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SOPHIE BOIVIN

MODELE ANIMAL DE SARCOÏDOSE PULMONAIRECHEZ LE RAT PAR L'ADJUVANT DE FREUNDCOMPLET :ANALYSES DE PARAMÈTRES DE

L'INFLAMMATION ET DE L'EFFICACITÉ D'UNAGONISTE NICOTINIQUE COMME THÉRAPEUTIQUE

Mémoire présentéà la Faculté des études supérieures de l'Université Laval, Québec

dans le cadre du programme de maîtrise en médecine expérimentalepour l'obtention du grade de maître es sciences (M.Sc.)

FACULTE DE MEDECINEUNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

2007

© Sophie Boivin, 2007

II

Résumé

La sarcoïdose est une maladie inflammatoire multisystémique s'attaquant aux poumons

dont l'étiologie demeure inconnue. Elle est caractérisée par l'accumulation de granulomes non-

caséeux dans les organes touchés. L'appareil pulmonaire est fréquemment atteint par la

sarcoïdose et d'importants changements de population cellulaire sont observés dans le fluide

récolté lors de lavages bronchoalvéolaires (LBA). Une étude précédente a démontré la

possibilité d'utiliser un modèle animal de rat pour l'étude de cette maladie. Cette étude a

démontré que l'adjuvant complet de Freund (CFA) administré par voie intraveineuse (IV) à deux

reprises induit l'apparition de granulomes qui furent, par la suite, analysés par tomographie

axiale. Le projet de recherche décrit dans ce mémoire a visé à développer, à partir du modèle

déjà connu, un modèle mieux toléré par les animaux et à analyser les caractéristiques cellulaires,

histologiques et immunologiques de celui-ci. De plus, certains agonistes des récepteurs

nicotiniques, molécules ayant des propriétés anti-inflammatoires, seront testés sur le modèle

comme traitement potentiel. Il fut démontré lors de cette étude qu'une seule injection de CFA

cause l'apparition de granulomes dans les poumons des animaux et que cette injection est bien

tolérée par les animaux. Les analyses cellulaires des LBA des animaux malades ont permis de

noter une forte similarité avec la sarcoïdose pulmonaire humaine. De plus, le profil

immunologique des animaux était très près de la pathologie humaine. Finalement, l'utilisation

des agonistes nicotiniques n'a pas permis d'atténuer l'inflammation reliée à cette pathologie

granulomateuse.

mAvant-propos

Ce mémoire de maîtrise résume le travail de recherche et de laboratoire accompli durant l'année et demie

que dura ma maîtrise. Il est divisé en cinq chapitres permettant de comprendre la pathologie à laquelle je m'attarde,

de mesurer la nécessité d'un modèle animal, d'une thérapie efficace et finalement de démontrer les progrès effectués

dans ces différentes voies. Un article scientifique portant sur ces recherches sera rédigé sous peu et présenté pour

publication.

Je suis très heureuse d'avoir pris la décision de faire une maîtrise en médecine expérimentale. Ce fut une expérience

extrêmement enrichissante qui m'a permis de mesurer mes capacités et mes limites. Mais surtout cette maîtrise m'a

dirigé vers la carrière future auquel je me dédie. Grâce au Dr. Cormier qui m'a rapidement poussé à présenter mes

résultats lors de différents congrès, j 'ai pu constater que la communication était mon avenir. Merci au Dr. Cormier

qui m'a fait confiance dès le début et qui m'a permis de mesurer à quel point j'aime transmettre des connaissances

scientifiques. Je le remercie aussi pour son écoute lorsque j'avais des questionnements et pour ses nombreux

conseils prodigués avec beaucoup de compréhension. Une mention spéciale pour les cours de jardinage.

Je ne pourrais passer sous silence l'aide indéfectible d'Evelyne Israël-Assayag qui était toujours présente pour me

conseiller et me diriger dans mes travaux. J'ai apprécié particulièrement ta porte qui m'étais toujours ouverte et

l'attention que tu porte à tes étudiants. Je voudrais aussi dire un gros merci à Marie-Josée Beaulieu pour ses mimes

qui m'ont immédiatement mise en confiance, mais surtout pour son aide lorsque mes journées me semblaient

irréalisables! Une mention spéciale à Mélissa Girard qui a été pour moi une figure très importante lors de ma

maîtrise. Tu as toujours répondu à mes mille et une questions, tu m'as soutenue, appuyée, bref tu as toujours été

présente pour moi. Mille merci! Un gros remerciement à tout le reste de l'équipe Cormier passée et présente; Marie-

Renée, Geneviève, Arnold, Yakob, Annick et Magalie. Et comment passer sous silence l'aide que m'ont apporté

Justin, Guy et Sébastien les techniciens en santé animale du Centre de recherche. Merci au Centre de Recherche de

l'Hôpital Laval pour le soutien financier qu'il m'a accordé.

Finalement, un gros gros remerciement à mes parents Marie et Gaétan qui m'ont appuyée dans mes démarches et à

ma sœur Catherine qui était toujours présente pour moi.

Merci à tous ceux qui ont contribué à mon succès!

