Origine et différenciation des lymphocytes T TCR et...
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Origine et différenciation des lymphocytes T TCR et tolérance centrale
Pr. Guislaine Carcelain Immunologie, Hôpital Robert Debré, Université Paris Diderot
- Les lymphocytes T dans le système immunitaire - Le récepteur à l’antigène des lymphocytes T = TCR - Les organes lymphoïdes primaires - La maturation centrale des lymphocytes T
- Sortie du thymus des lymphocytes T et circulation périphérique
- La numération lymphocytaire
- Les lymphocytes T non classiques
PARTIE I : Les Lymphocytes T dans le système immunitaire
Rôle du système immunitaire
Distinguer le SOI et NON-SOI Reconnaître un contexte de DANGER
Non-soi et danger : parasites micro-organismes virus L’Autre (?) Soi modifié et danger : cellules tumorales Non-soi sans danger : fœtus Soi sans danger:
tolérance
Immunité Innée Immunité Spécifique
Dendritiques, langherans
Phagocytes : Monocytes/macro /PNn
Lymphocytes NK
Lymphocytes T CD4+ et CD8+
Récepteur Spécifique d’antigène/ CMH CD4 : Régulation des réponses immunes
CD8 : Cytotoxicité cellules infectées ou anormales
Les Réponses immunes, coordonnées et coopérantes
Lymphocytes B
Récepteur spécifique d’antigène Réponse Anticorps à distance
Maturation centrale MO, thymus
Production dans la moelle osseuse
(CPA professionnelles)
Maturation pérophérique
Des récepteurs pour reconnaître spécifiquement des épitopes
Récepteur spécifique d’antigène (non soi)
CMH CPA
TCR
LyT
antigène
BCR
LyB
antigène
BCR : B cell receptor (Ig de surface)
TCR : T cell receptor Crées par recombinaison, diversité importante
Notion de clone : 1 antigène ↔ 1 lymphocyte
Activation Production d’anticorps
Activation Prolifération
CPA : cellule présentatrice d’antigène
CMH = HLA : molécule du complexe majeur d’histocompatibilité
Les lymphocytes T: 75 à 85% des lymphocytes sanguins
TCR ab
CD3+ TCR gd
CD3+
< 10% T > 90% T
CD4- CD8+
CD4- CD8-
CD4+ CD8+
Cytotoxicité régulation cytotoxicité
«fonction auxiliaire» (sécrétion de cytokines)
< 1% T TCRab invariant CD3+
PARTIE II : Le Récepteur T pour l’antigène (TCR)
Le Récepteur T pour l’antigène = T-Cell Receptor ou TCR
Structure du complexe TCR-CD3
α β
+ +
+
δ ε ε γ
- - - -
TCR
CD3 CD3
Reconnaissance
Transduction du signal
Région hypervariable (recombinaison somatique)
Région Variable “V”
Région Constante “C”
Region transmembranaire
Queue Cytoplasmique
ITAM ITAM
ITAM ITAM
ITAM
ITAM ITAM
ITAM
ITAM ITAM
ζ ζ
500000/lymphocytes T
Les TCR ont une structure de type «Immunoglobulin like»
• Domaine d’immunoglobulinique= structure de base de la famille Domaine conservé de 110 acides aminés avec un pont disulfure, Structure-type en feuillets bêta antiparallèles Structure en tonneau
• Super-famille des immunoglobulines = molécules contenant de tels domaines immunoglobuliniques
Les molécules CD4 et CD8
Written by Dan Stowell (©2002-2006)
• Stabilisation interaction CMH/TCR : interaction avec le CMH • Participent à la signalisation intracellulaire : recrutement de kinases
Le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH)
