Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles - Transferts d'électrons en biologie -...

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Photosystème I, ferrédoxine et partenaires soluble - Transferts d'électrons en biologie - Spectroscopie d'absorption cinétique - Photosystème I, ferrédoxine, partenaires solubles Ferrédoxine-NADP + oxydoréductase, nitrite réductase, hydrogénase : - présentation - transferts d’électron, mécanismes Pierre Sétif CEA Saclay DSV/iBiTec-S/SB 2 SM Laboratoire de Photocatalyse et Biohydrogène

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Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles

- Transferts d'électrons en biologie- Spectroscopie d'absorption cinétique- Photosystème I, ferrédoxine, partenaires solubles

Ferrédoxine-NADP+ oxydoréductase, nitrite réductase, hydrogénase :- présentation- transferts d’électron, mécanismes

Pierre SétifCEA SaclayDSV/iBiTec-S/SB2SMLaboratoire de Photocatalyse et Biohydrogène

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Interaction des orbitales électroniques impliquées dans le transfert est faible :les réactants D et A n'ont pas en commun d'atome ou de groupement chimique

("outer-sphere mechanism")

Réactions chimiques (enzymatiques ou non) :les réactants ont souvent en commun un atome ou un groupement chimique

("inner-sphere mechanism")

D + A D+ + A-

En biologie : Distances centre à centre : 8 - 25 Å Distances bord à bord : 3 - 20 Å ("outer-sphere mechanism")

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au sein d'une protéine

Puits de potentiel :densité de probabilité(orbitale moléculaire) :

énergie d'ionisation

dans le vide

D A

Les orbitales électroniques impliquées doivent se recouvrir

distance

transfert d'électron possible

Couplage électronique (faible) TDA

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éner

gie

pote

ntie

lle

xnoyaux (d, )

(D + A)

(D+ + A-)

Lorsque l'électron passe du donneur à l'accepteur, les noyaux ne changent pas de position

Approximation de Born-Oppenheimer,principe de Frank-Condon (transitions électroniques) : la transition est verticale

Conservation de l'énergie : la transition est horizontale

x0 (D, A)

x0 (D+, A-)

(D + A)(D+ + A-)

Tunneling de l’électron

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(D + A)

(D+ + A-)

énergie de réorganisation

Gactivation

Gactivation =(G ° + )2

4

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(G° + )2

4 kBT-

4 kBT

1kTE = TDA

2 exp4 2 h

Constante de vitesse de transfert d'électron kTE (théorie semi-classique de Marcus)

couplage électronique énergie d'activation

terme nucléaire (facteur de Franck-Condon)

FC

Conditions de validité : - faible couplage électronique TDA entre donneur et accepteur (d > 6-7 Å, dbord à bord > 3-4 Å)- transfert d'électron couplé à des vibrations de faible énergie : h < kBT (traitement classique)

G° : différence d'énergie libre entre l’état final (D+ A-) et l’état initial (D A)

: énergie de réorganisation (toujours > 0, typiquement 0.5 à 1.5 eV)T : température; kB : cte de Boltzmann; h : cte de Planck

Marcus & Sutin (1985) Biochim. Biophys. Acta 811, 265-322

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région normale région inverse

((di,i)) = Cte G° < 0

(D + A)

(D+ + A-)

Gactiv.G°

(di,i)

Gactiv.= 0

log (kET)

- G°0

TDA = Cte

(G° + )2

4 kBT-

4 kBT

1 expFC =

Gactivation =(G ° + )2

4

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par rapport à WT

WT

P865* Bpha P865+ Bpha-

Haffa et al (2002) J. Phys. Chem. 106, 7376

membrane

(bactériophéophytine a)

(quinone)

Centre réactionnel bactérien (Rhodobacter sphaeroides)

0.3 eV

P865* (1er état singulet excité): réducteur très fort

Energie libre

P865* Bpha

P865+ Bpha-

P865 Bpha

1012 s-1 G° (WT) = -0.2 eV

108 s-1 G° (WT) = -1.2 eV h

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Mélange à l'équilibre D A D+ A- : modifications de propriétés spectroscopiques liées au transfert d'électron. Ex. : en RMN, système partiellement réduit. En régime de mélange rapide de raies "ox" et "red" (kTE > ox - red), on observe un élargissement éch des nouvelles raies résultantes éch, dû au principe d'incertitude ("lifetime broadening") : E/kTE = héch /kTE h d'où éch kTE

