Nouvelles approches thérapeutiques dans les Leucémies aiguës myéloblastiques

Cellule souche leucémique

• Fréquence faible 1 /1000 000

• Auto renouvellement:Modèle souris

• Bim-1,Wnt/beta caténine,Notch

• Différentiation

CD34+/CD38- CD3+ GPA+

LSC• PhénotypeCD34+;CD38-,Thy-;CD123+,CD90-,CD117-CD33+/-• Quiescente dans 95% des cas en phase G0• Activation consécutive NFkb;STAT5; PI3K;RasInterferon regulatory factor:IRF-1Death associated Protein Kinase:DEPK• Exprime mdr et Bcl2

LAM

Modèle de leucémogénèse en deux étapes: Gilliland DG

Mutations de type I

• Mutations activatrices de FLT3

• Mutations de c-Kit

• Mutations de N-Ras et K-Ras

Effets sur la prolifération et la survie

Mutations

AML1

C/EBP

PU-1 ?

CSL

Blocage de la différenciation

Mutations de type II

AML1/ETO

CBF/MYH11

PML/RAR

Fusions MLL

Association entre événements Géniques

CBF C-Kit dans 30 a 40% des cas Impact négatif

Flt3 IDT -KT normaux /M3

-AML1 muté dans 60% pour M0

-Association MLL

Dup 50 %

Topo trans 64 %

CEBP/ KT normaux 15%Pas association avec Flt3

Pas association avec CBF

Impact positif

GATA-1 M7 Sd de Down

Inhibition de TK et des voies de Transductions

Inhibition de l’activation de FLT3

membrane cellulaire

JM

C-terminal

Structure de FLT3 et mutations les plus fréquentes

FLT3

ITD

D835Y

Duplication en tandem de la régionjuxtamembranaire

FLT3

ITD

Ras/MAPKSTAT5PI3K

Blocage de la différenciationpar répression de CEBP/

Auto-renouvellement des cellulesCD34+ via STAT5 ?

ProliférationSurvie cellulaire

Rationnel des inhibiteurs de FLT3

Avantage de prolifération

FLT3

ITD

D835Y

25% des LAM de l’adulte

t(15,17), caryotypes normaux (ITD 32%, D835Y 14%)

t(8,21), inv (16), 11q23, rare dans les caryotypes complexes

Hyperleucocytaire, pronostic adverse dans les caryotype normaux

33% des LAM1 avec mutation de CEBP/

Valeur pronostique ?

Rapport ITD/allèle normal, délétion allèle normal,mutations des 2 allèles

Inhibiteurs de Flt3

SU11248Fiedler Onc 2003

21wt,Itd 5 (2Flt3*)

SU11248Fiedler Blood 2005

16wt,ITD 4/4 Itd

2/7WT

2 a 7 semaines Disparition de Flt3*

CEP701Allebach Blood2004

14Itd 5 Amélioration 2 a 15 semaines Corrélation activité déphosphorylation

PKC412Stone Blood 2005

20Itd 2RC;4RP 9et 47semaines Corrélation activité déphosphorylation

MLN518De Angelo Blood 2004

20Itd Sang 6(92%)

Moelle 6(62%)

1 et 15 semaines

Traitement Patients Réponse Durée

Inhibiteurs de FLT3 dans les LAM

Questions

Évènement secondaire. Tardif ? Probablement

Expression de l’ITD dans un sous clone ? Sûrement

Mutations présentes dans le compartiment de CSL ? Probablement pas

Indication chez les patients FLT3 non mutés ?

Inhibiteurs de FLT3 dans les LAM

Mécanismes de résistance ?

Mécanismes de résistance intrinsèque

Pas de mutation secondaire de FLT3 actuellement décrite

La sensibilité aux inhibiteurs diffère selon le type de mutation D835 ou de ITD(Clarck JJ, Blood, 2004, July 15)

Mutation G697R proche de la boucle d’activation: résistance totaleà PKC412, CEP-701, SU5614 (Cools J, Cancer Research, 2004, 64, 6385)

Inhibiteurs de FLT3 dans les LAM

l’avenir ?

Patients en première ligne de traitement

Association à la chimiothérapie

Association à l’inhibition de voies de signalisation situées en aval ?

- Effet synergique in vitro avec Aracytine et Daunorubicine(Yee KWH, Blood, 2004, August 10)

Diminution des doses de chimiothérapie chez les sujets agés ?

