Outils chimiques pour létude des macromolécules biologiques Marius Réglier...
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Outils chimiques pour l’étude des macromolécules biologiques Marius Réglier [email protected] Laboratoire de Bioinorganique Structurale, service 432 Chimie, Biologie et Radicaux Libres UMR-CNRS 6517 Université Paul Cézanne Aix-Marseille III Faculté des Sciences et techniques Avenue Escadrille Normandie-Niemen 13397 Marseille cedex 20 http://www.lbs.fst.u-3mrs.fr
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Outils chimiques pour l’étudedes macromolécules biologiques
Marius Réglier
Laboratoire de Bioinorganique Structurale, service 432 Chimie, Biologie et Radicaux Libres UMR-CNRS 6517
Université Paul Cézanne Aix-Marseille IIIFaculté des Sciences et techniques
Avenue Escadrille Normandie-Niemen13397 Marseille cedex 20
http://www.lbs.fst.u-3mrs.fr
I. L’apport de la chimieà la biologie moléculaire
Le 25 avril 1953, Crick et Watson révèlent la structure de l'ADN
Prix Nobel de Medecine en 1962F. Crick, J. Watson et M. Wilkins
Erwin Chargaff
Rosalind Franklin
Le dogme
AAA
mRNA
tRNA
traduction
protéine
transcription
DNA
réplication
L’ADN, deux paires de bases AT, CG
N
N
N
NN
NN
O
O
H
H
H
R
R
ATN
N
N
N O
N
N
N
N
O
C
H
H
H
H
H
R
R G
Triplex
N
N
N
NN
NN
O
O
H
HH
RR
A
T
N
NO
OH
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N
NN
NO
N
NN
N
O
C
H
H
H
H
H
R
R
N
NN
O
C+H
H
R
H
Quadruplex
N
NN
NO
N
H
H
H
R
N
N
NN
ON
HH
H
R
N
NN
NO
N
H
H
H
R
N
N
NN
ON
HH
H
R
Télomères
O
HO
NN
O
O
OP
OO
-O
O NN
N
O
OP
O
-O
O
NN
N O
N
NO
OP
O O
-O
NN
N
N N
O
OP
-O
-O
O
HH
H
HH
HH
H
N N
O
O
H
NN
N
O
HH
NN
N
NO
NH
H
H
NN
N
NNHH
OOH
OP
OO
O-
O
OP
O
O-
O
O
OP
OO
O-
O
OP
O-
O-
O
3’
5’
5’
3’
T
C
G
A
A
G
C
T
ADN, deux brins
DNA, double hélice
Forme B, forme commune dans les conditions physiologiques, faible force ionique et haut dégré d’hydratation (10 paires de bases/tour avec une conformation C2'-endo/anti), deux sillons distincs.Forme Z, (Zigzag) riche en paires G-C, allongée et étroite, possède une unusuelle hélice gauche (12 paires de bases/tour), un seul sillon compactLe Zigzag résulte d’une alternance de purines (C3'-endo/syn) et de pyrimidines (C2'-endo/anti).Forme A-form, aux fortes concentrations en cations ou aux faibles degrés d’hydratation (11 paires de bases/tour, C3'-endo/anti), 2 sillons (1 grand étroit et profond et 1 petit large et peu profond).
