Modifications post-traductionnellesde la matrice extracellulaire et

cellules inflammatoires

Journées Pédagogiques et ScientifiquesMatrice Extracellulaire

7-8 septembre 2006Faculté de Pharmacie, Marseille

Roselyne GARNOTEL

Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, CNRS UMR 6198, UFR Médecine, IFR 53 Biomolécules, Reims

“Biomolécules”

INTRODUCTION

1. Recrutement1. Recrutement

2. Adhésion2. Adhésion3. Diapédèse3. Diapédèse

4. Contact collagène/cellules 4. Contact collagène/cellules sanguines sanguines

(RGD)(RGD)

5. Explosion respiratoire 5. Explosion respiratoire (DGGRYY sur (DGGRYY sur 11CB6)CB6)

Libération de MMPsLibération de MMPs

collagène Icollagène I

polynucléairepolynucléaireneutrophileneutrophileou monocyteou monocyte

cellules cellules endothélialesendothéliales

membranemembranebasale ou basale ou

collagène IVcollagène IV

COMPARTIMENT INTRAVASCULAIRE

MATRICEEXTRACELLULAIRE

± MODIFIEE

Interactions collagènes/cellules sanguines

télopeptide N-terminal télopeptide C-terminal

zone hélicoïdale ( triple hélice )

Le collagène de type I

DGGRYY

RGD

Demi-vie : 15 ans

Les cellules inflammatoires

Les polynucléaires neutrophiles :principales cellules de défense de l’organismesont impliqués dans les réponses inflammatoires, la phagocytose bactérienne…

Les monocytes :sont impliqués dans les réponses inflammatoires et la production de cytokines régulatricessont transformés en macrophages tissulaires qui sont les cellules pivot de l’inflammation chronique

sont en contact du collagène I, le composant majoritaire de l’espace sous-endothélial

Famille des intégrinesStructure des intégrines

2

Les récepteurs de type intégrine

p22 phox

gp91phox

p21 rac

GDPGDI p67 phox

p47 phox

p40 phox

NADPH NADP+ + H+

O2O2

-

CYTOSOL

MEMBRANE PLASMIQUE

p21 rac

GTP

GDI

p47 phoxp67 phox

p40 phoxP

P

P

La NADPH oxydase

- dégradent au moins un des composants de la matrice

extracellulaire

- sont synthétisées sous forme latente appelée proMMP

- nécessitent une activation extracellulaire par clivage du

prodomaine

- contiennent un site de liaison au zinc dans le domaine

catalytique

- sont inhibées par les TIMPs (inhibiteurs spécifiques

tissulaires)

-sont divisées en familles dont une est celle des

gélatinases

(A et B, ou MMP-2 et MMP-9 )

Les métalloprotéinases matricielles

peptide signal pro-peptide domaine

catalytique

Structure primaire

des gélatinases

région charnière

domaine hémopexine

domaine fibronectinetype II Zn2+

Les métalloprotéinases matricielles

t-PAu-PA

plasminogène plasmine

pro-collagénase(proMMP-1)

pro-stromélysine(proMMP-3)

Stomélysine(MMP3)

collagénase(MMP1)

gélatinase B(MMP-9)

pro-gélatinase B(proMMP-9)

TIMPsTIMPs

2-macroglobuline

PAIs

La cascade protéolytique

- fait partie de la famille des Sérine protéinases.- fait partie de la famille des Sérine protéinases.

- contient un domaine analogue à l’EGF, un domaine - contient un domaine analogue à l’EGF, un domaine

« kringle » et un domaine catalytique.« kringle » et un domaine catalytique.

- se fixe à un récepteur membranaire (uPAR).- se fixe à un récepteur membranaire (uPAR).

