EnvironnementCanada

EnvironmentCanada

SÉRIE DE LA

PROTECTION DE

L’ENVIRONNEMENT

SPE 1/RM/42 — avril 2002Section de l’élaboration et de l’application des méthodesDirection générale de l’avancement des technologies

environnementalesCentre de technologie environnementaleEnvironnement Canada

Méthode d’essai biologique : méthodede référence servant à déterminer la toxicité

des sédiments à l’aide d’une bactérieluminescente dans un essai en phase solide

Méthode d’essai biologique : méthodede référence servant à déterminer la toxicitédes sédiments à l’aide d’une bactérieluminescente dans un essai en phase solide

Section de l’élaboration et de l’application des méthodesCentre de technologie environnementaleEnvironnement CanadaOttawa (Ontario)

Rapport SPE 1/RM/42Avril 2002

ii

Données de catalogage avant publication de la Bibliothèque nationale du Canada

Vedette principale au titre :

Méthode d’essai biologique. Méthode de référence servant à déterminer latoxicité des sédiments à l’aide d’une bactérie luminescente dans un essai enphase solide.

(Rapport d’information SPE 1/RM/42)Publié aussi en anglais sous le titre : Biological test method.Reference method for determining the toxicity of sediment usingluminescent bacteria in a solid-phase test.Publié aussi sur Internet.Comprend des références bibliographiques.ISBN 0-660-96753-7No de cat. En49-24/1-54F

1. Vibrio fischeri -- Essais.2. Organiques aquatiques -- Effet de la pollution de l’eau sur les --

Essais -- Méthodologie -- Normes -- Canada.3. Effluents -- Qualité -- Essais -- Méthodologie -- Normes --

Canada.4. Toxicité -- Essais -- Méthodologie -- Normes -- Canada.I. Centre de technologie environnementale (Canada). Section de

l’élaboration et de l’application des méthodes.II. Canada. Environnement Canada.III. Coll. : Rapport d’information (Canada. Environnement Canada) ;

SPE 1/RM/42.

QR82.Z9B56 2002 579.34 C2002-980219-9

© Sa Majesté la Reine du chef du Canada (Environnement Canada) 2002ISBN 0-660-96753-7

No de cat. En49-24/1-54F

iii

Commentaires

Adressez les commentaires sur la teneur du présent rapport à :

Richard ScrogginsSection de l’élaboration et de l’application des méthodesCentre de technologie environnementaleEnvironnement Canada335, River RoadOttawa (Ontario)K1A 0H3

This report is also available in English under the title Biological Test Method : Reference Methodfor Determining the Toxicity of Sediment Using Luminescent Bacteria in a Solid-Phase Testfrom:

Environmental Protection PublicationsEnvironment CanadaOttawa, OntarioK1A 0H3

Avis de révision

Le présent document a été révisé par le personnel de la Direction générale del’avancement des technologies environnementales d’Environnement Canada, et sapublication a été autorisée. La mention d’une appellation commerciale ou d’unproduit offert sur le marché ne constitue ni une approbation du produit parEnvironnement Canada ni une recommandation de son emploi. D’autres produitsde valeur semblable existent.

iv

v

Résumé

Le présent rapport décrit une méthode de référence pour la détermination de latoxicité d’échantillons de sédiment entier dans des conditions maîtrisées etdéfinies de laboratoire. La méthode utilise une bactérie luminescente (Vibriofischeri), l’effet biologique mesuré étant l’inhibition de la production lumineusede la bactérie en phase solide. Pour réaliser l’essai, il faut préparer une série dedilutions de l’échantillon, mélanger les prises d’essai avec un inoculum deV. fischeri et faire incuber le tout 20 minutes, en tubes à essai gardés dans unbain d’eau à 15 ± 0,5 °C, filtrer le contenu de chaque tube, stabiliser les filtrats à15 ± 0,5 °C pendant 10 minutes dans une série de cuvettes de verre insérées dansles puits d’un photomètre, lire ensuite la bioluminescence subsistant dans lesfiltrats. Le paramètre statistique de l’essai est la concentration d’échantillon quel’on estime inhiber la luminescence bactérienne de 50% (c’est-à-dire la CI50).

S’inspirant de la méthode générique (polyvalente) intitulée Méthode d’essaibiologique : essai de toxicité sur la bactérie luminescente Photobacteriumphosphoreum, publiée par Environnement Canada (1992, SPE 1/RM/24), laméthode de référence est destinée à être utilisée sur les échantillons de sédimentseffectivement ou potentiellement contaminés.

La méthode préconise des conditions et des modes opératoires particuliers,notamment : des directives sur l’obtention, l’expédition, la conservation etl’entreposage des organismes d’essai (réactif bactérien) ; des conditions et desmodes opératoires acceptables pour le transport, l’entreposage et lamanipulation des échantillons de sédiments à utiliser ; les analysesphysicochimiques requises du sédiment ; les modes opératoires et les conditions àrespecter dans la préparation et la conduite de l’essai ; les critèresd’acceptabilité de l’essai et de validité de ses résultats ; les mesures et lesobservations à faire ; les analyses exigées ou recommandées des données ; desorientations sur l’interprétation des résultats ; les exigences minimales sur lesrapports à produire. La méthode renferme aussi des instructions sur l’emploid’essais de toxicité de référence.

vi

Abstract

A reference method for measuring the toxicity of samples of whole sediment undercontrolled and defined laboratory conditions is described in this report. It usesluminescent bacteria (Vibrio fischeri) as the test organism and inhibition of lightproduction by the bacteria in a solid-phase test as the biological endpoint. Thetest involves the preparation of a series of concentrations of the sample by serialdilution in water, their mixing with an inoculum of test organisms (V. fischeri)and incubation for 20 minutes in test tubes held in a water bath at 15 ± 0.5 °C,the filtration of the contents of each test tube, the subsequent stabilization of thefiltrate at 15 ± 0.5 °C for 10 minutes in a series of glass cuvettes held within wellsof a photometer, and thereafter the photometric reading of light produced by theluminescent bacteria remaining in the filtrate. The statistical endpoint of the testis the concentration of sample which is estimated to cause 50% inhibition of lightproduction by the bacteria (i.e., the IC50).

This reference method follows and is built upon the generic (multipurpose)biological test method “Toxicity Test Using Luminescent Bacteria(Photobacterium phosphoreum)” published previously by Environment Canada(1992; EPS 1/RM/24). It is intended for use with samples of contaminated orpotentially contaminated sediment.

Specific conditions and procedures are stipulated that include instructions onobtaining, shipping, holding, and storing test organisms (Bacterial Reagent);acceptable procedures and conditions for transporting, storing, and manipulatingsamples of sediment to be used in the test; required physicochemical analyses ofsediment; procedures and conditions to be followed in preparing for andconducting the test; criteria for acceptable performance and valid test results;measurements and observations to be made; required or recommended dataanalyses; guidance for interpreting test results; and minimum reportingrequirements. Instructions on the use of reference toxicity tests are also provided.

vii

Avant-propos

Voici l’un des titres de la collection des méthodes de référence, pour la mesureet l’évaluation de l’effet ou des effets toxiques exercés sur une espèce aquatiqueou terrestre exposée à des échantillons de matières ou de substances dans lesconditions maîtrisées et définies du laboratoire.

Par méthode de référence, on entend une méthode biologique particulièred’essai de la toxicité, c’est-à-dire une méthode écrite comportant un ensembleexplicite de directives et de conditions expérimentales décrites avec précision.Contrairement aux méthodes d’essai biologique polyvalentes (génériques)publiées par Environnement Canada, la méthode de référence est souventlimitée, dans son emploi, aux essais exigés par certains règlements (p. ex. leRèglement sur l’immersion de déchets en mer, sous le régime de la Loicanadienne sur la protection de l’environnement de 1999 ; LCPE, 1999 ;gouvernement d u Canada, 2001).

Les méthodes de référence sont celles qui ont été élaborées et publiées parEnvironnement Canada et qui sont préférées dans les cas suivants :

• pour un emploi à des fins réglementaires, dans les laboratoiresd’écotoxicologie des organismes fédéraux et provinciaux ;

• pour les essais à des fins réglementaires impartis par Environnement Canadaou demandés par des organismes de l’extérieur ou l’industrie ;

• pour la surveillance réglementaire, dans le cadre d’un règlement ou d’unpermis fédéral, provincial ou municipal dans le domaine de l’environnement ;

• comme base de l’énoncé de directives très explicites.

Dans l’annexe A, on trouve une liste des méthodes de référence préparées pourpublication par la Section de l’élaboration et de l’application des méthodesd’Environnement Canada, à Ottawa, de méthodes génériques (aux applicationsplus larges) d’essai biologique et de guides à l’appui.

Les termes définis sous la rubrique « Terminologie » se détachent en italiques,dans le corps du document, quand ils sont employés conformément à leurdéfinition. Les italiques feront aussi ressortir d’autres termes.

viii

ix

Table des matières

Résumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vAbstract . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viAvant-propos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viiListe des tableaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiiAbréviations et formules chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiiiTerminologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xivRemerciements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxii

Section 1Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Section 2Organismes d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.1 Espèce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.2 Source et entretien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Section 3Installations, équipement et fournitures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43.1 Installations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43.2 Appareillage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43.2.1 Nettoyage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43.2.2 Grandes lignes de l’essai et appareillage connexe . . . . . . . . . . . . . . . . . 43.2.3 Équipement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43.2.4 Fournitures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Section 4Essai du sédiment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74.1 Prélèvement de l’échantillon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74.2 Étiquetage, transport et entreposage des échantillons . . . . . . . . . . . . . . . 84.3 Manipulation et caractérisation des échantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94.4 Sédiments témoins négatif et positif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114.5 Conditions d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124.5.1 Grandes lignes de l’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124.5.2 Manipulations, réglages et corrections . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124.5.3 Température . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134.5.4 Durée des manipulations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134.5.5 Tableau des dilutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154.6 Modes opératoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154.6.1 Photomètre, bain d’eau et fiche de laboratoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154.6.2 Sous-échantillons pour la détermination de l’humidité . . . . . . . . . . . . 164.6.3 Solution mère . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164.6.4 Solutions filles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

x

4.6.5 Reconstitution du réactif bactérien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174.6.6 Inoculation et incubation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174.6.7 Préparation de l’ordinateur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184.6.8 Filtration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184.7 Mesures et observations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194.8 Critère de validité de l’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

Section 5Essai d’un toxique de référence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

Section 6Analyse et interprétation des données . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226.1 Analyse des données . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226.2 Interprétation des résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

Section 7Renseignements à fournir dans les rapports . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287.1 Exigences minimales pour le procès-verbal de l’essai . . . . . . . . . . . . . 297.1.1 Matériel d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297.1.2 Organismes d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297.1.3 Installations et appareillage d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297.1.4 Solution de reconstitution et « diluant en phase solide » . . . . . . . . . . . 297.1.5 Méthode d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297.1.6 Conditions de l’essai et modes opératoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297.1.7 Résultats des essais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307.2 Rubriques supplémentaires à communiquer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307.2.1 Matériel d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307.2.2 Organismes d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307.2.3 Installations d’essai et appareillage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307.2.4 Solution de reconstitution et « diluant en phase solide » . . . . . . . . . . . 317.2.5 Méthode d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317.2.6 Conditions expérimentales et modes opératoires . . . . . . . . . . . . . . . . . 317.2.7 Résultats de l’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

Références . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Annexe AMéthodes d’essai biologique et guides à l’appui publiés par la Section del’élaboration et de l’application des méthodes d’Environnement Canada . . 36

Annexe BComposition du Groupe intergouvernemental de la toxicité aquatique(avril 2002) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

xi

Annexe CAdresses de l’administration centrale et des bureaux régionauxd’Environnement Canada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

Annexe DMembres du Groupe consultatif scientifique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Annexe EVariantes du mode opératoire des essais de toxicité de sédiments en phasesolide employant des bactéries luminescentes et décrites dans les méthodescanadiennes, états-uniennes et néerlandaises . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

Annexe FFiche de laboratoire employée pour les essais de toxicité des sédimentsemployant V. fischeri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

xii

Liste des tableaux

1 Liste de contrôle des conditions expérimentales exigées ou recommandées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

xiii

Abréviations et formules chimiques

CI50 concentration inhibitrice à 50%CIp concentration inhibitrice, au pourcentage p (précisé) d’effetCL50 concentration létale médianecm centimètreCNRC Conseil national de recherches du CanadaCV coefficient de variationEC Environnement CanadaEPS essai en phase solideg grammeh heureHCl acide chlorhydriqueHNO3 acide nitriqueL litrem/v masse par volumez marque déposéemg milligrammemin minutemL millilitremm millimètreMON mode opératoire normaliséNaCl chlorure de sodiumNaNO3 nitrate de sodiumnm nanomètre°C degré Celsiusp probabilitéTFE tétrafluoroéthylèneUSEPA Agence de protection de l’environnement des États-Unisv. voirv/v volume/volume, en volumeµL microlitreµm micromètreF écart-type# inférieur (ou égal)± plus ou moins% pourcentage, pour cent< strictement inférieur> strictement supérieur$ supérieur (ou égal)

xiv

Terminologie

Les mots et expressions définis ci-dessous se détachent en italiques, dans le corps du document,quand ils sont employés conformément à leur définition. Les italiques feront aussi ressortird’autres termes.

Nota : Toutes les définitions ci-dessous s’inscrivent dans le contexte de la méthode ; ellespourraient ne pas être adaptées à d’autres contextes.

Verbes auxiliaires

L’auxiliaire doit (doivent) exprime l’obligation absolue.

L’auxiliaire devrait (devraient) et le conditionnel d’obligation (il faudrait, etc.) expriment unerecommandation ou la nécessité de respecter dans la mesure du possible la condition ou le modeopératoire.

L’auxiliaire peut (peuvent) exprime l’autorisation ou la capacité d’accomplir l’action.

L’auxiliaire pourrait (pourraient) indique la possibilité ou l’éventualité.

Vocabulaire technique général

conformité, respect des exigences officielles des règlements ou des permis.

eau estuarienne, eau de la zone côtière de l’océan, sensiblement diluée par les eaux doucesfluviales.

eau marine, eau provenant de l’océan, de la mer ou d’une zone côtière où elle n’a pas subi dedilution appréciable par les eaux douces naturelles apportées par les cours d’eau.

fin, se dit d’un sédiment ou de particules dont la taille mesure au plus 0,063 mm. Ladétermination du pourcentage de particules fines englobe toutes celles que l’on définit sousl’appellation de limons (c’est-à-dire de 0,004 à 0,063 mm) ou d’argiles (c’est-à-dire de moinsde 0,004 mm). Ces fractions portent aussi le nom de fines.

fines, V. FIN.

méthode de référence, protocole particulier d’un essai de toxicité, c’est-à-dire méthode écrited’essai biologique assortie d’un ensemble explicite de conditions et de modes opératoires,officiellement convenu par les parties et décrit avec précision. Contrairement aux autresméthodes biologiques polyvalentes (génériques) publiées par Environnement Canada, laméthode de référence est souvent limitée, dans son emploi, aux essais exigés par certainsrèglements (p. ex., Gouvernement du Canada en 2001).

xv

pH, logarithme négatif de l’activité des ions hydrogène, mesurée par leur concentration enéquivalents-grammes par litre. Cette valeur exprime le degré ou l’intensité des réactions acideet alcaline sur une échelle de 0 à 14, où 7 représente la neutralité. Les pH inférieurs à 7correspondent, en ordre décroissant, à des réactions de plus en plus acides, tandis que les pHsupérieurs à 7 indiquent, en ordre croissant, des réactions de plus en plus basiques oualcalines.

salinité, quantité totale de substance solide, en grammes, dissoute dans un litre d’eau (de mer) ;exprimée traditionnellement en parties pour mille (‰). On la détermine après conversion detous les carbonates en oxydes, remplacement de tous les bromures et iodures par deschlorures et oxydation de toute la matière organique. On peut aussi la mesurer directement àl’aide d’un salinomètre-conductimètre ou par d’autres moyens (v. APHA et al., 1995).

surveillance, vérification régulière (p. ex. quotidienne, hebdomadaire, mensuelle ou trimestrielle)de la qualité, de la collecte et de la diffusion de l’information. S’applique soit à la vérificationet à la mesure périodique (régulière) de certaines variables biologiques ou de la qualité del’eau ou, encore, à la collecte et à l’essai de toxicité d’échantillons de sédiments.

Vocabulaire relatif aux matières ou substances d’essai

diluant, solution de chlorure de sodium à 3,5 % dans l’eau distillée ou désionisée, préparée àpartir de sel de qualité réactif. Il peut être utilisé avec des échantillons de sédiment marin,estuarien ou d’eau douce. Voir aussi EAU DISTILLÉE et EAU DÉSIONISÉE.

eau de porosité, eau occupant les interstices entre les particules de sédiment. Syn. EAUINTERSTITIELLE.

eau désionisée, eau débarrassée des ions Ca++ et Mg++, etc., par passage sur colonnes de résine oupar osmose inverse.

eau distillée, eau purifiée par la distillation dans un appareil en verre borosilicaté ou d’un autrematériau.

emplacement, étendue délimitée de sédiment utilisée ou envisagée pour servir de zone d’étude,habituellement parce qu’elle est contaminée ou susceptible d’être contaminée par l’activitéhumaine.

essai de toxicité de référence, essai employant, dans le cadre d’un essai de toxicité d’unsédiment, un toxique de référence afin d’évaluer la sensibilité des organismes au moment del’évaluation de la substance d’essai ainsi que la précision et la fiabilité des résultats obtenuspar le laboratoire. Les résultats s’écartant d’un intervalle normal établi signifient que lasensibilité des organismes ainsi que la réalisation et la précision de l’essai sont douteuses.Pour les besoins de la présente méthode de référence, on devrait employer, pour l’essai deréférence, un sédiment témoin positif, qui peut être soit un sous-échantillon de la matière de

xvi

référence renfermant du sédiment contaminé étalon dans lequel les concentrations decontaminants sont connues (comme le sédiment du Conseil national de recherches duCanada) soit un sédiment témoin enrichi. V. aussi TOXIQUE DE RÉFÉRENCE, SÉDIMENTTÉMOIN POSITIF, SÉDIMENT CONTAMINÉ ÉTALON et SÉDIMENT TÉMOIN ENRICHI.

essai de toxicité en milieu exclusivement aqueux, essai dont on exclut tout sédiment ou touteautre matière solide (en employant, par exemple, la solution aqueuse d’un toxique deréférence). Synonyme : essai de toxicité en phase liquide. Cet essai sert à confirmer que lasolution de reconstitution ne diminue pas la bioluminescence de Vibrio fischeri (v. § 3.2.4).V. aussi ESSAI DE TOXICITÉ EN PHASE LIQUIDE et ESSAI DE TOXICITÉ EN PHASE SOLIDE.

essai de toxicité en phase liquide, essai se déroulant exclusivement en solution aqueuse, enl’absence de toute particule de sédiment ajoutée. Voir aussi ESSAI DE TOXICITÉ EN PHASESOLIDE.

essai de toxicité en phase solide, essai d’une série de concentrations de sédiment entier(c’est-à-dire les particules, plus l’eau de porosité, ajoutées en un mélange homogène)préparées au moyen d’une partie aliquote de ce sédiment. Voir aussi ESSAI DE TOXICITÉ ENPHASE LIQUIDE.

matière, substance ou substances dont est faite une chose. Ses caractéristiques peuvent êtrehétérogènes, même après mélange. Un sol, un sédiment ou une eau de surface sont desmatières. Habituellement, la matière renferme un nombre plus ou moins grand de substances.Voir aussi SUBSTANCE.

produit, préparation du commerce renfermant au moins une substance. V. aussi PRODUITCHIMIQUE.

produit chimique, tout élément, composé, formule ou mélange de substances chimiques quipourrait se trouver associé à des sédiments ou à de l’eau, y être mélangé ou y être déposé.

réactif bactérien, culture normalisée d’une souche particulière de Vibrio fischeri, lyophilisée,conservée dans de petits flacons scellés, renfermant chacun 100 millions d’organismes.

sédiment, matériau naturel formé de particules ayant été transportées dans l’eau puis s’étantdéposées sur le fond. Peut également désigner un substrat artificiel, constitué de matièresparticulaires choisies (p. ex. un sable d’une granulométrie donnée, de la bentonite [argile],etc.).

sédiment artificiel, sédiment synthétique, préparé au laboratoire, selon une formule précised’argiles, de limons et/ou de sables, pour simuler un sédiment naturel. Au laboratoire, onmélange des quantités convenables d’argiles, de limons ou de sables non contaminés auxpourcentages voulus de matières fines et grossières, afin d’obtenir un sédiment témoin négatifartificiel (non pollué). On mélange une formule précise d’argiles, de limons et/ou de sablesavec un toxique (ou, dans certains cas, avec un échantillon contaminé, fortement toxique, desédiment prélevé sur le terrain), opération portant le nom d’enrichissement, pour obtenir une

xvii

ou plusieurs concentrations de sédiment témoin positif artificiel. Voir aussi SÉDIMENT NONPOLLUÉ, SÉDIMENT TÉMOIN NÉGATIF, SÉDIMENT TÉMOIN POSITIF.

sédiment de référence, échantillon, prélevé sur le terrain, d’un sédiment que l’on estime noncontaminé, choisi pour ses propriétés (p. ex. granulométrie, compacité, teneur en matièreorganique totale), qui correspondent étroitement à celles du ou des échantillons du sédimentd’essai, sauf à la teneur en contaminants chimiques. On le prélève souvent dans un endroit àl’abri ou le plus à l’abri possible de la contamination d’origine anthropique, maisgénéralement à proximité des endroits où on prélève le sédiment d’essai. Un échantillon dusédiment de référence devrait faire partie de chaque série d’essais de toxicité d’un ou deplusieurs sédiments d’essai. Ce sédiment de référence pourrait (ou pourrait ne pas) se révélertoxique en raison de la présence (ou de l’absence) de substances naturelles telles que lesulfure d’hydrogène ou l’ammoniaque, ou en raison de la présence inattendue (ou del’absence) de concentrations nocives de contaminants anthropiques. Il faudrait éviter l’emploide ce sédiment (s’il se révèle toxique) comme sédiment de référence dans les essais ultérieursde toxicité, à moins que le plan d’expérience n’en tienne compte et que le ou les chercheursne veuillent comparer les résultats obtenus avec cette matière à ceux d’un ou de plusieurséchantillons de sédiment d’essai. V. aussi SÉDIMENT NON CONTAMINÉ et SÉDIMENT D’ESSAI.

sédiment contaminé, sédiment renfermant des concentrations de substances posant une menaceconnue ou potentielle pour l’environnement ou la santé humaine.

sédiment contaminé étalon, sédiment prélevé sur le terrain, dont le titre en contaminants estconnu, consigné et accessible (p. ex. au Conseil national de recherches du Canada), s’étant enoutre révélé toxique pour Vibrio fischeri, selon la méthode de référence décrite dans leprésent document.

sédiment d’essai, échantillon de sédiment entier, prélevé sur le terrain, dans un emplacementmarin, estuarien ou en eau douce, que l’on croit contaminé (ou pouvant être contaminé) parau moins un produit chimique et destiné à être employé dans l’essai de toxicité en phasesolide avec des bactéries luminescentes. Dans certains cas, la notion s’applique à toutéchantillon solide (notamment le sédiment de référence, le sédiment artificiel, le sédimenttémoin négatif, le sédiment témoin positif ou les déblais de dragage) utilisé dans l’essai.V. aussi ESSAI DE TOXICITÉ EN PHASE SOLIDE, SÉDIMENT DE RÉFÉRENCE, SÉDIMENTARTIFICIEL, SÉDIMENT TÉMOIN NÉGATIF, SÉDIMENT TÉMOIN POSITIF.

sédiment non contaminé, sédiment ne renfermant aucune concentration de contaminant(s) quiatténuerait la bioluminescence émanant de Vibrio fischeri durant l’essai.

