Phase pré analytique enPhase pré‐analytique en microbiologie et norme NF EN g

ISO 15 189

Dr. Patrice LAUDAT, ,Laboratoire Arnaud, Tours

54 ème Journée de Biologie Clinique Necker-Institut Pasteur-18 janvier 2012-Paris.

Phase pré‐analytique en microbiologie et norme NF EN ISOmicrobiologie et norme NF EN ISO 

15 189.

Patrice LAUDATPatrice LAUDAT 

Laboratoire ARNAUD – Toursplaudat@laboarnaud.fr

Le contexte réglementaire   français a changé

• Ordonnance du 13 janvier 2010 relative à la biologie médicale

• Code de la Santé Publique: Art. L 6221‐1 « Un laboratoire de biologie médicale (LBM) ne peut réaliser d’examen debiologie médicale (LBM) ne peut réaliser d examen de biologie médicale sans accréditation »

• Accréditation délivrée par le COFRAC selon la Norme NF EN ISO 15 189ISO 15 189

Contexte de la MicrobiologieContexte de la Microbiologie

É• Étapes pré‐analytiques, analytiques (examen direct , ensemencement, quantification parfois, identification, antibiogramme et interprétation) et post analytiquesantibiogramme et interprétation) et post‐analytiques.

• Microorganismes vivants potentiellement virulents• Microorganismes  vivants , potentiellement virulents.

• Méthodes manuelles et automatisées qualitatives et• Méthodes manuelles et automatisées, qualitatives et « quantitatives ».

• Traçabilité de l’ensemble du processus• Traçabilité de l ensemble du processus 

• Validations indispensables pour toutes les étapes et techniques.techniques.

Les trois phases d’un examen de microbiologie médicale

é l i élè d’ é h illPré‐analytique ‐Prélèvement d’un échantillon‐ Recueil des éléments cliniques pertinentsP é ti t t t ti‐Préparation , transport  et  conservation de l’échantillon jusqu’au laboratoire

Analytique  ‐ Processus technique permettant l’obtention du résultat de l’analyse microbiologique

Post‐analytique ‐Validation ‐ Interprétation contextuelle du résultat‐ Communication appropriée du résultat au prescripteur dans un délai compatible avec l’état de l’art

Ce qui n’est pas du pré analytiqueCe qui n est pas du pré‐analytique

• Analyses de biologie délocalisée : norme NF EN ISO 22870 = responsabilité du biologistep g

• Dépistage « au lit du malade », au cabinet médical ou par le patient (exemplemédical ou par le patient (exemple bandelette urinaire ‐ BU) : les BU disposent ’ ( f é ld’un marquage DMDIV ( dispositif médical 

pour diagnostic in vitro) mais relèvent du décret actes infirmiers ( art. R.4311‐5.39 du CSP) = pas de responsabilité du biologisteCSP)    pas de responsabilité du biologiste

Examens microbiologiques : principaux objectifs

• Mise en évidence du ou des microorganismes impliqués dans le processus infectieuxp q p

• Mesurer leurs sensibilités aux antimicrobiens

Dé l d i• Détecter le portage de certains agents

• Étudier l’épidémiologie communautaire et p gnosocomiale

Dét i l t t t i it i i à i• Déterminer le statut immunitaire vis‐à‐vis d’un microorganisme

• Suivre l’évolution d’une infection traitée ou non

Microbiologie : une place particulière en bi l ibiologie.

• Au service :

– D’un patient• Diagnostic d’une infection suspectée ou avérée

• En amont : prévention d’infection (MRSA, BLSE, VanR , C. difficile)

• En aval : assistance thérapeutique.

