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Fiche cours5 : Pathologie de la voie Ras

Généralité sur Ras - petite protéine G (monomérique) - commutateur moléculaire : Ras-GTP active - permet transduction des informations par liaison d’un facteur de croissance sur

récepteur à activité tyrosine kinase - cascade de phosphorylation - action pléiotrope de ras sur la cellule (apoptose, exocytose, transport golgi,

cytosquelette) - impliqué dans cancer (muté dans 30% des cancers humains) et maladie du

développement (neurofibromatose, syndrome de Noonan…) - 3 gènes RAS (très homologues) : HRAS, KRAS et NRAS ; codent pour 4 protéines

Historique de découverte de Ras Années 80 Découverte de Ras par son implication dans pathologie oncogénique :

identification HRAS et KRAS Implication dans les cancers, molécule oncogène* : transfection du gène de Ras muté pour voir son effet à mort des cellules par apoptose, pas capable de transformer des cellules primaires

Années 90 Tentative compréhension sur le plan moléculaire : Ras isoprénylé va vers la membrane à intérêt pour son interaction avec le récepteur Découvre que Ras active les voies MAPK/ERK et PI3K/AKT

Années 2000 Mis en évidence implication de KRAS dans le développement (ko : mort in utero) à sort du champs oncologique Mis en évidence de l’implication de Ras dans maladies du développement : Noonan, syndrome de Costello

*oncogène : impliqué dans les cancers, par mutation gain de fonction, par opposition aux gènes suppresseurs de tumeurs, impliqués par mutation perte de fonction.

Ras et voies de signalisation

Etudes fonctionnelles des mutations retrouvées sur les gènes Ras On étudie la voie en aval de Ras. Plusieurs méthodes : Western Blot, Cytométrie de flux, Immunofluorescence in situ. Permet de comprendre si Ras est suractivé ou sous activé suite à la mutation d’un des gènes.

Ras possède 20 effecteurs différents (ex : Raf) Liaison RAS-GTP à RAF à phosphorylation et activation de MEK à phosphorylation e activation de ERK à phosphorylation de plusieurs effecteurs finaux cytoplasmiques et nucléaires Attention : plusieurs gènes codent pour les protéines RAS, MEK et ERK : duplication de gène pour aboutir à une famille de gène

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Autre méthode « pull down essay » utilisée in vitro, permet de détecter l’état d’activation d’une protéine spécifique (activatrice ou inhibitrice). Ras et cancers Conséquences moléculaires d’une mutation de Ras :

- perte de la capacité d’hydrolyse spontanée ou dédiée par les protéines GAP - hypersensibilité à SOS : plus de Ras GTP produit mais inactivation reste possible

Conséquences cellulaires d’une mutation de Ras : Prolifération incontrôlée

- régulation positive des facteurs de transcription - dérégulation des contrôles du cycle cellulaire

Suppression de l’apoptose

Phosphorylation par la voie MAPK et PI3K de BAD alors séquestré par les protéines 14-3-3 et libère BCL2

Reprogrammation métabolique

- transcription augmentée de GLUT1 - Activation de mTOR à traduction augmentée de H1F1a,

augmentation des enzymes clés de la glycolyse - Stimule l’autophagie

Ras et maladie du développement Maladie du développement : maladie détectée à l’âge pédiatrique avec des anomalie de développement embryo-fœtal de certains organes Neurofibromatose de type 1 (NF1)

- autosomique dominante, touche 1/3500 naissances - gène codant pour la neurofibromine muté - neurofibromine = inactivation de RasGTP en RasGDP - NF1 happloinsuffisant dans toutes les cellules de

l’organisme - Prédisposition aux tumeurs malignes

Syndrome de Noonan

- autosomique dominante, touche 1/2000 naissances - retard de croissance et psychomoteur, malformation

cardiaque, dysmorphie caractéristique, nuque épaisse au stade prénatal, prédisposition faible aux leucémies

- Mutation du gène PTPN11 codant pour SHP2 (tyrosine phosphatase cytosolique activateur de la voie MAPK et PI3K) chez 40% des patients

- SHP2 = 2 domaines SH2 liant des tyrosine phosphate (activant la protéine) + 1 domaine PTP à activité phosphatase SHP2 repliée = inactive : auto-inhibition par repliement SHP2 liée à activateur est dépliée et activée : libération du site phosphatase SHP2 déphosphoryle le site de liaison à RAS GAP → pas de recrutement de RAS GAP → pas d’inactivation de RAS → activation de RAS. SHP2 est donc un inhibiteur d'inhibiteur de RAS cad une molécule qui active la signalisation RAS.