O
O
OO
O
O
H
H H
H
H
P
P
P
P
H
H2NHN
N
N
N
O
NH2
NHN
N
NO
C3'endoC2' endo
anti
syn
DNA, polymorphisme
DNA, polymorphisme
DNA, packaging
nucléosomes
Chromosome
chromatine
Réplication
Transcription et traduction
ARN, deux paires de bases AU, CG
N
N
N
NN
N
N
O
O
H
H
H
R
R
ATN
N
N
N O
N
N
N
N
O
C
H
H
H
H
H
R
R G
N
N
N
NN
N
N
O
O
H
H
H
R
R
AUN
N
N
N O
N
N
N
N
O
C
H
H
H
H
H
R
R G
ADN
ARN
3’
5’
U
C
G
A
O
HO
NN
O
O
OP
OO
-O
O NN
N
O
OP
O
-O
O
NN
N O
N
NO
OP
O O
-O
NN
N
N N
O
OP
-O
-O
O
HH
H
HH
HH
H
OH
OH
HO
OH
ARN, monobrin
ARNt
Anti-codon
Le code universel43 (64) codons pour 20 amino-acides
TTT F Phe TCT S Ser TAT Y Tyr TGT C Cys TTC F Phe TCC S Ser TAC Y Tyr TGC C Cys TTA L Leu TCA S Ser TAA * Ter TGA * Ter TTG L Leu i TCG S Ser TAG * Ter TGG W Trp
CTT L Leu CCT P Pro CAT H His CGT R Arg CTC L Leu CCC P Pro CAC H His CGC R Arg CTA L Leu CCA P Pro CAA Q Gln CGA R Arg CTG L Leu i CCG P Pro CAG Q Gln CGG R Arg
ATT I Ile ACT T Thr AAT N Asn AGT S Ser ATC I Ile ACC T Thr AAC N Asn AGC S Ser ATA I Ile ACA T Thr AAA K Lys AGA R Arg ATG M Met i ACG T Thr AAG K Lys AGG R Arg
GTT V Val GCT A Ala GAT D Asp GGT G Gly GTC V Val GCC A Ala GAC D Asp GGC G Gly GTA V Val GCA A Ala GAA E Glu GGA G Gly GTG V Val GCG A Ala GAG E Glu GGG G Gly
Polymerase Chain
Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR)
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’
3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’
3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’
3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
5’--ACGTAA---3’
+ 5’---AACGTC--3’
+ dNTP + TaqPol
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’
--ACGTAA---5’
5’---AACGTC--3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
3’--ACGTAA---5’ + 5’---AACGTC--3’
dNTP + TaqPol
Polymerase Chain Reaction (PCR)
30 cycles permettent d’amplifier 2 brins d’ADN en 34359738368 exemplaires.
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’
3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’
3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’
3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’
3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’
3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’
3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
+
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’
--ACGTAA---5’
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’
--ACGTAA---5’
5’---AACGTC--3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
5’---AACGTC--3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
+
5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’ 5’---AACGTC-----------------TGCATT---3’
3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’ 3’---TTGCAG-----------------ACGTAA---5’
+
3’--ACGTAA---5’ + 5’---AACGTC--3’
dNTP + TaqPol
Plasmide
Enzyme de restriction (EcoRI)CAATTG
I.1. Synthèse desoligonucléotides
Synthèse des oligonucléotides en phase supportée
la synthèse chimique des oligonucléotides se fait de 3' vers 5'.