EGF Kringle protéinaseN C

protéinase

S-S

N Cu-PA de

faible MM (30 kDa)

EGF Kringle protéinase

S-S

N C

Simple chaîne (sc-uPA)

Double chaîne (tc-uPA)

u-PA de haute MM (55 kDa)

L’u-PA (urokinase type-Plasminogen Activator)

Interactions entre le collagène de type I et cellules inflammatoires

Interactions entre les polynucléaires et le collagène de type I

Adhésion des polynucléaires au collagène de type IActivation des polynucléaires au contact du collagène I avec

libération de radicaux libres oxygénésexocytose des granules

Implication de l’intégrine LFA-1 ou L2 ou CD11a/CD18Mise en évidence des voies de transduction impliquées

GARNOTEL, R, MONBOISSE, J.C., RANDOUX, A., HAYE, B., BOREL, J.P.The binding of type I collagen to LFA-1 integrin triggers the respiratory burst of human polymorphonuclear neutrophils. Role of calcium signalling and tyrosine phosphorylation of LFA-1.J. Biol. Chem., 1995, 270, 27495-27503.

CAS pepsiné CAS

Interactions entre les monocytes et le collagène de type I

Adhésion des monocytes au collagène de type IActivation des monocytes au contact du collagène I avec

libération de radicaux libres oxygénés

Implication de l’intégrine gp150/95ou X2

GARNOTEL, R., RITTIE, L., POITEVIN, S., MONBOISSE, J.C., NGUYEN, P., MAQUART, F.X., RANDOUX, A., GILLERY, P.Human blood monocytes interact with type I collagen through x2 integrin (CD11c-CD18, gp 150-95).J. Immunol., 2000, 164, 5928-5934.

MMP

uPA

cytokines

uPA

Plasminogène -----> plasmine

pro-MMP9 -----> MMP9

Time (h)

Plastic Type I collagen

6 24 48 6 24 48

MMP-9

Pro-MMP9

LMW uPA

Time (h)Plastic Type I collagen

6 24 48 6 24 48

LMW uPA

HMW uPA

Libération de pro-MMP9 et d’uPAActivation de la pro-MMP9 en MMP9

0

2000

4000

6000

8000

0 2 4 6 8 10 12

Time (hours)

pg/m

l

TNF-

IL-1

IL-6

Libération d’IL-6, IL-1 et TNF-

Plast Plast PlastColl Coll Coll

1 h 2 h 3 h

Hetero-dimers

Homo-dimers

1 2 3

C

PD

NA

CU

Pro-MMP9

ControlPDTC

100 µMNAC

10 mMCurcumin

50 µM

HMW uPA

LMW uPA

Implication de NF-B

Les principales modifications post-traductionnelles

de la matrice extracellulaire

Remaniements moléculairesRemaniements moléculaires

Altérations structurales et fonctionnelles des protéinesAltérations structurales et fonctionnelles des protéines

Mécanismes de maturation / vieillissement Mécanismes de maturation / vieillissement

impliqués en pathologieimpliqués en pathologie

Fixation non enzymatique de métabolites Fixation non enzymatique de métabolites simplessimples

Oses et dérivés : glycationOses et dérivés : glycation

Urée et dérivés : carbamylationUrée et dérivés : carbamylation

Dérivés lipidiques ou de glycation : oxydationDérivés lipidiques ou de glycation : oxydation

Modifications post-traductionnelles des proteines

Pathologies « post-traductionnelles »

Diabète

Glycation

Oxydation

Insuffisance

rénale

Athérosclérose

Oxydation

Carbamylation

Glycation

Oxydation

Vieillissement

physiologique

Glycation / glycoxydation non enzymatique

Réaction chimique entre :

groupement NH2 (-NH2 terminal ou -NH2-lysine

d’une

protéine

ose simple (glucose)

Réaction générale :

In vitro : « brunissement des protéines » « réaction

de Maillard », 1912

In vivo : diabète (1960), vieillissement

physiologique et autres pathologies (1980)

toutes les protéines

Réaction spontanée, irréversible et cumulative (durée de

vie)

Produits d’Amadori

Oxydations,Clivages,Pontages

Produits intermédiaires(aldéhydes réactifs)

Produits avancés de la glycation(«advanced glycation end products» ou «AGE» ou «Produits de Maillard»)

Pontages,Altérations…..