– De la collectivité locale ou régionale : hôpital• Alerte sur les phénomènes épidémiques

• Gestion des épidémies

• Coopération avec EOH CLIN et C CLIN• Coopération avec EOH, CLIN et C‐CLIN

– De la collectivité nationale• Niveaux 1 2 et 3 du réseau Biotox• Niveaux 1, 2 et 3 du réseau Biotox

Echantillon Expression de la demandeet données cliniquesJ0

Aliquotage, PrétraitementC ti

Examen microscopique

Mise en culture

Saisie des donnéesanalytiques ± TransmissionConservation p q y q

Saisie cumulative des donnéesanalytiques ± Transmission

Lecture des cultures

Procédure DÉCISIONNELLEC.A.T. en f° microscopie,

Identif présomptive colonies J≥1Identif présomptive colonies,données cliniques, demande

J≥1

Procédure OPERATIONNELLESelon décisions prises :

Identification, Abg, BM, téléph, …

Saisie cumulative des donnéesanalytiques ± Transmission

Résultat final

Phase Pré-Analytique J≤0Phase Pré Analytique J≤0 Echantillons biologiques

PatientEchantillons

Personnel préleveur Enregistrement

Conformité

TransportMatériel

Phase préanalytique Phase pré-analytique

Diagramme d’Ishikawa

Phase pré analytique : ≤ J0Phase pré‐analytique : ≤ J0

Etape cruciale pour le processus en aval

Responsabilité du biologiste– Responsabilité du biologiste

– Clarté de la prescription médicale

– Choix du matériel de prélèvement

– Conditions de transport: délai, température…

– Documents associés (prescription adaptée?)

– Formation du personnel préleveur et à– Formation du personnel préleveur et à l’enregistrement.

La phase la plus concernée par les non‐conformités

PLAN EXPOSEPLAN EXPOSE

• Prescription médicale/  NF EN ISO 15 189

• Réalisation du prélèvementRéalisation du prélèvement

• Délai de transport et conservation des é h illéchantillons

• La sécurité

• Les risques d’erreurs

• Refus d’analyse par le biologiste

• Automatisation et robotisation à J0Automatisation et robotisation à J0

• Le personnel en microbiologie

Prescription médicale / norme NF EN ISO 15 189

• Acte de réflexion intellectuel

• Objectif diagnostique, pronostique,Objectif diagnostique, pronostique, thérapeutique ou préventif

V l é d édi li i d l f i• Volonté de médicalisation de la profession

• Possibilité de modifier la prescriptionp p

• L’interprétation biologique est faite « en f ti d élé t li i ti tfonction des éléments cliniques pertinents que le clinicien lui aura communiqués »

Aide  au processus d’accréditation en microbiologie: les sources d’information

Norme NF EN ISO 15 189• Documents COFRAC: avec points fastidieux

• Recueil des exigences spécifiques pour l’accréditation des LBM : SH REF 02 (septembre 2010)

G id h i d’ édi i bi l i édi l SH• Guide technique d’accréditation en biologie médicale : SH GTA 01 (mai 2011)

• Une Société Savante: SFM• Une Société Savante: SFM

• Référentiels: REMIC V4, 2010, SFM et CA‐SFM, 2011/12 

REVIR V2 2007 SFMREVIR, V2, 2007, SFM  

• Groupe de travail: QUAMIC, SFM

D d t é li é t d i bi l i t• Des documents réalisés par, et pour des microbiologistes

Norme EN NF ISO 15 189: contenu et butNorme EN NF ISO 15 189: contenu et but

• Chapitres 1 à 3 pas d’exigences spécifiques, introduction et terminologie.

Ch it 4 t l l d tè d il t ù• Chapitre 4 est le socle du système de « pilotage » où management: achats (logiciels), recours aux consultants, recrutements, investissements…..mais à quel coût ? À suivrerecrutements, investissements…..mais à quel coût ? À suivre

• Chapitre 5: formalisation des pratiques techniques avec des exigences renforcées sur la traçabilité et les validations des g çméthodes: partie métier

But final: obtenir la confiance dans la validité des résultats

5.4 NF EN ISO 15 189 :Procédures pré‐analytiques

• 5.4.1 : feuille de prescription ,ordonnance avec données démographiques et g p qrenseignements cliniques et/ou épidémiologiques (fiche)épidémiologiques (fiche)

‐ prélèvements à visée diagnostique/ é é lépidémiologique  

‐ spécimen et nature des analysesspécimen et nature des analyses

‐date et heure de prélèvement et de réception

• Contrat tacite entre 3 parties : prescripteur, patient et biologiste

Procédures pré‐analytiques : Articles L.6211‐14 et L.6211‐17

• Impose la signature d’une convention entre LBM et préleveurs externes qui fixe les p qprocédures applicables.

