Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles

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Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles. - Transferts d'électrons en biologie - Spectroscopie d'absorption cinétique Photosystème I, ferrédoxine, partenaires solubles Ferrédoxine-NADP + oxydoréductase, nitrite réductase, hydrogénase : - présentation - PowerPoint PPT Presentation

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  • Photosystme I, ferrdoxine et partenaires solubles- Transferts d'lectrons en biologie- Spectroscopie d'absorption cintique Photosystme I, ferrdoxine, partenaires solubles

    Ferrdoxine-NADP+ oxydorductase, nitrite rductase, hydrognase :- prsentation- transferts dlectron, mcanismesPierre StifCEA SaclayDSV/iBiTec-S/SB2SMLaboratoire de Photocatalyse et Biohydrogne

  • Interaction des orbitales lectroniques impliques dans le transfert est faible :les ractants D et A n'ont pas en commun d'atome ou de groupement chimique ("outer-sphere mechanism")

    Ractions chimiques (enzymatiques ou non) :les ractants ont souvent en commun un atome ou un groupement chimique ("inner-sphere mechanism")D + A D+ + A-En biologie : Distances centre centre : 8 - 25 Distances bord bord : 3 - 20 ("outer-sphere mechanism")

  • nergie d'ionisationdans le videD ALes orbitales lectroniques impliques doivent se recouvrirdistanceCouplage lectronique (faible) TDA

  • nergie potentiellexnoyaux (d, )(D + A)(D+ + A-)x0 (D, A)x0 (D+, A-)(D + A)(D+ + A-)

  • (D + A)(D+ + A-)G

  • Constante de vitesse de transfert d'lectron kTE (thorie semi-classique de Marcus)Conditions de validit : - faible couplage lectronique TDA entre donneur et accepteur (d > 6-7 , dbord bord > 3-4 )- transfert d'lectron coupl des vibrations de faible nergie : h < kBT (traitement classique)G : diffrence d'nergie libre entre ltat final (D+ A-) et ltat initial (D A) : nergie de rorganisation (toujours > 0, typiquement 0.5 1.5 eV)T : temprature; kB : cte de Boltzmann; h : cte de PlanckMarcus & Sutin (1985) Biochim. Biophys. Acta 811, 265-322

  • rgion normale rgion inverse ((di,i)) = CteG < 0log (kET)- G0TDA = Cte

  • Centre ractionnel bactrien (Rhodobacter sphaeroides)

  • Mlange l'quilibre D A D+ A- : modifications de proprits spectroscopiques lies au transfert d'lectron. Ex. : en RMN, systme partiellement rduit. En rgime de mlange rapide de raies "ox" et "red" (kTE > ox - red), on observe un largissement ch des nouvelles raies rsultantes ch, d au principe d'incertitude ("lifetime broadening") : E/kTE = hch /kTE h d'o ch kTEMthodes de mesure des vitesses de transfert d'lectronsTransfert d'lectron dclench par une photoexcitation laser (spectroscopie d'absorption laser, RPE cintique, spectroscopies vibrationnelles, ...):- systmes photobiologiques naturels : centres ractionnels photosynthtiques, photodissociation dun ligand (hme-CO), photolyase, ...- adjonction ou modification d'un cofacteur "color" pour le rendre photochimiquement actif (dure de vie assez longue d'un tat excit du cofacteur) :- complexes de Ruthnium adsorbs ou dans un complexe qui permet la liaison la protine.- porphyrines avec Zn ou Mg substitus Fe.- flavines naturelles, associes la protine ou ajoutes dans le milieu.