sédiment témoin enrichi, sédiment artificiel non contaminé ou sédiment de référence noncontaminé, prélevé sur le terrain, auquel, pour les besoins de l’expérience, on a ajouté unesubstance ou une matière d’essai, par exemple un produit chimique, un mélange de produitschimiques, de la boue de forage, des déblais contaminés, de la boue ou du sédimentcontaminé, après quoi on a mélangé le tout à fond afin de l’homogénéiser. V. aussi SÉDIMENTNON CONTAMINÉ, SÉDIMENT ARTIFICIEL, SÉDIMENT DE RÉFÉRENCE, SÉDIMENT CONTAMINÉ etSÉDIMENT TÉMOIN POSITIF.

xviii

sédiment témoin négatif, sédiment ne renfermant aucun contaminant en concentration susceptiblede modifier le comportement (en l’occurrence la bioluminescence) des organismes soumis àl’essai. Ce peut-être un sédiment naturel prélevé sur le terrain, dans un endroit noncontaminé, ou un sédiment artificiel. Il ne doit être additionné d’aucune matière ou substanced’essai et doit assurer une bioluminescence acceptable par Vibrio fischeri, conformément auxconditions et aux modes opératoires de l’essai. Il permet de juger de la toxicité d’un sédimentgrossier (< 20% de fines). Voir aussi SÉDIMENT TÉMOIN ARTIFICIEL et SÉDIMENT NONCONTAMINÉ.

sédiment témoin positif, sédiment que l’on sait contaminé par au moins un toxique et quiprovoque une réaction toxique prévisible (en l’occurrence l’inhibition de la bioluminescence)chez l’organisme en expérience, conformément aux modes opératoires et aux conditions del’essai. Ce sédiment pourrait être soit un sédiment contaminé étalon, soit sédiment artificielou un sédiment de référence additionné de toxique, pour les besoins de l’expérience. Cepourrait être aussi un échantillon fortement contaminé de sédiment prélevé sur le terrain, quise serait déjà révélé toxique pour Vibrio fischeri et dont on connaîtrait les caractéristiquesphysicochimiques. Ce sédiment aide à interpréter les résultats des essais de toxicité dessédiments. Pour les besoins de la présente méthode de référence, on doit l’utiliser commetoxique de référence lorsque l’on évalue la sensibilité de l’organisme d’essai ainsi que laprécision et la fiabilité des résultats qu’obtient le laboratoire avec cette matière. V. aussiSÉDIMENT CONTAMINÉ ÉTALON, SÉDIMENT ARTIFICIEL, SÉDIMENT DE RÉFÉRENCE et TOXIQUEDE RÉFÉRENCE.

sol, matière entière et intacte, manipulée le moins possible après le prélèvement, représentativedu milieu terrestre. Le sol provient de la désagrégation physicochimique des roches et dudépôt d’une litière de feuilles et/ou de la décomposition et du recyclage des nutrimentsprovenant de la vie végétale et animale. Ses caractéristiques physicochimiques dépendent del’activité des microbes et des invertébrés qui y vivent ainsi que de l’activité humaine.

solution de reconstitution, eau distillée ou désionisée non toxique, utilisée pour activer un flaconde réactif bactérien.

station d’échantillonnage, point précis, dans un emplacement ou une unité d’échantillonnage(selon le plan de l’étude) située sur le terrain, où, on prélève le ou les échantillons desédiment destinés aux essais de toxicité et aux analyses physicochimiques connexes. Voiraussi EMPLACEMENT.

substance, type particulier de matière, aux propriétés plus ou moins uniformes. La notionenglobe toutes les sortes de matières organiques ou inorganiques, qu’elles soient animées ouinanimées, que l’on peut distinguer.

témoin, dans une enquête ou une étude, variante expérimentale répétant toutes les conditions etfacteurs qui pourraient influer sur les résultats, sauf sur la condition particulière faisantl’objet de l’étude. Dans un essai de toxicité en milieu aquatique, le témoin doit répéter toutesles conditions d’exposition, mais il ne doit pas renfermer de matière ou de substance d’essaiajoutée. Il sert à déterminer l’absence de toxicité mesurable, attribuable aux conditions de

xix

base de l’essai (p. ex. température, santé des organismes, effets de leur manipulation ou deleur manutention).

toxique de référence, étalon constitué d’un sédiment témoin positif et servant mesurer lasensibilité de l’organisme d’essai afin d’établir le degré de confiance dans les résultats desessais de toxicité employant une substance ou une matière d’essai. Dans la plupart des cas,l’essai de toxicité employant un toxique de référence sert à évaluer la sensibilité desorganismes au moment de l’évaluation de la substance ou de la matière d’essai ainsi que laprécision et la fiabilité des résultats obtenus par le laboratoire à l’égard de ce toxique.V. aussi SÉDIMENT TÉMOIN POSITIF.

Terminologie statistique et toxicologique

aigu, qui se manifeste sur une courte période (de l’ordre de quelques minutes, dans le cas desbactéries) relativement à la durée de vie de l’organisme en expérience.

batterie d’essais, combinaison de plusieurs essais de toxicité, normalement sur différentsorganismes (Vibrio fischeri, un ou plusieurs amphipodes marins ou estuariens, un verpolychète).

carte de contrôle, graphique permettant de suivre l’évolution de l’effet exercé par un toxique deréférence. On reporte, pour la date de l’essai se trouvant sur l’axe horizontal, la concentrationà laquelle l’effet est observé, cette concentration se trouvant sur une échelle logarithmiqueverticale.

coefficient de variation (CV), quotient de l’écart-type (F) des mesures obtenues sur unéchantillon à la moyenne (�), exprimé en pourcentage : CV (%) = 100 F ÷ �.

concentration inhibitrice (CIp), concentration correspondant à un pourcentage (désignée par p)d’effet. C’est une estimation ponctuelle de la concentration de la substance ou de la matièred’essai qui inhibe, selon le pourcentage précisé, un paramètre biologique quantitatif tel que labioluminescence des bactéries ou la croissance du poisson, par rapport à la même fonctionchez le témoin. Par exemple, une CI50 pourrait être la concentration que l’on estime réduirede moitié la bioluminescence des organismes à la fin de l’essai par rapport à labioluminescence des témoins. L’expression vaut pour tout essai de toxicité mesurant un effetvariable continu tel que la bioluminescence, la reproduction, la respiration ou la masse sècheà la fin de l’essai.

échantillon subdivisé, échantillon de matière donnée après sa répartition en sous-échantillons envue d’essais multiples (en double ou plus) de la toxicité selon des modes opératoires et dansdes conditions identiques (c’est-à-dire répétitions de laboratoire).

échantillons réitérés, échantillons de sédiment prélevé dans la même station d’échantillonnage,afin d’estimer l’erreur d’échantillonnage ou d’améliorer la précision de l’estimation. Unéchantillon unique prélevé dans une station est considéré comme une répétition. Les

xx

échantillons supplémentaires sont considérés comme des échantillons réitérés lorsqu’ils sontsoumis à un traitement identique, mais en étant gardés dans des récipients séparés(c’est-à-dire qu’ils ne forment pas d’échantillons composites).

échantillonnage réitéré, prélèvement de plus d’un échantillon de matière d’essai au mêmemoment dans un endroit et à une profondeur donnés.

effet mesuré, valeur(s) ou mesure(s) caractérisant les résultats de l’essai (p. ex. la CIp). Peut aussis’entendre de la réaction de l’organisme en expérience montrant l’effet mesuré à la fin del’essai (p. ex. inhibition de la bioluminescence).

essai de toxicité, détermination de l’effet d’une matière ou d’une substance sur l’organisme enexpérience (p. ex. Vibrio fischeri) dans des conditions définies. L’essai de toxicité en milieuaquatique mesure habituellement soit : a) la proportion d’organismes touchés (essaiquantique) ; b) le degré d’effet observé (essai quantitatif ou gradué), après exposition à unematière particulière (p. ex. un échantillon de sédiment) ou un mélange particulier (p. ex.d’une substance chimique et d’un sédiment). L’essai de toxicité en phase solide employantdes bactéries luminescentes doit être considéré comme quantitatif (gradué), parce qu’on n’ymesure pas la proportion de chaque bactérie directement touchée, mais, plutôt, le degréglobal de réduction d’une fonction physiologique (c’est-à-dire de la bioluminescence)manifesté par des groupes de bactéries.

essai toxicologique, v. ESSAI DE TOXICITÉ.

gamma, mesure de l’extinction lumineuse servant à calculer la CIp. On calcule le gamma dechaque cuvette renfermant un filtrat d’une concentration donnée, d’après le rapport de labioluminescence d’un filtrat d’essai et à celle de solutions témoins, comme suit : ' = (It/Ie) ! 1, où It = valeur moyenne de la bioluminescence des filtrats de solutions témoins ;Ie = valeur moyenne de la bioluminescence des filtrats d’une concentration particulière de lamatière d’essai (§ 6.1). Lorsque ' = 1, cela correspond à l’extinction de la moitié de labioluminescence du fait de la toxicité ou d’autres facteurs de confusion (§ 6.2).

limite de la zone de confiance, limite, calculée logarithmiquement, située à plus ou moins deuxécarts-types (± 2 F), de part et d’autre de la moyenne géométrique de l’effet d’un toxique deréférence mesuré par des essais de toxicité.

moyenne géométrique, moyenne de mesures répétées, calculée logarithmiquement. Son avantageest de faire en sorte que les valeurs extrêmes n’influent pas sur sa propre valeur, comme celase produit avec la moyenne arithmétique. On peut calculer la moyenne géométrique commeétant la racine nième du produit de n valeurs et, aussi, comme l’antilogarithme de la moyennedes logarithmes des n valeurs.

paramètre de mesure, v. EFFET MESURÉ.

xxi

précision, mesure de la dispersion de mesures répétées de la même quantité, c’est-à-dire du degréd’écart entre les résultats. Elle décrit la certitude entourant un résultat ou la petitesse del’intervalle dans lequel se situe le résultat du calcul statistique de l’effet mesuré, p. ex. la CIp.

prélèvement réitéré, v. échantillonnage réitéré.

répétition, chaque enceinte expérimentale renfermant l’inoculum prescrit d’organismes, enprésence d’une concentration de la matière ou de la substance d’essai ou dans le(s) milieu(x)témoin(s) ou de référence. Elle constitue une unité expérimentale indépendante. C’estpourquoi tout transfert d’organismes ou de matières d’une enceinte à l’autre invalide l’essai.

toxicité, capacité propre qu’a une matière de provoquer un ou des effets nocifs chez desorganismes. L’effet ou les effets pourraient être létaux ou sublétaux.

toxicité aiguë, manifestation d’un effet nocif (létal ou sublétal) chez l’organisme en expérience,après une courte exposition au sédiment d’essai (pour les besoins de la présente méthode, enquelques minutes).

toxique, adj. Nocif pour les organismes vivants (s’il se trouve en quantité suffisante au bonendroit). ‚ n. m., substance toxique, poison.

variante, sédiment (p. ex. prélevé en un emplacement donné ou sédiment de référence prélevé àune station et à une profondeur données) ou concentration de ce sédiment. Dans un essai detoxicité, elle est habituellement représentée par plusieurs échantillons ou sous-échantillons dusédiment d’essai. Voir RÉPÉTITION.

xxii

Remerciements

Rédigée par D. McLeay (McLeay Environmental Ltd., Victoria) et G. Wohlgeschaffen(Dartmouth [N.-É.]), la présente méthode de référence est l’aboutissement d’un projet entrepriset financé par la Direction du milieu marin d’Environnement Canada (EC), avec l’appui etl’encouragement de L. Porebski et de J. Osborne (EC, Canada, Hull). En sa qualité d’autoritéscientifique, R. Scroggins (Section de l’élaboration et de l’application des méthodes, Centre detechnologie environnementale, EC, Canada, Ottawa) a fourni l’apport technique et desorientations tout au long des travaux. Les conseils techniques et les notes de révision fournis parK. Doe (Centre des sciences environnementales de l’Atlantique, EC, Moncton) au cours del’élaboration, de la validation et de la rédaction de la méthode ont été particulièrement utiles, etnous lui en savons particulièrement gré. Les données et les observations techniques fournies parD. Lee (EC, North Vancouver [C.-B.]) et D. St. Laurent (EC, Montréal) ont également aidé à lapréparation de cette méthode de référence. À M. G. Schroeder (EC, North Vancouver), noussommes redevables de l’élaboration des feuilles de calcul électroniques recommandées ici pourla comparaison de deux CI50.

Le Groupe intergouvernemental sur l’écotoxicité (GIE, annexe B) a participé à l’élaboration durapport et à sa révision. En le remerciant, nous remercions aussi les agents d’EnvironnementCanada dans les régions et à l’Administration centrale (annexe C) pour leur appui.

Des remerciements particuliers vont à chaque membre du groupe consultatif scientifique chargéde des conseils et de l’apport scientifiques qui, au cours de l’élaboration et de la révision dudocument, a fait de nombreuses observations utiles. Ce groupe comprenait M. C. Buday (EC,North Vancouver), le Dr A. Burton, fils (Université d’État Wright, Dayton, Ohio), M. K. Doe(EC, Moncton), le Dr K. Ho (USEPA, Narragansett, Rhode Island), Mme P. Jackman (EC,Moncton), M. J. Osborne (EC, Hull), Mme L. Porebski (EC, Hull), le Dr P. Ross (ColoradoSchool of Mines, Golden, Colorado)et MM. R. Scroggins (EC, Ottawa), P. Topping (EC, Hull) etS. Trottier (EC, Montréal). L’annexe D donne les coordonnées de chacun ainsi que de l’autoritéscientifique et des consultants.

Les photos de la première de couverture ont été fournies par Paula Jackman, Troy Steeves etDale Hughes (Centre des sciences environnementales, EC, Moncton).

1

Section 1

Introduction

La présente méthode de référence précise lesmarches à suivre et les conditions à employerpour préparer et entreprendre un essai demesure, en phase solide, de la toxicitéd’échantillons d’un sédiment à l’aide debactéries luminescentes (Vibrio fischeri).Représentant une des méthodes biologiquesemployées dans le cadre d’évaluations dessédiments compatibles avec le règlementfédéral concernant l’immersion en mer, sousle régime de la Loi canadienne sur laprotection de l’environnement (EC, 1997a ;LCPE, 1999 ; Gouvernement du Canada,2001), cette méthode peut aussi servir àmesurer la toxicité d’échantillons desédiment dont on envisage l’élimination surla terre ferme ou dans les emplacements eneau douce, estuarienne ou marine pourlesquels sont prescrits des évaluationsréglementaires ou des modes opératoiresrigoureux. Environnement Canada a publiéune autre méthode de référence, destinée auxéchantillons de sédiment (EC, 1998). Il existeaussi d’autres méthodes fédérales(Environnement Canada) d’essai biologiquepour mesurer la toxicité de sédiments(v. annexe A).

Les chercheurs et les responsables de laréglementation au Canada, aux États-Unis etailleurs utilisent les essais en phase solidepour mesurer la toxicité d’un sédiment àl’aide de bactéries luminescentes (V. fischeri,auparavant identifié comme Photobacteriumphosphoreum) depuis la première applicationde ce mode opératoire, par des chercheurscanadiens, aux sédiments du port deHamilton (Brouwer et al., 1990). La sociétéMicrobics (Carlsbad, Californie) aultérieurement normalisé un essai de toxicitéaiguë d’un sédiment (ou d’un sol) en phase

solide et l’a inclus dans ses méthodesMicrotoxz (Microbics, 1992). À l’époque,Environnement Canada (1992) arecommandé la méthode Microtox en phasesolide pour évaluer la toxicité d’échantillonsde sédiments ou de matières solidessemblables, tout en reconnaissant que sanormalisation se trouvait encore à sespremiers balbutiements. Néanmoins, laméthode publiée par Environnement Canada(1992), qui reste une référence utile (et demise pour les essais en phase liquide),complétera bien la présente méthode,lorsqu’il s’agira de réaliser des essais detoxicité aiguë en phase solide avec desbactéries luminescentes.

Beaucoup de conditions et d’éléments desmodes opératoires précisés dans la présenteméthode correspondent aux indications et auxapproches décrites pour la mesure de latoxicité de sédiments en phase solide aumoyen de V. fischeri, dans diverses méthodesou divers modes opératoires normalisés delaboratoire, notamment : EC (1992),Microbics (1992, 1995a), ASTM (1995), EC(1996a), AZUR (1997), AZUR (1998a, b),EC (1999a) et NICMM (1999). L’annexe Eexamine les similitudes et les différences queprésentent ces documents. Reconnaissant leurapport à toutes les parties de la présenteméthode, nous recommandons de lesconsulter comme sources explicatives.Toutefois, dans la planification et laréalisation, à des fins réglementaires, d’essaisde toxicité de sédiments en phase solide àl’aide de bactéries luminescentes (V. fischeri)au Canada, il faudrait considérer les modesopératoires et conditions énoncés ici commedéfinitifs.

2

Outre les lignes directrices méthodologiquesou les modes opératoires normalisés dont onrésume, dans l’annexe E, les conditions etmanipulations s’appliquant avant et pendantles essais, un certain nombre de publicationsscientifiques offrent désormais d’autresprécisions utiles sur la réalisation d’essais detoxicité des sédiments en phase solide àl’aide de bactéries luminescentes. Ce sontnotamment (et l’énumération n’est paslimitative) : des études de l’influence de lacomposition des sédiments sur la toxicitéapparente (Benton et al., 1995 ; Ringwoodet al., 1997 ; Tay et al., 1998) ; une étude durôle de la toxicité des sulfures dans lessédiments réduits comme facteur de latoxicité des sédiments des eaux douces(Brouwer et Murphy, 1995) ; une étude descorrélations entre un certain nombre d’essaisde toxicité des sédiments en phase solide et lastructure in situ des communautés benthiques(Day et al., 1995) ; la contribution des essaisde toxicité des sédiments en phase solide àl’aide de V. fischeri aux plans d’expérience età l’interprétation des données (Ross etLeitman, 1995) ; une étude de la toxicité dessédiments du port de Halifax (Cook et Wells,1996) ; le rôle de cet essai et d’autres essaisde toxicité des sédiments dans l’évaluation dela toxicité des sédiments (Ross, 1998 ;Bombardier et Birmingham, 1999) et laprécision interlaboratoires d’un essai detoxicité des sédiments en phase solideemployant V. fischeri (Ross et al., 1999).

Avant de donner à la présente méthode deréférence sa forme finale, on a effectué deuxséries d’études interlaboratoires avec deséchantillons de référence et des sédimentscontaminés, pour déterminer sa précisionintra- et interlaboratoires et la valider. À

chaque série ont participé les mêmeslaboratoires (six) diversement expérimentés(de moins d’une à huit années d’expérience)dans les essais de toxicité des sédiments enphase solide à l’aide de bactériesluminescentes. La première série a étéappliquée par chaque laboratoire à unensemble identique de parties aliquotes(sous-échantillons) de huit matières sèches,uniquement identifiées par les numéros 1 à 8.Sept matières étaient des sédiments étalonscertifiés (de référence ou contaminés), secs,fournis par le CNRC, tandis que la huitièmeétait constituée à 100 % de kaolin (une argile)séché. Bien qu’elles n’aient pas étéidentifiées comme telles, quatre de ces huitmatières étaient des sous-échantillonsprélevés dans le même lot d’un seuléchantillon composite de sédiment étaloncontaminé du CNRC. Pour la seconde séried’essais, on a envoyé à chaque laboratoire, unensemble identique de 11 sous-échantillonsde sédiment « humide », prélevés sur leterrain, dans un certain nombre de stationscontaminées ou de stations d’échantillonnagede référence, situées dans les eaux côtières duCanada. Bien qu’elles n’aient pas étéidentifiées comme telles, trois des11 matières provenaient du même lot d’unéchantillon composite d’un seul sédiment deréférence. Les conclusions de ces études, quisont exposées en détail dans un rapporttechnique que l’on peut obtenir de la Sectionde l’élaboration et de l’application desméthodes d’Environnement Canada (McLeayet al., 2001), ont révélé une très bonneprécision intra- et interlaboratoires pourchaque série d’essais ayant respecté lesconditions préalables à l’essai et lesconditions d’essai exposées en détail dans laprésente méthode de référence.

3

Section 2

Organismes d’essai

2.1 Espèce

Les organismes utilisés dans l’essaiproviennent d’une culture normalisée (soucheNNRL B-11177 ; v. tableau 10, annexe E). Ilsappartiennent à une espèce particulière debactérie marine luminescente (c’est-à-direVibrio fischeri, auparavant classé dansl’espèce Photobacterium phosphoreum).Cette bactérie vit normalement dans l’océanet émet une lumière bleu-vert continue, à lafaveur de réactions enzymatiques, si la teneuren oxygène est suffisant (EC, 1992).

2.2 Source et entretien

Les cultures étalons de V. fischeri peuventêtre achetées de Strategic Diagnostics Inc. 1.Les bactéries sont commercialisées sous laforme de souche uniforme de bactéries(« réactif bactérien ») lyophilisées(c’est-à-dire que l’on a séchées parcongélation sous vide), récoltées au cours dela phase de croissance exponentielle. Les lotsde production sont vendus en paquetsrenfermant chacun au moins 10 flaconsscellés. Chaque flacon renferme 100 millions(108) d’organismes lyophilisés.

Dans son récipient, le réactif bactérienlyophilisé serait stable un an au maximum,

s’il est conservé au congélateur à !20 °C(EC, 1992) 2. La température de conservationdevrait être constante et se tenir dansl’intervalle de !25 à !20 °C ; on ne devraitpas utiliser de congélateur sans givre, seréchauffant au cours du dégivrage. On devraitdéterminer la viabilité des nouveaux lots debactéries ou de chaque lot utilisé sur unelongue période par un essai de toxicité deréférence en phase solide effectué avec aumoins une substance chimique,conformément aux modes opératoires et auxconditions décrits dans la section 5. Chaquelot convient à un essai d’au moins deuxheures (EC, 1992) et d’au plus trois heures(Gaudet, 1998), après reconstitution.

Il faut consigner le numéro du lot desbactéries utilisées dans chaque essai detoxicité et la date de péremption de ce lot ;cette information doit figurer dans leprocès-verbal de l’essai, ainsi que le nom del’espèce et de la souche (v. § 7.1.2). Lesautres données propres à l’organisme d’essai,notamment sa source, sa date de réception etsa température d’entreposage ou de maintiendoivent soit figurer dans le procès-verbal del’essai ou le rapport général ou êtreconservées en archives pendant au moinscinq ans (v. § 7.2.2).

1 Ce produit et les produits apparentés ainsi que desquantités permettant la réalisation d’essais de toxicitéen phase solide avec V. ficher ont d’abord étécommercialisés par AZUR Environmental Ltd.(Carlsbad, CA). Les droits de commercialisation desproduits et des réactifs Microtoxz ont été acquis parStrategic Diagnostics Inc. de Newark, Delaware (DE).Pour obtenir les coordonnées de cette société, allez surson site Web, à www.sdix.com, ou, par téléphone,faites le 1-800-544-8881.

2 Sur les étiquettes des boîtes et des flacons fournispar Strategic Diagnostics Inc., la températurerecommandée de conservation se situe entre !25 et!20 °C.

4

Section 3

Installations, équipement et fournitures

3.1 Installations

L’essai peut se dérouler dans un laboratoirenormal, propre, à l’éclairage standard. Ledegré de danger posé par les échantillons et lerisque de contamination des échantillons etde l’appareillage commanderaient l’emploid’installations particulières. Les lieux doiventêtre bien aérés, exempts d’émanations etisolés des causes de perturbations physiqueset des contaminants atmosphériques quipourraient perturber les organismes enexpérience. Les installations d’essai devraientaussi être isolées des lieux de préparation dessédiments d’essai et éloignées, également,des lieux où l’on nettoie l’équipement.

3.2 Appareillage

3.2.1 NettoyageToute pièce d’équipement et toute fourniturequi pourraient entrer en contact avec lesédiment ou l’eau d’essai doivent être propreset sèches. Tout le matériel non jetable devraitêtre lavé après usage. Le mode suivant denettoyage (EC, 1997b, c) est recommandé.

1. Faire tremper dans l’eau du robinetpendant 15 min, puis nettoyer à fond audétergent ou laver dans un lave-vaisselleautomatique.

2. Rincer deux fois à l’eau du robinet.

3. Rincer soigneusement avec de l’acidenitrique (HNO3) ou chlorhydrique (HCl)fraîchement préparé, dilué (10 % v/v 3)pour supprimer le tartre, les métaux et lesbases.

