Martin KrahnNicolas LévyMarc BartoliAix-Marseille Université,Inserm UMR_S 910,GMGF, 13385 Marseille,France.APHM, Départementde Génétique Médicale,Hôpital Timone Enfants,13385, Marseille, France.

FICHE PRATIQUE

Le séquençage de nouvelle génération(Next-Generation Sequencing, ou NGS)appliqué au diagnostic demaladiesmonogéniques hétérogènesNotions essentielles pour le dialogue entre clinicienset généticiensMartin Krahn, Nicolas Lévy, Marc Bartoli

Le dialogue entre généticiens et cliniciens est devenu plus que jamais nécessaire avecl’implémentation du NGS pour le diagnostic génétique de pathologies hétérogènes. Uneinteraction étroite permet d’optimiser les possibilités d’un diagnostic précis, en retenantl’implication d’un gène dans la pathologie que présente le patient, par l’interprétation desmutations souvent nombreuses mises en évidence par les analyses de NGS dans unediversité importante de gènes. Pour cela, une connaissance synthétique du processus deNGS est dorénavant nécessaire en pratique clinique. Ce processus comporte de multiplesétapes de génération et d’analyse des données, associées à un vocabulaire spécifique, dontnous souhaitons présenter les notions essentielles dans cette Fiche Pratique.

La commercialisation depuis 2005 des technologiesde NGS a révolutionné au cours de ces dernièresannées la dimension des analyses génétiques par unchangement majeur d’échelle des capacités deséquençage.Ayant trouvé rapidement de nombreuses applica-tions dans le domaine de la recherche, en particulierpour l’identification de nouveaux gènes impliquésdans des maladies monogéniques, le NGS a progres-sivement été validé pour des applications en dia-gnostic génétique.Le NGS repose sur la génération massive de don-nées de séquences obtenues par des cycles succes-sifs d’incorporation de nucléotides, et ainsi l’émis-sion de signaux qui sont ensuite convertis eninformation de séquence. Différentes technologiesexistent actuellement, notamment basées sur unséquençage en parallèle de millions de moléculesd’ADN, avec une augmentation toujours croissantedes capacités de séquençage associée à une diminu-tion progressive des coûts, et de nouvelles appro-ches sont en développement (en particulier leséquençage direct de molécules d’ADN uniques).De manière schématique, le processus de NGS estconstitué de multiples étapes de génération etd’analyse des données, avec la prise en compte decritères de qualité de séquençage (en particulier

l’analyse de la « couverture » et de la « profondeurde lecture » de la séquence d’intérêt), qui sont pré-sentées de manière synthétique dans la figure enassociation avec des termes d’usage courant asso-ciés.Le NGS permet dorénavant d’effectuer l’analyse derégions d’intérêt de grande taille, ce qui n’était paspossible avec le séquençage « classique » (méthodede Sanger) utilisé depuis les années 1980, en raisonde limitations de coûts et de débit de quantités deséquences pouvant être générées, ce qui restreignaitson application à des approches de séquençage« gène après gène », responsable dans de nombreuxcas d’une longue errance diagnostique.Avec une multiplication des capacités de séquen-çage dans un rapport de plusieurs dizaines voire cen-taines de milliers de fois par rapport au séquençageSanger, le NGS a permis le développement de nou-velles stratégies d’analyses mutationnelles, dont troisprincipales sont actuellement utilisées :• Analyse de « listes de gènes » ou « panel degènes » : il s’agit de l’analyse simultanée de laséquence d’un certain nombre de gènes d’intérêt(habituellement une ou plusieurs dizaines). Commepour le séquençage Sanger, l’analyse est habituelle-ment centrée sur les régions codantes des gènes etles bornes introniques flanquantes, où est localisée

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Cah. Myol. 2016 ; 13 : 31-33© M. Krahn et al., publié par EDP Sciences, 2016

DOI : 10.1051/myolog/201613008Les cahiers de myologie No 13 JUIN 2016 31

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Figure 1Principales étapes de génération et d’analyse de données de NGS. Les principales étapes de génération et d’analyse de données de NGS sont schématisées dans lecadre des techniques actuelles de séquençage parallèle à haut débit, avec une définition des principaux termes d’usage courant associés.

la majorité des mutations délétères. L’approche« panel de gènes » est actuellement la plus utilisée endiagnostic génétique, notamment pour analyser deslistes de gènes connus comme étant impliqués dansun groupe de pathologies (par exemples les dystro-phies musculaires, ou encore les myopathies ou lesneuropathies périphériques au sens large). Certains« panels de gènes » très larges sont commercialiséset comportent la majorité des gènes répertoriéscomme étant impliqués en pathologie humaine (plusde 4 000), dans la base de données OMIM (OnlineMendelian Inheritance in Man, www.omim.org).Ces « super-panels » sont également appelés« exomes cliniques ».• Analyse « d’exome » (« Whole Exome Analysis/WES ») : cette approche consiste en l’analyse simul-tanée de la totalité des séquences codantes (etbornes introniques flanquantes) de tous les gènes dugénome (environ 20 000), correspondant à environ1 % du génome, soit environ 180 000 exons et30 millions de paires de bases.• Analyse du génome dans son intégralité(« Whole Genome Analysis »/WGS) soit 3 milliardsde bases, comprenant les séquences codantes et noncodantes.

