Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles - Transferts d'électrons en...

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  • Photosystme I, ferrdoxine et partenaires solubles - Transferts d'lectrons en biologie - Spectroscopie d'absorption cintique - Photosystme I, ferrdoxine, partenaires solubles Ferrdoxine-NADP + oxydorductase, nitrite rductase, hydrognase : - prsentation - transferts dlectron, mcanismes Pierre Stif CEA Saclay DSV/iBiTec-S/SB 2 SM Laboratoire de Photocatalyse et Biohydrogne
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  • Interaction des orbitales lectroniques impliques dans le transfert est faible : les ractants D et A n'ont pas en commun d'atome ou de groupement chimique ("outer-sphere mechanism") Ractions chimiques (enzymatiques ou non) : les ractants ont souvent en commun un atome ou un groupement chimique ("inner-sphere mechanism") D + A D + + A - En biologie : Distances centre centre : 8 - 25 Distances bord bord : 3 - 20 ("outer-sphere mechanism")
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  • au sein d'une protine Puits de potentiel : densit de probabilit (orbitale molculaire) : nergie d'ionisation dans le vide D A Les orbitales lectroniques impliques doivent se recouvrir distance transfert d'lectron possible Couplage lectronique (faible) T DA
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  • nergie potentielle x noyaux (d, ) (D + A) (D + + A - ) Lorsque l'lectron passe du donneur l'accepteur, les noyaux ne changent pas de position Approximation de Born-Oppenheimer, principe de Frank-Condon (transitions lectroniques) : la transition est verticale Conservation de l'nergie : la transition est horizontale x 0 (D, A) x 0 (D+, A-) (D + A) (D + + A - ) Tunneling de llectron
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  • (D + A) (D + + A - ) nergie de rorganisation G activation G activation = ( G + ) 2 4 G
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  • ( G + ) 2 4 k B T - 1 k TE = T DA 2 exp 4 2 h Constante de vitesse de transfert d'lectron k TE (thorie semi-classique de Marcus) couplage lectroniquenergie d'activation terme nuclaire (facteur de Franck-Condon) FC Conditions de validit : - faible couplage lectronique T DA entre donneur et accepteur (d > 6-7 , d bord bord > 3-4 ) - transfert d'lectron coupl des vibrations de faible nergie : h < k B T (traitement classique) G : diffrence d'nergie libre entre ltat final (D + A - ) et ltat initial (D A) : nergie de rorganisation (toujours > 0, typiquement 0.5 1.5 eV) T : temprature; k B : cte de Boltzmann; h : cte de Planck Marcus & Sutin (1985) Biochim. Biophys. Acta 811, 265-322
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  • rgion normale rgion inverse ( (d i, i )) = Cte G < 0 (D + A) (D + + A - ) G activ. G (d i, i ) G activ. = 0 log (k ET ) - G 0 T DA = Cte ( G + ) 2 4 k B T - 1 exp FC = G activation = ( G + ) 2 4
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  • par rapport WT WT P865* Bpha P865 + Bpha - Haffa et al (2002) J. Phys. Chem. 106, 7376 membrane (bactriophophytine a) (quinone) Centre ractionnel bactrien (Rhodobacter sphaeroides) 0.3 eV P865 * (1 er tat singulet excit): rducteur trs fort Energie libre P865* Bpha P865 + Bpha - P865 Bpha 10 12 s -1 G (WT) = -0.2 eV 10 8 s -1 G (WT) = -1.2 eV h
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  • Page 10 ox - red ), on observe un largissement ch des nouvelles raies rsultantes ch, d au principe d'incertitude ("lifetime broadening") : E/k TE = h ch /k TE h d'o ch k TE Mthodes de mesure des vitesses de transfert d'lectrons Transfert d'lectron dclench par une photoexcitation laser (spectroscopie d'absorption laser, RPE cintique, spectroscopies vibrationnelles,...): - systmes photobiologiques naturels : centres ractionnels photosynthtiques, photodissociation dun ligand (hme-CO), photolyase,... - adjonction ou modification d'un cofacteur "color" pour le rendre photochimiquement actif (dure de vie assez longue d'un tat excit du cofacteur) : - complexes de Ruthnium adsorbs ou dans un complexe qui permet la liaison la protine. - porphyrines avec Zn ou Mg substitus Fe. - flavines naturelles, associes la protine ou ajoutes dans le milieu. Mlange rapide ("stopped flow") de D et A (mesure d'absorption) : - Lorsque la diffusion des partenaires est cintiquement limitante, la vitesse observe correspond la vitesse de formation du complexe. A concentrations leves, on peut ventuellement atteindre un plateau qui, en l'absence d'une autre tape limitante, correspond au transfert d'lectron. - Limitation cintique ( > 1-2 ms). Voltamprommtrie cyclique de protines adsorbes sur llectrode ou en solution (transfert direct ou non): mesures de courants catalytiques">