Complexe: > 200 gènes codant pour des produits très divers Majeur: les produits sont à l’origine de différences allogéniques importantes entre individus de la même espèce. Histocompatibilité: à l’origine de phénomènes de rejet de greffe entre sujets incompatibles Fonctions :
Présentation de peptides du soi/non soi aux LT Sélection Thymique
Réponse immunitaire adaptative
Surveillance exercée par les cellules Natural Killer
Il existe sur certaines cellules humaines des molécules qui sont différentes d’un sujet à un autre
Molécules du CMH de classe I et de classe II
CMH Classe III C4, c2, HSP70, TNF …
Le complexe majeur d’histocompatibilité
A1 B7 Cw6 DP1 DQ5 DR3
A26 B27 Cw3 DP5 DQ2 DR4
A8 B28 Cw6 DP2 DQ5 DR3
A2 B7 Cw4 DP4 DQ2 DR1
A8 B28 Cw6 DP2 DQ5 DR3
A1 B7 Cw6 DP1 DQ5 DR3
A8 B28 Cw6 DP2 DQ5 DR3
A26 B27 Cw3 DP5 DQ2 DR4
A2 B7 Cw4 DP4 DQ2 DR1 A2 B7 Cw4 DP4 DQ2 DR1
A1 B7 Cw6 DP1 DQ5 DR3 A26 B27 Cw3 DP5 DQ2 DR4
recombinaisons rares
Transmission en haplotype
Expression codominante à la surface cellulaire
A2
A3
B14 B7 Cw
4
Cw
6
fixe des peptides de 8-10 aa
fixe des peptides >13 aa
b2-M
a1
Peptide
a1
b1 Peptide
HLA classe I HLA classe II
a2
Contenu de la cavité présentatrice d’Ag
Cavité des molécules du CMH Cl I : fermée par des ponts salins qui limitent
la taille du peptide
Cavité des molécules du CMH Cl II : le peptide peut dépasser aux extrémités
- La liaison des peptides se fait par des résidus dits d’ancrage (ou motifs) : acides aminés (aa) que l’on retrouve préférentiellement à certaines positions dans les peptides élués de molécules du CMH
Présentation du peptide par le CMH au TCR
Le TCR reconnait le peptide et le CMH notion de reconnaissance restreinte par le (au) CMH
Le TCR du lymphocyte T mature
- Les TCR des LT CD4 reconnaissent des peptides de 12 à 25 acides aminés, présentés par le CMH de classe II présent sur les cellules présentatrices d’antigène, provenant de la dégradation intracellulaire de protéines extracellulaires
Reconnaissance de peptides antigéniques
- Les TCR des LT CD8 reconnaissent des peptides de 9 acides aminés, présentés par le CHM de classe I présent sur toutes les cellules nucléées, provenant de la synthèse de protéines intracellulaires de pathogènes
Voie endosomale
Voie du protéasome
Partie III : Les Organes lymphoïdes 1aire : Moelle osseuse et Thymus
Organes et tissus lymphoïdes
Organe souche - Moelle Osseuse formation des précurseurs
lymphoïdes primaires ou centraux - Thymus maturation et différenciation - Moelle Osseuse des précurseurs
Organes et tissus lymphoïdes secondaires ou périphériques
- ganglions lymphatiques - rate siège des - tissu lymphoïde associé aux bronches réactions - amygdales végétations immunitaires - ganglions mésentériques - plaques de peyer - tissus lymphoïde urogénital
Organes lymphoïdes primaires
Cellules souches hématopoiétiques
Maturation des lymphocytes marqueurs spécifiques de lignée, récepteur spécifique de l’antigène, éducation (sélection) Production en périphérie de lymphocytes T ou B naïfs Thymus
Moëlle osseuse
● Tissu hématopoiétique présent dans les os longs et le squelette axial
● Toutes les cellules sanguines sont dérivées des cellules souches de la moelle, seules capables d’auto- régénération
© 2009 Nucleus Medical Media, Inc.