Glycation + Oxydation = Glycoxydation

Base de Schiff

Glucose +

Protéine

Glycation / glycoxydation

La carbamylation est une modification post-traductionnellenon enzymatique des protéines, par fixation d’acide isocyaniqueprovenant de la décomposition de l’urée

NHNH22 CC NHNH22

OO

NHNH44++ ++

UréeUrée CyanateCyanate

CC-- NN OO

CCHNHN OORR NHNH22 ++ NN CC NHNH22

OOHH

RR

Acide Acide IsocyaniqueIsocyanique

ProtéineProtéine(Lysine (Lysine -NH-NH22))

Protéine carbamyléeProtéine carbamylée(Homocitrulline)(Homocitrulline)

Carbamylation

Augmentation dans l'insuffisance rénale chronique Augmentation dans l'insuffisance rénale chronique (IRC)(IRC)

Perte de la fonction des protéines Perte de la fonction des protéines

Impliquée dans des réactions délétèresLDL carbamylées (Athérosclérose au cours de l'IRC)Collagène carbamylé

(Athérosclérose, inflammation et infection au cours de l'IRC)

Carbamylation des protéines

Les fonctions des cellules sont modulées par des stimuli provenant d’autres types cellulaires, mais aussi d’interactions spécifiques avec les protéines de la matrice extracellulaire (MEC).

Les protéines de la MEC sont particulièrement sujettes aux modifications post-traductionnelles, en raison de leur longue durée de vie.Les interactions cellules – matrice ne peuvent se concevoir sans prendre en compte ces modifications.

Rôle central de la matrice extracellulaire en pathologie

Interactions entre le collagène de type I modifié et

cellules inflammatoires

La carbamylation du collagène de type I

Collagène de type I (tendons de queues de rat) incubé pendant 2, 6 et 24 heures à

37°C dans un tampon phosphate 0,15 M (pH 7,4) contenant 0,1 M KCNO

1(I) -

2(I) -

T2h C2h T6h C6h T24h C24h

Taux de carbamylation du collagène I Hydrolyse acide (HCl 6 M – 18 h à 110°C)

Analyse de la composition en acides aminés

11111616Carb 24hCarb 24h

442323Carb 6hCarb 6h

222525Carb 2hCarb 2h

002727TémoinTémoin

HomocitrullinHomocitrullinee

LysineLysine

Résultats exprimés en nombre de résidus pour 1000

Modifications de la composition en acides aminés et de la migration

électrophorétique

Mobilité électrophorétiqueSDS-PAGE 5%

Témoin

10 µm10 µm

Carb 2h

10 µm10 µm

Carb 24h

10 µm10 µm

Carb 6h

10 µm10 µm

Modifications de l’aspect du réseau de fibres formé par le collagène carbamylé

11(CB3) -(CB3) -

11(CB6) -(CB6) -

11(CB7-8) -(CB7-8) -22(CB4) -(CB4) -

22(CB3-5) -(CB3-5) -

Clivage du collagène témoin ou carbamylé 6 h par le bromure de cyanogène (CNBr)Analyse des peptides par SDS-PAGE 12,5 % (Mono- et Bidimensionnelle)

TémoinTémoin Carb 6hCarb 6h

Electrophorèse 1D Electrophorèse Bidimensionnelle

11(CB6) -(CB6) -

11(CB6) -(CB6) -

TémoinTémoin

Carb 6hCarb 6h

pHi : 3pHi : 3 10 10

Mise en évidence de la carbamylation du peptide 1CB6

Interactions entre les polynucléaires et le collagène de type I carbamylé

Réd

ucti

on

du

NB

T (

Ab

s 5

60

nm

)Chaque puits (32mm²) est recouvert par 25 µg de collagène témoin ou carbamylé

Incubation des PNN pendant 2 heures à 37°C – Réduction intracellulaire du NBT (Abs 560 nm)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

PlastiquePlastique Coll TémoinColl Témoin+ fMLP 10+ fMLP 10-7-7 M M

Coll TémoinColl Témoin Coll Carb 2hColl Carb 2h Coll Carb 6hColl Carb 6h Coll Carb Coll Carb 24h24h

Inhibition de l’activation des PNN par le collagène I carbamylé

11(CB6) (CB6)

SDS-PAGE 12,5% ADHESION ACTIVATION

MM Témoin

Carb6h Pepsiné

Coloration au Bleu Coomasie R250

Témoin

Carb6h Pepsiné

Incubation : 30 minWestern Blot Anti-

CD11a, CD11b et CD18

Témoin

Carb6h Pepsiné

Incubation : 1hRéduction du NBT

La carbamylation du peptide 1CB6 entraîne l’inhibition de l’activation des polynucléaires