  • Mlange l'quilibre D A D + A - : modifications de proprits spectroscopiques lies au transfert d'lectron. Ex. : en RMN, systme partiellement rduit. En rgime de mlange rapide de raies "ox" et "red" (k TE > ox - red ), on observe un largissement ch des nouvelles raies rsultantes ch, d au principe d'incertitude ("lifetime broadening") : E/k TE = h ch /k TE h d'o ch k TE Mthodes de mesure des vitesses de transfert d'lectrons Transfert d'lectron dclench par une photoexcitation laser (spectroscopie d'absorption laser, RPE cintique, spectroscopies vibrationnelles,...): - systmes photobiologiques naturels : centres ractionnels photosynthtiques, photodissociation dun ligand (hme-CO), photolyase,... - adjonction ou modification d'un cofacteur "color" pour le rendre photochimiquement actif (dure de vie assez longue d'un tat excit du cofacteur) : - complexes de Ruthnium adsorbs ou dans un complexe qui permet la liaison la protine. - porphyrines avec Zn ou Mg substitus Fe. - flavines naturelles, associes la protine ou ajoutes dans le milieu. Mlange rapide ("stopped flow") de D et A (mesure d'absorption) : - Lorsque la diffusion des partenaires est cintiquement limitante, la vitesse observe correspond la vitesse de formation du complexe. A concentrations leves, on peut ventuellement atteindre un plateau qui, en l'absence d'une autre tape limitante, correspond au transfert d'lectron. - Limitation cintique ( > 1-2 ms). Voltamprommtrie cyclique de protines adsorbes sur llectrode ou en solution (transfert direct ou non): mesures de courants catalytiques
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  • Lumire danalyse Excitation t I 0 0 I0I0 0 t 0 A A = - log (I/I 0 ) dtection/amplification/ numrisation Echantillon Spectroscopie dabsorption par clairs Rsolution temporelle quasi illimite Identification de la nature chimique des ractions grce aux spectres dabsorption diffrentiels Mesures entre 250 et 1500 nm (transitions lectroniques)
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  • D'aprs Biochemistry & Molecular Biology of Plants (Buchanan/Gruissem/Jones) (American Society of Plant Physiologists) ATP et NADPH : assimilation du CO 2 en sucres (cycle de Calvin)
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  • photosystme I cytochrome c 6 (plastocyanine) ferrdoxine (flavodoxine) FXFX FBFB FAFA A1A1 A' 1 A0A0 A' 0 P700 F B F A agrgats [4Fe-4S] F X A 1, A 1 ' : phylloquinones A 0, A 0 ' : chlorophylles a P700 : dimre de chl. a Transfert d'lectron ( ) dclench par la lumire : absorption par les chlorophylles, formation de l'tat excit 1 S de P700 h - < 500 ns + - < 10 ps, puis sparation primaire de charges
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  • 20 ps P700 + /P700 E m (V) (ref.: H + / H 2 at pH 0) P700 + /P700* -1.2 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 A 0, A' 0 F X F A F B 1-3 ps 15 ns/200 ns h (700 nm) = 1.77 eV Fd P700 : dimre de chlorophylles a A 0, A' 0 : chlorophylles a A 1, A' 1 : phylloquinones F X, F A and F B : agrgats 4Fe-4S A 1, A' 1 FXFX FBFB FAFA A1A1 A' 1 A0A0 A' 0 P700
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  • Jordan et al. (2001) Nature 411, 909 400 kDa membrane Photosystme I de la cyanobactrie Synechococcus elongatus : structure 2.5
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  • Jordan et al. (2001) Nature 411, 909 Vue perpendiculaire la membrane: tous cofacteurs chlorophylles : transfert d'lectron transfert d'excitation ("antenne")
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  • Centres ractionnels photosynthtiques : - les premires tapes de transfert productif (sparation initiale, stabilisation) se droulent loptimum: - G =. Il sagit dune exception en biologie - les recombinaisons de charges (court-circuit) sont plus lentes que ltape de transfert vers laccepteur suivant: rgion inverse de Marcus (pour D + A - = P700 + Chla - ) Dans la plupart des ractions de transfert dlectron biologiques : G est de faible valeur absolue, est souvent ngatif mais parfois positif : -0.3 eV< G< 0.3 eV 0.7 1 eV : rgion normale de Marcus
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  • PSI = photosystme I Fd = ferrdoxine PSI - = (F A,F B ) - ractions de 1 er ordre clair laser Spectroscopie d'absorption cintique pour tudier la rduction de la ferrdoxine par le photosystme I Equilibre de liaison l'obscurit :
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  • PSI = photosystme I Fd = ferrdoxine PSI - = (F A,F B ) - 2 me ordre clair laser Spectroscopie d'absorption cintique pour tudier la rduction de la ferrdoxine par le photosystme I Equilibre de liaison l'obscurit :
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  • Spectroscopie d'absorption cintique pour tudier la rduction de la ferrdoxine par le photosystme I ractions de 1 er ordre 2 me ordre clair laser PSI = photosystme I Fd = ferrdoxine PSI - = (F A,F B ) -
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  • Ferrdoxine (Fd) - Fd - (F A,F B ) - (Fd, (F A,F B ) - ) - (Fd -, (F A,F B )) Synechocystis 6803 : 3 phases de 1 er ordre pH 8.0 : < 1 s, 20 s et 100 s 21C
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  • Ferrdoxine de cyanobactrie Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017
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  • Ferrdoxine de cyanobactrie Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017 rsidus acides aspartique et acide glutamique : COO - rsidus basiques arginine, lysine et histidine: atomes N portant une charge >0
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