ÉÉpidpidéémiologie actuelle desmiologie actuelle desinfections respiratoiresinfections respiratoiresvirales chez lvirales chez l’’enfantenfant

Jacques Brouard

Astrid Vabret

François FreymuthService de Pédiatrie

Laboratoire de VirologieHumaine et Moléculaire

Pour le clinicien un diagnostic virologiqueest parfait s’il est

! disponible

! réalisable au lit du malade

! simple

! rapide

! spécifique et sensible

! bon marché

Mais il n’existe pas …

Culture cellulaire! Mise en culture du prélèvement sur différentes lignées

cellulaires et incubation

! Observation au microscope d’un effet cytopathogène

Effet cytopathogène

d’adénovirus sur cellules

MRC-5

(photo. Virologie Caen)

! Mais il n’existe pas UNE lignée cellulaire permettantune culture pour tous les virus respiratoires

! Voire certaines cultures sont difficiles ou impossibles(hCoV-NL63, MPV)

«!Le diagnostic conventionnel!»• Immunofluorescence

– Fixation des cellules sur lame

– Révélation par des anticorps dirigés contre les protéinesvirales et marqués par une molécule fluorescente

– Lecture au microscope à fluorescence

Immunofluorescence surcellules nasopharyngées

(photo. Virologie Caen)

• Nécessité d’une certaine expertise lors de lecture

• Pas toujours possibilité IF par exemple pour lesrhinovirus ++++

FREYMUTH F et al. — Les virus responsables d’infections

respiratoires en pédiatrie. Bilan de 3 480 aspirations nasales

réalisées chez l’enfant en une période de six ans.

Ann Pédiatr (Paris), 1987. 34, n 7. 493-501.

Infections virales respiratoires du jeune entant (CHRU de Caen) 3480aspirations nasales de novembre 1980 à décembre 1986

• Virus respiratoire syncytial 897 (25,7%)

• Virus influenza A et B 108 (3,1%)

• Virus parainfluenza 3 111 (3,2%)

• Adénovirus 107 (3,1%)

• Rhinovirus 115 (3,3%)

ÉÉpidpidéémiologie viralemiologie viraleCHU de CaenCHU de Caen

12/1980 12/1980 àà 12/1990 12/19907085 pr7085 prééllèèvements (%/+)vements (%/+)

07/2000 07/2000 àà 08/2003 08/20033151 pr3151 prééllèèvements (%/+)vements (%/+)

VRSVRS 1497 (64) = 21,2 % 1497 (64) = 21,2 % prlvts Ttxprlvts Ttx 517 (42) = 16,4 % 517 (42) = 16,4 % prlvts Ttxprlvts Ttx

RhinovirusRhinovirus 212 (9)212 (9) 235 (19)235 (19)

EntEntéérovirusrovirus 79 (6,5)79 (6,5)

Influenza A/BInfluenza A/B 221 (9,5)221 (9,5) 195 (16)195 (16)

AdAdéénovirusnovirus 244 (10,5)244 (10,5) 96 (8)96 (8)

ParainfluenzaParainfluenza 1,2,3 1,2,3 159 (7)159 (7) 101 (8)101 (8)

Recherche virale +Recherche virale + 33 %33 % 39 %39 %

ÉÉpidpidéémiologie virale par mmiologie virale par mééthodes virologiques traditionnellesthodes virologiques traditionnellesCHU de CaenCHU de Caen

0

10

20

30

40

50

1112 1 2 3 4 5 6 9 101112 1 2 3 4 5 6 9 101112 1 2 3 4 5 6 9 101112 1 2 3 4 5 6mois

% pvtVRS

influenza A/Bparainfluenza 1,2,3Rhino

AdV

1999-2000 2002-20032001-20022000-2001

L’épidémiologie virale varie selon les années

Protocole exploration biologie moléculaire surplusieurs virus à la fois

Aspirations nasales à –80 °C

Extraction ARN (Qiagen®)

RT-PCR multiplex 1 RT-PCR multiplex 2 RT-PCR multiplex 3

Métapneumovirus

VRS

Influenza A

Influenza B

Parainfluenza 4

Parainfluenza 3

Parainfluenza 2

Parainfluenza 1

HCoV 229E

Influenza C

Rhinovirus

HCoV OC43

Évolution du protocole

Techniquesconventionnelles

Techniquesmoléculaires

Enfants consultant aux Urgences de Pédiatrie pour atteinte respiratoire aiguë

ENFANTSHOSPITALISES

1/11/2003 au 30/03/2004

Antigéniqueimmunofluorescence

Antigéniqueimmunofluorescence

et culture HuH7

Nombre de virusdétectables 7 13

Aspirations nasales 260 260

Recherche positive (%)Coinfections virales

150 = 57,6%0

188 = 72,3 %5

Épidémiologie virale enpourcentage des virus

détectés : 150 193

v. RespiratoireSyncytial

92,0 % 74,1 %

Rhinovirus ? 11,9 %

v. Influenza 7,3 % 9,3 %

Adénovirus 0 % 2,6 %

v. Parainfluenza 0,6 % 1,0 %

Entérovirus ? 1,0 %

Métapneumovirus ? ?