CollagèneCollagène Sans Sans anticorpsanticorps IgG1 ContrôleIgG1 Contrôle Anti-CD11aAnti-CD11a Anti-CD18Anti-CD18

Collagène TémoinCollagène Témoin 0,182 0,182 ± ± 0,0140,014 0,171 0,171 ± 0,008± 0,008 0,110 0,110 ± 0,012 ± 0,012

**** 0,047 0,047 ± 0,021 ± 0,021

****

Collagène Collagène Carbamylé 2hCarbamylé 2h

0,196 0,196 ± ± 0,0370,037

0,183 0,183 ± 0,033 ± 0,033 NSNS 0,133 0,133 ± 0,014 *± 0,014 * 0,035 0,035 ± 0,030 ± 0,030

****

Collagène Collagène Carbamylé 6hCarbamylé 6h

0,178 0,178 ± ± 0,0230,023

0,160 0,160 ± 0,026 ± 0,026 NSNS

0,119 0,119 ± 0,024 ± 0,024 ****

0,039 0,039 ± 0,027 ± 0,027 ****

Collagène Collagène Carbamylé 24hCarbamylé 24h

0,165 0,165 ± ± 0,0120,012

0,162 0,162 ± 0,025 ± 0,025 NSNS 0,118 0,118 ± 0,027 *± 0,027 * 0,012 0,012 ± 0,017 ± 0,017

****

*: p<0,05 ; ** : p<0,01

Mesure de l’adhésion des PNN au collagène carbamylé en présence d’anticorps anti-LFA-1 (coloration au violet cristal)

Interaction des polynucléaires avec le collagène carbamylé via LFA-1

(CD11a/CD18)

Etude de la phosphorylation de p125FAK suite à un contact entre PNN et collagène carbamylé par Western Blot

p125FAK

p125FAK P [Y397]

-- -- TémoinTémoin Carb 24hCarb 24h

Temps d’incubation (min) :Temps d’incubation (min) : 00 22 22 22

Inhibition de la phosphorylation de p125FAK suite au contact des polynucléaires avec le

collagène carbamylé

JAISSON, S., LORIMIER, S., RICARD-BLUM, S., SOCKALINGUM, G.D., DELEVALLEE-FORTE, C., KEGELAER, G., MANFAIT, M., GARNOTEL, R., GILLERY, P.Impact of carbamylation on type I collagen conformational structure and its ability to activate humanPolymorphonuclear neutrophils.Chem. Biol., 2006, 13, 149-159.

CAS

2 µm

CAS carbamylé

2 µm

Interactions entre les monocytes et le collagène de type I carbamylé

Carbamylation du collagène et monocytes

Carbamylation du collagène modifie les fonctions biologiques des cellules

inflammatoiresGARNOTEL, R., SABBAH, N., JAISSON, S., GILLERY, P.Enhanced activation of and increased production of matrix metaloproteinase-9 by human blood monocytesupon adhering to carbamylated collagen.FEBS Letters, 2004, 563, 13-16.

CONCLUSION

+/-

Quel(s) site(s) ? Quelle(s)

modification(s) ?

Protéine

Quel(s) mécanisme(s) ?

Quel(s) traitement(s) ?

+/-

Cellules

Quelle(s) fonction(s) ?

IBCP - CNRS UMR 5086 - Lyon

Pr. Sylvie Ricard-Blum

Unité Médian - CNRS UMR 6142 - Reims

Pr. Michel Manfait - Dr. Ganesh Sockalingum - Dr. Grégory Kegelaer

Laboratoire de Biochimie Médicale et Biologie Moléculaire - CNRS UMR 6198 – Matrice Extracellulaire et Régulations Cellulaires - Reims

Pr. Ph. GILLERY – Pr. F.X. MAQUART – Dr. S. JAISSON – Dr. C. DELEVALLEE-FORTE – Dr. N. SABBAHDr. F. TOURE – Dr. A. SZCZYHEL

Centre d’étude des Biomatériaux et Interfaces – INSERM ERM 0203 - Reims

Dr. S. LORIMIER