  • Lumire danalyseExcitation0 t 0AA = - log (I/I0)dtection/amplification/numrisationEchantillonSpectroscopie dabsorption par clairsMesures entre 250 et 1500 nm (transitions lectroniques)

  • D'aprs Biochemistry & Molecular Biology of Plants (Buchanan/Gruissem/Jones)(American Society of Plant Physiologists)ATP et NADPH : assimilation du CO2 en sucres (cycle de Calvin)

  • photosystme Icytochrome c6(plastocyanine)ferrdoxine(flavodoxine)FB FA agrgats [4Fe-4S]

    FX A1, A1' : phylloquinonesA0, A0' : chlorophylles a

    P700 : dimre de chl. a

  • 20 psP700+/P700Em (V) (ref.: H+/ H2 at pH 0)P700+/P700*-1.2-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.4A0, A'0FXFAFB1-3 ps15 ns/200 nshn (700 nm) = 1.77 eVFdP700 : dimre de chlorophylles a A0, A'0 : chlorophylles aA1, A'1 : phylloquinones FX, FA and FB: agrgats 4Fe-4SA1, A'1

  • Jordan et al. (2001) Nature 411, 909400 kDaPhotosystme I de la cyanobactrie Synechococcus elongatus : structure 2.5

  • Jordan et al. (2001) Nature 411, 909Vue perpendiculaire la membrane: tous cofacteurschlorophylles :transfert d'lectrontransfert d'excitation ("antenne")

  • Centres ractionnels photosynthtiques :

    - les premires tapes de transfert productif (sparation initiale, stabilisation) se droulent loptimum: - G = . Il sagit dune exception en biologie

    - les recombinaisons de charges (court-circuit) sont plus lentes que ltape de transfert vers laccepteur suivant: rgion inverse de Marcus (pour D+A- = P700+ Chla-)

  • PSI = photosystme IFd = ferrdoxinePSI- = (FA,FB)-Spectroscopie d'absorption cintique pour tudier la rduction de la ferrdoxine par le photosystme I Equilibre de liaison l'obscurit :

  • PSI = photosystme IFd = ferrdoxinePSI- = (FA,FB)-Spectroscopie d'absorption cintique pour tudier la rduction de la ferrdoxine par le photosystme I Equilibre de liaison l'obscurit :

  • Equilibre de liaison l'obscurit :Spectroscopie d'absorption cintique pour tudier la rduction de la ferrdoxine par le photosystme I PSI = photosystme IFd = ferrdoxinePSI- = (FA,FB)-

  • Ferrdoxine (Fd) - Fd-(FA,FB) - (FA,FB)-(Fd, (FA,FB)-) - (Fd-, (FA,FB))Synechocystis 6803 :3 phases de 1er ordre pH 8.0 : < 1 s, 20 s et 100 s 21C

  • Ferrdoxine de cyanobactrieFukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017

  • Ferrdoxine de cyanobactrieFukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017rsidus acides aspartique et acide glutamique : COO-rsidus basiques arginine, lysine et histidine: atomes N portant une charge >0

  • membrane

  • PsaE PsaC PsaDmembrane

  • Mutations des 3 sous-units priphriques PsaC, PsaD et PsaE

  • PsaE PsaC PsaDLes 3 sous-units priphriques PsaC, PsaD et PsaE sont impliques dans la liaison de la ferrdoxinemembrane

  • ferrdoxine-NADP+-rductase (FNR)2 e-ferrdoxine-thiordoxine-rductase (FTR)2 e-hydrognase2 e-nitrite rductasesulfite rductase6 e-glutamate synthase(GOGAT)

  • Ferrdoxine-NADP+-oxydorductase (FNR)

  • Nitrite rductase

  • Modle dune hydrognase dalgue verte

  • Ferrdoxine-NADP+ oxydorductase (FNR)Serre et al. (1996) J. Mol. Biol. 263, 202 Fd- + NADP+ + H+ 2 Fd + NADPHFAD (flavine adnine dinuclotide)