- Importance de la séquence d’administration(Levis M, Blood, 2004, May)

Inhibition du récepteur c-KIT

c-Kit

c-Kit dans les LAM

ProliférationSurvie

migration

60-80% des LAM expriment c-KIT

le SCF fait proliférer les blastesin vitro

Rôle paracrine+Rôle autocrine ?

surexprimé (10%)

c-Kit

Mutations de c-Kit dans les LAM

D816

D419

délétion/insertion mutations de l’Exon 8

incidence globale < 5%

Association particulière avec les LAM CBF+

Care RS, BJH, 2003, 121, 775

110 LAM de novo

63 inv16 47 t(8,21)

D419 23.8% 2%D816 7.9% 10.6%

total 31% 12.6%

FLT3* 7.9% 5.6%

hyperleucocytaire, pronostic adverse ?

43.6%

mutation activatrice probable

c-Kit

Mutations de c-Kit

D816

D419

délétion/insertion mutations de Exon 8

Résistance au glivec

Sensible au PKC412

Glivec ?PKC412 ?autres: MLN518, PD180970 ?BMS

Sensible MLN518

Inhibition de c-Kit

Mesters RM, Blood, 2001, 98, 241

Femme 62ansLAM4 réfractaire.c-KIT+, VEGFR2 (KDR)+, FLT3 ?del9qSU5416: 145mg/m2/jour IVRC obtenue en 12 semaines d’une durée de 4 moisDiminution de l’angiogénèse médullaire

Kindler T, Blood, 2003, 101, 2960

Homme 64 ansLAM2 secondaire à ASIA, trisomie 8, c-KIT+ non muté, PDGFR+/-Glivec: 600mg/jourRC obtenue en 5 semaines d’une durée de 5 moisAmélioration cytogénétique

Essai de phase II par le Glivec dans les LAM(Kindler T, Blood, 2004, 103, 3644)

21 patients c-KIT+ non mutés, avec phosphorylation du récepteur

Glivec 600mg/jour

Bonne tolérance

5 réponses, dont deux RC mais administration à J31 et J24 d’une chimiothérapieet 2RP

Inhibition du récepteur au VEGF

Padro T, Blood, 2000, 95, 2637

Néoangiogénèse dans les LAM

Augmentation de synthèse du VEGF

Autocrininie

- Extracellulaire

- Boucle autocrine intracellulaire

Système VEGF/VEGFR dans les LAM

VEGF

VEGFR1 (flt1) et VEGFR2 (KDR/flk1)

Inhibition du VEGF dans les LAM

SU5416 (KDR, c-KIT, FLT3)

Stopeck GFJ, Blood, 2003, 102, 795Fiedler W, Blood, 2003, 102, 2763

SU11248 (KDR, PDGF, FLT3)

Fiedler W, Blood, 2005 105

Rôle a préciser

Fiedler2003 1 RC sur 25patients

Voie NF-B dans les Leucémies aiguës myéloblastiques

Voie NF-B et cellules souches leucémiquesGuzman ML, PNAS, 2002, 99, 16220

Activation NF-B constitutive dans les CSL

L’inhibition de la translocation de NF-Binduit une apoptose p53 dépendante. Inhibiteur du protéasome. Inhibiteur du protéasome + Idarubicine. IkBsuper-répresseur

Comment est activée la voie NF-B ?

Comment inhiber spécifiquement NF-B ?

IKK

IkBNF-kB

Noyau

Protéasome

Gènes anti-apoptotiques, prolifératif

kB site binding

NF-kB

IkBS32

S34

Inhibiteur de NFkb

Romano et Al Leukemia 2003;1190

Inhibiteur de NFkbFrelin c et al Blood 2005,804

• Utilisation de AS602868 inhibiteur de IKKPotentialisation vis a vis

Ara c

VP16

Doxorubicine

Abolition de Phosphorylation NFb

Activation de la caspase-3

Étude de phase 2

Voie de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K/AKT)dans les Leucémies aiguës myéloblastiques

Voie de la phosphoinositide 3-kinase/AKT

AKT

PDK1 PDK2

Thr308Ser473

P P

mTOR

P

croissance

FOXO3a

BAD

Fas-L Bim

P

P

Survie

MDM2

p53

P

Survie

GSK3

Cyclin D1

P

Prolifération

IKK

NF-B

P

P

Survie

PI(4,5)P2PI(3,4)P2 PI(3,4,5)P3

SHIP-1 PTENGAB

RTK

P

TK

TK

PP

P

p110,,

p85

PI3K

Il existe une activation constitutive de la voie PI3K/Akt

dans 50% des LAM

Déprivation 2H 4H 8H

P35, LAM4, blastes 90%

p-Akt (Ser 473)

p-FOXO3a (Thr 32)

Actine

Indépendante du FAB

Indépendante des mutations de FLT3

Avantage de croissance in vitro

LY294002 (25µM) : - + -

p-FOXO3a (Thr 32)

P51, LAM2, blastes 88%

Actine

p-Akt (Ser 473)

IC87114 (10µM) : - - +

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000Patient 5120000

LY 294

002

Mili

eu

IC 8

7114

L’IC87114 (inhibiteur de la p110delta) inhibe la prolifération des blastes PI3K+

L’IC87114 n’a pas de toxicité sur les cellules CD34+ normales

Interet pour une phase 1-2

La voie mTOR/P70S6K/4E-BP1

mTOR

RapamycineRad-001CCI-779

FKBP-12

Arrêt du cycle cellulaireApoptoseInhibition de l’angiogénèse

Rapamycine

Activation constitutive de la PI3K

Hypersensibilité à la rapamycine

Inhibition de la voie mTOR en clinique ?