Coronavirus ? 0 %

Moléculaire par PCRet RT-PCR multiplex

15

263

242 = 92 %52

317

49,8 %

28,7 %

6,3 %

1,6 %

2,8 %

2,5 %

5,4 %

3,5 %

ENFANTSHOSPITALISES/ NON H1/11/2003 au 30/03/2004

Total HOSPITALISES

Nombre d’enfants 449 263

Age moyen 7,3 (+/-5,4) 5,3** (+/-4,5)

Recherche positive (%) 411 = 91,5% 242 = 92 %

Épidémiologie virale enpourcentage des virus

détectés : 518 317

v. RespiratoireSyncytial

43,6 % 49,8 %**

Rhinovirus 31,8 % 28,7 %

v. Influenza 8,8 % 6,3 %**

Adénovirus 2,3 % 1,6 %

v. Parainfluenza 3,2 % 2,8 %

Entérovirus 2,1 % 2,5 %

Métapneumovirus 4,4 % 5,4 %

Coronavirus 3,4 % 3,5 %

NON HOSPITALISES

186

9,3** (+/-6,3)

169 = 90,8 %

202

33,7 %**

36,1 %

13,9 %**

3,5 %

4,0 %

2,5 %

3,0 %

3,5 %

ÉÉpidpidéémiologie virale PCR multiplexmiologie virale PCR multiplexCaen 2003-2004Caen 2003-2004

Pneumovirus 49 %

Picornavirus 34 %

Adenovirus 2 %

Parainfluenza Parainfluenza 3 %3 %

Influenza 9 %

Coronavirus 3 %

Lors de cette enquête le Mycoplasma pneumoniae représentait 1% des résultats

Nouvelles techniques = modification de l’épidémiologie

ÉÉpidpidéémiologie virale PCR multiplex Wisconsinmiologie virale PCR multiplex WisconsinHenrickson PIDJ 2004; 23(1s): S11-S18

Children’s Hospital of Wisconsin 1/11/1996 au 31/10/19983325 Infections des VRI (42% bronchiolite, 38% pneumopathie, 12% laryngite)829 tests chez enfants de moins de 2 ans avec Hexaplex :

170 antérieurement sainsHexaplex (7 virus) recherche positive = 41%Influenza 34%, VRS 40%, VPI 16%Épidémiologie en fonction du tableau clinique

48%

24%

12%

69%

19%

16%

ÉÉpidpidéémiologie virale PCR multiplex Southamptonmiologie virale PCR multiplex SouthamptonLegg PIDJ 2005; 24: 611-16

Southampton University Hospital on the South Coast of England

- 88 nourrissons « à risque atopique » suivis 1er hiver

- 1/11/1997 au 31/03/1998 ambulatoire

RT-PCR (RV, EV, HCoV, AdV, VPI, VI, VRS, Mp, Cp)

Prélèvements effectués lors de symptômes respiratoires

. Prélèvements = 123

. Identification virale = 151

Épidémiologie : Picornavirus 46% (Caen 38,6)

VRS 27% (Caen 33,7)

VPI 13%

HCoV 9%

Coinfection virale = 20% (picornavirus + VRS ou VPI)

Comparaison des méthodes• Techniques

conventionnelles

– Caractère infectieux– Isolement de la

souche– IF : rapidité 2h

12,11! (n = 7)– Culture :référence

long 5 jours+IF 48,58! (n = 13)

– Prélèvement de bonnequalité, acheminementrapide

– Utilisateur entraîné

• PCR multiplex

– Gain en sensibilité– Outil épidémiologique– Séquençage– Rapport coût/efficacité– Rhinovirus, hMPV,

coronavirus, bocavirus

– Adapté aux grandesséries2 jours; 23,69! (n = 15)

– Conditions de travailspécifiques

– Virus non infectieux oulatent

Coût direct et indirect Laboratoire Freymuth

Discussion

A B A B C 1 2 3 4

1997Hexaplex

(Prodesse)

1998 Osiowy et coll.

1999 Grondahl et coll.

2003-2004 Coiras et coll.

2004 Syrmis et coll.

2004 Templeton et coll.

2004 Bellau-Pujol et coll.

Année AuteurAdéno

virus

Entéro

virus

Rhino

virushMPV

HCoV

OC

43

HCoV

229E

Virus influenza Virus parainfluenza VRS

Outils moléculaires : fiables pour le diagnostic ?