Méthodes de mesure des vitesses de transfert d'électrons

Transfert d'électron déclenché par une photoexcitation laser (spectroscopie d'absorption laser, RPE cinétique, spectroscopies vibrationnelles, ...):- systèmes photobiologiques naturels : centres réactionnels photosynthétiques, photodissociation d’un ligand (hème-CO), photolyase, ...- adjonction ou modification d'un cofacteur "coloré" pour le rendre photochimiquement actif (durée de vie assez longue d'un état excité du cofacteur) :

- complexes de Ruthénium adsorbés ou dans un complexe qui permet la liaison à la protéine.- porphyrines avec Zn ou Mg substitués à Fe.- flavines naturelles, associées à la protéine ou ajoutées dans le milieu.

Mélange rapide ("stopped flow") de D et A (mesure d'absorption) :- Lorsque la diffusion des partenaires est cinétiquement limitante, la vitesse observée correspond à la vitesse de formation du complexe. A concentrations élevées, on peut éventuellement atteindre un plateau qui, en l'absence d'une autre étape limitante, correspond au transfert d'électron.- Limitation cinétique ( > 1-2 ms).

Voltampérommétrie cyclique de protéines adsorbées sur l’électrode ou en solution (transfert direct ou non): mesures de courants catalytiques

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Lumière d’analyse

Excitation

t

I

00

I0

0 t

0

ΔA

ΔA = - log (I/I0)

détection/amplification/numérisation

Echantillon

Spectroscopie d’absorption par éclairs

Résolution temporelle quasi illimitée

Identification de la nature chimique des réactionsgrâce aux spectres d’absorption différentiels

Mesures entre 250 et 1500 nm (transitions électroniques)

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D'après Biochemistry & Molecular Biology of Plants (Buchanan/Gruissem/Jones)(American Society of Plant Physiologists)

ATP et NADPH : assimilation du CO2 en sucres (cycle de Calvin)

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photosystème I

cytochrome c6

(plastocyanine)

ferrédoxine(flavodoxine)

FX

FB

FA

A1 A'1

A0 A'0

P700

FB FA agrégats [4Fe-4S]

FX A1, A1' : phylloquinonesA0, A0' : chlorophylles a

P700 : dimère de chl. a

Transfert d'électron ( ) déclenché par la lumière : absorption par les chlorophylles, formation de l'état excité 1S de P700

h

-

< 500 ns

+-

< 10 ps

, puis séparation primaire de charges

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20 ps

P700+

/P700

Em (V) (ref.: H+ / H2 at pH 0)

P700+

/P700*

-1.2

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

A0, A'0

FX

FA

FB

1-3 ps

15 ns/200 ns

h (700 nm) = 1.77 eV

Fd

P700 : dimère de chlorophylles a A0, A'0 : chlorophylles aA1, A'1 : phylloquinones FX, FA and FB: agrégats 4Fe-4S

A1, A'1

FX

FB

FA

A1 A'1

A0 A'0

P700

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Jordan et al. (2001) Nature 411, 909

400 kDa

membrane

Photosystème I de la cyanobactérie Synechococcus elongatus : structure à 2.5 Å

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Jordan et al. (2001) Nature 411, 909

Vue perpendiculaire à la membrane: tous cofacteurs

chlorophylles :

transfert d'électron

transfert d'excitation ("antenne")

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Centres réactionnels photosynthétiques :

- les premières étapes de transfert productif (séparation initiale, stabilisation) se déroulent à l’optimum: - G° = . Il s’agit d’une exception en biologie

- les recombinaisons de charges (court-circuit) sont plus lentes que l’étape de transfert vers l’accepteur suivant: région inverse de Marcus (pour D+A- = P700+ Chla-)

Dans la plupart des réactions de transfert d’électron biologiques :

G° est de faible valeur absolue, est souvent négatif mais parfois positif : -0.3 eV< G°< 0.3 eV

0.7 à 1 eV : région « normale » de Marcus

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PSI + Fd PSI ... Fdkon

koff

PSI- + Fd PSI- ... Fd

k'on

k'off

PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on

k''off

h h

ket1

Kd = koff/kon

ket2

ket = ket1 + ket2

t1/2 = ln(2)/ket

PSI = photosystème IFd = ferrédoxine

PSI- = (FA,FB)-

PSI + Fd PSI ... Fdkon

koff

PSI- + Fd PSI- ... Fd

k'on

k'off

PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on

k''off

h h

ket1

Kd = koff/kon

ket2

ket = ket1 + ket2

t1/2 = ln(2)/ket

réactions de 1er ordre

éclair laser

Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I

Equilibre de liaison à l'obscurité :