Adipocytes
Globules rouges
Blastes
Vaisseau central
Os
L’anatomie de la moelle osseuse permet la production
et l’exportation des cellules hématopoïétiques
Fonctions de la moëlle osseuse
MO assure 3 fonctions: • Maintien d ’un contingent de cellules souches et production des cellules hématopoïétiques
• Maturation et différentiation des prolymphocytes B en lymphocytes B matures aptes à coloniser les organes lymphoïdes secondaires
• Hébergement des B activés par l ’antigène en provenance des organes secondaires et qui se transforment en plasmocytes sécréteurs d ’anticorps, à longue durée de vie
Structure du thymus
● Organe lymphoïde primaire
● Colonisé par les progéniteursT
Anatomie
● Bilobé, thoracique, médian
● Divisé en lobules :
- Cortex : thymocytes immatures
- Medulla : cellules matures
Composition cellulaire des lobules
Les différents types cellulaires thymiques:
Thymocytes
Cellules épithéliales corticales (cTECs) Cellules épithéliales médullaires (mTECs) Cellules dendritiques (DCs)
Macrophages
Fonctions du Thymus
Maturation des progéniteurs T pour produire des lymphocytes T CD4+ et CD8+ naïfs qui vont migrer en périphérie
Pas de thymus = pas de lymphocytes T naïfs (syndrome de Di Georges)
Production journalière moyenne environ 108 lymphocytes T/jour
Evolution du Thymus avec l’âge
- Le thymus involue avec l’âge à partir de la puberté et durant toute la vie, replacement du tissu thymique par tissu adipeux
- Mais des cellules T continuent à se former dans le thymus de l’adulte, variable selon les individus
Augmentation de production thymique lors du traitement par antirétroviraux, patients infectés VIH
(Markert ML 2001)
(Rubio 2002)
Spearman test; R = 0·571, P = 0·007
Augmentation du nombre de cellules naïves CD4 produites par le thymus Augmentation progressive du nombre de cellules naïves CD4 en périphérie
Partie IV : Maturation centrale des lymphocytes T
Etapes importantes de la maturation centrale des lymphocytes T
- Multiplication intense des thymocytes - Acquisition des marqueurs de surface spécifiques de lignée : ex : CD3 spécifique des LT - Acquisition des récepteurs spécifiques à l’antigène par recombinaison somatique au hasard : TCR (T Cell Receptor) - Sélections des lymphocytes compétents et ne reconnaissant pas le soi
- sortie des organes lymphoïdes de lymphocytes T naïfs
Facteurs nécessaires à la maturation centrale des cellules lymphoïdes
Moelle Osseuse
Cellule Souche hématopoïétique
Cellule Souche lymphoïde
IL3, SCF
IL7, SCF
Organes Lymphoïdes secondaires
Thymus
IL2, IL7
SCF, FT
CD34
Pro-B
Pro-T
B naïf
T naïf
FT= thymuline, thymosines a1, thymopoiétine
Récepteurs Notch / Ligands
Le réseau des cellules épithéliales permet la maturation des cellules T
- Cellules épithéliales nourricières (cortex externe) : IL-7
- Cellules épithéliales du cortex thymique (cTEC) : sélection positive
(CMH I et II)
- Cellules épithéliales médullaires (mTEC), DC : sélection négative
(peptides spécifiques d’organes du soi)
4 - 8 low
4 low 8 low
4 + 8 + TCR
4 + 8 + TCR
macrophage
Réarrangement TCR productif
Réarrangement TCR Non productif
Reco MHC S+
Non Reco MHC
Pas de Reco Ag du soi
Reco Ag du soi S-
APOPTOSIS
4 - 8 -
Region sous-capsulaire
Cortex
région cortico-médullaire
4+ 8- TCR
4- 8+ TCR vaisseaux