4. Rincer deux fois à l’eau désionisée.

5. Rincer une fois à l’acétone non diluée, dequalité convenant à l’analyse despesticides, pour éliminer les composésorganiques (sous hotte). Contre lesrésidus huileux, utiliser de l’hexane.

6. Rincer trois fois à l’eau désionisée dequalité.

3.2.2 Grandes lignes de l’essai etappareillage connexe

Cet essai en phase solide de mesure de latoxicité d’échantillons de sédiment entiercomporte les étapes suivantes :

• préparation d’une série de dilutions del’échantillon dans l’eau ;

• mélange de ces dilutions avec uninoculum d’organismes d’essai(V. fischeri reconstitué), puis incubation,pendant 20 min, dans des tubes à essaiplongés dans un bain d’eau à15 ± 0,5 °C ;

• immédiatement après, filtration ducontenu de chaque tube ;

• stabilisation du filtrat, à 15 ± 0,5 °C,pendant 10 min, dans une série decuvettes maintenues dans les puits d’unphotomètre ;

• photométrie de la bioluminescence desbactéries subsistant dans le filtrat.

3.2.3 ÉquipementL’équipement et les fournitures nécessaires àla réalisation de ces étapes sont rapidementdécrits ci-dessous. On devrait consulter lefournisseur pour obtenir plus de précisionssur ses articles. L’équipement et lesfournitures entrant en contact avec les

3 En ajoutant, soigneusement, 10 mL d’acideconcentré à 90 mL d’eau désionisée.

5

sédiments ou l’eau ne doivent pas renfermerde substances lixiviables ou solubles enquantités nuisibles pour les organismes enexpérience. On devrait les choisirsoigneusement afin de réduire au minimum lasorption de matières de l’eau.

L’équipement permettant l’exécution del’essai de toxicité des sédiments en phasesolide comprend ce qui suit :

• photomètre Microtoxz modèle 500Analyzer (appelé ci-après « modèle 500de Microtox ») ou photomètre équivalent,thermostaté (15 ± 0,5 °C pour au moins15 cuvettes renfermant les solutionsd’essai ; 5,5 ± 1 °C pour une seule cuvetterenfermant les bactéries reconstituéesdans l’alvéole du réactif), capable demesurer la bioluminescence à la longueurd’onde de 490 ± 100 nm (ASTM, 1995) ;

• bain d’eau thermostaté à 15 ± 0,5 °C ;

• portoir de tubes à essai ou compartimentd’incubateur pour l’incubation des tubes àessai renfermant des dilutions de lamatière d’essai et V. fischeri dans le baind’eau ;

• congélateur (qui n’est pas du type sansgivre) pour conserver les bactérieslyophilisées (réactif bactérien) ;

• pipettes automatiques débitant desvolumes de 20, 500, 1000 et 1500 :L, àcônes de plastique jetables 4 ;

• tubes à essai en phase solide (tubesd’EPS) [15,5 mm sur 56, capacité de7,5 mL, fond hémisphérique] ou tubes àessai équivalents ;

• cuvettes de verre jetables (verreborosilicaté, 3 mL de capacité, 50 mm delongueur sur 12 de diamètre, à fond plat) ;

• colonnes de filtration jetables pour lestubes d’EPS ou les tubes à essaiéquivalents 5 ;

• verrerie jaugée borosilicatée (lavée àl’acide conformément au § 3.2.1) pour letraitement de petites aliquotesd’échantillons ;

• chronomètre ou minuterie à affichage decompte à rebours ;

• mélangeur à barreau magnétique enrobéde téflon ;

• balance, d’une précision de 0,01 g ;

• étuve (100 ± 5 °C) ;

• récipients de pesée pour la déterminationdu poids sec ;

• cuillère ou spatule de métal pourl’homogénéisation des échantillons.

3.2.4 FournituresOn se procure les bactéries qui serviront àl’essai en culture normalisée et lyophilisée(« réactif bactérien », v. section 2) et on les

4 La précision et l’exactitude des pipettes devraientêtre élevées (p. ex. pour 20 :L, précision de 2% etexactitude de 10% au moins ; pour 500 :L, 1 et 5%,respectivement ou mieux ; pour 1500 :L, 2 et 5%respectivement ou mieux. Les cônes jetables despipettes débitant 1500 :L devraient avoir uneouverture de plus de 1,5 mm de diamètre, pour réduireau minimum le colmatage dû aux particules solides(ASTM, 1995 ; EC, 1996a).

5 Ce sont des colonnes de séparation sérique enpolyéthylène, de 13 mm de diamètre extérieur, 11 mmde diamètre intérieur, 67 mm de hauteur, dontl’extrémité inférieure, où le filtre s’adapte aux tubesd’EPS, est dotée d’un joint d’étanchéité souple de15 mm de diamètre. Le filtre même, qui occupe lapartie inférieure de la colonne, possède un diamètre de6 mm et une épaisseur de 4 mm. La taille des pores vade 15 à 45 :m, d’après le fournisseur [EvergreenScientific, Los Angeles, tél. : (323) 583-1331, pièceno 208-3193-020].

6

garde au congélateur à !20 °C (EC 1992 ;ASTM 1995).

On se sert d’eau distillée ou désionisée nontoxique pour activer un flacon de réactifbactérien (v. § 4.6). Pour désigner cette eau,on parle souvent de solution dereconstitution, que l’on peut soit acheter tellequelle (v. tableau 11 ; annexe E), soit prendredans les fournitures du laboratoire et utiliseraprès essai confirmant qu’elle ne diminue pasla bioluminescence de V. fischeri. Pour cetessai, on utilise de l’eau devant servir desolution de reconstitution, comme eau témoinou comme eau servant à la préparation dessolutions filles du ou des toxiques deréférence utilisés systématiquement aulaboratoire pour l’évaluation de l’essai menéavec V. fischeri. En conséquence, on devraitévaluer la bioluminescence de V. fischeri dueà la solution de reconstitution prévue dans un

essai de toxicité en milieu exclusivementaqueux, avec un ou plusieurs toxiques deréférence, conformément aux modesopératoires et aux conditions exposés dansEnvironnement Canada (1990), de même quedans la section 4 « Méthodes universelles »de la méthode d’essai biologique publiée parEnvironnement Canada et exposant les essaisde toxicité en phase liquide employant labactérie luminescente V. fischeri (EC, 1992).

Pour diluer chaque échantillon de sédimentd’essai, il faut une réserve de « diluant enphase solide » (v. tableau 5 ; annexe E)constituée d’une solution de chlorure desodium (NaCl) à 3,5% (v. § 4.6). On peutacheter ce diluant ou, encore, le préparer endissolvant 35,0 g de NaCl (de qualité« réactif ») dans 1000 mL de solution dereconstitution (c’est-à-dire d’eau distillée oudésionisée non toxique).

7

Section 4

Essai du sédiment

4.1 Prélèvement de l’échantillon

Environnement Canada (1994) donne desorientations sur les plans d’échantillonnagesur le terrain et sur les bonnes techniques deprélèvement des échantillons, qu’il faudraitsuivre si ces échantillons sont destinés auxessais de toxicité à l’aide de la présenteméthode de référence.

Les modes opératoires et les préleveurs(c’est-à-dire carottiers, bennes, dragues,préleveurs d’échantillons composites)dépendent de la nature des échantillons ainsique des objectifs de l’étude ou des exigencesréglementaires. On devrait prélever leséchantillons de déblais de dragage à toutes lesprofondeurs auxquelles on s’intéresse.

Chaque série d’essais de toxicité selon laprésente méthode de référence devraitcomprendre un ou plusieurs échantillons desédiment de référence. On devrait chercher cesédiment dans les endroits où ses propriétésgéochimiques, notamment la granulométrie,sont semblables à celles du sédiment d’essai(contaminé ou susceptible d’être contaminé)dans le lieu de prélèvement de ce sédiment.Idéalement, le sédiment de référence devraitprovenir d’un endroit à l’abri de l’influencede la source ou des sources de contamination,mais dans les parages des endroits où onprélève le sédiment d’essai. Il estrecommandé de prélever le sédiment deréférence en plus d’un emplacement, pouraccroître la probabilité d’une bonnecorrespondance de la granulométrie etd’autres caractéristiques physicochimiquesavec celles des sédiments d’essai.

Le plan d’expérience d’un essai de toxicitéemployant un ou plusieurs échantillons desédiment d’essai grossier comportant moinsde 20% de fines doit comprendre unéchantillon de sédiment de référence noncontaminé ou de sédiment témoin négatif,pour comparer la toxicité des échantillons(v. § 6.2). Le taux de fines de ces sédimentsde référence ou témoin ne doit pas différer deplus de 30% du taux de fines de l’échantillonou des échantillons de sédiment d’essaiauquel on les compare (§ 6.2). Si leur taux defines satisfait à cette exigence, ces sédimentsprélevés sur le terrain peuvent servir deréférence ou de témoin, auquel casl’orientation relative au prélèvement deséchantillons s’applique. On peut aussi, pourfaire coïncider étroitement le taux de finesavec celui du ou des échantillons de sédimentd’essai grossier, opter pour la préparationd’un ou de plusieurs échantillons de sédimenttémoin négatif artificiel. Les orientations sursa préparation sont données dans les § 4.3 et4.4.

Le nombre de stations à échantillonner dansl’emplacement étudié et le nombred’échantillons réitérés par station sontparticuliers à l’étude. Dans la plupart des cas,il s’agira d’établir un compromis entre lescontraintes logistiques et pratiques (p. ex.temps et coûts) et les besoins statistiques. Ilfaudrait consulter Environnement Canada(1994) pour obtenir des orientations sur leplan d’échantillonnage, y compris le nombreminimal recommandé de prélèvementsréitérés sur le terrain. On peut trouver desorientations supplémentaires surl’échantillonnage pour l’immersion en merdans Environnement Canada (1995a ; 2002a).Nous incitons les demandeurs à consulter le

8

Bureau régional de l’immersion en merd’Environnement Canada (coordonnées dansl’annexe C) avant d’entreprendre lesprélèvements et les essais.

Lorsque cela est pratique et est compatibleavec le plan et les objectifs de l’étude, ondevrait prélever au moins cinq échantillonsde sédiment dans chaque stationd’échantillonnage et à chaque profondeur àlaquelle on s’intéresse. Lorsque cela estpratique et convenable (v. section 6), leséchantillons prélevés devraient comprendreau moins cinq échantillons d’au moins unestation de référence (c’est-à-dired’emplacements où on peut trouver unsédiment non contaminé, aux propriétésphysicochimiques semblables à celles dessédiments d’essai) dans les parages.L’objectif du prélèvement réitéréd’échantillons dans chaque station(prélèvements réitérés) est de permettre descomparaisons statistiques quantitativesrelativement à la station ou entre différentesstations (EC, 1994 ; 1998 ; 2002b). Enconséquence, chacun de ces « véritableséchantillons réitérés » de sédiment devraitêtre soumis à un essai de sa toxicité aiguëpour V. fischeri. Des répétitions delaboratoire employant des sous-échantillonsde chaque échantillon prélevé sur le terrain desédiment d’essai et de référence, aprèsmélange et autres manipulations (v. § 4.3),pourraient aussi faire partie d’une étude, dansles cas où l’homogénéité des échantillons oula précision des résultats expérimentaux sontdouteuses.

On devrait utiliser une benne (p. ex.Smith-MacIntyre, Van Veen, PONAR) ou uncarottier pour prélever le sédiment, plutôtqu’une drague, afin de perturber au minimuml’échantillon. On devrait veiller, au cours del’échantillonnage, à réduire au minimum laperte de fines. On devrait utiliser partout lamême méthode de prélèvement.

Le volume d’échantillons nécessaire à unessai de toxicité des sédiments employantV. fischeri et portant sur plusieursconcentrations est faible (v. § 4.6). Environ100 mL devraient être expressément utiliséspour la réalisation de l’essai 6. On a souventbesoin, par échantillon, d’au moins 5 à 7 L desédiment entier (EC, 1994), bien que cevolume dépende des objectifs et du plan del’étude ainsi que de la nature des analysesphysicochimiques connexes et de la batteried’essais de toxicité à effectuer. Pour obtenirle volume nécessaire d’échantillons pour labatterie d’essais, il est souvent nécessaire decombiner des sous-échantillons obtenus aumoyen du préleveur. On devrait suivre lesorientations données dans EnvironnementCanada (1994) pour obtenir un échantilloncomposite à partir de sous-échantillonsprélevés sur le terrain.

4.2 Étiquetage, transport etentreposage des échantillons

Outre les consignes qui suivent, on trouve desorientations plus détaillées et utilesconcernant l’étiquetage, le transport et lestockage des échantillons dansEnvironnement Canada (1994), documentqu’il faudrait bien connaître à cette fin.

Les récipients servant au transport et àl’entreposage des échantillons doivent êtreneufs ou nettoyés et rincés à fond avec del’eau propre. On devrait consulterEnvironnement Canada (1994) pour obtenirdes orientations sur le choix des récipientsconvenables. Chaque récipient devrait êtrerempli entièrement de l’échantillon, pour enexclure l’air. Sans délai, on devrait le sceller,puis l’étiqueter ou le coder. L’étiquetage et

6 Volume suffisant pour donner plus de 100 g desédiment humide et permettre au moins 10 essais surl’échantillon.

9

les enregistrements connexes quiaccompagnent cette opération doiventcomprendre au moins un code que l’on peututiliser pour identifier l’échantillon ou lesous-échantillon. Un registre à renvoiscroisés, qui pourrait ou pourrait ne pasaccompagner l’échantillon ou lesous-échantillon, doit être établi par lepersonnel de terrain identifiant le typed’échantillon (p. ex. prélevé par benne,carottier, échantillon composite), sa source, lelieu précis du prélèvement (p. ex. hydronyme,latitude, longitude, profondeur), le numérod’échantillon réitéré et la date duprélèvement. Cet enregistrement devrait aussicomprendre le ou les noms et signatures duou des préposés au prélèvement, lesquelsdevraient aussi conserver des registresdécrivant :

• la nature, l’aspect, le volume et/ou lamasse de chaque échantillon ;

• la méthode et l’appareillage utilisés pourle prélèvement ;

• toute méthode utilisée pour obtenir unéchantillon composite ou dessous-échantillons des sédiments prélevéspar benne ou carottier ;

• le nombre d’échantillons réitérés prélevésdans chaque station d’échantillonnage ;

• le calendrier d’échantillonnage ;

• les types de récipients utilisés pour letransport des échantillons et leur nombre ;

• toute mesure effectuée sur le terrain(p. ex. température, salinité, pH, oxygènedissous) dans la colonne d’eau ou dans lesédiment sur les lieux du prélèvement) ;

• les méthodes et les conditions concernantle refroidissement et le transport deséchantillons.

Dès le prélèvement, on devrait refroidir leséchantillons tièdes (> 7 °C) entre 1 et 7 °C,avec de la glace ordinaire ou des contenantsréfrigérants (« cryosacs ») et les maintenirfroids (4 ± 3 °C), dans l’obscurité, durant letransport (EC, 1994 ; 1998). Au besoin, ondevrait utiliser des contenants réfrigérants, dela glace ordinaire, des glacières ou d’autresmoyens de réfrigération pour maintenirl’intervalle de températures de l’échantillondans la fourchette de 1 à 7 °C durant letransport. Les échantillons ne doivent pasgeler, pas même en partie, au cours dutransport ou de l’entreposage, et on ne doitpas les laisser sécher (EC, 1994).

À l’arrivée au laboratoire, il faut enregistrerla température de l’échantillon et sa date deréception sur une fiche à l’usage dulaboratoire (voir l’exemple de l’annexe F).Les échantillons à conserver pour usageultérieur doivent être gardés dans desrécipients étanches, à l’obscurité, à 4 ± 2 °C(EC, 1994 ; 1998). Il est recommandé desoumettre à l’essai le plus tôt possible aprèsle prélèvement, les échantillons de sédimentou de matières particulaires semblables.L’essai de toxicité du sédiment devraitcommencer dans les deux semaines suivant leprélèvement, de préférence dans la semainequi suit ce dernier ; l’essai ne doit pasdémarrer plus de six semaines après leprélèvement (EC, 1994 ; 1997b ; 1997c ;1998).

4.3 Manipulation et caractérisationdes échantillons

Il ne faut pas soumettre au tamisagehydraulique les échantillons de sédiment deréférence et d’essai prélevés sur le terrain. Ilfaudrait en éliminer les particules d’au moins2 mm ainsi que les gros débris ou les grosorganismes indigènes. Selon l’échantillon, onpeut à cette fin travailler avec une pincette ou

10

un gant, qu’on devrait rincer ou remplacer,entre chaque échantillon, pour en prévenir lacontamination croisée. Si un échantillonrenferme beaucoup de particules d’au moins2 mm et beaucoup d’organismes indigènesmacroscopiques qui ne peuvent pas êtreéliminés avec la pincette ou la main gantée,on peut soumettre l’échantillon à un tamisagesous pression (non hydraulique) au traversd’au moins un tamis d’acier inoxydable àouvertures convenablement calibrées (p. ex.$ 2 mm). Cette manipulation devraits’appliquer à toutes les fractions del’échantillon utilisées pour les analysesphysicochimiques (y compris l’analysegranulométrique), de même qu’aux fractionsdestinées aux essais de toxicité des sédimentsen phase solide avec V. fischeri. Les modesopératoires utilisés pour la manipulation dechaque échantillon doivent être notés sur lafiche de laboratoire (voir la colonne intitulée« Notes » dans l’exemple de l’annexe F).

Il faut homogénéiser de nouveau le sédimentet l’eau de porosité qui se seraient séparés aucours de l’expédition et de l’entreposage. Àcette fin, on mélange l’échantillon, soit dansle récipient qui a servi à son transport ou àson entreposage, soit dans un récipient propreservant à cette opération. On devraitnormalement employer un outil non toxique(p. ex. une cuillère ou une spatule en acierinoxydable), tant que la texture et la couleurne sont pas homogènes. On peut aussi utiliserune méthode mécanique (EC, 1994 ; 1998)pour homogénéiser l’échantillon. Pourchaque échantillon faisant partie d’un essai, ilfaut que les conditions de mélange, y comprisla durée et la température à laquellel’opération se déroule soient aussi semblablesque possible. Si on doute de l’efficacité dubrassage de l’échantillon, on devrait préleverdes sous-échantillons du sédiment après lemélange, puis en analyser séparémentl’homogénéité.

Immédiatement après le mélange del’échantillon, il faut prélever lessous-échantillons de la matière exigée pourcet essai de toxicité et d’autres (p. ex. EC,1998) et pour les analyses physicochimiques,les placer dans des enceintes d’essaiétiquetées et dans les récipients étiquetésexigés pour l’entreposage des échantillonsdestinés à des analyses physicochimiquesultérieures. Il faudrait alors transvaser aussitoute fraction subsistant de l’échantillonhomogénéisé qui pourrait être nécessaire àdes essais supplémentaires de toxicitéemployant des amphipodes (EC, 1998) oud’autres organismes dans des récipientsétiquetés. On devrait conserver tous lessous-échantillons à entreposer dans desrécipients scellés, sans espace d’air, et on doitles ranger à l’obscurité, à 4 ± 2 °C, jusqu’àl’emploi ou l’analyse. Immédiatement avantde l’analyser ou de l’employer dans l’essai detoxicité, il faut mélanger de nouveau à fondchaque sous-échantillon, pour s’assurer deson homogénéité.

On doit caractériser chaque échantillon(notamment de sédiment de référence, desédiment témoin négatif et de sédimenttémoin positif), au moyen desous-échantillons, au moins relativement auxparamètres suivants (EC, 1998) : dans le casd’un sédiment entier, le pourcentage departicules très grossières (c’est-à-dire> 1,0 mm), de sables (> 0,063 à 2,0 mm), defines (0,063 mm ou moins), d’eau et decarbone organique total ; dans le cas de l’eaude porosité, la salinité et le pH. On pourraitégalement englober d’autres analyses : lateneur en carbone inorganique total, enmatières volatiles totales, la demandebiochimique d’oxygène, la demandechimique d’oxygène, la capacité d’échangecationique, les sulfures extractibles à l’acide,les métaux, les composés organiques desynthèse, les huiles et les graisses, leshydrocarbures de pétrole, tandis que les

11

analyses de l’eau de porosité porteraient surdiverses caractéristiques physicochimiquestelles que l’ammoniac (total et non ionisé) oule sulfure d’hydrogène. Les modesopératoires recommandés pour leprélèvement de l’eau de porosité sont décritsdans Environnement Canada (1994). Ilfaudrait s’y conformer pour les besoins de laprésente méthode. Pour les applicationsconcernant l’immersion en mer, lesrenseignements minimaux exigés sontexpliqués dans deux lignes directricesd’Environnement Canada (c’est-à-dire EC,1995a ; 2002a).

Il faut entreprendre le plus tôt possible aprèsle prélèvement des échantillons, les analysesde la répartition granulométrique, pourfaciliter la sélection du ou des échantillonsconvenables de sédiment de référence et, lecas échéant, du sédiment témoin négatif(v. § 4.4 et 6.2).

À la faveur d’études antérieures, on aconstaté que V. fischeri tolère tout à fait lesfortes concentrations d’ammoniaque (Qureshiet al., 1982) y compris dans l’eau de porositéd’échantillons de sédiments prélevés enmilieu marin ou estuarien (McLeay et al.,2001). D’après ces données limitées, lesfortes concentrations d’ammoniaque dansl’eau de porosité ne sont pas un facteurmajeur de confusion pour les résultats desessais. Cependant, on pourrait vouloirmesurer la contribution de l’ammoniaque del’eau de porosité à la toxicité de l’échantillondéterminée par la présente méthode deréférence. À cette fin, il faudrait mesurer lepH, et la salinité de l’eau de porosité et endoser l’ammoniaque dans les 24 heuressuivant l’essai de toxicité du sédiment enphase solide à l’aide de V. fischeri, pourdéterminer à quelles concentrationsd’ammoniac total et non ionisé lesorganismes ont été exposés (§ 6.2). Lesanalyses de l’ammoniaque doivent employer

un mode opératoire reconnu et normalisé (parexemple APHA et al., 1995 ; StandardMethods). Les calculs des concentrationsd’ammoniac non ionisé doivent se fonder surla température à laquelle se déroule l’essai, lepH de l’eau de porosité et la salinité del’échantillon (Trussell, 1972 ; Bower etBidwell, 1978).

4.4 Sédiments témoins négatif etpositif

Les essais de toxicité limités à un ou àplusieurs échantillons de sédiment fin(renfermant au moins 20 % de fines) n’ontpas besoin d’échantillon de sédiment témoinnégatif ni de sédiment de référence noncontaminé, puisque la toxicité de ceséchantillons ne s’estime pas par comparaisondes résultats des essais aux résultats donnéspar un échantillon de sédiment noncontaminé possédant des caractéristiquesgranulométriques semblables. Cependant,tout essai de toxicité portant sur un ouplusieurs échantillons de sédiment renfermantmoins de 20% de fines doit comprendre unéchantillon de sédiment non contaminé dontle taux de fines ne diffère pas de plus de 30%de celui du ou des échantillons de sédimentd’essai auxquels on le compare pour estimerla toxicité (v. § 6.2). On peut se servir, à cettefin, d’un sédiment non contaminé prélevé surle terrain, dans un emplacement noncontaminé. Il est cependant recommandéd’employer un sédiment témoin négatifpréparé en laboratoire (artificiel), puisqu’onpeut faire correspondre étroitement sa teneuren fines à celle du ou des sédiments d’essai.Pour sa préparation, on devrait employer unmélange convenable de sable de silice lavéet/ou de kaolin du commerce, dont lagranulométrie correspond à celle du ou dessédiments d’essai. On devrait mélanger cesingrédients à fond, dans des proportionssemblables à celles que l’on trouve dans le ou

12

les sédiments d’essai. Le mode opératoire dela préparation et les résultats des essais detoxicité en phase solide avec V. fischeriemployant un sédiment témoin négatifartificiel sont présentés dans Ringwood et al.(1997), Tay et al. (1998) et McLeay et al.(2001).