Zoom sur la mutation de PTPN11 Observe mutations sur SHP2 localisées près du site catalytique et du repliement de la protéine, à l’interface de SH2 et PTP. On remarque aussi que beaucoup d’exons sont touchés. Hypothèse : Si on bouge un acide aminé de cet interface par une mutation on va soit augmenter les liaisons entres les deux domaines (inactivation ++) soit les diminuer (activation protéine ++) Test de l’hypothèse : On va étudier les cinétique enzymatique de SHP2 muté à son état basal et lorsqu’elle est stimulée par un activateur. On utilise un substrat synthétique possédant une tyrosine phosphorylée : IRS qui va être injecté dans le cellule dans le but d’activer PTPN11.

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Obtention des mesures par un système de fluorescence à IRS fluo dès qu’elle a subi une déphosphorylation (= qu’elle a activé la protéine). On mesure la quantité d’éléments fluo et on le traduit par le graphique ci dessous.

Expérience d’une souris transgénique KNOCK-IN pour PTPN11 a montré qu’une seule mutation est suffisante pour induire un phénotype de syndrome de Noonan avec syndrome myoprolifératif. D’un point de vu clinique le syndrome de Noonan est très proche d’autres pathologies qui sont liées à des mutations différentes mais appartenant à la même voie de signalisation.

Chez 40% des patients que le chercheur avait en banque de laboratoire, on a trouvé une mutation de PTPN11 activatrice de RAS. Cependant on ne connait pas la cause des 60% restant, et on possède un large spectre de maladies proches cliniquement mais non élucidées sur le fond génétique. On a constitué des bases de données cliniques. À ce stade, si on a des similitudes cliniques on peut également imaginer des similitudes de causalité. On cherche ce qui pourrait relier ces pathologies. L'idée est d'aller rechercher des mutations dans l'ensemble des gènes connus de la voie RAS. Par exemple, une mutation dans l'inhibiteur de RAS, le rendant moins inhibant. On parle d'approche par gène candidat.

Débat autour de l’importance des aspects clinique et moléculaire

Qu’est ce qui prime entre définition clinique et définition biologique/moléculaire d’une maladie ?

Niveau d’activation supérieur chez les sujets ayant reçu IRS toutes mutations confondues. Les mutations qu’on trouve dans le syndrome de Noonan vont avoir un effet activateur à activation plus prolongée de Ras par maintient de l’auto-inhibition à gain de fonction d’un régulateur positif de la voie Ras

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On observe une mutation majoritaire pour les différentes maladies :

Cependant il faut gardé en tête que ces syndromes sont expliqués par plusieurs mutations différentes.

Nouvelle définition de la maladie : un compromis acceptant l’importance de la clinique comme la biologie, deux abords faillibles.

Syndrome de Noonan Mutation de PTPN11 Cardio Facio Cutaneo syndrome (CFC) Mutation de BRAF Syndrome de Costello Mutation de HRAS

Arguments en faveur de la clinique Arguments en faveur de l'aspect moléculaire

- D'un point de vu économique et social, l'abord moléculaire est très couteux et inaccessible à certaines parties du monde. La clinique est donc primordiale, car universelle.

- La biologie seule ne suffit visiblement pas à diagnostiquer une maladie. Les signes cliniques étant plus spécifiques pour chaque maladie, il est indispensable de compléter la biologie par un diagnostic clinique.

- importance liée au traitement. Imaginez une définition du Costello (SC) limitée a la mutation HRAS : dans le cas moins fréquent d'un costello BRAF, le traitement biologique donnée ne sera pas adapté puisqu'il combattra uniquement la mutation HRAS. (bien sur, il se peut que le traitement soit symptomatique, et dans ce cas la mutation est moins importante)

- La mutation est associée à l'évolution : le fait de la connaître permet de prévenir le devenir et le developpement de la maladie, primordial pour un suivi diagnostic : hérédité, grossesses futures, conseil génétique...