Medullaire
DN
DP
SP
prolifération
Sélection négative
Sélection positive
Le thymus est l’organe de différentiation central des progéniteurs T en cellules T naïves
DN1 DN2
1 – le réarragement des gènes du TCR
Un lymphocyte T naïf = un TCR unique
α β
+ +
+
δ ε ε γ
- - - -
TCR
CD3 CD3
Reconnaissance
Transduction du signal
Région hypervariable (recombinaison somatique)
Région Variable “V”
Région Constante “C”
Region transmembranaire
Queue Cytoplasmique
ITAM ITAM
ITAM ITAM
ITAM
ITAM ITAM
ITAM
ITAM ITAM
ζ ζ
500000/ly
Gènes du TCR en configuration germinale
Chromosome 14
Chromosome 7
- Réarragement chaîne béta puis alpha - Le réarragement de la chaîne alpha induit l’excision du locus codant pour les gènes de la chaîne delta
Le réarragement de la chaîne alpha induit l’excision du locus de la chaîne delta
Réarragement chaînes alpha et béta
RAG (Recombinase Activating Gene)
Endonucléase, TdT (Terminal Desoxynucleotidyl Transferase)
ADN non réarrangé
ADN réarrangé ARN
Cercles d’excision
Intervention des mêmes systèmes enzymatiques que pour le BCR
séquences signal de recombinaison de part et autre segments
répertoire T: diversité combinatoire et jonctionnelle
combinatoire
jonctionnelle
totale
V-D et VD-J V-J
1 cellule T 1 récepteur à l’antigène, 10 13-15 TCR différents
Structure tridimentionnelle de l’extrémité terminale du TCR
a b
Complexe ternaire CDR1
CDR2
CDR3
Le site de fixation est défini par des séquences hypervariables CDR (Complementary Determining Regions) CDR1, 2, 3 dans chaque région V
Entre les CDR: les FR (framework region) présentent peu de variabilité Les interactions ont lieu entre les AA des CDR (paratope) et l’Ag (épitope)
- Lymphocytes T naïfs ayant chacun un TCR unique, créés au hasard par la recombinaison de gènes Reconnaissance d’un grand nombre de peptides différents Mais : - Reconnaissant les molécules CMH de l’hôte ou pas - Reconnaissant du non soi ou du soi
Éliminer les thymocytes ayant un TCR: ne reconnaissant pas les molécules du CMH de l’hôte reconnaissant le soi PERTES +++
Au total,
2 – la sélection Positive
Sélection Positive des Lymphocytes T dans le thymus : rôle des cellules épithéliales corticales
antigènes du soi présentés par les cellules Épithéliales Corticales (peu efficace )
Pas de reconnaissance CMH-peptide Mort programmée par négligence
Engagement faible du TCR Engagement CMH Cl I : CD8+ Engagement CMH Cl II : CD4+ Survie et poursuite différenciation
La sélection positive a lieu au stade DP lorsque les thymocytes expriment un TCRab potentiellement fonctionnel
Les CMH de classe I et II permettent la sélection positive des cellules CD8 et CD4 respectivement
Les CMH de classe I et II permettent la sélection positive des cellules CD8 et CD4 respectivement, restriction par le CMH
3 – la sélection Négative
Sélection négative: les cellules épithéliales médullaires expriment des antigènes de tissus grâce à Aire
- Aire : auto-immune regulatory gene (facteur de transcription) - mutation de Aire : syndrome de polyendocrinopathie auto-immunitaire (ACEPED) - les gènes spécifiques d’organes non exprimés par les cellules épithéliales
médullaires mTEC sont la cible des auto-anticorps
Rôle des cellules dentritiques et épithéliales médullaires dans la sélection négative ?