On devrait faire correspondre aussiétroitement que possible le taux de fines duou des échantillons de sédiment témoinnégatif englobés dans l’essai de toxicité et letaux de fines du ou des sédiments d’essai. Si,dans le cadre d’une étude, on soumetconsécutivement à des essais de toxicité unesérie de sédiments renfermant une largegamme de pourcentages de fines, on pourraity englober plus d’un sédiment témoin négatif,dont le taux de fines correspondrait aussiétroitement que possible à l’intervalle trouvédans les sédiments d’essai.

Dans chaque série d’essais de toxicité, onrecommande d’inclure un ou plusieurséchantillons de sédiment témoin positif, pourfaciliter l’interprétation des résultats (§ 6.2).Ce témoin pourrait être un sédimentcontaminé étalon, comme on peut s’enprocurer par le Programme des matériaux deréférence certifiés (PMRC, autrefoisProgramme des étalons d’analyse chimiquemarine) du CNRC, à Ottawa (p. ex. HS-3,Cook et Wells, 1996 ; HS-6, Tay et al.,1998). Ce pourrait aussi être un échantillonde sédiment non contaminé (p. ex. unsédiment témoin négatif artificiel ou unsédiment de référence non contaminé prélevésur le terrain), enrichi, au laboratoire, d’unajout dosé de toxique (EC, 1995b). Unetroisième possibilité serait d’utiliser unéchantillon fortement contaminé de sédimentprélevé sur le terrain, dont on aurait démontréla toxicité pour V. fischeri dans des essais enphase solide ; on évite cette option à moinsde bien connaître d’avance lescaractéristiques de ce sédiment (y compris

son comportement dans un essai en phasesolide employant V. fischeri). On doit utiliserun sédiment témoin positif comme toxique deréférence quand on évalue la sensibilité desorganismes d’essai ainsi que la précision et lafiabilité des résultats obtenus par lelaboratoire pour cette matière de référence(section 5).

4.5 Conditions d’essai

4.5.1 Grandes lignes de l’essaiL’essai de mesure de la toxicitéd’échantillons de sédiment entier, en phasesolide, comprend les étapes et l’appareillagedécrit sommairement dans le § 3.2.2.

Le tableau 1 est la liste de contrôle desconditions exigées ou recommandées pour laméthode de référence. D’autres détailsfigurent dans les § 4.5.2 à 4.5.5.

4.5.2 Manipulations, réglages etcorrections

• On ne doit pas soumettre les sédimentsd’essai, y compris le ou les échantillonsde sédiment de référence dont onrecommande l’inclusion dans chaquesérie d’essais, au tamisage hydraulique.On n’autorise aucune correction de lasalinité de l’eau de porosité 7.

• On ne doit pas ajuster le pH deséchantillons.

• On ne devrait pas aérer les échantillons,les solutions filles ou les filtrats.

• Il ne faut pas ajuster ou corriger leslectures de la bioluminescence

7 La préparation de séries de dilutions (solutionsfilles) au moyen du « diluant en phase solide »(solution de NaCl à 3,5%) [v. § 4.6.4], permet unecorrection osmotique efficace sur les échantillons desédiment marin, estuarien ou d’eau douce.

13

correspondant aux concentrations dessédiments d’essai à l’aide de lecturesrelatives aux concentrations de sédimentsde référence ou d’autres sédiments 8.

• Il faut normaliser, compte tenu del’humidité de l’échantillon, l’effet mesuréstatistique de l’essai (c’est-à-dire laCI 50 ; v. § 6.1).

4.5.3 Température• L’essai emploie la bactérie luminescente

Vibrio fischeri, souche NRRL B-11177,que l’on réactive dans une eau pure et nontoxique et que l’on conserve à5,5 ± 1,0 °C, jusqu’au transvasement desaliquotes dans chaque solution fille.Normalement, on obtient cettetempérature si on insère la cuvetterenfermant la solution bactériennereconstituée dans le puits indiqué duphotomètre (si on utilise le modèle 500 deMicrotox). Sinon, il faut employer unincubateur thermostaté.

• On doit faire incuber toutes les dilutionsde chaque échantillon de sédiment d’essai(y compris le sédiment de référence)inoculées avec les bactéries pendant20 min à 15 ± 0,5 °C. Un bain d’eau ouun local thermostaté ferait l’affaire.

• Après incubation et filtration, on doitgarder à 15 ± 0,5 °C, pendant les 10 minque dure leur stabilisation, tous les filtratsdes dilutions transvasés dans des cuvettes.

Cette température est normalementmaintenue dans les puits du photomètre.On peut aussi maintenir les filtrats danscet intervalle de température en plaçantleurs cuvettes dans un portoir que l’ongarde dans un incubateur ou un localthermostaté.

4.5.4 Durée des manipulations• Les bactéries lyophilisées devraient être

reconstituées immédiatement avant d’êtreinoculées dans les solutions filles. Cettesolution bactérienne devrait être utiliséedans les deux heures suivant lareconstitution et doit l’être dans les troisheures. Le moment de la reconstitutiondevrait être enregistré sur la fiche delaboratoire (voir exemple, annexe F).

• Il faut laisser les solutions filles sestabiliser à 15 ± 0,5 °C pendant au moins10 min avant l’inoculation avec lasolution bactérienne. L’inoculationdevrait se dérouler le plus vite possible :4 min, au plus, pour toutes les dilutionsd’essai. Sur la fiche de laboratoire(annexe F), enregistrer l’heure de lapremière inoculation comme heure dedépart de l’essai.

• On doit laisser toutes les solutions fillesincuber pendant 20 min. Une fois cessolutions filtrées et transvasées dans lescuvettes, les filtrats doivent être mis àincuber dans les cuvettes pendant 10 minavant d’en mesurer la productionlumineuse 9.

• La durée totale du transvasement desfiltrats des cuvettes et la lecture de leurbioluminescence devrait être semblable à

8 Dans un certain nombre d’essais de toxicité dessédiments en phase solide, actuels ou anciens,employant des bactéries luminescentes, on corrigel’effet de la couleur et/ou de la turbidité des sédimentsen ajustant les valeurs de la bioluminescence enfonction de valeurs correspondantes obtenues avec lesédiment de référence (v. annexe E, tableaux 14 et 16).Cela suppose une correspondance étroite, maisproblématique, de ces variables entre les sédimentsd’essai et de référence.

9 Cela vise à stabiliser la température des solutionsfilles et les bactéries luminescentes après leurfiltration, avant la photométrie de la bioluminescence.

14

Installations etéquipement

— photomètre (p. ex. modèle 500 Analyser de Microtoxz) capable de lire l’émissionlumineuse à 490 ± 100 nm ; incubateur pour une seule cuvette renfermant les bactériesreconstituées à 5,5 ± 1 °C ; pour au moins 15 cuvettes, à la température d’essai(15 ± 0,5 °C), dans un incubateur ou dans un local thermostaté.

Solution dereconstitution

— eau pure, non toxique.

Eau témoin ou dedilution (« diluant »)

— solution de NaCl de 3,5%, du commerce (p. ex. de Strategic Diagnostics Inc.) ou préparée àl’aide de la solution de reconstitution.

Température del’essai

— 15 ± 0,5 °C.

pH et salinité del’échantillon

— pas d’ajustement.

Couleur, turbidité — pas de correction.

Aération — aucune nécessaire.

Sous-échantillonspour ladétermination de lateneur en humidité

— 3 de 5,0 ± 0,2 g (précision, ± 0,01 g) séchés à 100 ± 5 °C pendant 24 h.

Solution mère — 7,00 g ± 0,05 de sédiment homogénéisé entier dans 35,0 mL d’eau de dilution, dans unbecher de verre ou de plastique jetable, mélangés pendant 10 min au moyen d’un barreaumagnétique revêtu de téflon, à une vitesse telle que la profondeur du tourbillon est la moitiéde celle du liquide.

Solutions filles(dilutions)

— Maximum normalement de 197 000 mg/L (19,7%, en poids de sédiment humide par rapportau volume), avec, en tout, 12 dilutions à la demie, dans des tubes de polystyrène ; troissolutions témoins (diluant seulement) ; laissées à équilibrer 10 minutes, à la températured’essai.

Espèce — Vibrio fischeri, souche NRRL B-11177, reconstitué par tourbillonnement du flacon, trois ouquatre fois, dont on vide le contenu dans une cuvette de verre jetable, mélangé 10 fois avecle contenu d’une pipette de 0,5 mL et conservé à 5,5 ± 1 °C.

Inoculum — 20 :L dans chaque dilution, mélangés trois fois avec le contenu d’une pipette de 1,5 mL.

Incubation — 20 min à la température d’essai, les colonnes de filtration insérées au sommet des tubesd’EPS, au-dessus de la surface de la solution.

Transvasement dufiltrat

— 500 :L dans des cuvettes de verre jetables, à la température d’essai, puis 10 min de repos.

Observations — insertion des cuvettes dans le puits de lecture, mesure de la luminescence de tous les filtratset témoins.

Effet mesuré — CI50 (mg/L), calculée par le logiciel ou « à la main » ; normalisée compte tenu del’humidité du sédiment (c’est-à-dire ramenée au poids du sédiment sec).

Sédiment deréférence

— devrait faire partie de la série d’essais, en étant soumis aux mêmes modes opératoires quel’échantillon ou les échantillons du sédiment d’essai (contaminé ou susceptible de l’être).

Essai avec toxiquede référence

— effectué moins d’un mois après l’essai de toxicité du sédiment en phase solide avecV. fischeri, en employant un sédiment témoin positif convenable ainsi que les modesopératoires et les conditions exposés dans le présent document, pour mesurer la toxicité dusédiment d’essai.

Tableau 1 Liste de contrôle des conditions expérimentales exigées ou recommandées

15

celle de l’inoculation bactérienne dessolutions filles (# 4 min).

4.5.5 Tableau des dilutions• Les solutions expérimentales

comprennent trois témoins (eau dedilution uniquement) et 12 solutions filles(dilutions).

• La concentration maximale estnormalement de 197 000 mg/L (19,7%,poids de sédiment humide en volume),chaque concentration successive étant lamoitié de la précédente.

4.6 Modes opératoires

La méthode d’essai biologique comportel’incubation simultanée d’au moins troissolutions témoins (constituées d’un inoculumde V. fischeri reconstitué dans le diluant)ainsi que de 12 dilutions différentes de lamatière d’essai dans le diluant 10. Après lapériode prescrite d’incubation, on filtre lessolutions incubées (se trouvant dans les tubesà essai, à une température fixée) et lessolution filles, puis on transvase les filtratsdans les cuvettes. Après une courte périodede stabilisation des conditions de maintiendes filtrats, on mesure par photométrie labioluminescence des organismes subsistantdans le filtrat.

Dans la présente section, les modesopératoires appliqués à un photomètreprésupposent l’emploi du modèle 500 deMicrotox ou d’un photomètre possédant des

caractéristiques semblables. Comme lemodèle 500 possède 30 puits pour conserverles cuvettes renfermant les filtrats desdilutions, le technicien a la possibilité dedédoubler l’essai ou d’effectuer deux essaissimultanément sur des échantillons différents.La description qui suit du mode opératoiresuit le parcours d’un échantillon de sédimentdans ses diverses étapes. Selon le plan del’expérience et la nature ainsi que la sourcedes sédiments d’essai, on devrait aussiinclure dans chaque étude un ou plusieurséchantillons de sédiment de référenceprélevés sur le terrain (v. § 4.1 et 6.1). Lesessais de toxicité comportant un ou plusieurséchantillons de sédiment grossier(c’est-à-dire moins de 20% de fines) doiventcomprendre un sédiment témoin négatif(artificiel ou naturel) ou un sédiment deréférence, dont le taux de fines ne diffère pasde plus de 30% du taux se trouvant dans le oules sédiments d’essai (v. § 6.2). Onrecommande aussi l’inclusion d’un sédimenttémoin positif (§ 4.4) dans chaque séried’essais de toxicité. Pour englober un ouplusieurs échantillons de sédiment d’essai enmême temps qu’un sédiment de référence, unsédiment témoin négatif et/ou sédimenttémoin positif dans une seule étude, il estnécessaire de passer chaque échantillon l’unaprès l’autre.

4.6.1 Photomètre, bain d’eau et fiche delaboratoire

• Mettre l’ordinateur, le photomètre et labalance sous tension.

• Dans le cas du modèle 500 de Microtox,s’assurer que la commande de latempérature derrière l’appareil est régléeà « Microtox Acute ».

• Insérer 15 cuvettes dans les troispremières rangées (A à C) de puits.Ceux-ci seront maintenus à 15 ± 0,5 °C.Les puits d’incubation sont disposés selon

10 Le modèle 500 possède 30 puits pour l’incubationdes cuvettes à 15 ± 0,1 °C. Ce photomètre ou unphotomètre thermostaté équivalent, à au moins30 puits d’incubation, permet de passer simultanémentdeux échantillons. McLeay et al. (2001) préconisent cemode opératoire, plus efficace, selon eux, pouranalyser des échantillons multiples et économiser leplus de réactif bactérien.

16

une matrice de rangées étiquetées A à Cet de colonnes numérotées 1 à 5. On lesdésigne A1 à C5.

• Insérer une cuvette dans le puits de réactifet y transvaser à la pipette 1,0 mL desolution de reconstitution. Cette solutionsera maintenue à 5,5 ± 1 °C.

• Mettre sous tension l’incubateur du baind’eau. Laisser la température de l’eau sestabiliser à 15 ± 0,5 °C.

• Brasser l’échantillon pourl’homogénéiser, à la cuillère d’acierinoxydable.

• Remplir la fiche de laboratoire (v. § 7.2.7et l’annexe F). Placer 15 tubes d’EPS(v. annexe E, tableau 5) dans un portoir.

4.6.2 Sous-échantillons pour ladétermination de l’humidité

• Pour chaque sédiment d’essai, étiqueter etpeser trois flacons vides (p. ex. flacons deverre pour spectrométrie de scintillation,de 20 mL, ou autres récipients convenantau séchage et à la pesée) et en noter lespoids à 0,01 g près. Saisir les données, sion emploie une feuille de calcul pourconvertir la CI50 en une valeur basée surle poids du sédiment sec (§ 6.1).

• Ajouter 5,0 ± 0,2 g de sédiment auxflacons et noter les poids à 0,01 g près (oules saisir dans la feuille de calcul).

• Faire sécher les sous-échantillons enportant les flacons dans une étuve à100 ± 5 °C pendant 24 h. Noter latempérature de l’étuve.

• Noter les poids secs à 0,01 g près.

4.6.3 Solution mère• Peser 7,00 ± 0,05 g d’échantillon

homogénéisé dans un becher de verre oude plastique jetable de 50 mL.

• Ajouter une tige magnétique revêtue detéflon de 2,5 cm et 35,0 mL de « diluanten phase solide » au becher.

• Agiter 10 min sur un agitateurmagnétique, à une vitesse suffisante pourcréer un tourbillon dont la profondeuratteint la moitié de celle du liquide.

4.6.4 Solutions filles• Verser 1,50 mL de « diluant en phase

solide » (section 3) dans les 14 premierstubes sur le portoir (§ 4.6.1). Le tube 15renfermera la concentration maximale,provenant de la solution mère.

• À la fin des 10 min d’agitation de lasolution mère, utiliser l’extrémité d’unemacropipette à cône de grand calibre pourtransvaser 1,50 mL de suspension dubecher de 50 mL, dont on continued’agiter le contenu, vers chacun des tubesd’EPS nos 15 et 14. À cette fin, insérerplonger l’extrémité de la pipette près dela paroi du becher à environ la moitié dela profondeur de l’échantillon en traind’être agité. Éviter de colmaterl’extrémité tout en aspirant l’échantillon.

• En commençant par le tube d’EPS 14,dans lequel se trouvent 3,00 mL desolution, effectuer une série de dilutions àla 1/2 comme suit : mélanger le contenutrois fois avec la macropipette, puisprélever rapidement 1,50 mL à environ untiers de la profondeur (pour aider àprélever une partie des sables lourds).Transvaser cette aliquote dans le tube 13.Répéter l’opération de mélange et detransvasement du tube 13 au tube 12, puispoursuivre, à la suite, du 12 au 11, etc.jusqu’au transvasement de 1,5 mL d’unedilution à la 1/2 dans le tube 4. Enfin,mettre au rebut 1,5 mL du tube 4. Lestubes 1 à 3 ne renferment que du diluantet servent de témoins.

17

• Placer le portoir et ses tubes d’EPSrenfermant toutes les solutions (dilutions)filles (y compris les témoins) dans le baind’eau, à 15 ± 0.5 °C. Les laisser 10 minpour permettre à la température des’équilibrer. Le niveau de l’eau dans lebain devrait se situer juste au-dessus duniveau du liquide dans les tubes d’EPS.

4.6.5 Reconstitution du réactif bactérien• Prendre un flacon de bactéries

lyophilisées (Microtox Acute Reagent) enentreposage.

• L’ouvrir et en reconstituer le contenu, enversant rapidement de la solution dereconstitution de la cuvette se trouvantdans le puits de réactif du modèle 500 deMicrotox (ou d’un autre photomètre) dansle flacon, en en faisant tourbillonner lecontenu trois fois et en versant lesbactéries réhydratées dans la mêmecuvette.

• Remettre la cuvette dans le puits deréactif.

• À l’aide d’une pipette de 500 :L, aspirertout le réactif bactérien reconstitué duflacon, l’ajouter à la cuvette et mélanger10 fois à l’aide de la même pipette et dumême cône de pipette.

• Noter le numéro de lot du réactif, la datede péremption et l’heure de lareconstitution sur la fiche de laboratoire(v. § 7.2.7 et annexe F).

4.6.6 Inoculation et incubation• Préparer les trois pipettes suivantes :

a) une pipette automatique (telle que lapipette Eppendorf ou Oxford Nichiryo),dotée d’une seringue de 0,5 mL decapacité à cône « ultramicro » ; b) unemacropipette (p. ex. Oxford, de 1 à5 mL) ; c) une pipette de 500 :L.

• Après équilibrage de la températurependant 10 min des tubes d’EPSrenfermant les solutions filles (§ 4.6.4),régler un chronomètre à 20 min, maissans le mettre en marche.

• S’assurer que la pipette automatique estréglée pour distribuer 20 :L par éjection.Placer le cône sous la surface de bactériesreconstituées (réactif bactérienreconstitué) et aspirer suffisamment deréactif pour au moins 18 éjections.

• En maintenant le cône au-dessus duréactif et contre la paroi de la cuvette,effectuer deux éjections. Essuyersoigneusement le cône avec une serviettede papier propre (p. ex. KimWipez)après avoir aspiré le réactif. Plongerensuite le cône dans un tube ou un becher renfermant du « diluant en phase solide »et effectuer une autre éjection (pour rincerl’extérieur du cône). Rejeter le contenu dece tube ou de ce becher.

• Mettre en marche la minuterie réglée à20 min, noter l’heure (ce sera l’heure dedémarrage de l’essai) sur la fiche delaboratoire, puis éjecter immédiatement20 :L de réactif dans chacun destubes d’EPS, en débutant par le tube 1(première solution témoin) et poursuivre,à la suite, jusqu’au tube 15 inclusivement.En appuyant le collier du cône« ultramicro » sur le rebord supérieur dechaque tube, on fait en sorte que le cônese trouve à la surface de l’échantillon etnon au fond du tube.

• Enlever et mettre au rebut le cône« ultramicro ». Éjecter ce qui reste deréactif de la seringue dans la cuvetted’attente du puits de réactif.

• Si on est censé effectuer un second essai(c’est-à-dire soit avec un deuxièmeéchantillon, soit un essai en double avec

18

le même échantillon), en même temps,dans les 15 puits restants du photomètre,fixer de nouveau un cône propre à laseringue, remplir cette dernière de réactif,puis inoculer la série suivante desolutions filles. Ce second essai(parallèle) peut être effectué avec soit unautre échantillon de sédiment d’essai(effectivement ou peut-être contaminé),de sédiment de référence, de sédiment témoin négatif ou de sédiment témoinpositif.

• Avec la macropipette réglée à 1,5 mL,mélanger le contenu de chaque tube deuxfois, en commençant par le tube 1(premier témoin) et en passantconsécutivement aux tubes suivantsjusqu’au tube 15, inclusivement.

• Insérer une colonne de filtration (v. note5, § 3.2.3) sur chaque tube, son extrémitéinférieure étant positionnée à environ1 cm au-dessus de la surface du liquide.Ne pas mouiller le filtre, ce qui pourraitnuire à la filtration de l’échantillon.

4.6.7 Préparation de l’ordinateur• Préparer l’ordinateur à la réception des

données du photomètre.

• Faire démarrer le progiciel et les menuspour l’essai en phase solide.

• Suivre les consignes à l’écran.

• Consulter le guide de l’utilisateur pourobtenir des renseignementscomplémentaires.

• Le logiciel pourrait demander la saisie dunombre de témoins (3), du nombre dedilutions (12), de la concentration initiale(197 000 mg/L), du coefficient de dilution(2) et de la durée de l’essai (30 min).

4.6.8 Filtration• Au son de la minuterie réglée à 20 min,

donner au logiciel les réponsesconvenables.

• Remettre la minuterie à 10 min et ladéclencher. Avec le logiciel de StrategicDiagnostics Inc. (Omniz Version 1.18ou l’équivalent), le démarrage estautomatique. Sinon, programmer lelogiciel pour qu’il fasse démarrer cettepériode de 10 min automatiquement, parl’action d’une touche sur le clavier.

• Pousser doucement le filtre dans le tube 1(premier témoin) vers le bas,suffisamment loin pour obtenirlégèrement plus de 500 :L de filtrat dansle tube. Puis, en utilisant la pipette de500 :L, transvaser 500 :L de filtrat dansla cuvette se trouvant dans le puits A1 duphotomètre.

• Répéter cette étape pour les 15 tubes, àl’aide du même cône de pipette, enterminant avec 500 :L de filtrattransférés du tube 15 à la cuvette C5.

• Prendre note du temps exigé pourterminer tous les transvasements.

• Souvent, quand on manipule dessédiments riches en fines, le filtre de lasolution fille la plus concentrée (tube 15)se colmate. Obtenir ce qui peut êtrerécupéré et le transvaser dans la cuvettedésignée (C5). Habituellement, laluminescence de ces échantillons auradiminué à zéro avant la lecture de laconcentration maximale. Signaler ce typede problème sur la fiche de laboratoire(v. § 7.2.7 et annexe F).

• À la fin de tous les transvasements,répondre à l’ordinateur, s’il y a lieu.Habituellement, cela nécessitera laphotométrie de la luminescence (§ 4.8),

19

ce qui prendra à peu près le même tempsqu’il a fallu pour la filtration et letransvasement des filtrats vers lescuvettes.

• Les données sont souvent envoyées duphotomètre à l’ordinateur, étant reçuespar le logiciel qui construit un fichier dedonnées.

4.7 Mesures et observations

Consulter le § 4.3 pour connaître lesexigences et les recommandations concernantla caractérisation des échantillons (p. ex.mesures de la granulométrie et d’autrescaractéristiques physicochimiques de lamatière d’essai).

Le mode opératoire de la mesure de laluminescence bactérienne dans les solutionsfilles varie selon le photomètre et le logicielutilisés. Dans le cas du modèle 500 deMicrotox, placer le premier témoin(cuvette A1) dans le puits de lecture, puisappuyer sur le bouton de réglage « set ».L’instrument abaisse la cuvette dans le puits(parfois 2 ou 3 fois) pour régler la lecture dezéro (obscurité) et du témoin à environ 95 et,de la sorte, établir la gamme convenable desensibilité pour les mesures photométriques.Quand le voyant vert s’allume, appuyer sur lebouton de lecture « read ». Lire la cuvette,puis la retirer du puits de lecture et la

remettre dans le bloc d’incubation. Si leprogiciel n’enregistre pas les donnéesphotométriques, les noter sur la fiche delaboratoire. Faire la lecture etl’enregistrement de la luminescence de toutesles cuvettes, en prenant à peu près le mêmetemps par cuvette qu’il en a fallu pour lafiltration et le transvasement (v. § 4.6.8).Avec le logiciel de Strategic Diagnostics Inc.(Omniz Version 1.18 ou l’équivalent), leminutage est effectué par l’ordinateur, et unsignal indique le moment où on devrait lirechaque cuvette.