B1
O
O
H
HH
O
OMe
MeO
O
NH
O
Les dérivés phosphoramidites des 4 nucléotides
N
NN
N
HN
O
O
H
HH
O
NH
N
N
O
NH
N
O
OPON
H
HH
DMTrOO
OPON
H
HH
DMTrO
N
N
NCOPh
O
O
OPON
H
HH
DMTrO
HN
N
O
O
OMe
MeO
O
PO N
N
O
Adénosine
Guanosine ThymineCytidine
Etape 1: de-blocking
B1
O
O
H
HH
O
OMe
MeO
O
NH
O
B1
O
O
H
HH
O
OMe
MeO
O
NH
O
H B1
O
O
H
HH
HO
OMe
MeO
O
NH
O
Etape 2: Condensation
B1
O
O
H
HH
O
NH
O
B2
O
O
H
HH
DMTrO
PO N
N
B2
O
O
H
HH
DMTrO
PO N
N
N NN
NH
NN
N
B2
O
O
H
HH
DMTrO
PO N
N
H
N NN
N
B2
O
O
H
HH
DMTrO
PO O
N
N
H
B1
O
O
H
HH
O
NH
O
HO
Etape 3: Capping
B1
O
O
H
HH
O
NH
O
B2
O
O
H
HH
DMTrO
PO O
N B1
O
O
H
HH
O
NH
O
HO
98% 2%
B1
O
O
H
HH
O
NH
O
AcO
Ac2O
Capping
-----ATGCTACGTCAACTA-----
-----ATGCTACGTCAACTA----------ATGCTACGTCAACT-----ATGCTACGTCAAC-----ATGCTACGTCAA-----ATGCTACGTCA-----ATGCTACGTC-----ATGCTACGT-----ATGCTACG
-----ATGCTAC-----ATGCTA
-----ATGCTACG-----ATGCTAG-----ATGCTAC
-----ATGCTACGT-----ATGCTAGT-----ATGCTACT-----ATGCTAG
Sans
Avec
Etape 4: Oxydation
B1
O
O
H
HH
O
NH
O
B2
O
O
H
HH
DMTrO
PO O
N B1
O
O
H
HH
O
NH
O
B2
O
O
H
HH
DMTrO
PO O
N
OI2, Pyridine
H2O - THF
RO P
ROOR
RO P
ROOR
I
RO P
ROOR
OI H
RO P
ROOR
OI2 H2O - H
Etape finale
B1
O
O
H
HH
O
NH
O
Bn
O
O
H
HH
PO O
N
O
Bn+2
O
O
H
HH
DMTrO
PO O
N
O
nB1
O
OH
H
HH
Bn
O
O
H
HH
PHOO
O
Bn+2
O
O
H
HH
HO
PHOO
O
n
NH4OH
Synthétiseur
I.2. Séquençage de l’ADN
La méthode de Maxam and Gilbert
5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’3’-----TACGATGCAGTTGAT-----5’
PrimerADN polymérasedATP, dTTP, dCTP et dGTP dATP radioactif P32
5’-----------------ATGCTACGTCAACTA-----------------3’3’-----------------TACGATGCAGTTGAT-----------------5’
1) Enzyme de restriction (EcoRI)2) Introduction dans un plasmide
La méthode de Maxam and Gilbert
Tube 2 + Me2SO4-0.1M HCl3’---TACGATGCAGTTG3’---TACGATGCAGTT3’---TACGATGCA3’---TACGATGC3’---TACGAT3’---TACG3’---TAC3’---T A + G
Tube 1 + Me2SO4-0.1M NaOH3’---TACGATGCAGTT3’---TACGATGCA3’---TACGAT3’---TAC G
Tube 3 + N2H4
3’---TACGATGCAGTTGA3’---TACGATGCAGT3’---TACGATGCAG3’---TACGATG3’---TACGA3’---TA3’--- C + T
Tube 4+ N2H4-NaCl3’---TACGATG3’---TA C
5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’
La méthode de Maxam and Gilbert
CG
ATGCTACGTCAACTAATGCTACGTCAACTATGCTACGTCAACATGCTACGTCAAATGCTACGTCAATGCTACGTCATGCTACGTATGCTACGATGCTACATGCTAATGCTATGCATGATA
Mig
ratio
n Lectu
re
A+G T+C
Séquençage de l’ADN : la méthode de Sanger
O
OH
HN
N
O
O3-HO9P3O O
N
N
NH2
O
OH
3-HO9P3O
NH
N
NO
NH2N
O
OH
3-HO9P3O
N
NN
NNH2
O
OH
3-HO9P3O
O
HN
N
O
O3-HO9P3O O