• 12 patients (Octobre 2003-mars 2004)

– Age médian: 72 ans (55-77)

– Réfractaire (n=4) / Rechute (n=5) / Secondaire (n=3)

– Rapamycine (sirolimus, Rapamune®, Wyeth)

– 6 mg à J1 puis 2 mg/J pendant 28 jours

– Réponse hématologique:• Réduction de plus de 50% des blastes sanguins et/ou médullaires

Etude pilote. C RécherEtude pilote. C Récher

– Pharmacocinétique variable+++

– 4 réponses, 7 progressions et 1 stable à J28

– Durée de traitement: 50 (21-240)

– Durée de réponse= 38 jours (35-120)

– 2 répondeurs vivants à 9 et 11 mois

Etude pilote. C RécherEtude pilote. C Récher

4 répondeurs à J284 répondeurs à J28

Voie des protéines JAK/STATdans les Leucémies aiguës myéloblastiques

P

P

P

P

P

PStat

P

P

Stat Stat

JAK JAK

X

c-myc

c fosFT

Noyau

Cytoplasme

La voie d’activation des facteurs de transcription STAT

La voie JAK/STAT dans les LAM

Activation constitutive de STAT3 et/ou STAT5dans 30-70% des LAM

Activation associée aux mutations de FLT3 ?

Rôle dans la prolifération, la survie des cellules blastiques ?Auto-renouvellement ?

L’activation constitutive de STAT3 confère un pronosticAdverse (DFS)

Benekli M, Blood, 2002, 99, 252

Inhibition de la voie JAK/STAT

STATs

STATs

JAKJAKAG490 CIS/SOCS

PIAS

NH2 COOH

SH2DBD TA

Y

LD

Inhibition de la dimérisationSTAT3: PY*LKTK

Activation de phosphatases

SHP1/SHP2 PP2A

Anti-sens

Inhibition de la transcriptionSTAT3 DNSéquences consensus ADN

Voie des protéines Ras-ERK/MAPKdans les Leucémies aiguës myéloblastiques

Signaux extracellulaires

RAS

RAF

MEK

MAPK

MAPKK

MEKK

MAPK

Elk-1

Rsk

Rsk

Bad

BclX

Histone H3SRE

C- mycAp1

cdc25 Cyclines D

PD 98059

UO126

Bad

BclX

14.3.3

Progression dans le cycle

SurvieFTI

La voie Ras; ERK/MAPK dans les LAM

Activée dans 50-90% des LAM, indépendamment des mutationsactivatrices de RasContrôle la prolifération et la survie des cellules blastiques

Thérapeutique:Synergie sur l’induction d’apoptose avec l’inhibitionde l’expression de Bcl-2 (AS)

La voie Ras; ERK/MAPK dans les LAM

• Phase 1 FTI dans les LAM Karp Blood2001

35 patients

2RC durée de 3 a 7 mois et 6 RP

Dose entre 600mg et 1200mg

• Phase 2 FTI dans les LAM réfractaires et en rechutes Harousseau ASCO 2002

17% de RC

• Phase 2 LAM non traitée et les SMD Blood2002

34% de réponse dont 12 RC

• Indépendamment de l’inhibition de la Farmestylation et mutation Ras

Induction de l’Apoptose en bloquant les voies anti

apoptotiques :modèle des anti Bcl-2

Genasense:G3139

Peptides anti Bcl-2

Genasense et LAM

Phase 1 Genasense and FLAG in relapse or refractory leukemia Marcucci et al Blood 2003;425

• 17 LAM réfractaire ou en rechute (médiane 7 mois)

Genasense de J1 a J10 et FLAG de J5 a J10

5RC et 2 RCu entre 83 et 565 jours

La durée de 2Rc est supérieur a la première

Phase 2 Moor et al Blood2004

• 39 Patients LAM en rechute ,age >60 ans

Association Genasense et Mylotarg (9mg)