Si un problème survient, consulter les guidesde l’utilisateur du photomètre et du logicielutilisés.

4.8 Critère de validité de l’essai

Le critère suivant décide de la validité del’essai de toxicité du sédiment effectué àl’aide de la présente méthode de référence 11 :

Le coefficient de variationreprésentant la lecture photométriquemoyenne des filtrats des troissolutions témoins faisant partie del’essai doit être inférieur ou égal à12%.

11 Ce critère s’inspire d’ASTM (1995) [v. annexe E,tableau 17).

20

Section 5

Essai d’un toxique de référence

L’emploi systématique d’un toxique deréférence est nécessaire pour évaluer, dansdes conditions normalisées, la sensibilitérelative des bactéries après reconstitution,l’exactitude des techniques de dilution etd’autres facteurs influant sur la précision et lafiabilité des données produites par lepersonnel de laboratoire employant laméthode de référence en phase solide (EC,1992). Le ou les toxiques de référencedoivent être testés au moins une fois par moisau cours des périodes où l’on exécute desessais de toxicité des sédiments en phasesolide à l’aide de V. fischeri et au début de lapremière utilisation d’un nouveau lot ou d’unnouvel envoi de réactif bactérien.

Il faut utiliser comme toxique(s) de référencepour cette méthode de référence un ouplusieurs échantillons de sédiment témoinpositif (v. § 4.4). Lorsque l’on effectuechaque essai de toxicité de référence, il fautsuivre les modes opératoires et respecter lesconditions d’essai définies dans les § 4.5 et4.6.

Pour effectuer un essai de toxicité deréférence conformément aux modesopératoires et aux conditions précisées dansla présente méthode, il est recommandéd’utiliser un sédiment contaminé étalon telque la matière de référence de port marin duCNRC (Harbour Marine Reference Material,p. ex. HS-5 ou HS-6), que l’on peut seprocurer auprès du CNRC 12. On peut aussiutiliser comme toxique de référence un

sédiment témoin enrichi après normalisationdes modes opératoires convenables pourl’enrichissement. À cet égard, il faudraitconsulter le guide d’Environnement Canadasur l’emploi d’un sédiment témoin enrichid’un toxique de référence (EC, 1995b).

Pour les besoins de l’essai de toxicité deréférence, on devrait choisir une série deconcentrations qui, d’après des essaispréliminaires ou des essais antérieurs réalisésdans les mêmes conditions et avec les mêmesmodes opératoires, permettront de calculerune CI50 pour la luminescence de V. fischeri(v. § 6.1), avec des limites de confiance à95% d’une étroitesse acceptable. Lesconcentrations choisies devraient encadrer laCI50 prédite.

Il revient au personnel de laboratoire demontrer qu’il est capable d’obtenir desrésultats constants, précis, avec le toxique deréférence avant d’effectuer des essaisdéfinitifs sur les sédiments à l’aide de laprésente méthode de référence. À cette fin, ildevrait d’abord déterminer la précisionintralaboratoire, exprimée sous forme depourcentage par un coefficient de variation(CV), en effectuant au moins cinq essais detoxicité de référence avec différents lots deréactif bactérien (§ 2.1), en utilisant le mêmetoxique de référence et les modes opératoireset conditions définis dans le présentdocument. Cet essai devrait servir à acquérirl’expérience du mode opératoire et servir depoint de comparaison pour les essaisultérieurs (EC, 1998). Tout en l’appliquantsystématiquement à chaque lot de réactifbactérien, le personnel ne devrait pass’écarter du mode opératoire. Dès que l’onpossède des données suffisantes (EC, 1995b),il faut porter les CI50 successives

12 Conseil national de recherches du Canada,Programme d’étalons de chimie analytique marine,Institut des biosciences marines, 1411, rue Oxford,Halifax, NS ; tél. : 902-426-8280 ; téléc. :902-426-9413 ; courriel : crm.imb@nrc.ca.

21

déterminées grâce à ces essais sur une cartede contrôle propre à chaque toxique etdéterminer graphiquement si les résultats sesituent à moins de ± 2 écarts-types desvaleurs obtenues dans les essais antérieursemployant le même toxique de référence et lemême mode opératoire. Il faut construire puisactualiser une carte de contrôle pour chaquetoxique de référence utilisé avec la présenteméthode de référence. La carte de contrôledevrait montrer le logarithme de laconcentration, sur l’axe vertical, en fonctionde la date de l’essai ou du numéro de l’essai,sur l’axe horizontal. Chaque nouvelle CI50correspondant au toxique de référence doitêtre comparée aux limites établies de lacarte ; la CI50 est acceptable si elle se situedans la zone de confiance. Tous les calculs dela moyenne et de l’écart-type devraientemployer le logarithme de la CI50 (log CI50).

Tous les calculs de la moyenne et del’écart-type et tous les graphiques devraientemployer le logarithme de la concentration (ycompris de la CI50). On adhère ainsisimplement à l’hypothèse selon laquellechaque CI50 a été estimée à partir delogarithmes de concentrations. On peutconstruire la carte de contrôle par report desvaleurs logarithmiques de la moyenne(�) ± 2 écarts-types (F) sur papierarithmétique ou par conversion de ces valeursen valeurs arithmétiques et report de cesdernières sur l’échelle logarithmique depapier semi-logarithmique. Si la distributiondes CI50 se trouvait à ne pas êtrelog-normale, la moyenne et l’écart-typearithmétiques pourraient se révéler plusconvenables. On devrait recalculer lamoyenne des log (CI50) obtenues ainsi queles limites supérieures et inférieures de lazone de confiance (± 2 F) à chaque CI50successive jusqu’à ce que les statistiques se

stabilisent (EC, 1995b ; 2002b).

Si une CI50 particulière tombe à l’extérieurde la zone de confiance, on devraits’interroger sur la sensibilité des organismesainsi que sur la réalisation et la précision del’essai. Comme elle risque de survenir 5% dutemps, du seul fait du hasard, une CI50aberrante ne traduit pas nécessairement unesensibilité anormale du lot de réactifbactérien ou une précision insatisfaisante desdonnées toxicologiques. Ce serait plutôt unavertissement qu’il pourrait y avoir unproblème. On devrait vérifier en profondeurtoutes les conditions et tous les modesopératoires de l’essai. Selon les conclusionsauxquelles on arriverait, il pourrait êtrenécessaire de répéter l’essai de toxicité deréférence ou d’obtenir un nouveau lot duréactif bactérien pour évaluer la toxicité deséchantillons de la matière d’essai (en mêmetemps qu’on effectuerait un nouvel essai detoxicité de référence avec le nouveau lotd’organismes).

Les résultats cantonnés à l’intérieur deslimites de confiance ne signifieraient pasnécessairement que les résultats dulaboratoire sont cohérents. La grandevariabilité des données relatives à un toxiquede référence se traduirait par l’élargissementde la zone de confiance ; une nouvelledonnée pourrait se trouver à l’intérieur decette zone tout en représentant un écartindésirable. Environnement Canada (1995b)propose comme limite raisonnable uncoefficient de variation de pas plus de 30%,de préférence de 20% ou moins. Pour laprésente méthode de référence, le coefficientde variation des moyennes des résultats desessais de toxicité de référence effectués dansun laboratoire d’essai ne devrait pas excéder30%.

22

Section 6

Analyse et interprétation des données

6.1 Analyse des données

Il faut calculer la moyenne et l’écart-type deslectures de la bioluminescence des solutionstémoins utilisés dans l’étude (v. § 4.6.4, 4.7et 4.8). Ces valeurs servent à calculer lecoefficient de variation de la moyenne deslectures faites sur les solutions témoins. Cecoefficient sert de critère à la présenteméthode pour juger de la validité desrésultats expérimentaux (§ 4.8).

Une étude effectuée selon la présenteméthode de référence devrait englober aumoins un échantillon du sédiment d’essai(effectivement ou potentiellement contaminé)ainsi qu’au moins un échantillon de sédimentde référence. En outre, on recommandel’inclusion d’au moins un échantillon desédiment témoin positif (v. § 4.4 et section 5).Les essais employant au moins un échantillonde sédiment grossier (c’est-à-dire renfermantmoins de 20% de fines) doivent aussienglober au moins un échantillon de sédimenttémoin négatif (artificiel ou naturel) ou desédiment de référence non contaminé, dont lateneur en fines ne diffère pas de plus de 30%de celle que l’on trouve dans ce sédimentgrossier (v. § 6.2). Dans chaque cas, leparamètre statistique à calculer pour chacunede ces matières d’essai, est la CIp.

Sauf indication du contraire, dans lerèglement ou à dessein, l’effet ou paramètremesuré est, dans la présente méthode deréférence, la concentration inhibant de moitiéla bioluminescence, c’est-à-dire la CI50. Lescalculs pour estimer cette CI50 et ses limitesde confiance de 95% font partie des versionsles plus récentes (à partir de 1999) desprogiciels Omniz (version 1.18 oul’équivalent) auparavant commercialisés par

AZUR Environmental Ltd., maintenant parStrategic Diagnostics Inc. (coordonnées dansle § 2.2) 13. On trouve aussi des orientationspour estimer la CI50 (ainsi que ses limites deconfiance à 95 %) dans EnvironnementCanada (1992). Il existe d’autres progicielsde statistique permettant ce calcul (EC,1997b ; 1997c ; 2002b).

Si l’on ne possède ni ordinateur ni logicielconvenable, on peut calculer la CI 50 à l’aidede l’une des deux équations et approchessuivantes.

Pour chaque solution fille, on calcule gamma(') [ASTM, 1995], comme suit :

'''' = (It/Ie) !!!! 1

où : It = la valeur moyenne des lectures desfiltrats des solutions témoins ;

Ie = la lecture photométrique d’un filtratd’une solution fille (e = essai)particulière.

Sur un graphique, on reporte à la main lesvaleurs gamma de chaque filtrat situées entre0,02 et 200, et on relie ces points par unecourbe ajustée à l’œil. On interprète la CI50comme la concentration correspondant au

13 En 1999, AZUR a lancé un logiciel d’exploitationappelé «Microtox Omni », comprenant le calculateur« AutoCalc ». Il faut prendre l’option « AutoCalc On »dans l’application du logiciel, sous peine d’obtenir desrésultats erronés. AutoCalc ne choisit que les donnéesentourant les CI50 possédant un ' se situant dansl’intervalle de 0,02 à 200. Il examine, en employantces données, toutes les séries contiguës, par analyse derégression par convergence itérative, afin dedéterminer les limites de la zone la plus étroite deconfiance.

23

gamma de 1,0. On devrait vérifier les pointsreportés à la main à l’aide des lecturesobservées, pour éliminer les erreurs de saisieou les anomalies d’estimation de la CI50. Ondevrait aussi vérifier le graphique tracé à lamain et la CI50 estimée graphiquement aumoyen d’un graphique tracé par ordinateur etle calcul informatique de la CI50 (EC, 1992).

On peut aussi calculer la régression linéairede log C (concentration, sur l’axe desordonnées) en fonction de log ' (sur l’axedes abscisses) conformément à la formule del’ASTM (1995) :

log '''' = b (log C) + log (a)

où b est la pente, tandis que log (a) est lepoint où la droite de régression coupe l’axedes ordonnées (axe des y) à log ' = 0,correspondant à ' = 1. En conséquence, acorrespondant à 10 log (a) est la CI50.

La CI50 et ses limites de confiance doiventêtre converties et exprimées en milligrammesde sédiment sec par litre (mg/L). À cette fin,on utilise les données relatives au « poidssec » (v. § 4.6.2) [ASTM, 1995]. Onmultiplie la CI50 (et les limites supérieures etinférieures de confiance) du sédiment humidepar la moyenne des rapports de la massesèche à la masse humide dessous-échantillons :

CI50 = CI50h × [(S1s /S1h) + (S2s /S2h) +(S3s /S3h)]/3

où : CI50h est la CI50 calculée (ou seslimites de confiance à 95%) del’échantillon de sédiment humide ;

S1s à S3s sont les poids secs dessous-échantillons de sédiment du§ 4.6.2 ;

S1h à S3h sont les poids humidescorrespondants.

On peut accélérer ces calculs en saisissant lesmasses et les CI50 dans une feuille de calculet en employant les formules nécessaires.

Pour obtenir des orientations détaillées sur leseffets statistiques convenables à mesurer etleur calcul, on devrait consulterEnvironnement Canada (2002b). Lesobjectifs de l’analyse des données sont lessuivants : quantifier les effets du contaminantsur les organismes exposés à diverséchantillons de sédiment d’essai(effectivement ou potentiellementcontaminé) ; déterminer si ces effets sontstatistiquement différents de ceux qui semanifestent dans un sédiment de référence ;prendre une décision relativement à latoxicité de l’échantillon (§ 6.2). On calculd’abord la CIp (normalement la CI50) pourchacun des échantillons (y compris ceux quireprésentent le sédiment de référence prélevésur le terrain).

Selon le plan d’expérience et les objectifs del’étude, on devrait prélever et tester unnombre convenable (typiquement au moinscinq par station, à chaque profondeur àlaquelle on s’intéresse) d’échantillonsréitérés de sédiments d’essai et de référenceprélevés sur le terrain (v. § 4.1). Chaque séried’essais de toxicité doit comprendre au moinstrois répétitions de solutions témoins (v. § 4.6et 4.8), et au moins un sédiment d’essai. Lesédiment d’essai pourrait être représenté pardes échantillons réitérés de déblais dedragage provenant d’une profondeur ou d’unestation donnée (station d’échantillonnage) àlaquelle on s’intéresse, ou des échantillonsréitérés de sédiment prélevés sur le terrain,dans une station donnée, située dans un lieud’immersion en mer ou contiguë. Lesédiment d’essai pourrait aussi être représentépar au moins un sous-échantillon (c’est-à-dire

24

des répétitions de laboratoire) d’unéchantillon unique (non réitéré) de sédimentprovenant d’une station d’échantillonnagedonnée ou d’une profondeur particulière d’unemplacement donné (v. § 4.1). On devraitutiliser le même nombre de répétitions pourchaque variante (chaque sédiment d’essaiprovenant d’une profondeur donnée dans unestation particulière d’échantillonnage) et dechaque échantillon, dans l’essai, chaque foisque c’est possible, pour maximiser lapuissance et la robustesse statistiques (EC,2002b).

6.2 Interprétation des résultats

L’interprétation des résultats ne relève pasnécessairement du seul personnel dulaboratoire entreprenant l’essai. Ce pourraitêtre une tâche partagée avec, notamment, unconsultant en environnement ou d’autrespersonnes compétentes, chargées de l’examenet de l’interprétation des constatations.

Environnement Canada (1999b) donne desconseils utiles pour l’interprétation etl’application des résultats des essais detoxicité employant des échantillons prélevésdans l’environnement. C’est un document àconsulter. Au départ, le chercheur devraitexaminer les résultats et déterminer s’ils sontvalides. Ils doivent satisfaire au critère devalidité de l’essai (v. § 4.8). En outre, il estrecommandé d’examiner la courbe de larelation entre la dose et la réponse de chaqueéchantillon du sédiment d’essai, afin deconfirmer que la bioluminescence est à peuprès directement proportionnelle à la dilution.Sinon (p. ex. si une ou plusieurs donnéessemblent aberrantes par rapport aux autres),on devrait envisager de répéter l’essai pourcet échantillon.

On devrait tenir compte des constatationsdécoulant de l’essai de toxicité de référenceréalisé avec le même lot de réactif bactérien

que celui de l’essai de toxicité du sédiment(v. section 5) pour l’interprétation de l’étude.Ces résultats, lorsqu’on les compare auxrésultats antérieurs du laboratoire avec lemême toxique de référence et le même modeopératoire (c’est-à-dire à la carte de contrôledu laboratoire établie pour cet essai detoxicité de référence), donneront une idée dela sensibilité des organismes d’essai de mêmeque de la précision et des performances dulaboratoire dans la réalisation d’un essai detoxicité de référence avec V. fischeri.

On devrait prendre en considération toutes lesdonnées représentant les caractéristiquesphysicochimiques connues de chaqueéchantillon de la matière d’essai (y comprisde tout échantillon de sédiment de référenceou de sédiment témoin négatif englobé dansl’étude) dans l’interprétation des résultats. Ondevrait comparer les données de l’analyse dusédiment entier et de l’eau de porosité(v. § 4.3) à l’influence connue de cesvariables sur la production lumineuse deV. fischeri.

Dans les échantillons de déblais de dragageou de sédiment prélevés sur le terrain, lesconcentrations d’ammoniaque et/ou desulfure d’hydrogène dans l’eau de porositépeuvent être élevées. Ce pourrait êtreattribuable à un apport organique d’originenaturelle, anthropique ou les deux. On devraittenir compte de l’effet inhibiteur connu del’ammoniaque (v., par exemple, Tay et al.,1998 et McLeay et al., 2001) et du sulfured’hydrogène (Brouwer et Murphy, 1995 ; Tayet al., 1998) sur la bioluminescence deV. fischeri, de même que des concentrationsmesurées de ces composés dans l’eau deporosité des échantillons d’essai, lorsque l’onexamine et interprète les résultats obtenus surdes échantillons de sédiments d’essai et deréférence prélevés sur le terrain.

Dans l’examen et l’interprétation desrésultats des essais, on devrait prendre en

25

considération les observations de filtratstroubles ou fortement colorés que l’on auraanalysés pour déterminer la bioluminescenceV. fischeri (v. § 4.8).

Outre la toxicité, un certain nombre devariables peuvent gêner les résultats de laphotométrie de la bioluminescence deV. fischeri survivant dans le filtrat de chaquesolution fille et d’ainsi confondrel’interprétation des résultats. Les personnesemployant cette méthode de référence, etcelles qui en interprètent les résultatsdevraient être sensibles à ces facteurs deconfusion et à leurs conséquences avant dedécider si les matières d’essai sont toxiquesou non. Les variables qui peuvent gêner laluminescence de V. fischeri dans les filtratssont notamment (ASTM, 1995 ; Ringwoodet al., 1997 ; Tay et al., 1998) :

• la sorption de V. fischeri aux particules desédiment (plus particulièrement auxparticules fines) retenues par le filtre, quiréduit le passage de ces bactériesluminescentes dans le filtrat ;

• la sorption de V. fischeri sur le filtre, quiréduit de même le passage des bactériesdans le filtrat ;

• l’interférence optique du filtrat, en raisonde sa couleur (absorption lumineuse)et/ou de sa turbidité (dispersionlumineuse) ;

• le ralentissement du métabolisme deV. fischeri passé et survivant dans lefiltrat, en raison de la toxicité et/ou dustress dû aux manipulations et du stressmécanique.

La taille des grains des sédiments peut être unfacteur de confusion important, puisqu’unpourcentage croissant d’argile dans la matièred’essai s’est révélé causer une diminutionproportionnelle des CI50 pour V. fischerirécupéré dans des filtrats de sédiment non

contaminé. Dans un essai en phase solideemployant V. fischeri, les échantillons desédiment non contaminé, constituésprincipalement de sables, (p. ex. 0–5% defines) ont donné de façon caractéristique uneCI50 de 28 000, à moins de 100 000 mg/L(Cook et Wells, 1996 ; Ringwood et al.,1997 ; Tay et al., 1998). Les CI50 présententune chute brusque (Benton et al., 1995 ;Ringwood et al., 1997) lorsque lepourcentage de fines dans le sédiment noncontaminé passe de 5 à environ 20%, alorsque la CI50 pourrait varier de, disons, 5000 à15 000 mg/L, selon la nature des fines (p. ex.pourcentage d’argiles et de limons)[Ringwood et al., 1997 ; Tay et al., 1998 ;McLeay et al., 2001]. Des taux supérieurs defines dans le sédiment non contaminé setraduisent typiquement par une stabilisationde la baisse des CI50 associées àl’augmentation du taux de fines. Les essais enphase solide avec V. fischeri en présence de100 % de kaolin se seraient traduits par desCI50 variant de 1373 à 2450 mg/L(Ringwood et al., 1997 ; Tay et al., 1998).Dans une étude interlaboratoires visant àvalider cette méthode de référence, les CI50obtenues par un échantillon de kaolin à 100%ont varié de 1765 à 2450 mg/L (McLeayet al., 2001). Ensemble, ces conclusionsappuient les nouvelles lignes directricesprovisoires, exposées plus loin, pour décidersi les échantillons sont toxiques ou non,conformément à l’essai en phase solideemployant V. fischeri. Ces nouvelles lignesdirectrices tiennent compte : du taux de finesdans le sédiment d’essai ; de la brusqueinflexion des valeurs lorsque la teneur enfines du sédiment d’essai atteint ou excède20% (Ringwood et al., 1997) ; de la capacitéd’une prise d’essai constituée à 100%d’argile d’abaisser la CI50 à 1765 mg/L, àpeine, d’après la présente méthode deréférence (McLeay et al., 2001).

Dans les alinéas qui suivent, il sera questionde deux lignes directrices provisoires pour

26

décider de la toxicité des échantillons dans unsédiment d’essai, d’après la présente méthodede référence. La première, qui a étérecommandée et appliquée parEnvironnement Canada (EC, 1996b ;Porebski et Osborne, 1998), se fonde sur laprémisse selon laquelle tous les échantillonssont toxiques selon la présente méthoded’essai biologique si leur CI50 est inférieureà 1000 mg/L, quelle que soit lagranulométrie. La seconde se fonde sur laprémisse selon laquelle les échantillons dontle taux de fines est inférieur à 20% pourraientêtre toxiques à une CI50 d’au moins1000 mg/L, vu que les facteurs de confusionde la granulométrie sont sensiblementdiminués dans un sédiment grossier.

La première ligne directrice devraits’appliquer à tous les échantillons desédiment d’essai dont le taux de fines est d’aumoins 20%, de même qu’à tout échantillonrenfermant moins de 20% de fines et donnantune CI50 de moins de 1000 mg/L. Laseconde devrait s’appliquer à tous leséchantillons de sédiment d’essai ayant untaux de fines de moins de 20%, dont la CI50est d’au moins 1000 mg/L. Si l’on appliquecette seconde ligne directrice provisoire auxéchantillons de sédiment ayant un taux defines inférieur à 20% et une CI50 d’au moins1000 mg/L, on peut reconnaître commetoxiques les sédiments grossiers lorsque leurCI50 est sensiblement supérieure à1000 mg/L. Il est recommandé d’appliquer laseconde ligne directrice à chaque échantillonde sédiment d’essai dont le taux de fines estinférieur à 20%, sauf si la CI50 est inférieureà 1000 mg/L, auquel cas l’échantillon devraitêtre considéré comme toxique, et la secondeligne directrice ne s’applique pas.

Ligne directrice 1Le sédiment d’essai prélevé dans unestation et à une profondeur données estconsidéré comme toxique si, quelle que

soit sa granulométrie, sa CI50 estinférieure à 1000 mg/L.

Ligne directrice 2Le sédiment d’essai prélevé dans unestation et à une profondeur données, dontle taux de fines est de moins de 20% et dontla CI50 est d’au moins 1000 mg/L, doit êtrecomparé, quant à sa CI50, à un échantillonde sédiment de référence non contaminé oude sédiment témoin négatif (artificiel ounaturel) dont le taux de fines ne diffère pasde plus de 30% du sien 14. D’après cettecomparaison, il est toxique si, et seulementsi, il remplit les deux conditions suivantes :

(1) sa CI50 est inférieure à la moitié decelle de l’échantillon du sédiment deréférence ou du sédiment témoinnégatif 15 ;

14 Voici deux exemples pour montrer comment doits’appliquer ce critère obligatoire lorsque l’on choisitun sédiment témoin négatif ou un sédiment deréférence dont le taux de fines ne s’écarte pas de plusde 30 % de celui du sédiment d’essai : si le taux defines du sédiment d’essai est de 10%, il doit, dans lesédiment de référence ou le sédiment témoin négatif,varier dans la fourchette de 7 à 13% ; de même, s’il estde 5% dans le sédiment d’essai, sa fourchette dans lesédiment de référence ou le sédiment témoin négatifdoit varier entre 3,5 et 6,5%.