N
N
NH2
O3-HO9P3O
NH
N
NO
NH2N
O3-HO9P3O
N
NN
NNH2
O3-HO9P3O
dTTP dCTP dGTP dATP
ddTTP ddCTP ddGTP ddATP
Séquençage de l’ADN : la méthode de Sanger
Tube 4+ ddATP-----ATGCTACGTCAACTA----------TACCATGCAGTTGA-----TACCATGCA-----TACCA-----TA
Tube 1 + ddTTP-----ATGCTACGTCAACTA----------TACCATGCAGTTGAT-----TACCATGCAGTT-----TACCATGCAGT-----TACCAT-----T
Tube 2 + ddCTP-----ATGCTACGTCAACTA----------TACCATGC-----TACC-----TAC
Tube 3 + ddGTP-----ATGCTACGTCAACTA----------TACCATGCAGTTG-----TACCATGCAG-----TACCATG
5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’3’-----TACGATGCAGTTGAT-----5’
PrimerADN polymérasedATP, dTTP, dCTP et dGTP dATP radioactif P32
Autoradiographie du gel de séquence
A C G T
ATGCTACGTCAACTAATGCTACGTCAACTATGCTACGTCAACATGCTACGTCAAATGCTACGTCAATGCTACGTCATGCTACGTATGCTACGATGCTACATGCTAATGCTATGCATGATA
Mig
ratio
n Lectu
re
ddATP
ddTTP ddCTP
ddGTP
Fluorescence (Diagramme de Jablonski )
S0
S1’
S1
En
erg
ie
hh
O OHO
CO2
COOR
FAMmax = 490-495 nmEmmax = 515-520 nm
Pigments
O O O O
O NMe2 O N
HOCl
HO
MeO
Cl
OMeCO2
O
DNA
CO2
O DNA
O2C
O
DNA
CO2
O
DNA
NMe2N
Rhodamines
Fluorescéines
JOEFAM
TAMRA ROX
Marquage fluorescent
1) Dye-labeled primer sequencingcolorant attaché en 5’ du primer
2) Internal labelingcolorant attaché à un dNTP et incorporé durant la synthèse du nouveau brin d’ADN
3) dye-labeling terminator sequencingcolorants attaché à un ddNTP
Point d’ancrage du pigment
N
NN
NN
NN
O
O
H
HH
R
RA
T
N N
NN
O
NN
N
N
O
C
H H
H
H H
R
R
G
Dye-labeled primer sequencing
Tube 4+ ddATP-----ATGCTACGTCAACTA---------TACCATGCAGTTGA----TACCATGCA----TACCA----TA
Tube 1 + ddTTP-----ATGCTACGTCAACTA---------TACCATGCAGTTGAT----TACCATGCAGTT----TACCATGCAGT----TACCAT----T
Tube 2 + ddCTP-----ATGCTACGTCAACTA---------TACCATGC----TACC----TAC
Tube 3 + ddGTP-----ATGCTACGTCAACTA---------TACCATGCAGTTG----TACCATGCAG----TACCATG
5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’3’-----TACGATGCAGTTGAT-----5’
PrimerADN polymérasedATP, dTTP, dCTP et dGTP
d-Rhodamine dye-labeled terminators
ddC-EO-5dTMR
O
NMe2
Me2NCl
Cl
O
HN
O
3-HO9P3OO
N
586 nmCOO
N
NH2
O
ddT-EO-6dROX
O NN
ClO2C
ClO
HN
O
3-HO9P3OO
N
NH
O
O
625 nm
d-Rhodamine dye-labeled terminators
ddT-PA-5dR6G ddT-EO-5dR110
O
NH2
H2N
ClCl
ONH
O
3-HO9P3OO
N N
NH
O
540 nm
COO
O NHEtEtNH
Cl
Cl
O NH
3-HO9P3OO
N N
N
H2N
570 nm
COO
PA, propargylamino - EO, propargyl ethoxyamino
ddT-BigDye terminator
O NMe2Me2N
Cl
Cl
COO
NHO
O OO
OOC
O
HN
NH
O
ONH
O
O
O3-HO9P3O
excitation
émission
Transfertd’énergie
Gel de séquence