• En cas de prélèvement par un auxiliaire• En cas de prélèvement par un auxiliaire paramédical extérieur au LBM, le patient 

é l bl lprend toujours contact préalablement avec le LBM. Le biologiste détermine les examens à réaliser et les procédures applicables.

Ecoute et contractualisation avec les clients

• Besoins clients identifiés : tous moyens

• Contrats formalisés : exigences etContrats formalisés : exigences et engagements des 2 parties, respect du guide du préleveur renseignements cliniques delaidu préleveur, renseignements cliniques, delai de réponse…

• Revue régulière des contrats : indicateurs de suivi, non‐conformités, délais …suivi, non conformités, délais …

• Réclamations des clients tracées : actions ticorrectives

• Enquêtes de satisfaction des clients à faire

Exemples de renseignement cliniques à obtenir

• Bactériologie : nature du prélèvement, site , urgence de la réponse (examen g p (direct/cytologie), symptômes cliniques , antibiothérapie infection nosocomialeantibiothérapie , infection nosocomiale, endocardite , méningite………

l lé l l hl• Biologie moléculaire : simple si Chlamydiae , si VIH VHC VHB quantification , génotypage ,.

• Sérologie infectieuse : hors femme enceinte et réglementaire informationset réglementaire , informations complémentaires ( vaccins……)…….. 

5.4.2 : manuel de prélèvements

• Liste des analyses du LBM

• Informations sur le choix des méthodesInformations sur le choix des méthodes disponibles et les indications médicales

I f i l i / é i• Informations pour le patient / préparation pour le prélèvement

• Procédures : identification de l’échantillon primaire prélèvement matérielprimaire, prélèvement, matériel…

• Instructions : type et quantité d’échantillon, exigences particulières (délai, transport, °C..)

Manuel de prélèvements suiteManuel de prélèvements, suite

• Fourni aux préleveurs

• Formation et contractualisation : traçabilitéFormation et contractualisation : traçabilité de la formation et de la prise de connaissanceconnaissance

• Investissement des microbiologistes dans la formation des préleveurs : choix du matériel adaptéadapté

• Tout échantillon non‐conforme refusé et t étracé

• Dérogations possibles formalisées

Points critiques en microbiologieSH GTA 01 ‐COFRAC

• Prélèvement réalisé de manière aseptique avant antibiothérapiep

• Réactifs commerciaux et non périmés

Dél i élè l i i• Délai entre prélèvement et analyse : critique

• Cas des échantillons pré‐traités dans un autre plaboratoire : mêmes exigences

Q lifi ti lid ti d i• Qualification  : validation des acquis

• Actes opérateurs‐dépendant : compétence

• Analyses de bactériologie à traiter en 1er

Réalisation du prélèvement : acte‐cléRéalisation du prélèvement : acte clé

• Préleveur : habilité, identifié et « respect des précautions standard »p

• Prélèvement : respect des procédures du LBM choix du matériel identificationLBM, choix du matériel, identification, conditionnement, quantité

• Si visée diagnostique : début du processus infectieux, avant antimicrobiens, éviter lesinfectieux, avant antimicrobiens, éviter les flores commensales, privilégier les prélèvements profonds ou invasifsprélèvements profonds ou invasifs

Schéma général de la significativité des microorganismes dans les prélèvements

d élè l l S il d i ifi i éNature du prélèvement Flore commensale Seuil de significavité