15 Ce critère découle des constatations faites à lafaveur de deux séries d’études interlaboratoireseffectuées pour valider la présente méthode deréférence (McLeay et al., 2001). Dans une séried’essais avec quatre sous-échantillons identiques d’unsédiment contaminé, testés au cours d’essais séparéspar chacun des six laboratoires participants, la CI50minimale d’un laboratoire était inférieure de 14 à 48%(écart moyen interlaboratoires, 31% ; n = 6) à la CI50maximale. Vu la grande variabilité intralaboratoire desCI50 du même sédiment d’essai, on juge prudent deposer, comme un des critères de toxicité d’unéchantillon de sédiment grossier, que sa CI50, si elleest d’au moins 1 000 mg/L, soit inférieure de plus de50% à celle du sédiment témoin négatif ou dusédiment de référence de comparaison.

27

(2) sa CI50 et celle du sédiment deréférence ou du sédiment témoinnégatif diffèrent sensiblement.

Pour ce qui concerne la ligne directrice 2 et laprésente méthode de référence, « fines »s’entend de particules (de sédiments) qui ontau plus 0,063 mm de diamètre, c’est-à-diretous les limons (de 0,004 mm à 0,063 mm) etargiles (de moins de 0,004 mm).

On vérifie s’il est satisfait à la premièrecondition de la ligne directrice 2 à l’aide desexemples suivants de calcul : si la CI50 del’échantillon de sédiment de référence ou desédiment témoin négatif utilisé pour juger dela toxicité du sédiment d’essai grossier est de20 000 mg/L, celle du sédiment d’essai doitêtre inférieure à 10 000 mg/L. De même,respectivement, si elle est de 5 050 mg/L, laCI50 du sédiment d’essai doit être de moinsde 2 025 mg/L.

Il faut éprouver la deuxième condition de laligne directrice 2, afin de voir si elle estsatisfaite par la comparaison, par paires, desvaleurs de deux CI50 et de leurs limites deconfiance à 95 %, décrite dans Sprague etFogels (1977), comme moyen de comparerdeux CL50 16. Lorsque l’on cherche unedifférence significative, p < 0,05 doit servircomme seuil de distinction de l’effet.

16 Le test de comparaison par paires, exposé parSprague et Fogels (1977), conviendrait aussi à lacomparaison de deux CI50 (J. B. Sprague,communication privée, septembre 2001, SpragueAssociates Ltd., Saltspring Island [C.-B.]). Une feuillede calcul électronique créée par le Centre des sciencesde l’environnement du Pacifique d’EnvironnementCanada (CSEP, North Vancouver) facilite cettecomparaison statistique. On peut obtenir copie de cettefeuille de calcul, soit du CSEP, soit du Centre dessciences de l’environnement de l’Atlantiqued’Environnement Canada (CSEA), à Moncton, ens’adressant soit à C. Buday, soit à K. Doe, dont lescoordonnées sont fournies dans l’annexe D.

28

Section 7

Renseignements à fournir dans les rapports

Le cas échéant, le procès-verbal de l’essaidoit signaler et décrire dans le détail toutécart survenu par rapport à l’une desobligations exposées dans les sections 2 à 6de la présente méthode de référence. Lalecture du procès-verbal de l’essai doitpermettre d’établir si les conditions et modesopératoires ayant précédé ou accompagnél’essai en ont rendu les résultats valides etacceptables pour l’usage auquel ils étaientdestinés.

Le § 7.1 énumère les rubriques devant fairepartie de chaque procès-verbal d’essai. Le§ 7.2 énumère les rubriques devant soitfigurer dans le procès-verbal, soit êtreprésentées dans un rapport général, soit êtrearchivées pendant au moins cinq ans. Desprogrammes de surveillance ou desrèglements particuliers pourraient exigerl’inclusion, dans le procès-verbal de l’essai,de certains renseignements propres à l’essaiet énumérées dans le § 7.2 (p. ex. des détailsconcernant la matière d’essai et/ou des modesopératoires et des conditions explicites aucours du prélèvement des échantillons, deleur manipulation, de leur transport et de leurentreposage) ou ils pourraient faire en sortequ’ils fassent partie des données à archiver.

On peut renvoyer aux modes opératoires etaux conditions communs à une série d’essaispermanents (p. ex. essais de toxicité effectuésde façon systématique pour les besoins de lasurveillance ou de la conformité) etcompatibles avec les spécifications exposéesdans la présente méthode, soit par référence,soit en joignant un rapport général exposantla pratique normale du laboratoire.

On devrait conserver pendant au moins cinqans les détails concernant la conduite de

l’essai et ses constatations, qui ne sont pasprésentés dans le procès-verbal de l’essai nidans un rapport général, pour quel’information appropriée puisse être produitesi un audit ou une vérification de l’essai estdemandé. L’information archivée pourraitcomprendre les éléments suivants :

• l’enregistrement de la chaîne detransmission des échantillons prélevés surle terrain ou des autres échantillonsanalysés pour les besoins d’un règlementou de la surveillance ;

• une copie du dossier d’acquisition del’échantillon ou des échantillons ;

• les données d’analyse chimique del’échantillon ou des échantillons qui nefont pas partie du procès-verbal de l’essai ;

• les fiches de laboratoire concernant lesobservations et les mesures enregistrées aucours de l’essai ;

• les fiches de laboratoire et les cartes decontrôle des essais de toxicité deréférence ;

• les enregistrements détaillés de l’originedes organismes ayant servi à l’essai, deleur numéro de lot, de leur date depéremption, du ou des essais de toxicité deréférence effectués à l’usine, la date deréception et la température d’entreposageou d’entretien ;

• des renseignements sur l’étalonnage del’équipement et des appareils.

L’original des feuilles de données doit êtresigné ou paraphé et daté par le personnel delaboratoire ayant effectué les essais.

29

7.1 Exigences minimales pour leprocès-verbal de l’essai

On trouvera dans les paragraphes qui suiventl’énumération des rubriques qui doivent fairepartie du procès-verbal de chaque essai.

7.1.1 Matériel d’essai

• Courte description du type d’échantillon(p. ex. déblais de dragage, sédiment deréférence, sédiment effectivement oupotentiellement contaminé, prélevé sur leterrain, sédiment témoin négatif ousédiment témoin positif) ou code del’échantillon fourni au personnel dulaboratoire.

• Renseignements sur l’étiquetage ou lecodage de chaque échantillon.

• Date du prélèvement et de réception del’échantillon ou des échantillons aulaboratoire.

7.1.2 Organismes d’essai

• Nom de l’espèce, de la souche, numéro dulot et date de péremption.

7.1.3 Installations et appareillage d’essai

• Nom et adresse du laboratoire d’essai.

• Nom de la personne ou des personneseffectuant l’essai.

• Nom et numéro de modèle du photomètre.

7.1.4 Solution de reconstitution et « diluanten phase solide »

• Type et source.

7.1.5 Méthode d’essai

• Mention de la méthode d’essai biologiqueutilisée (c’est-à-dire la présente méthode).

• Mention et nom du ou des programmes etméthodes de calcul de l’effet mesuréstatistique.

7.1.6 Conditions de l’essai et modesopératoires

• Le cas échéant, préparation et descriptionde toute non-application des modesopératoires et des conditions précisésdans le présent document et de tout écartpar rapport à eux.

• Nombre d’échantillons discrets parvariante ; nombre de répétitions (le caséchéant) pour chaque variante ; nombre etdescription des variantes faisant partie dechaque essai, y compris les solutionstémoins, le ou les sédiments témoinspositifs et le ou les sédiments de référenceprélevés sur le terrain.

• Date de réalisation de l’essai.

• Pour chaque échantillon, le taux desédiment très grossier (c’est-à-dire departicules de plus de 1,0 mm), de sables,de fines, le pourcentage d’eau, la teneuren carbone organique total ; la salinité, lepH et la teneur en ammoniaque de l’eaude porosité.

• Le cas échéant, mention que deséchantillons du sédiment d’essai (ycompris du sédiment de référence) ontsubi un tamisage sous pression, pour lesdébarrasser des particules, détritus ouorganismes indigènes de grande taille, ycompris le mode opératoire utilisé et lataille des ouvertures du tamis.

• Aspect (couleur, turbidité) des filtratsdans les cuvettes, à chaque concentration(variante).

30

7.1.7 Résultats des essais

• Résultats de la lecture de labioluminescence (moyenne, écart-type,coefficient de variation) dans lesmultiples solutions témoins.

• Les CI50 et leurs limites de confiance à95%, ainsi que la méthode de calcul et lesunités (mg/L), avec trois chiffressignificatifs 17.

• Tous les résultats statistiques descomparaisons, par paires ou autrement,des valeurs de l’effet mesuré.

• Déclaration selon laquelle le sédimentd’essai est considéré ou non commetoxique, y compris la description deslignes directrices ayant permis cetteconclusion.

• Les résultats pour chaque CI50 (ycompris ses limites de confiance à 95%)du ou des toxiques de référence analysésavec le même lot de réactif bactérien quecelui qui a été utilisé dans l’essai detoxicité du sédiment, à moins d’un moisde l’essai et lorsque le lot a été éprouvépour la première fois ; la valeur de lamoyenne géométrique (± 2 F) pour le oules toxiques de référence, calculéeantérieurement au laboratoire.

• Toute circonstance inhabituelle au sujetde l’essai, tout écart par rapport auxmodes opératoires et aux conditionsdécrits, toute difficulté observée, toutesolution appliquée.

7.2 Rubriques supplémentaires àcommuniquer

Dans les paragraphes qui suivent, on énumèreles rubriques devant faire partie soit duprocès-verbal de l’essai, soit du rapportgénéral, ou être archivées pendant au moinscinq ans.

7.2.1 Matériel d’essai

• Nom du ou des préleveurs et/ou desfournisseurs de l’échantillon ou deséchantillons.

• Enregistrement de la chaîne detransmission des échantillons et fichesd’inscription.

• Conditions (p. ex. température, obscuritéou non, récipient étanche) dans lesquellesle ou les échantillons ont été reçus etentreposés.

7.2.2 Organismes d’essai

• Source, numéro du lot, date depéremption, essai(s) de toxicité deréférence en usine, date de réception,température au cours de l’entreposage oude l’entretien.

7.2.3 Installations d’essai et appareillage

• Description de l’expérience que possèdele laboratoire de cette méthode deréférence.

• Description des systèmes d’éclairage etde régulation de la température au coursde l’incubation des solutions filles.

• Description des enceintes d’incubation(c’est-à-dire des tubes à essai) et destabilisation puis de lecturephotométrique (c’est-à-dire des cuvettes).

17 On doit signaler les CI50 inférieures à laconcentration fille minimale (c’est-à-dire à 96,3 mg/L)comme suit : « < 96,3 mg/L » ; celles qui sontsupérieures à la concentration maximale (c’est-à-dire à197 000 mg/L) comme suit : « > 197 000 mg/L ».

31

• Description des pipettes et des cônesjetables utilisés pour préparer ettransvaser les solutions filles.

• Description et compte rendu del’étalonnage de la balance utilisée pourpeser les sédiments.

• Température de l’étuve utilisée poursécher les sous-échantillons de sédiments.

• Description des filtres jetables.

• Description des modes opératoires utiliséspour nettoyer et rincer l’appareillaged’essai.

7.2.4 Solution de reconstitution et « diluanten phase solide »

• Types et quantités de toute substancechimique ajoutée à la solution dereconstitution ou au diluant.

• Résultats des essais pour confirmerqu’aucune de ces solutions n’inhibe labioluminescence de V. fischeri.

• Conditions d’entreposage et date depéremption (ou date de préparation).

7.2.5 Méthode d’essai

• Méthodes utilisées (avec références) pourles analyses chimiques de la matièred’essai (sédiment et eau de porosité) ; ycompris des détails concernant leprélèvement, la préparation et laconservation des aliquotes avant analyse.

7.2.6 Conditions expérimentales et modesopératoires

• La température, contrôlée dans le baind’eau au cours de l’incubation dessolutions filles.

• La température contrôlée dans lephotomètre, au cours du maintien duréactif reconstitué et des filtrats.

• Mesure des concentrations de substanceschimiques dans les matières d’essai et lessolutions filles, autres que celles qui sontmentionnées dans le procès-verbal del’essai.

7.2.7 Résultats de l’essai

• Enregistrements de la présenced’organismes indigènes dans chaqueéchantillon de sédiment de référence etd’essai prélevé sur le terrain, leurélimination manuelle ou par tamisagesous pression et leur description,notamment le type (famille, genre,espèce ?) et la taille approximative ainsique le nombre par unité de volumed’échantillon, s’il est connu.

• Carte de contrôle montrant les résultatsles plus récents et les résultats antérieursd’essais de toxicité effectués avec un oudes toxiques de référence.

• Originaux des fiches de laboratoire(v. p. ex. l’annexe F) et de toute autrefeuille de transmission de données, signéset datés par le personnel du laboratoireeffectuant l’essai et les analysesconnexes.

32

Références

APHA, AWWA et WEF (American PublicHealth Association, American WaterWorks Association et Water EnvironmentFederation), « Toxicity », Part 8000,dans : Standard Methods for theExamination of Water and Wastewater,19e éd., APHA, AWWA et WEF,Washington, DC (1995).

ASTM (American Society for Testing andMaterials), « Standard Guide forConducting Sediment Toxicity Tests withLuminescent Bacteria », ébauche 8,ASTM, Philadelphie, PA (1995).

AZUR, « Basic Solid-Phase Test »,ébauche 6–11–96, 4 p., AZUREnvironmental, Carlsbad, CA (1997).

———. « Basic Solid-Phase Test (BasicSPT) », 16 p., AZUR Environmental,Carlsbad, CA (1998a).

———. « Solid-Phase Test (SPT) », 19 p.,AZUR Environmental, Carlsbad, CA(1998b).

Benton, M.J., M.L. Malott, S.S. Knight,C.M. Cooper et W.H. Benson, « Influenceof Sediment Composition on ApparentToxicity in Solid-Phase Test UsingBioluminescent Bacteria », Environ.Toxicol. Chem., 14(3):411–414 (1995).

Bombardier, M. et N. Bermingham, « TheSed-Tox Index: Toxicity-DirectedManagement Tool to Assess and RankSediments Based on TheirHazard—Concept and Application »,Environ. Toxicol. Chem., 18(4):685–698(1999).

Bower, C.E. et J.P. Bidwell, « Ionization ofAmmonia in Sea Water: Effects of

Temperature, pH and Salinity », J. Fish.Res. Board Can., 35(7):1012–1016(1978).

Brouwer, H. et T. Murphy, « VolatileSulfides and their Toxicity in FreshwaterSediments », Environ. Toxicol. Chem.,14(2):203–208 (1995).

Brouwer, H., T. Murphy et L. McArdle, « ASediment-Contact Bioassay withPhotobacterium phosphoreum », Environ.Toxicol. Chem., 9:1353–1358 (1990).

Cook, N.H. et P.G. Wells, « Toxicity ofHalifax Harbour Sediments: AnEvaluation of the Microtox Solid-PhaseTest », Water Qual. Res. J. Canada,31(4):673–708 (1996).

Corbin, T., K. Doe et D. McLeay,« 1996-1999 Studies at ECs AtlanticRegional Laboratory Related to theDevelopment of Environment Canada’s14-Day Survival-and-Growth Test forSediment Toxicity Using CulturedSpionid Polychaete Worms », rapporttechnique préparé par McLeayEnvironmental Ltd. (Victoria) pour laSection de l’élaboration et l’applicationdes méthodes, Environnement Canada,Ottawa, mars 2000 (2000).

Day, K.E., B.J. Dutka, K.K. Kwan,N. Batista, T.B. Reynoldson etJ.L. Metcalfe-Smith, « CorrelationsBetween Solid-Phase MicrobialScreening Assays, Whole-SedimentToxicity Tests with Macroinvertebratesand In-Situ Benthic CommunityStructure », J. Great Lakes Res.,2(2):192–206 (1995).

33

EC (Environnement Canada), « Documentd’orientation sur le contrôle de laprécision des essais de toxicité au moyende produits toxiques de référence »,Conservation et protection, Ottawa,rapport SPE 1/RM/12, 85 p. (1990).

———. « Essai de toxicité sur la bactérieluminescente Photobacteriumphosphoreum », Conservation etprotection, Ottawa, rapport SPE1/RM/24, 61 p. (1992).

———. « Document d’orientation sur leprélèvement et la préparation desédiments en vue de leur caractérisationphysicochimique et d’essaisbiologiques », Service de la protection del’environnement, Ottawa, rapport SPE1/RM/29, 144 p. (1994).

———. « Guide d’utilisation de la formule“Demande de permis (immersion enmer)” », Division du milieu marin,Ottawa, rapport SPE 1/MA/1 (1995a).

———. « Document d’orientation sur lamesure de la précision des essais detoxicité sur sédiment de contrôle dopéavec un produit toxique de référence »,Service de la protection del’environnement, Ottawa, rapport SPE1/RM/30, 56 p. (1995b).

———. « Procedure for Conducting aMicrotox Solid Phase Test », Modeopératoire normalisé 43, 10 p., préparé,en janvier 1996 par G. Wohlgeschaffen. Centre des sciences de l’environnementde l’Atlantique, Moncton (1996a).

———. « 1996 National CompendiumMonitoring at Ocean Disposal Sites »,rapport inédit, programme d’immersionen mer, Division du milieu marin, Ottawa(1996b).

———. « 1996–97 Discussion Paper onOcean Disposal and Cost Recovery »,rapport inédit, programme d’immersionen mer, Division du milieu marin, Ottawa(1997a).

———. « Méthode d’essai biologique : essaide survie et de croissance des larvesdulcicoles de chironomes (Chironomustentans ou Chironomus riparius) dans lessédiments », Service de la protection del’environnement, Ottawa, rapportSPE 1/RM/32, 133 p. (1997b).

———. « Méthode d’essai biologique : essaide survie et de croissance de l’amphipodedulcicole Hyalella azteca dans lessédiments », Service de la protection del’environnement, Ottawa, rapportSPE 1/RM/33, 123 p. (1997c).

———. « Méthode d’essai biologique :méthode de référence pour ladétermination de la létalité aiguë d’unsédiment pour des amphipodes marins ouestuariens », Service de la protection del’environnement, Ottawa, rapportSPE 1/RM/35, 57 p. (1998).

———. « Standard Operating Procedure forthe Solid-Phase Toxicity Test UsingLuminescent Bacteria (Vibrio fischeri) »,mode opératoire normaliséno IC50MS10.SOP, première ébauche,18 p., préparé en octobre 1999 parC. Buday, Centre des sciences del’environnement du Pacifique, NorthVancouver (C.-B.) [1999a].

———. « Guide des essais écotoxicologiquesemployant une seule espèce et del’interprétation de leurs résultats »,Service de la protection del’environnement, Ottawa, rapportSPE 1/RM/34 (1999b).

34

———. « A Guide to Canada’s Disposal atSea Permit System », Direction du milieumarin, Ottawa, rapport SPE 1/MA/2, enpréparation (2002a).

———. « Guidance Document on StatisticalMethods to Determine Endpoints ofToxicity Tests », Service de la protectionde l’environnement, Ottawa, rapportSPE 1/RM/xx, en préparation (2002b).

Gaudet, I.D., « Effect of Microtox ReagentReconstitution Age on the Variability ofAnalytical Results from the MicrotoxAssay », rapport final au comité desutilisateurs du réactif Microtox de l’Ouestcanadien par l’Alberta Research Council,Edmonton (1998).

Gouvernement du Canada, « Règlement surl’immersion en mer », DORS/2001-275sous le régime de la Loi canadienne surla protection de l’environnement (1999),Gazette du Canada Partie II, 135(17):1655–1657, 1er août 2001, Ottawa(2001).

LCPE (Loi canadienne sur la protection del’environnement), « Immersion », partie 7,section 3, articles 122 à 127 et annexes 5et 6, Lois du Canada, chapitre 33 (1999).

McLeay, D., K. Doe, P. Jackman, P. Ross,C. Buday, G. van Aggelen, G. Elliott,W. Antoniolli, S. Trottier, J. Pickard,K. Kinnee, K. Lee et G. Wohlgeschaffen,« Interlaboratory Studies to ValidateEnvironment Canada’s New ReferenceMethod for Determining the Toxicity ofSediment Using Luminescent Bacteria(Vibrio fischeri) in a Solid-Phase Test »,rapport technique préparé par McLeayEnvironmental Ltd. (Victoria) et le Centredes sciences de l’environnement del’Atlantique d’Environnement Canada(Moncton) pour la Section de

l’élaboration et de l’application desméthodes, Environnement Canada,Ottawa, décembre 2001 (2001).

Microbics, « Detailed Solid-Phase TestProtocol », p. 153–178, dans : MicrotoxManual— A Toxicity Testing Handbook,Microbics Corporation, Carlsbad, CA(1992).

———. « Microtox Acute Toxicity Solid-Phase Test », Microbics Corporation,Carlsbad, CA, 18 p. (1995a).

———. « Model 500 Analyzer », MicrobicsCorporation, Carlsbad, CA, 13 p.(1995b).

NICMM (National Institute for Coastal andMarine Management/RIKZ), « StandardOperating Procedures, Marine: MicrotoxSolid-Phase (Vibrio fisheri) SedimentToxicity Test », C.A. Schipper,R.M. Burgess, M.E. Schot, B.J. Kater, etJ. Stronkhorst, projet SPECIE*BIO,RIKZ/AB-99.107x, version 1.1,juin 1999, NICMM, Middelburg,Pays-Bas, 23 p. (1999).

Porebski, L.M. et J.M. Osborne, « TheApplication of a Tiered Testing Approachto the Management of Dredged Sedimentsfor Disposal at Sea in Canada »,Chemistry and Ecology, 14:197–214(1998).

Qureshi, A.A., K.W. Flood, S.R. Thompson,S.M. Janhurst, C.S. Innis et D.A. Rokosh,« Comparison of a Luminescent BacterialTest with Other Bioassays forDetermining Toxicity of PureCompounds and Complex Effluents »,p. 179–195, dans : J.G. Pearson,R.B. Foster et W.E. Bishop (dir.), AquaticToxicology and Hazard Assessment: FifthConference, ASTM STP 766, American

35

Society for Testing and Materials,Philadelphie, PA (1982).

Ringwood, A.H., M.E. DeLorenzo, P.E. Rosset A.F. Holland, « Interpretation ofMicrotox Solid-Phase Toxicity Tests: TheEffects of Sediment Composition »,Environ. Toxicol. Chem., 16(6):1135–1140 (1997).

Ross, P., « Role of Microbiotests inContaminated Sediment AssessmentBatteries », p. 549-556, chapitre 38 dans :Microscale Testing in Aquatic Toxicology—Advances, Techniques, and Practice, P.G. Wells, K. Lee et C. Blaise (dir.),CRC Press, New York, NY (1998).

Ross, P. et P.A. Leitman, « Solid PhaseTesting of Aquatic Sediments UsingVibrio fischeri: Test Design and DataInterpretation », p. 65-76, chapitre 6dans : Environmental ToxicologyAssessment, M. Richardson (dir.), Taylorand Francis, Londres (1995).

Ross, P., G.A. Burton, Jr., M. Greene, K. Ho,P. Meier, L. Sweet, A. Auwarter,A. Bispo, K. Doe, K. Erstfeld, S. Goudey,M. Goyvaerts, D. Henderson,M. Jourdain, M. Lenon, P. Pandard,A. Qureshi, C. Rowland, C. Schipper,

W. Schreurs, S. Trottier etG. van Aggelen, « InterlaboratoryPrecision Study of a Whole SedimentToxicity Test with the BioluminescentBacterium Vibrio fischeri », Environ.Toxicol., 14:339–345 (1999).

Sprague, J.B. et A. Fogels, « Watch the Y inBioassay », p. 107–118, dans :Proceedings of the 3rd Aquatic ToxicityWorkshop, Halifax, 2 et3 novembre 1976, EnvironnementCanada, rapport techniqueSPE-5-AR-77-1 du Service de laprotection de l’environnement (1977).

Tay, K.L., K.G. Doe, A.J. MacDonald etK. Lee, « The Influence of Particle Size,Ammonia, and Sulfide on Toxicity ofDredged Materials for Ocean Disposal », chapitre 39, p. 559–574, dans :Microscale Testing in AquaticToxicology—Advances, Techniques, andPractice, P.G. Wells, K. Lee et C. Blaise(dir.), CRC Press, New York, NY (1998).