Sélection Négative dans le thymus
cellules Dendritiques , Cellules Épithéliales Médullaires thymiques Présentation des antigènes efficace
ENGAGEMENT FORT DU TCR : mort cellulaire induite via le TCR
Cellule souche
Précurseur T DN1
SP T naïfs
T matures
CD34 cCD3
CD7
CD5
CD2
MOELLE OSSEUSE THYMUS
corticale médullaire
cCD3
CD7
CD5
CD2
CD1a
cCD3
CD7
CD5
CD2 CD3 - TCR
CD7
CD5
CD2
CD4
DN = double négatif, DP = double positif CD4+CD8+ SP = simple positif CD4+ou CD8+
CD3- preTCR
CD7
CD5
CD2
CD4
CD8
DN2 DP
CD3 - TCR
CD7
CD5
CD2
CD8
CD3 - TCR
CD7
CD5
CD2
CD4
CD3 - TCR
CD7
CD5
CD2
CD8
PERIPHERIE
Progression des différentes étapes du réarragement des gènes du TCR
Multi potents Pro-T
Partie V : Sortie du thymus des lymphocytes T et circulation périphérique
Circulation des Lymphocytes emprunte les vaisseaux sanguins et lymphatiques
ORGANES LYMPHOIDES PRIMAIRES Moelle Osseuse / Thymus PRODUCTION
ORGANES LYMPHOIDES SECONDAIRES Ganglions, rate, tissus lymphoïde associé aux muqueuses ACTIVATION, DIFERENCIATION
ORGANES LYMPHOIDES TERTIAIRES Lieu de l’aggression FONCTIONS EFFECTRICES
Cellules naïves - Entrée dans les gg lymphatiques et le MALT à travers les veinules à endothélium élevé (HEV) - Entrée dans la rate à travers la zone marginale
Lymphe, CT, sang, tissus …
Sang
Cellules effectrices Sang Cellules naives, mémoires
Les lymphocytes T gagnent le ganglion par les HEV pour être activés par les cellules dendritiques
Flux sanguin Contact = roulement du lymphocyte Adhérence primaire réversible Activation du lymphocyte
Adhérence secondaire irréversible
transmigration
L sélectine CD62L ELAM-1
Intégrines LFA-1/ VLA4 ICAMS
Lymphocytes Cellules endothéliales des veinules post capillaires
CCR7 / CXCR5 CCL21, 19 / CXCL13 Tissus
Passage trans-endothélial des Lymphocytes
adhésion chimiotactisme
Partie VI : Numération lymphocytaire
Principaux Marqueurs des lymphocytes T
TCR récepteur à l’antigène CD2, CD5, CD7 marqueurs de lignée T CD3 lignée T, transduction du signal CD4 liaison MHC Cl II, signalisation CD8 liaison MHC Cl I, signalisation CD28 co-activation / B7 CD40L co-activation / CD40 IL2R récepteur à l’IL2 LFA1, ICAM-1 molécules d’adhésion CD45 RA / RO marqueur de différenciation
488 nm
excitation émission
FITC
PerCP
PE CD8
CD4
CD3
CD45
CELL
680 nm
578 nm
543 nm
Principe de la cytométrie en flux
LASER
Informations sur: - taille - structure - fluorescence
Numération des lymphocytes CD4 et CD8
1) marquage sang total Ac anti-CD4, Anti-CD8, anti-CD3, anti-CD45 couplés à des fluorochromes différents lyse des hématies 2) analyse cytomètre sur 10,000 cellules 1 à 3 min/prélèvement
Immunofluorescence à l’aide d’Ac monoclonaux anti-CD4, CD8, CD3, CD45 Analyse en cytométrie en flux
2 phases
10-20 min
1-3 min
Polynucléaires Neutrophiles
Monocytes
Lymphocytes
Str
uctu
re
Taille
0 200 400 600 800 1000
0
20
0
40
0
60
0
80
0
100
0
Débris cellulaires
Exemple sur sang total lysé: informations sur la taille et la structure
CD3 APC
CD3 APC
CD4 F
ITC
CD8 P
E
CD4 FITC
CD8 P
E
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 0
10
1
10 2
10
3
10 4
10 0
10
1
10 2
10
3
10 4
10 0
10
1
10 2
10
3
10 4
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