Catégorie 1 :Prélèvements au niveau 

Non Non 

des sites « normalement stériles »: LCR, hémocultures, liquides séreuses, biopsies…

Catégorie 2 :Autres prélèvements : 

Oui  Oui 

urines, respiratoires

Catégories 3 :Prélèvements fortement

Oui  Non Prélèvements fortement colonisés : peau, selles, téguments, muqueuses,gorgeg g

Délai de transport et conservation des échantillons

• Analyse d’organismes vivants, parfois virulents et sujets à leur environnement: jtransport, délai, conditionnement inadaptés faussent les résultats par excèsfaussent les résultats par excès (prolifération)ou par défaut (germes fragiles).

é é ’é h ll• Variété du type d’échantillons : sang, urines, selles, liquides , pus, pièces anatomiques….

• Ce qui impose :prélèvement ciblé ,milieu de transport adapté (délai idéal < 2 h sinon ) untransport adapté (délai idéal < 2 h sinon ), un dialogue avec les cliniciens.  

Milieux spéciaux « dits de transport » :  milieu Amies et milieu M4RT 

• Permettent la survie et non croissance de nombreux microorganismesg

• Milieux tamponnés , réducteurs et pauvres en éléments nutritifsen éléments nutritifs

• Conservent l’humidité de l’échantillon

• Evitent le stress oxydatif

M i ti t l t t l• Maintiennent le rapport entre les populations microbiennes initiales  

Dispositif médical pour diagnostic in vitro : DMDIV (CE)

• Le laboratoire doit maitriser la phase pré‐analytique et doit procéder à la vérification y q p(validation) des modifications apportées lors d’écarts aux recommandations fournisseursd écarts aux recommandations fournisseurs

• Important pour les milieux transports : / l l fCLSI/NCCLS, 2003, Quality control of 

microbiological transport systems, Approved standard M40‐A vol 23 N°34.

Conditions pré‐analytiques conformes au REMIC – SFM (V4 – 2010)

è é é él i l é i lParamètre Fréquence Température Délai  analyse Matériel

Urines ECBU Continue Ambiante   24 h Flacon stérile + ac.borique

Urines  ECBU Continue 2‐8 °C < 12 h Flacon stérile

Pus   Continue  Ambiante  24 h Écouvillon transporttransport (Amies)

Pus  Continue  Ambiante  < 2 h Écouvillon 

Hémocultures 5‐10 ml sang Continue 

Ambiante  < 12 h Flacons aéroet/ou ana

LCR Continue Ambiante < 2 h Flacons stérilesLCR Continue  24/24 h

Ambiante  < 2 h Flacons stériles  2

Génital  Continue  Ambiante  24 h Écouvillons   2 (Amies)(Amies)

Génital  PCR ,virologie

Continue  Ambiante  24 h Écouvillons M4RT

Conditions pré analytiques :SuiteConditions pré‐analytiques :Suite

è é é él i l é i lParamètre  Fréquence  Température  Délai  analyse Matériel 

CoprocultureSelles  (3 noix)

Continue  2‐8 °C < 12 h Flacon stérile

Toxine C.difficile

7/7 jContinue 

2‐8 °C < 12 h Flacon stérile

Asp bronchique Continue Ambiante < 2 h Flacon stérileAsp.bronchiqueSpermoculture

Continue  Ambiante < 2 h Flacon stérile

Crachats BK Continue  2‐8 °C < 48 h Flacon stérile 3j

Liquideponction

Continue  Ambiante  < 2 h<12 h

Flacon stérileFlacon hémoculture

Per‐opératoireorthopédie

Continue  Ambiante  < 2 h Flacons stériles  (5 idéal) broyagey g

Anaérobies  Continue  Ambiante  Vol > 2ml < 6 hVol < 2ml  <1h*

Flacon stérile *ou 24 h+ M transport

ECBU :Système de transport avec acide borique 

Ecouvillons en nylon ou dacron en milieu de transport

Choisir un milieu liquide de transport évalué

La sécuritéLa sécurité

• Respecter les « Précautions dites standard »