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PSI + Fd PSI ... Fdkon

koff

PSI- + Fd PSI- ... Fd

k'on

k'off

PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on

k''off

h h

ket1

Kd = koff/kon

ket2

ket = ket1 + ket2

t1/2 = ln(2)/ket

PSI = photosystème IFd = ferrédoxine

PSI- = (FA,FB)-

PSI + Fd PSI ... Fdkon

koff

PSI- + Fd PSI- ... Fd

k'on

k'off

PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on

k''off

h h

ket1

Kd = koff/kon

ket2

ket = ket1 + ket2

t1/2 = ln(2)/ket

2ème ordre

éclair laser

Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I

Equilibre de liaison à l'obscurité :

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PSI + Fd PSI ... Fdkon

koff

PSI- + Fd PSI- ... Fd

k'on

k'off

PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on

k''off

h h

ket1

Kd = koff/kon

ket2

ket = ket1 + ket2

t1/2 = ln(2)/ket

PSI + Fd PSI ... Fdkon

koff

PSI- + Fd PSI- ... Fd

k'on

k'off

PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on

k''off

h h

ket1

Kd = koff/kon

ket2

ket = ket1 + ket2

t1/2 = ln(2)/ket

Equilibre de liaison à l'obscurité :

Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I

réactions de 1er ordre

2ème ordre

éclair laser

PSI = photosystème IFd = ferrédoxine

PSI- = (FA,FB)-

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Ferrédoxine (Fd) - Fd-

(FA,FB) - (FA,FB)-

(Fd, (FA,FB)-) - (Fd-, (FA,FB))

Synechocystis 6803 :3 phases de 1er ordre à pH 8.0 : < 1 µs, 20 µs et 100 µs à 21°C

0 200 400 600

-1.0

-0.5

0.0

chan

gem

ent d

'abs

orpt

ion

à 58

0 nm

(

104 )

cyanobactérie Synechocystis 6803

time (µs)0 100 200 300

-1.0

-0.5

0.0

algue verte Chlamydomonas reinhardtii

460 480 500 520 540 560 580 600

0

1

2

3

4

5

coef

f. d

'abs

orpt

ion

(mM

-1cm

-1)

longueur d'onde (nm)

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Ferrédoxine de cyanobactérie

Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017

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Ferrédoxine de cyanobactérie

Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017

résidus acides aspartique et acide glutamique : COO-

résidus basiques arginine, lysine et histidine: atomes N portant une charge >0

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membrane

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PsaE PsaC PsaD

membrane

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-2 -1 0 1 2

-2

-1

0

1

2

3

D98K

R39K

R39H

E109KD98SS37K

H95E

V48I/K51T/R52Q

K104C & R109C

K104A

K34T/S37KK34T

R39Q

K34D & K34E

R39D & R39E

I11V/T14K/Q15R

E103Q

log(

Kd

mut

ant/K

d W

T)

charge du PSI

diminution d'affinité

augmentation d'affinité

Mutations des 3 sous-unités périphériques PsaC, PsaD et PsaE

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PsaE PsaC PsaD

Les 3 sous-unités périphériques PsaC, PsaD et PsaE sont impliquées dans la liaison de la ferrédoxine

membrane

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photosystème I

cytochrome c6

(plastocyanine)

ferrédoxine-NADP+-réductase (FNR)

2 e-

ferrédoxine-thiorédoxine-

réductase (FTR)

2 e-

hydrogénase2 e-

nitrite réductasesulfite réductase

6 e-

glutamate synthase(GOGAT)

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Ferrédoxine-NADP+-oxydoréductase (FNR)

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Nitrite réductase

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Modèle d’une hydrogénase d’algue verte

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Ferrédoxine-NADP+ oxydoréductase (FNR)

Serre et al. (1996) J. Mol. Biol. 263, 20

2 Fd- + NADP+ + H+ 2 Fd + NADPH

FAD (flavine adénine dinucléotide)

2 Fd- + FAD + H+ 2 Fd + FADH-

FADH- + NADP+ FAD + NADPH

flavine adénine

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+

-

600 nm

FNR (ferrédoxine-NADP+-réductase)

580 nm

NiR (nitrite réductase)

