Méthodes analytiques utilisées dans les
Transcript of Méthodes analytiques utilisées dans les
Méthodes analytiques utilisées dans les études de stabilité
Laurence Galanti MD, PhD CHU-UCL Namur
Laboratoire de chimie médicaleGroupe de recherche DSRG
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v
Pharmacie hospitalière
Délivrance des médicaments
US
EfficacitéFiabilitéRapidité
DSRG Group depuis … 22 ans
Préparation centralisée
Connaissance de la stabilité
Matériel Compétences (personnel)
Laboratoire
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Etude de stabilité
Stabilité microbiologique :
Preuve d’ambiance stérile, vérification de la
contamination (1x/6 mois)Cf USP 797
Stabilité physique : -Mesure du pH-Recherche visuelle sur fond blanc et noir de changement de couleur, d’opacités, de précipités-Recherche microscopique de précipités- Analyse spectrophotométrique
Stabilité chimique :Suivi de la concentration en fonction du temps selon- Type de conservation- Type de contenant- Type de préparation
Limite inférieure de confiance à 95 % de la droite de régression, estimée à partir de la
courbe de concentration en fonction du temps, supérieure à 90 % de la
concentration initiale (FDA)
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Protocoles : Préparation des solutions thérapeutiques (5x perfusions, seringues, solutions orales, …)
Congélation des préparations (60 - 90 jours)
Décongélation : micro-ondes ou T° ambiante
Stockage T° étude + réalisation des aliquots :- 1ère semaine : tous les jours- 2e-4e semaine : 3x/sem- 2e-3e mois : 1x/sem
1 aliquot 1 aliquot
Analyse physique
Analyse chimique
(en triplicate)
Protocole 2
Sans congélation
Stockage T° étude + réalisation des aliquots :- 1ère semaine : tous les jours- 2e-4e semaine : 3x/sem- 2e-3e mois : 1x/sem
1 aliquot 1 aliquot
Analyse physique
Analyse chimique
(en triplicate)
Protocole 1
Avec congélation
Stockage T° étude + réalisation des aliquots :
- 1ère semaine : tous les jours- 2e-4e semaine : 3x/sem- 2e-3e mois : 1x/sem
1 aliquot 1 aliquot
Analyse physique
Congélation
Décongélation de tous les
aliquots en fin de test
1 aliquot
Congélation
Analyse chimique (en triplicate)
Back-up
Protocole 3
5
Botaniste russe
1906
Méthodes analytiques Méthodes chromatographiques = méthodes physico-chimiques de séparation →
Répartition des composants d’une solution entre 2 phases (stationnaire et mobile)
→ Chromatographie liquide haute pression (1965)
Théorie et pratique de la chromatographie de partage
(Archer J P Martin et Richard L M Synge, 1940)
↨Prix Nobel de Chimie (1952)
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Principes de séparation
Adsorption, partage, échange d’ions,
exclusion stérique, affinité, …
Couplées- Spectrométrie de masse
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Types de chromatographie
Nature de la phase mobile
Liquide
(Haute pression)
Gaz
Type de supports (phase stationnaire)
Sur couche
mince (planaire) :
silice, cellulose,
…
Sur colonne
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Types de
détecteurs
o UV-Visibleo Longueur d’onde fixe/variableo Barrette de diodes
Absorption de lumière
o Fluorescence Emission de fluorescence
o Electrochimie Propriétés oxydo-réductives
o RéfractométrieIndice de réfraction phase mobile/effluent
o ConductimétrieConductivité phase mobile/effluent
o …
*
*
*
Peu sensible, sensible à la T°, débit et pression,
mode isocratique
Sensibilité +++ à la T°
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Détecteur UV-Visible / Barette diodes
UV-Visible Barette de diodes
Avantages Sensibilité
Peu sensibles aux ≠ T° et débit
Mode gradient
Utilisation et entretien « faciles »
Spécificité Spécificité +Spectre (tps, absorbance, λ)
Inconvénients Substances chromophores
Bande passante plus large
Utilisation plus complexe
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Détecteur fluorescence - électrochimique
Fluorescence Electrochimique
Avantages Sensibilité + Sensibilité ++
Spécificité + (fct des composés)
Peu sensibles aux ≠ T° et Débit
Mode gradient
Inconvénients Substances fluorescentes Modification de l’échantillon
Sensible O2 dissous (phase mobile) Sensible à la phase mobile (pH, O2 dissous)
Entretien constant des cellules
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Avantages Limitations
- Technique de référence éprouvée, bien maîtrisée
- Largement utilisée dans les domaines de recherche (industrie)
- En constante évolution (UPLC, couplage MS, …)
- Analyse quantitative précise et reproductible, haut pouvoir de séparation
- Possibilité d’analyse de ≠ types de composés ou d’échantillons
- Méthode flexible, personnalisable
- Nécessité d’un personnel qualifié, expertise
- Difficilement automatisable → nécessité de main d’œuvre
- Prétraitement des échantillons- Absence de détecteur universel
idéal- Encore relativement complexe
pour les dosages de laboratoire de routine
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Défis de la chromatographie
o ↑ la sensibilité (abaisser le seuil de détection )
o ↑la spécificité (coélution)
o ↓ le temps d’analyse (↑la vitesse de séparation)
o ↑ la précision
o ↓ Volume d’injection
o ↑ la fiabilité et la facilité d’utilisation
o ↓ les coûts (personnel, volume phase mobile, colonnes, ….)
o ….
