Марахонов Андрей Владимирович

Молекулярная биология

Лекция 13. Молекулярно-биологические методы.

Место молекулярной биологии

RNA

Central dogma of molecular biology

Этапы любого анализа

• Выделение того или иного компонента (ДНК/РНК/белки/…)

• Разделение компонентов

• Визуализация

Методы основаны на:

Собственных свойствах

• Различные физико-химические свойства разных компонентов клетки (заряд, размер, масса, состав, растворимость в различных соединениях)

• Эти свойства используются для выделения, разделения и анализа компонентов

(Электрофорез, комплементарность НК)

Неферментативные реакции

Специфичных реакциях

• Специальные ферменты узнают и изменяют только конкретные последовательности

(Пример: Рестриктазы разрезают только ДНК только в определенном месте.)

Ферментативные реакции

Гель-электрофорез

• метод анализа или разделения веществ под действием электрического поля, когда в качестве носителя используется гель.

Гель-электрофорез

Гель-электрофорез

• В агарозном или полиакриламидном геле

• Капиллярный или обычный

• В денатурирующих или нативных условиях

• В градиентном или обычном геле

• В постоянном поле или пульс-электрофорез

• Одно- и двухмерный (в случае белков)

Изоэлектрофокусирование белков

• Разделение белков происходит в зависимости от их заряда в градиенте pH создаваемом с помощью синтетических смесей (амфолитов) под действием электрического поля.

Изучение ДНК

• Гибридизация — соединение комплементарных одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот в одну двухцепочечную молекулу

Гибридизация НК Southern blot: фрагментированную ДНК переносят на подходящий носитель и затем с помощью зонда с известной нуклеотидной последовательностью определяют содержание целевой последовательности в образце

Sir Edwin Mellor Southern

Source: Neuromuscular Disorders 2012; 22:463-470 (DOI:10.1016/j.nmd.2011.09.004 )

Copyright © 2012 Elsevier B.V. Terms and Conditions

Клинический случай — FSHD (Facioscapulohumeral dystrophy)

Гибридизация НК

• Southern blot — гибридизация ДНК

• Northern blot — гибридизация РНК

• Western blot — определение белков с помощью антител

• Far-western blot — определение белок-белковых

взаимодействий с помощью взаимодействующих белков

• Eastern blot — детекция посттрансляционных модификаций белков

• Far-Eastern blot — определение липидов

Гибридизация НК: ДНК-микрочип

• Современный ДНК-микрочип состоит из зондов, или проб, закреплённых на твёрдой подложке. Каждая проба имеет определённую нуклеотидной последовательностью. Гибридизация зонда и мишени регистрируется и при помощи флюоресценции, что позволяет определять относительное количество НК с заданной последовательностью в образце.

Гибридизация НК

Tilling DNA-Microarray — пробы (зонды) комплементарны участкам, расположенным вдоль всех хромосом

Amplification of chromosome 8q24. 12−13 in colorectal cancer cell line COLO320. This 1.9-Mb amplification containing MYC is bounded by BAC clones RP11-810D23 and RP11-294P7. Vertical green and red lines are scale bars indicating log2 ratios of +0.5 and -0.5, respectively.

Гибридизация НК: кариотипирование

Гибридизация НК: Northern blot

• Определение альтернативных вариантов транскриптов

• Полуколичественное измерение экспрессии

• Определение размера/ориентации транскрипта

Northern blot analysis of brain and spleen β-adducin (membrane skeleton protein).

Гибридизация НК: expression microarray

Гибридизация НК: expression microarray

• Определение относительного уровня экспрессии всех белок-кодирующих генов человека

• Дифференциация различных состояний

• Поиск биомаркеров

Hierarchical clustering of data from the microarray analysis of gene expression in minor salivary glands from patients with primary Sjögren's syndrome (SS) and from healthy control subjects (Ctrl 1-10).

