1161.2163.2

213.2

173.2

255.2329.4

178.2 303.4273.3 414.5

396.5381.4

330.4302.3 415.4354.5

416.4 491.2455.3 535.1 577.2 641.0603.4

Identification partielle du composé

�Identification par familles de composés : triglycérides, stérols végétaux, acides gras saturés et insaturés…�GC/MS utilisée en complément de l’analyse LC/MS permet de mieux appréhender l’échantillon dans son ensemble

Dosage de composés allergènes

Méthode utilisé : étalonnage interne-Principe : Le dosage par étalonnage interne repose sur l’ajout en quantité parfaitement connue, dans toutes les solutions standards et tous les échantillons, d’une molécule qui sert de référence durant les phases de l’analyse. Le dosage, se fait de façon relative par rapport à cette molécule de référence, appelée étalon interne.

-But : s’affranchir de la variation expérimentale (erreur de prises d’échantillon, volume d’injections, reproductibilité de la réponse en masse, …) :• Injection 1 : Vinj = 10µl IA = 50 et IEID = 10 rapport = 5• Injection 2 : Vinj = 9µl IA = 45 et IEID = 9 rapport = 5

• Analyse Quantitative (GC/MS)

Dosage de cinq allergènes dans un extrait de coriandre : limonène, linalol, citronellol, géraniol, eugénol.

Gamme étalon des cinq composés + Etalon interne : DibromobenzèneRT: 0.00 - 18.02

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Relative Abundance

9.14

5.80

6.84

10.63

8.31

5.174.39 9.40 15.7912.647.36 11.586.05 15.3414.36 17.704.272.67

NL:1.25E8TIC MS 100ppm_110111125245

Analyse en mode SIM pour une meilleure sélectivité : exemple sur le pic du linalol à 5ppm

RT: 6.63 - 7.03

6.65 6.70 6.75 6.80 6.85 6.90 6.95 7.00Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bund

ance

RT: 6.85MA: 496527095SN: 170RMS

6.92 6.98 7.017.006.69 6.746.71 6.75 6.796.776.64

NL:3.72E8TIC MS S1

RT: 6.63 - 7.03

6.65 6.70 6.75 6.80 6.85 6.90 6.95 7.00Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bund

ance

RT: 6.85MA: 65849672SN: 2070

6.67 6.74 6.79

NL:4.90E7TIC MS 5ppm

Full scanAire : 496e6S/N : 170

SIMAire : 65e6S/N : 2070

Exemple de résultat obtenu :

Quantification par LC/MS triple quadESI

Triple Quadripôle

(QqQ)

+/-

MS-MS

SRM/MRM

UPLC


MW : 50 – 1000 g/mol

Quantification

Solvant compatible : H2O,

Acétonitrile, MeOH

A éviter : DMSO, DMF, solution

tampon

- Dosage d'acrylamide à l'état de traces dans les aliments frits

- En 2002, découverte d’acrylamide, dans différents aliments cuits à haute température (pomme de terre, café, céréales…)

- Cette petite molécule polaire est connue pour ses propriétés neurotoxiques et une activité carcinogène potentielle chez l’Homme

- Projet :- Développement d’une méthode de dosage de l’acrylamide dans les produits frits à base de banane plantain- Etude réalisée par étalonnage interne - Mode SRM pour augmenter la sélectivité et obtenir ainsi la meilleure sensibilité

Composé Structure ion parent (m/z) ion fils (m/z) E collision (V) Tr (Min)

Acrylamide 72 55 11 11.9

Acrylamide deutéré

75 58 11 11.8

HH

HNH2

O

DD

DNH2

O

- L’acrylamide étant fortement polaire, elle n’est pas retenue avec des phases stationnaires apolaires classiques et son analyse est difficile.-La séparation s’effectue en utilisant une colonne ATLANTIS dC18 qui a la capacité de retenir les petites molécules très polaires lors d’une élution en mode isocratique avec 100% d’eau .

- Limite de quantification obtenue avec cette méthode : 50 ppb- Cette méthode de dosage (hors validation) est venue supporter une étude visant àexplorer de nouveaux procédés afin de réduire la formation d’acrylamide

AcrylamideY = 0.891391*X R^2 = 0.9990 W: Equal

0 1 2 3 4 5ppm

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

Are

a R

atio

Etude de la formation de l’acrylamide dans un système modèle

(asparagine+glucose) en fonction de la température.