: PSI seul

+

-

: PSI + Fd

+

FNR/NiR-: PSI + Fd + FNR/NiR

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0 2 4 6 80

1

2

3

abso

rptio

n ch

ange

at 6

30 n

m ( 1

04 )

time (ms)

Réduction à 1 électron de la FNR (sans NADP+)

Observation de la FNR seule à 630 nm

[FNR]

PSI.Fdred PSI + Fdred

koff

Fdred + FNRox Fdox + FNRsq

k1

k-1

kred = k1 [FNRtotale] kox = k-1 [Fdtotale]

Conditions de pseudo-1er ordre : [FNRtotale] >> [PSI] [Fdred] et [FNRox] [FNRtotale][Fdtotale] >> [PSI] [FNRsq] et [Fdox] [Fdtotale]

[ ][FNRsq](t) = kred [PSI-Fd-]t=0

- (kred + kox) t koff e

kred+kox- koff

- koff t- e

(kred+kox- koff)(kred+kox)+ +

1

kred+kox

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0 2 4 6 80

1

2

3

abso

rptio

n ch

ange

at 6

30 n

m ( 1

04 )

time (ms)

koff = 800 s-1

k1 = 4.1 108 M-1s-1

k-1 = 1.5 108 M-1s-1

PSI.Fdred PSI + Fdred

koff

Fdred + FNRox Fdox + FNRsq

k1

k-1

Cte d'équilibre rédox : Keq = k1/k-1 = 2.7

E0(Fdox/Fdred) - E0(FNRox/FNRsq) = (RT/F) ln(Keq) = 25 mV

E0(Fdox/Fdred) = -412 mV E0(FNRox/FNRsq) = -387 mV

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PSI + Fd PSI ... Fdkon

koff

PSI- + Fd PSI- ... Fd

k'on

k'off

PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on

k''off

h h

ket1

Kd = koff/kon

ket2

ket = ket1 + ket2

t1/2 = ln(2)/ket

PSI + Fd PSI ... Fdkon

koff

PSI- + Fd PSI- ... Fd

k'on

k'off

PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on

k''off

h h

ket1

Kd = koff/kon

ket2

ket = ket1 + ket2

t1/2 = ln(2)/ket

PSI = photosystème IFd = ferrédoxine

PSI- = (FA,FB)-

FB

FA

k'on = 3.5 108 M-1s-1

Kd = 0.45 µM = koff/kon

k'on < kon ou k"off > koff

k"off = 800 s-1

Kd k'on = 160 s-1

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ferrédoxine oxydée

ferrédoxine réduite

surf

ace

de F

d à

l'int

erfa

ce a

vec

les

part

enai

res

Morales et al. (1999) Biochemistry 38, 15764 Refined X-ray structures of the oxidized, at 1.3 Å, and reduced, at 1.17 Å, [2Fe-2S] ferredoxin from the cyanobacterium Anabaena PCC7119 show redox-linked conformational changes

Modèle proposé :

après sa réduction, le changement conformationel de la ferrédoxine favorise sa dissociation du photosystème I: k"off > koff

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0 10 20 30

0

2

4

time (ms)

k2/k1 = 1 0.25k2/k-2 20

E0(FNRox/FNRsq) (-387 mV) < E0(FNRsq/FNRred) ( -335 mV)

400 500 600 700 800

-2

0

2

4

wavelength (nm)

wavelength (nm)

abso

rptio

n ch

ange

( 1

04 )

400 500 600 700 800

-2

0

2

4

6

[PSI] = 2.0 µM[Fd] = 4.0 µM[FNR] = 0.8 µM

pas de NADP+

Fdredk1

Fdred

+

Fdox+FNRred

PSI:Fdred

koff

(8)

k-1

k2 k-2

FNRox+

Fdox+FNRsq

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étape 7 : transfert d’hydrure :

FADH- + NADP+ FAD + NADPH

2 Fdred 2 Fdox

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Swamy et al. (2005) Biochemistry 44, 16054

Nitrite réductase

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6 Fd- + NO2

- + 8 H+ 6 Fd + NH4+ + 2 H2O

agrégat 4Fe-4S hème

protéine

e-

NO2-

NH4+

90°Nitrite réductase

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hème

agrégat 4Fe-4S

ferrédoxine

nitriteréductase

Nitrite réductase

6 Fd- + NO2- + 8 H+ 6 Fd + NH4

+ + 2 H2O

Swamy et al. (2005) Biochemistry 44, 16054

ferrédoxine [2Fe-2S] : Em = -410 mV

agrégat [4Fe-4S] : Em = -370 mV sirohème : Em = -290 mV

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Cycle catalytique de la nitrite réductase

Kuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, 510

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CF: piston; C, F: seringues; M: mélangeur; OC: cellule optique; I0: lumière incidenteI: lumière transmise

Kuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, 10765

Mélange rapide (stopped-flow) de 75 µM nitrite réductase et 25 mM NaNO2

cinétique à 563 nm : k = 0.45 s-1

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[Fd-] = 3 µM[PSI] = 3 µM[Fd] = 6 µM

0 1 2 3 4 5

chan

gem

ent d

'abs

orpt

ion

à 52

0 nm

temps (s)

pas de NiR [NiR] = 0.1 µM

réoxydation de Fd- par O2

réoxydation de Fd- par NiR (catalyse)

[NaNO2] = 1.5 mMRéoxydation de Fd- nitrite réductase (NiR)

Vitesse initiale : 160 Fd réoxydées par NiR et par s

La fixation de NO2- sur la NiR oxydée est beaucoup trop lente par rapport à cette vitesse.

Cc: cette réaction n'a pas lieu au cours de la catalyse. Différentes possibilités :

- NO2- se fixe beaucoup plus rapidement sur une forme réduite de NiR

- NO2- se fixe lors d'un échange avec la sortie du produit NH4

+, ...

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Modèle d’une hydrogénase à fer d’algue verte

D’après la structure de l’hydrogénase à fer de Clostridium pasteurianum. Peters et al. (1998) Science 282, 1853

2 Fd- + 2 H+ H2

2 Fd- + 2 H+ 2 Fd + H+ + H-

H+ + H- H2

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centre fer-soufre

cystéine pontante

centre di-fer

centre di-fer

COCN

Cluster H

H2H+

H-

Hydrogénase à fer

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0.0 0.5 1.0 1.5

-4

-2

0

2

4

abso

rpti

on c

hang

es (x

104 )

time (s)

+

-

[PSI] = 2 µM

photosystème I

540 nm

La contribution de P700+ (charge positive) est soustraite

Page 51: Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles - Transferts d'électrons en biologie - Spectroscopie d'absorption cinétique - Photosystème I, ferrédoxine,

0.0 0.5 1.0 1.5

-4

-2

0

2

4

abso

rpti

on c

hang

es (x

104 )

time (s)

+

-+

-

[PSI] = 2 µM[Fd] = 4 µM

photosystème I/ferrédoxine

540 nm

La contribution de P700+ (charge positive) est soustraite

Page 52: Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles - Transferts d'électrons en biologie - Spectroscopie d'absorption cinétique - Photosystème I, ferrédoxine,

0.0 0.5 1.0 1.5

-4

-2

0

2

4

abso

rpti

on c

hang

es (x

104 )

time (s)

+ +

-?photosystème I/ferrédoxine/hydrogénase

[PSI] = 2 µM[Fd] = 4 µM[HydA1] ≤ 0.16 µM

540 nm

La contribution de P700+ (charge positive) est soustraite

Page 53: Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles - Transferts d'électrons en biologie - Spectroscopie d'absorption cinétique - Photosystème I, ferrédoxine,

0.0 0.5 1.0 1.5

-4

-2

0

2

4

abso

rpti

on c

hang

es (x

104 )

time (s)

540 nm

-(d[Fdred]/dt)t = 0

[HydA1]Initial rate of reoxidation of Fdred per HydA1 =

[HydA1] = 0.16 µM :

t = 0: 73 Fdred reoxidized per HydA1 per s

[HydA1] = 0.32 µM :

t = 0: 52 Fdred reoxidized per HydA1 per s

-(d[Fdred]/dt)t = 0 = k [Fdred]t=0 = k [PSI] (exponential phase)

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- Réduction de la ferrédoxine : cinétiques et site de fixation sur le photosystème I :

Rufat Agalarov, Patrick Barth, Jonathan Hanley Nicolas Fischer/Jean-David RochaixBernard Lagoutte, Hervé Bottin

- Ferrédoxine-NADP+-réductase et nitrite réductaseSonya Kuznetsova, Nicolas Cassan David KnaffBernard Lagoutte Masakasu Hirasawa

- HydrogénaseTatiana Kuznetsova, Kateryna SybirnaHervé Bottin

[email protected]