• Fermeture hermétique des flaconsFermeture hermétique des flacons

• Procédures de désinfection connues et é li éréalisées

• Sachets protecteurs et séparés du bonp p

• Gestion des DASRI

• Ne jamais décapuchonner les aiguilles , pas de seringue transport avec aiguille

Les risques d’erreursLes risques d erreurs

• Identification et étiquetage

• Antiseptique préalableAntiseptique préalable

• Transport ou stockage impropre

• Milieu de transport absent ou inaproprié

• Traitement en coursTraitement en cours

• Contamination par flore endogène

• Site inaccessible : ponction hémorragique

• Matériel de prélèvement deffectueux• Matériel de prélèvement deffectueux 

Echantillons justifiant d’un refus pour analyse microbiologique

• Non ou mal étiquetés ( sauf dérogation)

• Reçus dans des flacons endommagés et nonReçus dans des flacons endommagés et non étanches (en particulier pour site stérile)

Vi ibl i é• Visiblement contaminés

• Conditions de conservation non respectéesp

• Inappropriés aux analyses demandées

• Identique à un autre échantillon reçu le même jour ( sauf LCR, Hémoc.,état clinique, contrôle sérologique légal..) 

Automatisation et robotisation à J0Automatisation et robotisation à J0

• Disponibilité de nouveaux automates et robots en Microbiologie et en Biologie Moléculaire.

• Evolution réglementaire: permet d’envisager des plateauxtechniques partagés pour plusieurs sitestechniques partagés pour plusieurs sites.

• Preuve que le processus est déjà engagé: nombre des LBM• Preuve que le processus est déjà engagé: nombre des LBM inscrits au contrôle national de qualité en bactériologie:

2009: 2905‐ 2009:    2905

‐ 2011:    1118  données Afssaps

Phase Analytique J 0Phase Analytique J 0Automates

Echantillons Personnel EnvironnementContexte

AutomatesTechnique

Phase préanalytique Phase analytique

Diagramme d’Ishikawa

Automates à J0Automates à J0

• Colorateurs : (Gram, Auramine, Ziehl, MGG)

• Automates pour HémoculturesAutomates pour Hémocultures

• Cytomètre en flux pour les urines :

‐ IQ 200 (Iris)

‐ Sysmex UF 1000 (bioMérieux)‐ Sysmex UF 1000  (bioMérieux)

‐ Urised (i2A)

Ensemenceurs

Biologie moléculaire temps réelBiologie moléculaire temps réel

ColorateursColorateurs

Automates à J0 : HémoculturesAutomates à J0 : Hémocultures

I2A URISED® / Menarini

Sysmex /bioMérieux UF‐1000i®Sysmex /bioMérieux UF‐1000i

IRIS iQ200®

Automates à J0 : Bio. Mol.GeneXpert Ceipheid

Automates à J0 : ensemenceursAutomates à J0 : ensemenceurs

• Non robotisé :

‐ Prévi Isola bioMérieuxPrévi Isola bioMérieux

• Robots : 

‐WASP COPAN/SIEMENS‐WASP COPAN/SIEMENS

‐ INNOVA BD

‐ Kiestra Lab Automatisation

Prélude I2A‐ Prélude I2A

Automates à J0 : ensemenceursAutomates à J0 : ensemenceurs

Les ensemenceurs à J0

• Automatisation de certaines phases de culture• Automatisation de certaines phases de culture• Facteur de : 

– Standardisation– Traçabilité – Gain de temps – Réduction de la variabilité interopérateurRéduction de la variabilité interopérateur

• Etiquetage boite par boite suivi du dossier• Etiquetage boite par boite : suivi du dossier patient