Trussell, R.P., « The Percent Un-IonizedAmmonia in Aqueous AmmoniaSolutions at Different pH Levels andTemperatures », J. Fish. Res. Board Can.,29:1505–1507 (1972).

36Annexe A

Méthodes d’essai biologique et guides à l’appui publiés par la Section del’élaboration et de l’application des méthodes d’Environnement Canada 1

Titre de la méthode ou du guide No depublication

Date depublication

Modificationsultérieures

A. Méthodes génériques (universelles)

Essai de létalité aiguë sur la truite arc-en-ciel SPE 1/RM/9 Juillet 1990 Mai 1996

Essai de létalité aiguë sur l’épinoche à trois épines(Gasterosteus aculeatus)

SPE 1/RM/10 Juillet 1990 Mars 2000

Essai de létalité aiguë sur Daphnia spp. SPE 1/RM/11 Juillet 1990 Mai 1996

Essai de reproduction et de survie sur le cladocèreCeriodaphnia dubia

SPE 1/RM/21 Février 1992 Novembre1997

Essai de croissance et de survie sur des larves de tête-de-boule SPE 1/RM/22 Février 1992 Novembre1997

Essai de toxicité sur la bactérie luminescente Photobacteriumphosphoreum

SPE 1/RM/24 Novembre1992

—

Essai d’inhibition de la croissance de l’algue d’eau douceSelenastrum capricornutum

SPE 1/RM/25 Novembre1992

Novembre1997

Essai de toxicité aiguë de sédiments chez les amphipodes marinsou estuariens

SPE 1/RM/26 Décembre1992

Octobre 1998

Méthode d’essai biologique : essai sur la fécondation chez leséchinides (oursins verts et oursins plats)

SPE 1/RM/27 Décembre1992

Novembre1997

Essai de toxicité sur des salmonidés aux premiers stades de leurcycle biologique

SPE 1/RM/281re édition

Décembre1992

Janvier 1995

Méthode d’essai biologique : essais toxicologiques sur dessalmonidés (truite arc-en-ciel) aux premiers stades de leur cyclebiologique

SPE 1/RM/282e édition

Juillet 1998 —

Méthode d’essai biologique : essai de survie et de croissancedes larves dulcicoles de chironomes (Chironomus tentans ouChironomus riparius) dans les sédiments

SPE 1/RM/32 Décembre1997

—

Méthode d’essai biologique : essai de survie et de croissance del’amphipode dulcicole Hyalella azteca dans les sédiments

SPE 1/RM/33 Décembre1997

—

Méthode d’essai biologique : essai de mesure de l’inhibition dela croissance de la plante macroscopique dulcicole Lemna minor

SPE 1/RM/37 Mars 1999 —

1. On peut acheter ces documents des Publications de la protection de l’environnement, Service de la protection del’environnement, Environnement Canada, Ottawa, K1A 0H3 (Canada). Pour renseignements ou observations, prière des’adresser au chef de la Section de l’élaboration et de l’application des méthodes, Centre de technologieenvironnementale, Environnement Canada, Ottawa, K1A 0H3.

37

Titre de la méthode du guide No depublication

Date depublication

Modificationsultérieures

B. Méthodes de référence 2

Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguëd’effluents chez la truite arc-en-ciel

SPE 1/RM/131re édition

Juillet 1990 Mai 1996,décembre 2000

Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguëd’effluents chez la truite arc-en-ciel

SPE 1/RM/132e édition

Décembre2000

—

Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguëd’effluents chez Daphnia magna

SPE 1/RM/141re édition

Juillet 1990 Mai 1996,décembre 2000

Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguëd’effluents chez Daphnia magna

SPE 1/RM/142e édition

Décembre2000

—

Méthode d’essai biologique : méthode de référence pour ladétermination de la létalité aiguë d’un sédiment pour desamphipodes marins ou estuariens

SPE 1/RM/35 Décembre1998

—

C. Guides

Document d’orientation sur le contrôle de la précision des essaisde toxicité au moyen de produits toxiques de référence

SPE 1/RM/12 Août 1990 —

Document d’orientation sur le prélèvement et la préparation desédiments en vue de leur caractérisation physico-chimique etd’essais biologiques

SPE 1/RM/29 Décembre1994

—

Document d’orientation sur la mesure de la précision des essaisde toxicité sur sédiment de contrôle dopé avec un produittoxique de référence

SPE 1/RM/30 Septembre1995

—

Guide des essais écotoxicologiques employant une seule espèceet de l’interprétation de leurs résultats

SPE 1/RM/34 Décembre1999

—

2. Dans cette collection, on entend par méthode de référence une méthode biologique particulière d’essai de la toxicité,c’est-à-dire une méthode écrite, assortie d’un ensemble explicite de consignes et de conditions décrites avec précision.Contrairement aux méthodes universelles (polyvalentes ou génériques) publiées par Environnement Canada, la méthodede référence est souvent limitée, dans son emploi, aux essais exigés par un règlement particulier.

38Annexe B

Composition du Groupe intergouvernemental de la toxicitéaquatique(avril 2002)Administration fédérale (EnvironnementCanada)

C. BlaiseCentre Saint-LaurentMontréal

M. BombardierCentre de technologie environnementaleOttawa

U. BorgmannInstitut national de recherche sur les eauxBurlington (Ontario)

J. BrunoCentre des sciences de l’environnement du PacifiqueNorth Vancouver (Colombie-Britannique)

C. BudayCentre des sciences de l’environnement du PacifiqueNorth Vancouver

K. DoeCentre des sciences de l’environnement de l’AtlantiqueMoncton

G. ElliottService de la protection de l’environnementEdmonton

F. GagnéCentre Saint-LaurentMontréal

M. HarwoodService de la protection de l’environnementMontréal

D. HughesCentre des sciences de l’environnement de l’AtlantiqueMoncton

P. JackmanCentre des sciences de l’environnement de l’AtlantiqueMoncton

N. KruperService de la protection de l’environnementEdmonton

M. LinssenCentre des sciences de l’environnement du PacifiqueNorth Vancouver

D. MacGregorCentre de technologie environnementaleOttawa

D. MoulCentre des sciences de l’environnement du PacifiqueNorth Vancouver

W.R. ParkerService de la protection de l’environnementFredericton

L. PorebskiDirection du milieu marinHull

D. RodrigueDirection générale pour l’avancement des technologiesenvironnementalesHull

R. ScrogginsCentre de technologie environnementaleOttawa

A. SteenkamerCentre de technologie environnementaleOttawa

T. SteevesCentre des sciences de l’environnement de l’AtlantiqueMoncton

G. van Aggelen (président)Centre des sciences de l’environnement du PacifiqueNorth Vancouver

R. WattsCentre des sciences de l’environnement du PacifiqueNorth Vancouver

39P. WellsService de la conservation de l’environnementDartmouth (Nouvelle-Écosse)

Administration fédérale (Pêches et OcéansCanada)

R. RoyInstitut Maurice-LamontagneMont-Joli (Québec)

Provinces

C. BastienMinistère de l’Environnement du QuébecSainte-Foy

B. BayerEnvironnement ManitobaWinnipeg

D. BedardMinistère de l’Environnement de l’OntarioRexdale

M. MuellerMinistère de l’Environnement de l’OntarioRexdale

D. PoirierMinistère de l’Environnement de l’OntarioRexdale

J. SchroederMinistère de l’Environnement de l’OntarioRexdale

40Annexe C

Adresses de l’administration centrale et des bureaux régionauxd’Environnement Canada

Administration centrale351, boul. Saint-JosephPlace Vincent-MasseyHull (Québec)K1A 0H3

Région de l’Ontario4905, rue Dufferin, 2e étageDownsviewM3H 5T4

Région de l’Atlantique15e étage, Queen Square45 Alderney DriveDartmouth (Nouvelle-Écosse)B2Y 2N6

Région de l’Ouest et du NordPièce 210, Twin Atria no 24999 - 98e AvenueEdmontonT6B 2X3

Région du Québec105, rue McGill8e étageMontréalH2Y 2E7

Région du Pacifique et du Yukon224, rue Esplanade OuestNorth Vancouver (Colombie-Britannique)V7M 3H7

41Annexe D

Membres du Groupe consultatif scientifique

Membres du Groupe

M. Craig BudayEnvironnement CanadaCentre des sciences de l’environnement du Pacifique2645, route DollartonNorth Vancouver (C.-B.) V7H 1B1Tél. : (604) 924-2514Téléc. : (604) 924-2554Courriel : craig.buday@ec.gc.ca

Dr Allen Burton, Jr.Institute for Environmental QualityWright State UniversityDayton, OH 45435, USATél. : (937) 775-4995Téléc. : (937) 775-4997Courriel : aburton@wright.edu

M. Ken DoeEnvironnement CanadaLaboratoire de toxicologieSection de la qualité de l’environnement, Direction descontaminants de l’environnementCentre des sciences de l’environnement de l’AtlantiqueC.P. 23 005Moncton (N.-B.) E1A 6S8Tél. : (506) 851-3486Téléc. : (506) 851-6608Courriel : Ken.Doe@ec.gc.ca

Dr Kay HoAtlantic Ecology DivisionU.S. Environmental Protection Agency27 Tarzwell DriveNarragansett, RI 02882, USATél. : (401) 782-3196Téléc. : (401) 782-3030Courriel : ho.kay@epamail.epa.gov

Mme Paula JackmanEnvironnement CanadaLaboratoire de toxicologieSection de la qualité de l’environnement, Direction descontaminants de l’environnementCentre des sciences de l’environnement de l’AtlantiqueC.P. 23005Moncton (N.-B.) E1A 6S8Tél. : (506) 851-2886Téléc. : (506) 851-2907Courriel : Paula.Jackman@ec.gc.ca

M. Jim OsborneEnvironnement CanadaDirection du milieu marinPlace Vincent-Massey, 12e étage351, boul. Saint-JosephHull (Qc) K1A 0H3Tél. : (819) 953-2265Téléc. : (819) 953-0913Courriel : Jim.Osborne@ec.gc.ca

Mme Linda PorebskiEnvironnement CanadaDirection du milieu marin Place Vincent-Massey, 12e étage351, boul. Saint-JosephHull (Qc) K1A 0H3Tél. : (819) 953-4341Téléc. : (819) 953-0913Courriel : Linda.Porebski@ec.gc.ca

Dr Philippe RossEnvironmental Science and Engineering DivisionColorado School of MinesGolden, CO 80401-1887, USATél. : (303) 273-3473Téléc. : (303) 273-3413Courriel : pross@mines.edu

M. Paul ToppingEnvironnement CanadaDirection du milieu marinPlace Vincent-Massey, 12e étage351, boul. Saint-JosephHull (Qc) K1A 0H3Tél. : (819) 953-0663Téléc. : (819) 953-0913Courriel : Paul.Topping@ec.gc.ca

M. Sylvain TrottierEnvironnement CanadaCentre Saint-Laurent105, rue McGillMontréal (Qc) H2Y 2E7Tél. : (514) 496-7104Téléc. : (514) 496-7143Courriel : sylvain.trottier@ec.gc.ca

42Autorité scientifique

M. Rick ScrogginsEnvironnement CanadaSection de l’élaboration et de l’application desméthodesCentre de technologie environnementale3439, River Road SouthOttawa (Ont.) K1A 0H3Tél. : (613) 990-8569Téléc. : (613) 990-0173Courriel : scroggins.richard@etc.ec.gc.ca

Consultants

Dr Don McLeayMcLeay Environmental Ltd.2999, route Spring BayVictoria (C.-B.) V8N 5S4Tél. : (250) 472-2608Téléc. : (250) 472-2609Courriel : mcleayenvir@islandnet.com

M. Gary WohlgeschaffenSciences de l’environnement marinInstitut Bedford d’océanographieC.P. 1006Dartmouth (N.-É.) B2Y 4A2Tél. : (902) 426-2479Téléc. : (902) 426-6695Courriel : WohlgeschaffenG@mar.dfo-mpo.gc.ca

43Annexe E

Variantes du mode opératoire des essais de toxicité de sédiments enphase solide employant des bactéries luminescentes et décrites dansles méthodes canadiennes, états-uniennes et néerlandaises(Énumération chronologique, mettant en vedette l’organisation plutôt que l’auteur ou les auteurs)

EC 1992: Environnement Canada, Méthode d’essai biologique : essai de toxicité sur la bactérieluminescente Photobacterium phosphoreum, Conservation et protection, Ottawa, rapport SPE1/RM/24, 67 p. (1992).

MICROBICS 1992: Microbics, Detailed Solid-Phase Test Protocol, p. 153–178, dans :Microtox Manual—A Toxicity Testing Handbook, société Microbics, Carlsbad, CA (1992).

MICROBICS 1995a: Microbics, Microtox Acute Toxicity Solid-Phase Test, société Microbics,Carlsbad, CA, 18 p. (1995a).

ASTM 1995: ASTM (American Society for Testing and Materials), Standard Guide forConducting Sediment Toxicity Tests with Luminescent Bacteria, ébauche 8, ASTM,Philadelphie, PA (1995).

EC 1996a : Environnement Canada, Procedure for Conducting a Microtox Solid-Phase Test,Section de toxicologie, Laboratoire de la qualité de l’environnement, Direction de laconservation de l’environnement, Moncton, mode opératoire normalisé 43, 10 p.,janvier 1996, G. Wohlgeschaffen. Centre des sciences de l’environnement de l’Atlantique,Moncton (1996a).

AZUR 1997 : AZUR, Basic Solid-Phase Test, AZUR Environmental, Carlsbad, CA, ébauche du1997/11/6, 4 p. (1997).

AZUR 1998a : AZUR, Basic Solid-Phase Test (Basic SPT), AZUR Environmental, Carlsbad,CA, 16 p. (1998).

AZUR 1998b : AZUR, Solid-Phase Test (SPT), AZUR Environmental, Carlsbad, CA, 19 p.(1998).

EC 1999a : Environnement Canada, Standard Operating Procedure for the Solid-Phase ToxicityTest Using Luminescent Bacteria (Vibrio fischeri), mode opératoire normaliséIC50MS10.SOP, première ébauche, 18 p., octobre 1999, C. Buday. Centre des sciences del’environnement du Pacifique, North Vancouver (1999a).

NICMM 1999 : NICMM (National Institute for Coastal and Marine Management/RIKZ),Standard Operating Procedures, Marine: Microtox Solid-Phase (Vibrio fisheri) SedimentToxicity Test, C.A. Schipper, R.M. Burgess, M.E. Schot, B.J. Kater et J. Stronkhorst, projetSPECIE*BIO, RIKZ/AB-99.107x, version 1.1, juin 1999, 23 p, NICMM, Middelburg,Pays-Bas (1999).

441 Type d’échantillon, prélèvement et transport

Document source Typed’échant.

Méthode deprélèvement

Temp. detransport(°C)

Récipient Prélè-vementsréitérés ?

EC 1992 sol,sédiment,boue

suivre lesorientationsdonnées dansASTM (1991)et EC (1994)

1–7 On préfère lesrécipients de verre ouà revêtement deTéflonz ; sontacceptables lepolyéthylène et lepolypropylène ;500 mL à 1 L

n. p.

MICROBICS 1992 sol,sédiment

n. p. 1 n. p. capsules neuves enverre borosilicaté doublé de TFE

n. p.

MICROBICS 1995a sol,sédiment

n. p. n. p. capsules neuves enverre borosilicatédoublé de Téflon

n. p.

ASTM 1995 sédiment suivre lesguides sur lesnormes ASTME 1367, E 1383,et E 1391

4 ± 2 capsules neuves 2

borosilicaté doublé deTFE

oui 3

EC 1996a sol,sédiment

n. p. n. p. n. p. n. p.

AZUR 1997 sol,sédiment

n. p. n. p. n. p. n. p.

AZUR 1998a sol,sédiment

n. p. n. p. n. p. n. p.

AZUR 1998b sol,sédiment

n. p. n. p. n. p. n. p.

EC 1999a sol,sédiment

n. p. n. p. tube à centrifuger de50 mL

n. p.

NICMM 1999 sédiment n. p. n. p. n. p. n. p.

1. n. p. = non précisé.2. Si on les réutilise, les nettoyer comme suit : savon non toxique, lavage à l’acide, double rinçage à l’eau distillée.3. On devrait prélever des échantillons réitérés à chaque emplacement pour déterminer la variabilité des

caractéristiques du sédiment.

45

2 Entreposage des échantillons

Document source Espace libre ? Température(°C)

Lumière ouobscurité

Durée maximale

EC 1992 non 4 ± 2 obscurité 6 semaines

MICROBICS 1992 non 2–8 n. p. 48 h, si possible

MICROBICS 1995a non réfrigérateur n. p. 48 h, si possible

ASTM 1995 non 4 ± 2 obscurité 2–8 semaines

EC 1996a n. p. 1 n. p. n. p. n. p.

AZUR 1997 n. p. n. p. n. p. n. p.

AZUR 1998a n. p. n. p. n. p. n. p.

AZUR 1998b n. p. n. p. n. p. n. p.

EC 1999a non 4 ± 2 obscurité 6 semaines

NICMM 1999 n. p. 4 obscurité < 4 semaines

1. n. p. = non précisé.

46

3 Traitement préalable et caractérisation des échantillons

Document source Tamisage ? Suppressiondes grosorganismes ?

Suppressiondes grossesparticules ?

Homogé-néisationde l’éch. ?

Caractérisationdu sédiment

EC 1992 n. p. 1 n. p. n. p. mélangerà fond

couleur

MICROBICS 1992 n. p. n. p. oui ($ 1 mm) oui pH

MICROBICS 1995a n. p. n. p. n. p. oui(1–3 min)

pH

ASTM 1995 non oui oui (> 5 mm) oui carboneorganique oumatières volatilestotales,granulométrie,ammoniaque,pourcentaged’eau, pH

EC 1996a n. p. n. p. n. p. oui n. p.

AZUR 1997 n. p. n. p. n. p. oui(1–3 min)

n. p.

AZUR 1998a n. p. n. p. n. p. mélangerà fond

n. p.

AZUR 1998b n. p. n. p. n. p. mélangerà fond

n. p.

EC 1999a non oui oui mélangerà fond

n. p.

NICMM 1999 n. p. n. p. n. p. oui dans le cas del’eau deporosité 2 : pH,salinité, sulfures,ammoniaque

1. n. p. = non précisé.2. Sédiment centrifugé 20 min à 2500 g.

47

4 Dessiccation d’un sous-échantillon pour déterminer la teneur en eau

Document source Quantité (g) Nombre derépétitions

Précision dela pesée (g)

Température(°C)

Durée

EC 1992 n. p. 1 n. p. n. p. n. p. n. p.

MICROBICS 1992 5 n. p. n. p. n. p. n. p.

MICROBICS 1995a 5 ± 0,2 3 ± 0,01 100 ± 5 24 h

ASTM 1995 quelquesgrammes

n. p. n. p. ~ 100 pendant lanuit

EC 1996a 3–5 3 ± 0,01 60–100 48 h

AZUR 1997 n. p. n. p. n. p. n. p. n. p.

AZUR 1998a n. p. n. p. n. p. n. p. n. p.

AZUR 1998b n. p. n. p. n. p. n. p. n. p.

EC 1999a 5 ± 0,2 3 ± 0,01 100 ± 5 24 h

NICMM 1999 ~ 5 3 n. p. 100 24 h

1. n. p. = non précisé.

48

5 Sous-échantillon de sédiment, diluant, récipients de la solution mère et des solutionsfilles

Documentsource

Masse dusous-éch.(g)

Séparationde l’eau deporosité ?

Type dediluant

Volumede diluant(mL)

Récipient de lasolution mère

Récipient dessolutions filles

EC 1992 0,4 oui(centrifug.)

« diluant enphase solide »

4,0 s. o. 4 tube d’EPS 6

MICROBICS1992

0,3 oui(centrifug.)

« diluant enphase solide »

3,0 s. o. 4 tube d’EPS 6, 7

MICROBICS1995a

7,00 facultatif solution deNaCl ou deNaNO3

35 récipient neuf deverre ou deplastique de 50 mL

tube d’EPS 6, 7

ASTM 1995 7 ± 0,35 1 non NaCl à 3,5 %ou NaNO3 à3,02 % 3

35 récipient neuf deverre borosilicatépropre 5

tube de verreborosilicaténeuf, propre 5

EC 1996a 7 ± 0,05 n. p. 2 « diluant enphase solide »

35 récipient depolypropylèneneuf, jetable, de50 mL

tube d’EPS 6, 7

AZUR 1997 7,00 n. p. diluant ou eaude mer deréférence

35 becher d’env.50 mL

cuvette 8

AZUR 1998a 7,00 n. p. « diluant enphase solide »

35 becher d’env.50 mL

cuvette 8

AZUR 1998b 7,00 n. p. « diluant enphase solide »

35 becher d’env.50 mL

tube d’EPS 6, 7

EC 1999a 0,3 oui(centrifug.)

NaCl à 3,5 % 3,0 s. o. 4 tube d’EPS 6, 9

NICMM1999

7,0 n. p. « diluant enphase solide »

35 tube à sérum tube d’EPS 6, 7

1. La masse effectivement utilisée devrait être connue à ± 0,05 g et doit être connue à ± 0,35 g.2. n. p. = non précisé.3. Utiliser du NaCl (à 3,5 %) pour les sédiments marins ou estuariens et NaNO3 (à 3.02 %) pour les sédiments d’eau douce.4. s. o. = sans objet. La première dilution (solution fille à la concentration maximale) se fait dans le tube de styrène pour essai en

phase solide (tube d’EPS).5. Récipients de 16 mm de diamètre (15,6 mm, diamètre nominal), à fond hémisphérique de 15,3 mm de diamètre. On les porte à

l’incubateur, à 15 °C, dans un portoir convenable.6. EPS = essai en phase solide. Chaque tube, de polystyrène, mesure 15,5 mm sur 56 (capacité de 7,5 mL), possède un fond

hémisphérique, adapté à la colonne de filtration (tableau 12, présente annexe). Fournisseur : Evergreen Scientific, pièceno 208-3193-020, Los Angeles, Californie, tél. : (323) 583-1331.

7. Les tubes d’EPS sont déposés dans un râtelier ou portoir (bloc d’incubateur), mis à incuber à 15 °C (bain d’eau).8. En verre borosilicaté, jetable, de 50 mm de longueur sur 12 de diamètre(11,75 mm, diamètre nominal) ; fond plat. Les cuvettes

sont déposées dans les puits de l’incubateur.9. Les tubes d’EPS reposent dans un portoir (bloc d’incubateur) à la température ambiante.

49

6 Mélange de la solution mère de sédiment

Documentsource

Ajustementdu pH ?

Dispositif de mélange Profondeurdu tourbillon

Temps de mélange(min)

EC 1992 n. p. 1 pipette (pour agitation etmesure)

s. o. 4 n. p. (bien mélanger)

MICROBICS1992

n. p. 2 pipette (pour agitation etmesure)

s. o. n. p. (complètementdisperser l’échantillon etle mettre en suspension)

MICROBICS1995a

n. p. plaque magnétique etbarreau magnétiqueenrobé de téflon

moitié de lahauteur duliquide

10

ASTM 1995 non 3 plaque magnétique etbarreau magnétiqueenrobé de téflon

moitié de lahauteur duliquide

20 5

EC 1996a n. p. agitateur magnétique tiers de lahauteur duliquide

10

AZUR 1997 n. p. plaque magnétique etbarreau magnétiqueenrobé de téflon

moitié de lahauteur duliquide

10

AZUR 1998a n. p. plaque magnétique etbarreau magnétiqueenrobé de téflon

moitié de lahauteur duliquide

10

AZUR 1998b n. p. plaque magnétique etbarreau magnétiqueenrobé de téflon

moitié de lahauteur duliquide

10

EC 1999a non pipette (pour agitation etmesure)

s. o. n. p. (complètementdisperser l’échantillon etle mettre en suspension)

NICMM 1999 n. p. plaque magnétique etbarreau magnétiqueenrobé de téflon

moitié de lahauteur duliquide

10, ou jusqu’àhomogénéisation de lasuspension

1. n. p. = non précisé.2. De 6 à 8, le pH a effet minime sur le réactif reconstitué (c’est-à-dire les bactéries lyophilisées reconstituées).3. Le pH optimal est de 7,3 ; peu d’effet si le pH va de 6,6 à 7,8.4. s. o. = sans objet.5. Vérifier après cinq minutes, pour voir si les grosses particules, qui se déposent rapidement après agitation, sont

exemptes d’argile.