Exemple sur sang total lysé : Information sur les fluorescences/molécules
CD4+, CD3+
CD3+,CD4- (ex: CD8)
DN (ex LB)
CD4+, CD3-, (ex monocyte)
CD8+, CD3+
CD3+,CD8- (ex:CD4)
CD4
CD8
CD8+, CD3- ex NK
Répartition tissulaire des populations lymphocytaires
Sang périphérique Moelle osseuse Thymus Ganglions Rate
Lymphocytes T Lymphocytes B Lymphocytes NK
70-85 %
70-80 %
5-10 %
99 %
30-40 %
5-15 % 5-15 %
80-90 % 5-10 %
<1 % <1%
20-30 % <1 %
50-60 % 1-5 %
Populations lymphocytaires, valeurs normales adulte
Résultats en % de lymphocytes circulants et en valeurs absolues Pour valeur d’exemple, normes laboratoire Immunologie Pitié-Salpêtrière
CD3+ (lymphocytes T) 70%-85% CD4+CD3+ 47% 860/mm3 (SD 260)
CD8+CD3+ 26% 480/mm3 (SD 160)
CD4+CD3+/CD8+CD3+ > 0.9 CD19+ (lymphocytes B) 5-15%
CD3-CD16+et/ou56+ (lymphocytes NK) 5-15%
Variations des sous populations lymphocytaires T aux âges extrêmes
Sang cordon
J1-11 mois 1-6 ans 7-17 ans 18-70ans
Lymphocytes % .103/mm3
Cellules T CD4+ % .103/mm3
Cellules T CD8+ % .103/mm3
Cellules T CD3+ % .103/mm3
CD4/CD8
41 5.4
47 4
46 3.5
40 2.5
32 2
55 3
64 2.5
64 2.5
70 1.8
72 1.4
35 2
41 2
37 1.6
37 0.8
42 0.8
29 1.5
21 0.9
29 0.9
30 0.8
25 0.5
1.2 (0.8-1.8)
1.9 (1.5-2.9)
1.3 (1-1.6)
1.3 (1-1.4)
1.2 (1-1.5)
>75ans
Partie VII : Lymphocytes T non conventionnels
Les lymphocytes T avec un récepteur à l’antigène de type gd
Doubles négatives CD4-CD8- ou Simples positives CD8+CD4- Tissus et muqueuses Diversité beaucoup plus restreinte, restriction par le CMH non classique CD1 Reconnaissance d’épitopes conservés au sein des pathogènes Action rapide, proche de l’innée, cytotoxicité +++ et sécrétion de cytokines
Les lympocytes NKT
- Marqueurs T : CD3 et TCR et marqueurs NK CD56 et CD16 - TCR quasi invariant : chaine a V14-J18, diversité b mais restreinte - Reconnait des lipides présentés par la molécule du CMH non classique CD1d
- Fréquence sanguine variable et faible, distribution tissulaire hétérogène
- Rôle dans la régulation des réponses immunitaires: anomalies associées à des pathologies auto-immunes, inflammatoires, tumorales
Points clefs
- la majorité des lymphocytes T circulants ont un récepteur à l’antigène composé des chaînes a et b
- le TCR est au sein d’un complexe : TCR/CD3/ CD4 ou CD8
- le TCR reconnait le complexe CMH/peptide, notion de restriction par CMH
-le TCR des LT CD4 reconnait des peptides de 12-25 acides aminés, présentés par le CMH II des cellules présentatrices provenant de la dégradation intracellulaire de protéines extracellulaires
-les TCR des LT CD8 reconnait des peptides de 9 acides aminés, présentés par le CMH I des cellules nucléées, qui proviennent de la synthèse de protéines intracellulaires de pathogènes
- thymus : organe de différenciation centrale des lymphocytes T : multiplication, formation TCR, sélection TCR adéquats
- TCR formés par la recombinaison au hasard de segments de gènes
- sélection positive des thymocytes présentant un TCR reconnaissant le CMH
- sélection négative des thymocytes présentant un TCR reconnaissant le soi
-populations de lymphocytes T non classiques , minoritaires, fonction se rapprochant de celle des cellules innées
Livre Immunologie Fondamentale et Immunopathologie Les cours de L2-L3 Médecine Elsevier Masson