  • Rduction 1 lectron de la FNR (sans NADP+)Observation de la FNR seule 630 nm

  • koff = 800 s-1k1 = 4.1 108 M-1s-1k-1 = 1.5 108 M-1s-1

  • PSI = photosystme IFd = ferrdoxinePSI- = (FA,FB)-k'on < kon ou k"off > koff

  • Morales et al. (1999) Biochemistry 38, 15764 Refined X-ray structures of the oxidized, at 1.3 , and reduced, at 1.17 , [2Fe-2S] ferredoxin from the cyanobacterium Anabaena PCC7119 show redox-linked conformational changesModle propos :

    aprs sa rduction, le changement conformationel de la ferrdoxine favorise sa dissociation du photosystme I: k"off > koff

  • k2/k1 = 1 0.25k2/k-2 20E0(FNRox/FNRsq) (-387 mV) < E0(FNRsq/FNRred) ( -335 mV) [PSI] = 2.0 M[Fd] = 4.0 M[FNR] = 0.8 Mpas de NADP+

  • tape 7 : transfert dhydrure :FADH- + NADP+ FAD + NADPH

  • Swamy et al. (2005) Biochemistry 44, 16054Nitrite rductase

  • 6 Fd- + NO2- + 8 H+ 6 Fd + NH4+ + 2 H2Oagrgat 4Fe-4S hmeprotinee-Nitrite rductase

  • Nitrite rductase6 Fd- + NO2- + 8 H+ 6 Fd + NH4+ + 2 H2OSwamy et al. (2005) Biochemistry 44, 16054ferrdoxine [2Fe-2S] : Em = -410 mV agrgat [4Fe-4S] : Em = -370 mV sirohme : Em = -290 mV

  • Cycle catalytique de la nitrite rductaseKuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, 510

  • Kuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, 10765Mlange rapide (stopped-flow) de 75 M nitrite rductase et 25 mM NaNO2cintique 563 nm : k = 0.45 s-1

  • [PSI] = 3 M[Fd] = 6 MVitesse initiale : 160 Fd roxydes par NiR et par sLa fixation de NO2- sur la NiR oxyde est beaucoup trop lente par rapport cette vitesse.Cc: cette raction n'a pas lieu au cours de la catalyse. Diffrentes possibilits : - NO2- se fixe beaucoup plus rapidement sur une forme rduite de NiR - NO2- se fixe lors d'un change avec la sortie du produit NH4+, ...

  • Modle dune hydrognase fer dalgue verteDaprs la structure de lhydrognase fer de Clostridium pasteurianum. Peters et al. (1998) Science 282, 18532 Fd- + 2 H+ H2

  • centre fer-soufrecystine pontantecentre di-fercentre di-ferCOCNCluster HH2H+H-Hydrognase fer

  • +-[PSI] = 2 Mphotosystme I540 nmLa contribution de P700+ (charge positive) est soustraite

  • [PSI] = 2 M[Fd] = 4 Mphotosystme I/ferrdoxine540 nmLa contribution de P700+ (charge positive) est soustraite

  • photosystme I/ferrdoxine/hydrognase[PSI] = 2 M[Fd] = 4 M[HydA1] 0.16 M540 nmLa contribution de P700+ (charge positive) est soustraite

  • [HydA1] = 0.16 M :

    t = 0: 73 Fdred reoxidized per HydA1 per s[HydA1] = 0.32 M :

    t = 0: 52 Fdred reoxidized per HydA1 per s -(d[Fdred]/dt)t = 0 = k [Fdred]t=0 = k [PSI] (exponential phase)

  • - Rduction de la ferrdoxine : cintiques et site de fixation sur le photosystme I :Rufat Agalarov, Patrick Barth, Jonathan Hanley Nicolas Fischer/Jean-David RochaixBernard Lagoutte, Herv Bottin

    - Ferrdoxine-NADP+-rductase et nitrite rductaseSonya Kuznetsova, Nicolas CassanDavid KnaffBernard Lagoutte Masakasu Hirasawa

    - HydrognaseTatiana Kuznetsova, Kateryna SybirnaHerv Bottin pierre.setif@cea.fr