30% de RC ou RCu

p1p122p1p1

22

p17p17

p17p17Caspase-8

DEDDED

Bak/ Bax

BH3BH3BidBid

tBid

+ p12p12

p12p12

p17p17

p17p17

Caspase-9

Apoptosis pathways : type I I cells

Bcl-2 Caspases-3/ 7

Procasp-9

Apoptosome

Cytochrome c

Apaf -1ATP

Nucleus

FADDFADDProCaspProCasp--88

AI F

Peptides interagissant entre Bcl2 et BAX Shangary et Al Mol Cancer Ther 2004;3

Peptides interagissant avec BH3BAX libère BAX et induit apoptose

Peptides de 15 AA qui interviennent dans BAX-Bcl-xL et BAX Bcl2

Les Anticorps

Anti CD33 avec calicheamicin

Anticorps I131 ou Y80

Anticorps DT

Mylotarg et LAMMylotargSievers J clin Onc 2001

142 LAM Rechute 9mg/m2x2 30% RC

MylotargNabhan Leuk rec2005

12 LAM NT 6mg/m2x2 27% RC

Mylotarg+/-IL11 Estey Blood2002

51LAM

SMD

NT 9mg/m2x2 8%sans IL11

36%avec IL11

Influence du KT

Mylotarg

Fluda Arac cicloEstey Cancer 2003

49 LAM NT 6mg/m2 48% RC

Mylotarg

+IAEstey Leu chemo Pharma2003

14 LAM Rechute

Réfractaire

6mg/m2x2 47% RC

Anticorps et DT

• DT-GM • Frankel et al Clin Cancer Res 2002 1RC sur 34 LAM rechute réfractaire• Problème Anticorps neutralisant (30%), Hall PD Clin Immunol 2001• Toxicité hépatique

• DT-IL3• Toxicité sur les LSC et non les HSC,Frankel Leukemia 2000• Inhibe la colonisation des NOD/SCID par les LSC et non les HSC• Black Leukemia 2003

• DT-Urokinase (CD87)• Présent sur les cellules souches

DIFFERENTIATION

Anti CD44

Inhibiteur des Histones deacethylases

Anti-corps activant CD44

• Récepteur de Ac Hyaluronique

• Présent sur les cellules souches normales et leucémiques

• Blocage inhibe la myélopoiése

• Induit la différentiation de lignées myéloïdes:

NB4,THP-1,HL60

• Bloque apoptose induit par la chimiothérapie(Doxo,VP16,Mitoxantrone)

• Inhibe la greffe secondaire des CSL dans des NOB/SCID

Différentiation et CD44F Smadja-joffre Nature Med 1999

NT CD14/CD15 Cytologie

LAM3 70% 79% DIFFERENTIATION

LAM5 41% 58% DIFFERENTIATION

LAM4 30% 32% 0

LAM1/2 20% 42% 0

Mode action des CBF

Mode action des CBF

• Dominant négatif sur la synthèse de gènesGM-CSF;P21;CBF

• Activateur de génes cibles Bcl2 ;Mdr

• Bloque la différentiation :Rôle des HDAC

Inhibiteurs des HDAC

• Butyrate• Acide Hydroxamique(acide suberoylanilide ou

SAHA)• Tetrapeptides cycliques(Depsipeptide)• Benzamides (MS-275)• Acide cinnamique Hydroxamate(NVP-LAQ824)• Acide Valproique

Mode action des HDACI

• Les HDACI• Apoptose par: expression de TRAIL et de son Récepteur

• Blocage de la prolifération par: expression de la P21

• Induise une différentiation par: expression de la P21

• Interet dans les LAM• Nebbioso A Nature Med 2005

61 patients 90% présente une apoptose

• Weisberg E Leukemia 2004

HDACI MS275 Nebisso Nat Med 2005

Différentiation Apoptose

Conclusion 1

L’avenir est il à l’association concomitante de plusieursinhibiteurs ciblant des RTK et des protéines de signalisation? Probablement oui

Diminuer le risque d’émergence de mécanismes de résistanceaux inhibiteurs de RTK

Potentialiser les effets apoptotiques

Augmenter le degré d’inhibition d’une voie de signalisationen l’inhibant à plusieurs niveaux d’activation

Restaurer une sensibilité aux inhibiteurs de mutants résistantsde RTK

FLT3

PI3K Akt TSC2TSC1

RhebGTP

RhebGDP

mTOR

P70S6K4E-BP1

ITD

Ras

Raf

MEK

MAPK

PKC412

PKC412

Mohi MG, PNAS, 2004, 101, 3130

sensibilité restaurée d’unmutant résistant à PKC412

rapamycine

< PKC412 + rapamycine

UO126

< PKC412 + rapamycine + U0126

CONCLUSION 2

-Association a la chimiothérapie traditionnelle?

Oui pour agir sur ensemble des cellules leucémiques

-Faut il mieux caractériser les LAM ?

Sûrement il faudra a avenir:

Connaître les anomalies des TK

Des voies activationsPI3K,STAT ;Ras ,ERK

-Quels sont les drogues a tester ?

Les inhibiteurs de TK :BMS

Les Inhibiteurs de NFb

Les HDACI