Il est à noter que certains laboratoires ont choisi demettre en place des stratégies de séquençage« large » (panel OMIM, exome, voire génome pourcertains laboratoires pionniers anglo-saxons), puisd’effectuer un filtrage restreint sur liste de gènesd’intérêt, ce qui permet une « ouverture » du filtred’analyse informatique à une liste plus grande en casde résultat initial non concluant. Le choix de la stra-tégie prend actuellement en compte notamment lescapacités des séquenceurs dont disposent les labo-ratoires, et en lien avec ceci les coûts de l’analyse.

La conséquence directe de l’augmentation des capa-cités de séquençage a été l’augmentation considé-rable des données mutationnelles à interpréter. Àtitre d’exemple, l’analyse de l’exome d’un individugénère en moyenne 25 000 variants par rapport àla séquence de référence du génome humain.L’objectif étant d’identifier la ou les mutation(s) délé-tères responsable(s) de la pathologie que présentele patient, le défi consiste à recueillir un maximumd’informations disponibles pour chacun des variantsde séquence identifiés, et effectuer une interpréta-tion à deux niveaux : juger du caractère pathogèneou non des variants, puis de leur lien avec la

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pathologie concernée. Cette étape essentielle del’analyse, appelée « annotation », permet grâce àdes logiciels spécifiques de compiler des informa-tions très diverses (type de variant, statut hétérozy-gote/homozygote/hémizygote, données de descrip-tion et de fréquence de bases de donnéesmutationnelles, données bioinformatiques prédic-tives de pathogénicité, données de ségrégation fami-liale, etc.), qui permettront d’appliquer des filtres detri. Malgré l’utilisation de filtres, la conclusion n’estpas toujours évidente, et la validation de l’implica-tion d’une/de mutation(s) d’un gène dans la patho-logie que présente le patient est largement optimiséepar une discussion conjointe des résultats entregénéticiens et cliniciens. Néanmoins, le taux de dia-gnostic positif obtenu pour des analyses en NGS decas index sporadiques reste limité à 25-50 %, selonles pathologies, avec des résultats équivalents pourles approches « panel » ou « exome ». Selon desétudes récentes, une relative amélioration estobtenue par le séquençage de génome dans sa tota-lité, sachant qu’une proportion probablementimportante d’événements mutationnels délétèresreste pour l’instant « difficilement accessible » enraison d’éléments insuffisants pour l’interprétation,en particulier pour des variants en régions non-codantes.Avec le changement d’échelle associé aux analysesNGS, les comptes rendus d’analyse, et l’informationà apporter aux patients se sont également complexi-fiés. À l’initiative de la Fondation Maladies Rares, ungroupe d’experts a élaboré une notice d’informationet un modèle de consentement à vocation nationale(disponibles en téléchargement : http://fondation-maladiesrares.org/actualite/consentement-a-letude-des-caracteristiques-genetiques), prenant en comptele contexte du NGS. Ces documents abordent en par-ticulier la problématique des identifications « fortuites/accidentelles » (variants « supplémentaires » dans desgènes analysés en lien avec la pathologie que présentele patient, appelées identifications « non-sollicitées » ;ou sans lien, appelées « identifications secondaires »).

Afin de clarifier l’offre diagnostique par NGS, desréflexions ont été engagées dans le cadre des diffé-rentes filières nationales de maladies rares, etnotamment FILNEMUS. L’objectif est de proposersur le plan national une démarche homogène consis-tant en l’analyse de listes de gènes par groupe depathologies, établies de manière conjointe entregénéticiens et cliniciens, et utilisées de manièreconsensuelle par les laboratoires diagnostiques.Dans le cadre d’une démarche séquentielle, l’ana-lyse peut notamment être réalisée dans un premiertemps sur une liste restreinte de gènes, puis élargieen cas de résultat négatif ou non concluant à uneliste plus importante, et finalement une analyse del’exome (voire génome). De la même manière, unenjeu majeur réside en l’homogénéisation desdémarches d’interprétation du caractère pathogèneou non des variants identifiés.Le NGS est maintenant implanté dans les labora-toires diagnostiques. L’instauration récente du Réfé-rentiel des actes Innovants Hors Nomenclature(RIHN) déterminant la tarification des analyses deNGS, et la réflexion actuelle sur la mise en place deplateformes nationales de séquençage à très hautdébit permettront de systématiser à l’avenir l’accèsà ces technologies pour la prise en charge despatients.

Next-generation sequencing (NGS) applied todiagnosis of heterogeneous genetic disorders:essential concepts for dialogue between clini-cians and geneticists

LIENS D’INTÉRÊTLes auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernantles données publiées dans cet article.

RÉFÉRENCES1. Krahn M, Arveiler B. Le séquençage de nouvelle génération :principe, applications en diagnostic et perspectives. In : Livrenational d’enseignement - Génétique Médicale - DFGSM2/3.Issy-les-Moulineaux : Elsevier-Masson, 2016.2. Gorokhova S, Biancalana V, Lévy N, Laporte J, Bartoli M,Krahn M. Clinical massively parallel sequencing for the diagnosisof myopathies. Revue Neurologique (Paris) 2015 ; 171 : 558-71.

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