Analyse MALDI-TOF/TOFMALDI

Temps de vol (TOF) (TOF/TOF)

+/-MS-MS

Haute résolution

Molécules de haute masse (peptides, protéines, ADN,

polymères….)500 – 100 000 g/mol

MacromoléculesSequençage peptidique

Solvant à éviter : DMSO, DMF, solution tampon

- Analyse d’un mélange de peptide- Analyse MS/MS d’un peptide- Analyse d’une protéine (BSA)- Analyse d’une digestat (protéolyse enzymatique)- Analyse de polymère

Analyse d’un mélange de 9 peptides

2093.1

1619.8

2465.2

1347.7

1046.5 1758.9

1296.7 3147.5

757.4

0

500

1000

1500

2000

Inte

ns. [

a.u.

]

1000 1500 2000 2500 3000 3500m/z

: Ions monochargés � dépouillement simple

Spectre obtenu en mode positif, avec réflectron

[M+H]+

3147.5

0

50

100

150

200

250

300

Inte

ns. [

a.u.

]

3147 3148 3149 3150 3151 3152 3153 3154m/z

Résolution pour le pic à 3147 R = 19 700

[M+H]+

Analyse MSMS d’un peptide892.632

1388.946

1633.185

1204.808

496.486

312.578

740.513

1552.0342120.006

1876.481

567.533

1020.743

428.475821.571

244.626

1422.876

696.520 1991.728

2075.503

1145.753368.494

1746.397

128.773 961.688 1291.825

853.596

69.807

612.477

1107.715

Fragmentation 0:G3 LIFT 2120.0000, Smoothed, BaselineSubtracted

0

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

ns. [

a.u.

]

250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500m/z

Analyse MS/MS peptide 2119,1 g/mol

Utilisation de BioTools

On arrive à remonter à la séquence (partielle ou totale) du peptide

Analyse d’une protéine

66435.9

33221.8

22135.3

16612.0

0

100

200

300

400

500

600Inte

ns. [

a.u.

]

10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000m/z

Albumine de sérum bovin (BSA)Masse moléculaire 66 430 Da

[M+H]+[M+2H]2+

Analyse d’une digestion trypsique

• Protéine connue de masse: 30 290 g/mol

• 269 acides aminés• Digestion trypsique: Peptides R/K-Cter

2026.0

1212.6

2193.0

1758.8

2598.6

2273.2

1952.0

2323.1

1316.7

2080.1

1438.8 1836.9

1800.8

1590.8

2145.0

884.6 1630.7

2550.5

2642.6

1900.91272.5

2119.1

1477.7

1532.71020.5650.3 3300.83211.5

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

500 1000 1500 2000 2500 3000m/z

- Reconnaissance de 8 fragments par Biotools- Possibilité de faire de la MS/MS sur les signaux non attibués

Analyse d’un polymère PEG 3400

3386.9

3519.0

3474.9

3342.9

3298.8

3563.0

3210.8

3166.8

3651.0

3122.7

3695.1

3078.7

3739.1

3034.7

3783.1

3827.2

2990.6

3871.2

2946.6

3446.9

3915.2

2902.6

3959.2

3623.0

2858.6

4003.3

4047.3

2770.5

4091.3

4135.3

2682.5 4223.4

0

500

1000

1500

2000

2500

Inte

ns. [

a.u.

]

2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400m/z

Matrice: Dithranol

On observe deux distributions.

Avec agent de cationisation

3342.9

3298.8

3254.8

3430.9

3166.8

3474.9

3122.7

3519.0

3078.7

3563.0

3034.7

3607.0

3651.0

2990.7

2946.6

3695.1

3739.1

2902.6

2858.6

3783.1

2814.6

3827.1

2770.5

3871.2

2726.5

3915.2

3959.2

2682.5

4003.2

4047.3

2594.44091.3

4179.3

0

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

ns. [

a.u.

]

2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400m/z

Matrice: dithranolAgent de cationisation: NaI

Plus qu’une seule distribution.

3342.9 3386.93430.9

PEG 2 0:F4 MS Raw

0

1000

2000

3000

4000

5000Inte

ns. [

a.u.

]

3386.9 3430.9

3342.9

3446.93402.93358.8

PEG 0:F2 MS Raw

0

500

1000

1500

2000

2500

Inte

ns. [

a.u.

]

3340 3360 3380 3400 3420 3440m/z

44 Da

44 Da

16 Da

- Sans agent de cationisation: Adduit avec les ions Na+ et K+ �

Perte de sensibilité car une même molécule se trouve sous deux formes/complexité d’interprétation.- Avec agent de cationisation: Adduit Na+ seulement � Spectre plus clair

[M+Na]+

[M+Na]+

[M+K]+


Témoignage d’un

partenaire industriel

Medesis Pharma

Laure Dougui

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