Синдром Шегрена

Гибридизация НК: FISH (fluorescent in situ hybridization)

Drosophila embryo

Human Papillomavirus DNA demonstrated by In Situ Hybridisation (pink) in epithelial cells identified by indirect immunofluorescence using antibody against cytokeratin (green)

Subcellular localization

Human tissue and cell

Protein analysis

Антитела (иммуноглобулины, ИГ, Ig) — это особый класс гликопротеинов, присутствующих на поверхности B-лимфоцитов в виде мембраносвязанных рецепторов и в сыворотке крови и тканевой жидкости в виде растворимых молекул, и обладающих способностью очень избирательно связываться с конкретными видами молекул, которые в связи с этим называют антигенами.

Western blot analysis

Protein analysis: immunofluorescence (IF)

Tissue distribution and organization

(mouse intestine)

Subcellular localization

(hepatocytes)

Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS)

Co-immumoprecipitation (co-IP)

Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

Enzymes for molecular biology analysis

• Синтезирующие (полимеразы, обратные транскриптазы, …)

• Модифицирующие (лигазы, рестриктазы, нуклеазы, никазы, …)

Преимущества: высокая активность и специфичность, что позволяет достигать высокой скорости реакции и большого выхода

Почему ферментативные методы?

• Малое количество исходного материала для анализа, необходимость увеличить его кол-во (->> синтезирующие ферменты)

• Специфичность действия используется для анализа только интересующих последовательностей (модифицирующие ферменты узнают только определенные последовательности)

PCR — полимеразная цепная реакция

1983

PCR — полимеразная цепная реакция

PCR — полимеразная цепная реакция

2

4

16

𝑃𝑛 = 𝑃0𝑛−1

Real-Time PCR — ПЦР в «реальном времени»

Real-Time PCR — ПЦР в «реальном времени»

• Определение абсолютного количества молекул ДНК в исходном образце

• Определение относительного уровня экспрессии генов в образце

Виды ПЦР • ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse

Transcription PCR, RT-PCR) • Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR)

или ПЦР в реальном времени • Метилспецифическая, метилчувствительная

ПЦР • ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) • Вложенная ПЦР (Nested PCR) • Ступенчатая ПЦР (Touchdown, stepdown PCR) • RAPD (Random Amplification of Polymorphic

DNA) — fingerprinting • Инвертированная ПЦР (Inverse PCR),

асимметричная ПЦР (asymmetric PCR)

PCR для медицины

• Инфекционные агенты, мутантные гены, перестройки, …

• Отцовство

• Судебная медицина (идентификация личности)

DNA fingerprint

PCR для науки • Кроме всего

предыдущего…

• Молекулярное клонирование

Использование молекулярного клонирования

Использование молекулярного клонирования

• А также:

• Биотехнология и биоинженерия (получение трансгенных организмов, рекомбинантных лекарственных препаратов, вакцин)

Использование молекулярного клонирования

• А также:

• Функциональный анализ генов

Гиперэкспрессия Knock-out, knock-in

Knock-down

Использование ПЦР: секвенирование

Использование ПЦР: секвенирование

Колоссальный научно-технический прогресс!

Как оно было Как оно стало

Продолжительность >3650 дней 3 дня

Стоимость 3 000 000 000 $ 2 000 $

Участники Сотни

лабораторий 1 человек

Качество 1 прочтение 100 прочтений

Современные секвенаторы

HiSeq 2500

Применение метода массивного параллельного секвенирования

В геномике

• Секвенирование de novo • Ресеквенирование • Секвенирование экзома • Таргетное

секвенирование • Метагеномное

В транскриптомике

• Исследование профиля экспрессии (RNA-seq)

• Исследование профиля трансляции (TRAP-seq)

• Исследование RBP (CLIP-Seq)

• Секвенирование малых РНК (miRNA, siRNA, piRNA)

В эпигенетике

• ChIP-seq (транскрипционные факторы, модифицированные гистоны)

• Анализ метилирования (Methyl-Seq)

• Анализ иммунной системы (Immuno-Seq)

• Анализ архитектоники ядра (Hi-C)

Разнообразие применения NGS

RNA-seq