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HPLC / UPLC
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Système HPLC
Logiciel d’intégration Empower
(Waters)
Détecteur UV
Détecteur
barette de
diodes
Détecteur
électrochimique
Solvants
Sample
manager
Echantillonneur Colonne
Pompe
quaternaire
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Système UPLC
Détecteur
fluorescence
Détecteur
barette de
diodes
Solvants
Echantillonneur
Pompe
quaternaire
Colonne
Logiciel d’intégration
Empower
(Waters)
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Comparaison HPLC - UPLC
HPLC Diamètre particules phase stationnaire 3-10 µm
Pression 5000 psi
Volume échantillon plus grand
Flux (+) important
Température de colonne (-) élevée
Cellule de détection (+) grande
Temps de rétention plus long
UPLC↓ diamètre particules (1.75 à 1.8 µm)
↑ pression (>15000 psi)
↓ volume d’échantillon
↓ flux
↑ température de colonne
↓ cellule de détection
↓ temps de rétention
↑ vitesse d’analyse ↑ résolution↑ sensibilité
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UPLC :Volume : 5 µL
RT : 0.598 min
Run Time : 5 min
TR 0.598
HPLC :Volume : 50 µL
RT : 2.736 min
Run time : 10 min
Vitamine A
TR 2.736
De
HP
LC à
UP
LC
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Système UPLC-QDA
- Intégrer les données optiques et de masse de manière simultanée- Confirmer l’identification d’un composé- Quantifier des composés de faible concentration- Confirmer des composés sous forme de traces- Limiter les co-élutions- Détecter les molécules n’absorbant pas en UV
Détecteur de masseSéparation en phase gazeuse de molécules
chargées (ions) en fct de la m/z
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Planification d’un étude de stabilité
1. Choix de(s) molécule(s) à analyser : fonction de la demande des cliniciens1. Forme2. Type de contenant3. Conditions de stockage
2. Recherche bibliographique : méthodes de dosage, données de stabilité3. Mise au point de la méthode d’analyse :
1. Système de dosage, type de détecteur, colonne2. Phase mobile : ([tampon], pH, addition d’un composé organique (nature,
%)3. Conditions de travail : flux: (isocratique ou gradient), température, choix
des dilutions→ temps le plus court possible, séparation optimale des pics
4. Validation de la méthode : CV inter/entra-essais, linéarité, LOD, LOQ, test de dégradation
5. Préparation des médications et étude de la stabilité
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Test de dégradation
Objectif : Mettre en évidence
des pics de dégradation éventuels
→ Adapter les conditions d’analyse pour :
Séparer les pics de dégradation des pics de la substance active
Eviter tout contamination d’un échantillon sur le suivant
Test : pH neutre, basique et acide
avant et après chauffage à 100°C
AU
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Minutes 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
V A N C
O
AU
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Minutes 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
V A N C
O
1 : No heating _____ at natural pH(3.72), …….. at acidic pH(1.60) and _ _ _ _ at
alkaline pH (11.54).
2: Heating at 100°C for 30 minutes ______ at natural pH(3.72), …….. at
acidic pH(1.60) and _ _ _ _ _ at alkaline pH (11.54).
(1) (2)
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DSRG Etudes :
- Type de contenant : pochettes,
seringues, sirop, collyre, …
- Type de conservation : frigo,
congélateur, T) ambiante, …
- Types de molécules : princeps,
générique, …
Antifongique :Voriconazole
Anti-inflammatoires, analgésiques, anesthésiants :
Lidocaïne, cocaine, procaine, kétamine, diclofenac, dexaméthasone, morphine, tramadol, kétorolac, levobupivacaine,
sufentanil,
Divers : Levofolinate, ésoméprazole,
alizapride, ondansetron, droperinol, metoclopramide, chlorazepate,
tromethamine, …
Antitumoraux : 5FU, doxorubicine
Antibiotiques/ antiviraux : Céfuroxime, vancomycine, teicoplanin,
céfépime, pipéracilline, tazobactam, ceftriaxone, ceftriaxone, témocilline,
acyclovir
Cardiologiques :Noradrénaline,
isosorbide, amiodarone
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Conclusions
o La chromatographie, en particulier liquide = méthode analytique en constante évolution (LC → HPLC → UPLC → …)
o Technique incontournable dans de nombreux domaines scientifiques, notamment dans le domaine pharmaceutique et médical
o Moyen d’identifier, de quantifier de nombreux composés de manière fiable
o Technique nécessitant une expertise (coût)
o Possibilité de couplage avec d’autres techniques d’analyse (spectrométrie de masse → amélioration de d’identification)
o Développement technologique pour une plus grande automatisation
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Bilan 1996 – 2018 (02/07) Publications nationales et internationales : 53 + 1 Posters : 83 + 1 Oral communications : 18 + 3 Prix et nominations : 5 Symposium : 3 + 1 Publications soumises : 4
Remerciements à toute l’équipe : • Pr Jean-Daniel Hecq• Mme Laura Soumoy• Pr Jacques Jamart• Mr Benoît Bihin• Mme Marie-Lise Colsoul• Mr Nicolas Goderniaux
Merci pour votre attention