• Suivi des N° de lot des milieux

Choix critères : robot, marquage CE, évaluations disponibles

WASP Evaluation sur siteWASP‐Evaluation sur site

Standardisation de l’ensemencementStandardisation de l ensemencement

Standardisation de l’ensemencementStandardisation de l ensemencement

Evaluation sur site : répétabilitéEvaluation sur site : répétabilité

Evaluation sur site : contaminationEvaluation sur site : contamination

Evaluation sur site : pouvoir de séparation

Vérification quantificationVérification quantification

Quantification WASPQuantification WASP

Quantification en ManuelQuantification en Manuel

Quantification en ManuelQuantification en Manuel

Réduction de la variabilité inter opérateur

é i l ill 100 C li• Matériel : pastille 7100 CFU E.coli• WASP/ Manuel

N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

NBColWA

71 75 61 66 63 84 73 76 67 75

WASP

NB 70 50 38 55 15* 3*

• WASP Valeur moyenne : 71.1 (écart type 6.59 ).

ColMa

NC NC

y ( yp )

• Manuel Valeur moyenne : 38.5 (écart type 23.13 ).

Traçabilité et respect du temps minimal d’incubation de 18 H

• Essentiel pour les prélèvements polymicrobiens : ECBU, pus superficiels, p y p psuppurations de classe II et III..

• Indispensable pour les milieux sélectifs :• Indispensable pour les milieux sélectifs : MRSA, EBLSE ……

• Gestion avec « 2 étuves » ce qui permet d’assurer la lecture correcte des milieux.d assurer la lecture correcte des milieux.

• En attente d’une gestion automatisée idéale : l’i b ti i t lli t« l’incubation intelligente».

Le personnel en microbiologie 

• Formation complexe pour le personnel spécialiséFormation complexe pour le personnel spécialisé– Techniques de bactériologie classique (savoir‐faire acquis sur plusieurs années)

– Connaissances anatomiques solides– Connaissance des divers dispositifs médicaux– Connaissances en pathologie infectieuse pour lier la bactériologie à la cliniqueConnaissance de ses propres limites et responsabilités po r– Connaissance de ses propres limites et responsabilités pour faire intervenir le biologiste

– Communication positive, esprit d’équipeCommunication positive, esprit d équipe– Formation permanente dans le laboratoire et hors de celui‐ci : lectures, réunions

– Programme de contrôle des connaissances

Accréditation: état des lieux ( site du COFRAC‐11/ 2011). Norme 15 189

• Nombre total LBM accrédités en Santé Humaine (SH) : 205.

• Mais : 60 types EFS, spécialisés ( toxicologie, génétique….).

• Soit 145 LBM à activité médicale: 133 privés et 12 CH.

• Accréditation en bactériologie: 23 / 145 (16 %).

22 privés et 1 CH

• Accréditation en virologie: 4 (2 CH et 2 privés)

• Idem en mycologie‐parasitologie

Coûts liés à l’accréditation / norme ISO 15189total = 444 000 euros dépenses initiales

Données SNMB mai 2011

Surcoût personnel ETP  40 000

Qualiticien  40 000

V lid i é h d 240 000Validation méthodes  240 000

CIQ et EEQ  5 000

Logiciel dédié 45 000Logiciel dédié  45 000

Mise niveau matériel  25 000

Agencements locaux  10 000

Maintenances supplémentaires  5 000

Achats métrologie  8 000

Accompagnement 15 000

Audits  3 000

Audits COFRAC 8 000Audits COFRAC  8 000

+ Suivi : 145 000 euros / an 

ConclusionConclusion

Si l’ l d’ é h ill d l• Si l’analyse d’un échantillon ne donne pas le résultat escompté : revoir les modalités des prélèvements autre site moment du prélèvementprélèvements, autre site, moment du prélèvement, milieux de transport, délai…..5M

• La qualité du dialogue entre le prescripteur et le biologiste est primordialebiologiste est primordiale

S t é it ( l élè t) t• Supports écrits (manuel prélèvement) et procédures diffusées  sont indispensables

Indispensable REMICIndispensable REMIC

• FIN MERCI• FIN MERCI