Falsey et al., J Clin Dis, 2005

Non malades,S-1 à S+1

RT-PCR nichée

Pathologie respiratoireN = 146 : VRS = 17; hMPV = 5 (15%)

Témoins N = 158 :VRS = 1; hMPV = 0

NB : adultes

Choix de la technique de détection enfonction des virus recherchés

Détectionantigénique

Isolement enculture

PCR

Influenza A et B + ++ +

Influenza C - - ++

VRS ++ ++ ++

hMPV - +/- ++

Parainfluenza ++ + ++

Adénovirus + + ++

Rhinovirus - + ++

Coronavirus - +/- ++

Une sensibilité supérieure n’est pas leseul intérêt des techniques moléculaires

– Épidémiologie différente selon les

phénotypes sifflants du nourrisson

– Intérêt dans évaluation de la gravité de

l’atteinte respiratoire

– Intérêt de veille épidémiologique : virus

émergents

Enquêtes épidémiologiquescomparatives : Caen 2003-2004

Tableau clinique Bronchiolites Asthmes du nourrisson p

Nombre d’aspirations nasales 298 61

Age moyen en mois(± DS)

5 (±4) 10,5 (±5,5)

Epidémiologie virale (%)

v. Respiratoire Syncytial 54,3 25,7 < 0,001

Rhinovirus 29,0 44,6 < 0,01

v. Influenza 3,7 8,1 NS

Adénovirus 0,9 4,0 NS

v. Parainfluenza 2,6 0,0 NS

Entérovirus 1,1 4,0 0,06

Coronavirus 3,5 8,1 NS

Métapneumovirus 4,9 5,5 NS

• RT-PCR en temps réelstandardisée avec ARNgène de « ménage »GAPDH

• 1ère étape de validationanalytique

• Corrélation entre lacharge virale et lagravité de labronchiolite chez 75nourrissons : 36 + parIFA-CV-RT PCR

Gueudin et al. J Virol Methods 2003; 109: 39

Quantification ARN VRSaspiration nasale

Respiratory syncytial virus load predicts diseaseseverity in previously healthy infants

1 log charge RSV = 0,8 jour supplémentaire hospitalisation

Les virus «!émergents!»• Le métapneumovirus humain

– Infection hivernale

– Age précoce (6,7 mois)

– Responsable de bronchiolites (70,6%)

– 4 ou 5ème agent chez les enfants hospitalisés (~ 5%)

• Les coronavirus– Détectés dans 4% à 9% des prélèvements « traditionnels » négatifs

– Présents dans les infections des voies aériennes inférieures

– Co-infections fréquentes

– Comorbidités

• Les bocavirus….

Comparaison phénotype clinique <24 moisCoronavirus/Métapneumovirus/VRS (09/04-05/05)

S/VRS35,9

(7,8)

12,5

(3,1)

8,9

(1,8)

O_ Tt %

(réa %)

5,64,43,7Durée Hosp (jours)

S/VRS21,92539,3Gastro-entérite %

S/VRS

(S/VRS)

87,5

(70,3)

56,3

(50)

30,4

(23,2)

Atteinte VAI %

(bronchiolite)

S/VRS12,521,926,8Otite MA %

-4,1-3,4-4,5Début !p jours

S/HCoV18,721,99Atopie P %

S/VRS12,528,133,9Comorbidité %

S/VRS689Âge mois

pVRS

64

hMPV

32

HCoVs

56

Atteintes Radiologiques MPV

ProblProbléématique de lmatique de l’é’étude destude desinfections viralesinfections virales

? Non vues par une structure de soinNon vues par une structure de soin

Prise en chargePrise en chargeMMéédecins de villedecins de ville

Venues directes auxVenues directes auxUrgences hospitaliUrgences hospitalièèresres

Hospitalisations :Hospitalisations :Population de loin la plus Population de loin la plus éétuditudiééeeReprRepréésentativitsentativitéé ? ?

ConclusionConclusion• Chaque année ~ 500000 bronchiolites• 2 à 5% hospitalisés• Parmi ceux-ci ~ 40 % recherche virale positive• Place des autres virus grâce au développement de

la biologie moléculaire +++• Exceptionnel de voir des virus nouveaux, hMPV et

HCoV-NL63, avec une telle prévalence (~ 10%)• Études complémentaires compréhension de la

physiopathologie de l’atteinte respiratoire enfonction de chaque virus : séquelles à long terme #

• Surveillance au niveau planétaire par OMS apermis de détecter SRAS, H5N1

• Virus de la prochaine pandémie ?