50

7 Préparation des séries de dilutions (solutions filles)

Document source Rapportdedilution

Nombre desolutionsfilles

Volume desolution mèretransvasédans le tubede la premièresolution fille(mL)

Nombre dede pipettagespourremettre lesparticules ensuspension

Volumesuccessivementtransvasé de lapremièresolution fille àla dernière(mL)

EC 1992 1/2 9 s. o. 2 n. p. 7 2,0

MICROBICS 1992 1/2 12 1 s. o. 5 ou 6 1,5

MICROBICS 1995a 1/2 13 1 1,5 3 n. p. 1,5

ASTM 1995 1/2 1 12 1 1,5 4 plusieurs 1,5

EC 1996a 1/2 12 1,5 3, 4 3 ou 4 1,5

AZUR 1997 1/2 9 2,0 5 à fond 1,0

AZUR 1998a 1/2 9 2,0 5, 6 mélanger 1,0

AZUR 1998b 1/2 13 1,5 3, 6 mélanger 1,5

EC 1999a 1/2 10 1,5 4 5 ou 6 1,5

NICMM 1999 1/2 13 1,5 10 1,5

1. Tableau des dilutions décrit, mais l’emploi d’autres combinaisons de milieux témoins, de rapports de dilution et denombres de dilutions est également énuméré.

2. s. o. = sans objet.3. Le tube à la concentration maximale renferme déjà 1,5 mL de diluant.4. Utiliser une pipette à grande ouverture pour éviter son colmatage ; tenir à environ 5 mm de la paroi, à environ

15 mm de fond.5. Transféré directement dans la cuvette du photomètre M500 Analyzer.6. Utiliser une pipette à grande ouverture pour éviter son colmatage, en l’appuyant contre la paroi, à environ 2 cm de

fond.7. n. p. = non précisé.

51

8 Concentration maximale des solutions filles, solutions témoins, échantillons pour essaien double et récipients inoculés

Document source Concentrationmaximale dessolutionsfilles 1

Nombredesolutionstémoins 3

Dédoublementde chaquesolution fille ?

Lectures del’intensitélumineuseinitiale (I0) ?

Récipientsinoculés avecle réactif 6

EC 1992 10 % 1 facultatif non tubes d’EPS

MICROBICS 1992 98 684 mg/Lou 9,868 %

3 facultatif non tubes d’EPS

MICROBICS1995a

19,737 % 4 oui non tubes d’EPS

ASTM 1995 10 % 3 non non tubes de verre

EC 1996a 197 368 mg/L 3 non non tubes d’EPS

AZUR 1997 9,9 % ou99 000 mg/L

1 facultatif 4 oui 5 cuvettes 7

AZUR 1998a 99 000 mg/L 1 facultatif 4 oui 5 cuvettes 7

AZUR 1998b 9,9 % ou99,01 mg/L 2

2 non non tubes d’EPS

EC 1999a 9,868 % 3 non non tubes d’EPS

NICMM 1999 19,737 % 4 oui non tubes d’EPS

1. Les pourcentages sont en poids par volume.2. Ce chiffre semble erroné. Plus probablement 99 000 mg/L.3. Elles sont constituées uniquement de diluant, auquel on ajoute l’inoculum bactérien.4. Lorsqu’un essai en double est exigé, effectuer ce mode opératoire deux fois.5. L’intensité lumineuse initiale, au temps zéro (I0) est mesurée sur des aliquotes de 500 :L de diluant plus réactif

seulement, dans 10 cuvettes (répétitions).6. Par « réactif », on entend la bactérie reconstituée (v. tableau 11). Voir, dans le tableau 5, la description des

récipients dans la colonne « Récipient des solutions filles ».7. Les solutions filles ne sont pas inoculées avec le réactif. On transvase plutôt une aliquote de 500 :L de chaque

solution fille dans les cuvettes initiales après qu’on a mesuré l’intensité lumineuse initiale. Voir la description descuvettes dans le tableau 5.

52

9 Équilibrage des solutions filles avant l’inoculation des bactéries

Document source Température d’équilibrage (°C) Délai d’équilibrage (min)

EC 1992 15 ± 0,3 n. p.

MICROBICS 1992 15 10

MICROBICS 1995a 15 10

ASTM 1995 15 ± 0,5 n. p.

EC 1996a 15 10

AZUR 1997 n. p. 1 5

AZUR 1998a n. p. 1 5

AZUR 1998b 15 5

EC 1999a température ambiante (~ 20) 5

NICMM 1999 15 10

1. n. p. = non précisé. On pose la température égale à 15 °C, puisque les solutions filles sont préparées dans lescuvettes, directement dans le photomètre (Microbics, 1995b).

5310 Organismes d’essai, source et entreposage

Document source Espèce Souche Source Températured’entreposage(°C) 5

EC 1992 P. phosphoreum 1 B-11177 du NRRL 3 Microbics ! 20

MICROBICS 1992 P. phosphoreum 1 n. p. Microbics n. p.

MICROBICS 1995a n. p. 2 n. p. Microbics n. p.

ASTM 1995 V. fischeri B-11177 du NRRL 3 n. p. ! 20

EC 1996a P. phosphoreum 1 n. p. n. p. n. p.

AZUR 1997 n. p. n. p. AZUR 4 n. p.

AZUR 1998a n. p. n. p. AZUR n. p.

AZUR 1998b n. p. n. p. AZUR n. p.

EC 1999a V. fischeri B-11177 du NRRL 3 AZUR ! 20

NICMM 1999 V. fischeri n. p. AZUR n. p.

1. Par la suite identifié comme Vibrio fischeri.2. n. p. = non précisé.3. Déposé au Northern Regional Research Laboratory (NRRL), à Preoria (Illinois), États-Unis.4. Le 15 août 1996, la société Microbics est devenue AZUR Environmental.5. Les organismes d’essai, achetés sous forme de bactéries lyophilisées en flacon (« réactif bactérien »), se

conservent longtemps à !20 °C.

54

11 Reconstitution des bactéries lyophilisées

Document source Source de lasolution dereconstitution 1

Temp.(°C)

Durée devie utile

Tournoie-ment duflacon

Agitation desbactériesreconstituées

EC 1992 Microbics 3 ou 5 2 h 3 ou 4 fois 20 fois avec unepipette de 0,5 mL

MICROBICS 1992 Microbics n. p. 2 2 h 3 ou 4 fois 20 fois avec unepipette de 0,5 mL

MICROBICS 1995a Microbics n. p. 2 n. p. n. p. 10 fois avec unepipette de 0,5 mL

ASTM 1995 eau 5,5 ± 1 n. p. quelques fois 20 fois avec unepipette de 0,5 mL

EC 1996a AZUR n. p. 2 n. p. 3 fois 10 fois avec unepipette de 0,5 mL

AZUR 1997 AZUR n. p. 2 3 h n. p. 10 fois avec unepipette de 0,5 mL

AZUR 1998a AZUR n. p. 2 3 h 3 ou 4 fois $ 10 fois avec unepipette de 0,5 mL

AZUR 1998b AZUR n. p. 2 3 h 3 ou 4 fois $ 10 fois avec unepipette de 0,5 mL

EC 1999a eau distillée aulaboratoire

n. p. 2 3 à 4 h 3 ou 4 fois 20 fois avec unepipette de 0,5 mL

NICMM 1999 AZUR n. p. 2 4 h non 3 20 fois avec unepipette de 1 mL

1. Eau distillée, non toxique, vérifiée par un essai de toxicité aiguë avec les bactéries luminescentes.2. n. p. = non précisé. Température posée égale à 5 °C, puisqu’on utilise le photomètre M500 Analyzer (Microbics,

1995b).3. À l’aide d’une pipette, on porte, dans le flacon, de la solution de reconstitution de la cuvette se trouvant dans le

puits de réactif, on mélange 20 fois, puis on la porte, après pipettage, dans la cuvette se trouvant dans le puits deréactif et on laisse équilibrer 30 min.

55

12 Inoculation, incubation et filtration des solutions filles

Document source Volumed’inoculum (::::L)

Méthode demélange

Nombre debrassages

Duréed’incu-bation(min)

Temp.d’incub.(°C)

Colonnesdefiltration ?4

EC 1992 n. p. 1 n. p. n. p. 20 15 ± 0,3 oui

MICROBICS 1992 20 pipette de 1,5 mL 5 ou 6 fois 20 15 oui

MICROBICS 1995a 20 agitation, puispipette de 1,5 mL

n. p. 20 15 oui

ASTM 1995 20 agitation outourbillon

n. p. 20 15 ± 0,5 oui

EC 1996a 20 pipette de 1,5 mL 2 fois 20 15 oui

AZUR 1997 10 2 agitation n. p. 30 2 n. p. 3 non 5

AZUR 1998a 10 2 agitation n. p. 30 2 n. p. 3 non 5

AZUR 1998b 20 pipette de 1,5 mL n. p. 20 15 oui

EC 1999a 20 pipette de 1,5 mL 5 ou 6 fois 20 temp.ambiante(~ 20)

oui

NICMM 1999 20 à la main n. p. 20 15 oui

1. n. p. = non précisé.2. On inocule les cuvettes initiales renfermant 0,5 mL de diluant, mais non les solutions filles, et on les laisse se

stabiliser 15 min après mélange. On prend ensuite les lectures initiales. Commence une période d’incubation de30 min, après transvasement de 500 :L de chaque solution fille dans les cuvettes initiales et mélange à la pipette.

3. Posée égale à 15 °C, puisque les cuvettes sont dans le photomètre M500 Analyzer (Microbics, 1995b).4. Colonnes de séparation de sérum en polyéthylène, 13 mm, diamètre extérieur ; 11 mm, diamètre intérieur ; 67 mm

de hauteur, avec obturation flexible de 15 mm de diamètre à l’extrémité inférieure, où le filtre s’adapte au tubed’EPS (tableau 5). Le filtre lui-même, situé à l’extrémité inférieure, possède un diamètre de 6 mm et une épaisseurde 4 mm. La taille des pores est de 15 à 45 :m, selon le fournisseur, Evergreen Scientific, Los Angeles, CA, tél. :(323) 583-1331, no de la pièce : 208-3193-020.

5. Cette méthode d’essai n’emploie pas de filtration.

56

13 Mesure de la luminescence bactérienne

Document source Analyseur(photomètre)

Volumetransvasé(::::L)

Type decuvette

Conditions destabilisation 7

Cuvette delecture

EC 1992 Modèles 2055 et 500 de Microtox

500 en verre 5 5 min, 15 ± 0,3 °C insertionmanuelle

MICROBICS 1992 Modèle 500 deMicrotox

500 en verre 5 5 min 8 insertionmanuelle

MICROBICS 1995a Modèle 500 500 en verre 5 10 min 8 insertionmanuelle

ASTM 1995 photomètre 500 en verre 5 10 min, 15 ± 0,5°C notice d’emploidu photomètre

EC 1996a Modèle 500 500 en verre 5 n. p. 1, 8, 9 insertionmanuelle

AZUR 1997 n. p. 1, 2 5003 n. p. 1, 6 n. p. 1, 8, 10 insertionmanuelle

AZUR 1998a Modèle 500 500 3, 4 n. p. 1, 6 n. p. 1, 8, 10 insertionmanuelle

AZUR 1998b Modèle 500 500 n. p. 1, 6 10 min 8 insertionmanuelle

EC 1999a Modèle 500 deMicrotox

500 en verre 5 5 min 8 insertionmanuelle

NICMM 1999 Modèle 500 deMicrotox

500 en verre 5 n. p. 8 insertionmanuelle

1. n. p. = non précisé.2. Par hypothèse, le photomètre Model M500 Analyzer.3. Transvasement dans les cuvettes initiales, à partir de quoi commence la période d’incubation de 30 min. On agite

les cuvettes après 15 min. Inutile de secouer les cuvettes avant la lecture de la luminescence, parce que,secouement ou non, la CE50 tend à être semblable.

4. Prendre les lectures des cuvettes, sans secouement, quand les 30 min sont écoulées, puis, de nouveau, aprèssecouement, après 31 min écoulées, puis comparer les résultats de la CI50.

5. Verre borosilicaté jetable, 50 mm de longueur sur 12 mm de diamètre (11,75 mm nominaux) ; fond plat.6. Posé être le type habituel de verrerie, comme dans toutes les autres méthodes connexes.7. Après que la solution bactérienne filtrée a été transvasée, du tube mis à incuber vers la cuvette du photomètre, on

la laisse s’équilibrer à la température précisée pendant la période précisée.8. On pose la température égale à 15 ± 0,5 °C, si on utilise le photomètre Model M500 Analyzer (Microbics, 1995b).9. Posés égales à 10 min (le programme de saisie des données du logiciel attend 10 min avant de demander une

lecture).10. La durée de stabilisation fait partie de la période d’incubation de 30 min (v. tableau 12).

57

14 Emploi d’un sédiment de référence

Document source Utilisation et propriétés du sédiment deréférence

Emploi pour corriger lesvaleurs de l’échantillon ?2

EC 1992 utilisation obligatoire 1 ; essai parallèle ; lagranulométrie ainsi que la teneur en matièreorganique et inorganique devraient être semblables.

n. p. 3

MICROBICS 1992 facultatif ou souhaitable ; des échantillons« témoins » prélevés dans le même secteur sontutiles pour distinguer la toxicité.

n. p.

MICROBICS 1995a souhaitable ; apparier avec la matière d’essai pource qui concerne la granulométrie, la teneur enmatière organique et l’humidité.

facultatif ; donnéesd’analyse « réduites » parrapport à la référence.

ASTM 1995 recommandé ; important d’apparier lagranulométrie avec celle de la matière d’essai.

facultatif 4 ; donnéesd’analyse « réduites » parrapport à la référence.

EC 1996a facultatif n. p.AZUR 1997 recommandé ; apparier la granulométrie, la teneur

en matière organique et l’humidité avec celles de lamatière d’essai.

non 5

AZUR 1998a recommandé ; apparier la granulométrie, la teneuren matière organique et l’humidité avec celles de lamatière d’essai.

non 5

AZUR 1998b recommandé ; apparier la granulométrie, la teneuren matière organique et l’humidité avec celles de lamatière d’essai.

n. p.

EC 1999a recommandé ; des échantillons « témoins »prélevés dans le même secteur et possédant unegranulométrie semblable sont utiles pour distinguerla toxicité.

non

NICMM 1999 correction effectuée pour tenir compte de lafraction mesurée de limons et d’argiles dansl’échantillon à l’aide d’une équation obtenue àpartir de ses propres données et de celles deRingwood et al. (1997).

employer l’équation pourcorriger la CE 50.

1. L’essai exige au moins un échantillon de référence ou un sédiment témoin (« non contaminé »).2. Les valeurs corrigées de l’extinction lumineuse (gammas ; 'T) dans chaque solution fille sont calculées

automatiquement par le logiciel, qui applique les valeurs du sédiment de référence (Microbics, 1995) ou calculéespar l’application des équations 1 à 3 du § 6.1.

3. n. p. = non précisé.4. La correction effectuée par rapport à un échantillon de référence peut être importante pour les échantillons dont la

CI50 est supérieure à environ 0,25 % ; la correction est rarement justifiée pour les échantillons très toxiquespossédant une CI50 inférieure à environ 0,1 %. La décision d’utiliser cette correction est laissée à la discrétion duchercheur.

5. Choisir un échantillon de référence possédant des caractéristiques semblables (p. ex. granulométrie, teneur enmatière organique, humidité) à celle de la matière d’essai ; comparer les résultats de chacune lorsque l’on juge dela toxicité ou non de la matière d’essai (v. tableau 15).

58

15 Analyse des données et lignes directrices pour juger de la toxicité de l’échantillon

Document source Saisie desdonnées

Méthode d’analyse Effet ouparamètremesuré 4 (unités)

Lignesdirectricespour juger dela toxicité ? 5

EC 1992 par le logiciel manuelle ou par établissementd’un graphique par le logiciel 3

CI 50 (%poids/vol.)

non

MICROBICS 1992 par le logiciel manuelle ou par établissementd’un graphique par le logiciel

CExx (mg/L) non

MICROBICS 1995a par le logiciel manuelle ou par établissementd’un graphique par le logiciel

CExx (%poids/vol.)

non

ASTM 1995 à la main calculs et graphiques établis àla main

CIxx (%poids/vol.)

oui 6

EC 1996a par le logiciel graphique établi par le logiciel CIxx (mg/L) non

AZUR 1997 par le logiciel graphique établi par le logiciel CE 50 (%poids/vol.) ouCE 50 (mg/L)

oui 7

AZUR 1998a n. p. 1, 2 graphique établi par le logiciel CI 50 (mg/L) oui 8

AZUR 1998b n. p. 1, 2 n. p. 1, 3 n. p. non

EC 1999a par le logiciel graphique établi par le logiciel CI 50 (%poids/vol.)

oui 9

NICMM 1999 par le logiciel manuelle ou par établissementd’un graphique par le logiciel

CExx (%poids/vol.)

non

1. n. p. = non précisé.2. On pose que la saisie des données est faite par le logiciel.3. On pose que le graphique est construit par le logiciel.4. CE = concentration efficace ; CI = concentration inhibitrice.5. Lignes directrices particulières, pour juger, d’après l’effet mesuré, si la matière visée par l’essai est toxique ou

non.6. Une CI50 de 0,7% peut représenter un échantillon non toxique renfermant un fort pourcentage d’argiles. Dans ce

cas, une CI50 supérieure à 0,1% traduirait une faible toxicité de ce sédiment. Une CI 50 apparente d’au moins10% est fréquente dans les échantillons non toxiques renfermant moins de particules très fines, de sorte qu’unefaible toxicité serait une CI supérieure à 5%.

7. La matière d’essai est toxique lorsque sa CE50 est inférieure à celle de l’échantillon de référence.8. La matière d’essai est toxique lorsque sa CI50 est inférieure à celle de l’échantillon de référence.9. La matière d’essai est pratiquement non toxique lorsque sa CI50, corrigée pour tenir compte de l’humidité, est

supérieure à 0,5%, légèrement toxique lorsque le même paramètre, également corrigé, se trouve dans l’intervallede 0,1 à 0,5% et toxique lorsque sa CI50, corrigée pour tenir compte de l’humidité, est inférieure à 0,1%.

59

16 Normalisation et correction des données pour tenir compte de l’humidité, de lacouleur et de la turbidité

Document source Normalisation pourtenir compte del’humidité ?

Correction pour tenircompte de lacouleur ?

Correction pour tenircompte de laturbidité ?

EC 1992 n. p. 1 n. p. n. p.

MICROBICS 1992 non oui 3 oui 3

MICROBICS 1995a oui 2 oui 4 oui 4

ASTM 1995 facultatif facultatif 4, 5 n. p.

EC 1996a oui oui oui

AZUR 1997 n. p. non 6 non 7

AZUR 1998a n. p. non 6 non 7

AZUR 1998b n. p. non 6 non 7

EC 1999a oui 2 non non

NICMM 1999 oui 2 n. p. n. p.

1. n. p. = non précisé.2. Utiliser le logiciel Microtoxz pour saisir les données relatives aux sédiments humides ou secs, les corriger et

créer automatiquement un nouveau fichier des données corrigées, du poids humide au poids sec.3. Vérifier la concentration de l’échantillon à la valeur de la CE50 correspondant à la teinte visible ou à la turbidité

visible ; si elle correspond à une coloration ou à une turbidité évidente(s), effectuer le protocole de correction del’effet de la couleur (Colour Correction Protocol).

4. Effectuer la correction en employant la valeur correspondante d’un échantillon de référence, conformément à lanote 2 du tableau 14 de la présente annexe.

5. Cette correction n’est pas recommandée lorsque l’on possède les résultats d’essais effectués sur un échantillon deréférence convenable.

6. Comme la couleur de l’échantillon de référence et celle de l’échantillon ou des échantillons d’essai devraient êtresemblables, l’effet net de la couleur serait négligeable.

7. Comme la turbidité de l’échantillon de référence et celle de l’échantillon ou des échantillons d’essai devraient êtresemblables, l’effet net de la turbidité serait négligeable.

60

17 Maîtrise de la qualité

Document source Toxique deréférence

Sédimenttémoin ?

Critère de validité de l’essai de toxicité dusédiment

EC 1992 phénol, zinc,bichromatede potassium,laurylsulfatede sodium

oui 2 Estimation numérique valide de la CIp, d’après lesconcentrations présentant une inhibition de laluminescence inférieure et supérieure à l’inhibitioncorrespondant à la CIp.

MICROBICS 1992 phénol, zinc n. p. 1, 3 n. p. 1

MICROBICS 1995a n. p. 1 n. p. 1 Si la valeur gamma de chaque solution fille estsupérieure à 1, il faut reprendre l’essai en utilisantmoins de 7 g dans la solution mère.

ASTM 1995 phénol, zinc oui (ce peutêtre lesédiment deréférence)

Si l’écart-type de la lecture de la luminescence danstrois solutions témoins s’écarte d’environ 12 % de lamoyenne, on devrait considérer l’essai commeinacceptable 4.

EC 1996a n. p. 1 n. p. 1 n. p. 1

AZUR 1997 n. p. 1 n. p. 1 n. p. 1, 5

AZUR 1998a n. p. 1 n. p. 1 n. p. 1, 5

AZUR 1998b n. p. 1 n. p. 1 n. p. 1

EC 1999a sédimentétalon HS-6

sédiment« noncontaminé »du bancRoberts

Les CI 50 correspondant à un sédiment « noncontaminé » et au sédiment HS-6 se trouvent àl’intérieur de la zone de confiance (± 2 F) des cartesde contrôle établies respectivement pour ces deuxsédiments.

NICMM 1999 zinc oui 2 Sulfures de l’eau de porosité : < 16,5 mg/L ; pH del’eau de porosité : 6,5-7,5 (± 0,5) ; salinité de l’eaude porosité : > 8 ‰ ; CE 50 du toxique de référence(ZnSO4) à l’intérieur de la zone délimitée par ± 3 Fde la carte de contrôle ; CE 50 du sédiment témoin :< 1 000 unités de toxicité.

1. n. p. = non précisé.2. L’essai exige l’emploi d’au moins un échantillon de sédiment témoin ou de sédiment de référence (« non

contaminé »).3. Ce mode opératoire fait allusion à des « échantillons témoins » ; cependant, ceux-ci sont décrits comme des

« échantillons provenant des parages », qui pourraient présenter une toxicité « naturellement très élevée » (cettedescription correspond donc à la notion d’échantillon de référence).

4. Il est recommandé d’utiliser un toxique de référence pour valider les données obtenues avec différents lots deréactif (c’est-à-dire différents lots de bactéries lyophilisées) ou pour les lots utilisés pendant une longue période.

5. Si la valeur de gamma correspondant à chaque solution fille est supérieure à 1,0, on pourrait devoir répéter l’essaien utilisant moins de 7 g dans la solution mère (voir le tableau 5 de la présente annexe). Inversement, si la valeurgamma correspondant à chaque concentration de solution fille est inférieure à 1,0, on pourrait devoir répéterl’essai en utilisant plus de 7 g dans la solution mère.

61Annexe F

Fiche de laboratoire employée pour les essais de toxicité des sédiments employantV. fischeri

Projet :

Méthode d’essai : Analyste :

Lot de réactif : Date depéremption :

Date del’essai

Nom defichieret/oud’échan-tillon

Date deprélève-ment surle terrain

Date deréceptionau labo-ratoire

Temp. àl’arrivée(°C)

Heurederecons.duréactif 1

Heuredudébutdel’essai

Notes 2

1.Délai de reconstitution du réactif bactérien.2.Précisions sur les paramètres tels que la couleur de l’échantillon, son odeur et ses manipulations (p. ex.

tri ou tamisage de l’échantillon, espèces éliminées, taille des ouvertures du tamis-presse, problèmes,modifications).