IV

Table des matières

Pages

Résumé IIAvant-propos IIITable des matières IVListe des tableaux VIListe des figures VIIListe des abréviations VIII

Chapitre 1 ; Introduction

1.1 Pathologie; la sarcoïdose 2

1.2 La prévalence 3

UÉtiologie 3

1.3.1 Facteurs génétiques 3

1.3.2 Agents infectieux 4

1.3.3 Agents organiques et inorganiques 5

1.4 Symptômes 5

1.5 Diagnostique 6

1.6 Traitements 7

1.7 Granulome, contenu et formation 9

1.8 Caractéristiques cellulaires 10

1.8.1 Le lymphocyte T 11

1.8.2 Le macrophage alvéolaire 12

1.8.3 Le neutrophile 12

1.9 Les cytokines et chimiokines 13

1.9.1 L'interleukine-1 13


1:9.3 L'interleukine-4 14




V




1.9.10 L'interféron-gamma 16

1.9.11 TNF 17

1.10 Distinction entre sarcoïdose, alvéolite allergique et tuberculose 17

1.10.1 Alvéolite allergique 17

1.10.2 Tuberculose 18

1.11 Modèles animaux de granulomes pulmonaires 18

1.11.1 Le béryllium 19

1.11.2 L'adjuvant complet de Freund 19

1.12 Nicotine 20

1.12.1 Récepteurs nicotiniques 20

1.12.2 Agonistes des récepteurs nicotiniques 21

Chapitre 2; Objectif général et objectifs spécifiques 23

Chapitre 3; Méthodologie 25

Chapitre 4; Résultats .30

Chapitre 5; Discussion et conclusion 42

Bibliographie 48

VI

Liste des tableaux

Pages

Tableau 1.1 Pourcentage des organes touchés chez les patients

Tableau 1.2 Symptômes associés à la sarcoïdose 5

Tableau 1.3 Résultats des tomographies axiales effectuées au jour 0 et 33 sur les 31

rats du groupe contrôle

Tableau 1.4 Résultats des tomographies axiales effectuées au jour 0 et 33 sur les 32

rats des groupes CFA et DMPP

VIIliste des figures

PagesFigure 1.1 Schéma d'un granulome non-caséeux 9

Figure 1.2 Récepteur nicotinique 21

Figure 1.3 Tomographie axiale d'un rat des groupes contrôle et CFA 30

Figure 1.4 Résultats obtenus en tomographie axiale 32

Figure 1.5 Coupes histologiques de poumons de rats des groupes contrôle et CFA 33

Figure 1.6 Résultats obtenus en histologie 33

Figure 1.7 Comptes cellulaires totaux et différentiels 34

Figure 1.8 Pourcentages des cellules en présence dans le LBA 35

Figure 1.9 : Marquage CD4 sur les cellules des LBA 36

Figure 1.10 : Ratio CD4/CD8 36

Figure 1.11: Résultats d'histologie après 45 jours 37

Figure 1.12 : Score histologique 37

Figure 1.13 : comptes cellulaires totaux et différentiels 38

Figure 1.14 : Pourcentages des cellules en présence dans le LBA 39

Figure 1.15: Marquage des cellules CD4+ et CD8+ 40

Figure 1.16: Analyses immunologiques 40

VIII

Liste des abréviations

TNF

IL

ACE

TAP

NRAMP

LBA

CD

PMN

NK

1FN

CFA

IV

ADN

AcH

Ca

DMPP

seIP

tumor necrosis factor

interleukine

angiotensin converting enzyme

transporter-associated with antigen processing

natural resistance-associated macrophage protein

lavage bronchoalvéolaire

cluster of différenciation

cellule polymorphonucléaire

natural killer

interferon

adjuvant complet de Freund

intraveineuse

acide désoxyribonucléique

acétyleholine

calcium

diméthylphénylpiperazinium

sous-cutanée

intrapéritonéale

Chapitre 1

Introduction

1. INTRODUCTION

1.1 Pathologie; la sarcoïdose

La sarcoïdose est une maladie granulomateuse multisystémique décrite depuis

125 ans et dont on ignore encore à ce jour la cause exacte [5]. Cette pathologie est

caractérisée par une réponse exagérée du système inflammatoire dirigée contre un

antigène non-identifié. La maladie peut toucher de nombreux organes tels que le

cœur, la peau, les yeux, le foie et les poumons [6]. Dans la majorité des cas de

sarcoïdose, il y a présence d'une atteinte pulmonaire et d'une atteinte des ganglions

médiastinaux. En effet, l'appareil respiratoire est l'organe touché dans

approximativement 90% des cas de sarcoïdose; on parle alors de sarcoïdose

pulmonaire [2-3].

Tableau 1.1 : Pourcentage des organes touchés chez les patients

Organes % des patients

Ganglion lymphatique médiastinal 95-98Poumon >90Foie 50-80Rein 40-80Yeux 20-50Ganglion lymphatique périphérique 30Peau 25Système nerveux 10Coeur 5

Adapté de la référence [1]

La sarcoïdose peut évoluer de différentes façons selon, entre autre, la gravité de

l'atteinte, la durée de la maladie et le patient lui-même. Il existe un processus de

résorption spontanée de la maladie qui ne nécessite aucun traitement et ne laisse

aucune séquelle aux personnes atteintes. Par contre, un pourcentage des malades va

développer une forme plus grave de la maladie nécessitant un traitement et pouvant

évoluer vers une forme chronique et potentiellement mortelle [1-2-6]. La sarcoïdose

peut donc être fatale, son taux de mortalité variant de 1 à 5% [1-2].

1.2 Prévalence

La sarcoïdose est une maladie observée partout à travers la planète avec une

prédominance sur le continent africain et asiatique. Elle frappe légèrement plus

souvent les femmes, peut survenir à tout âge, mais semble plus fréquente entre la

vingtaine et la quarantaine. De plus, il semble y avoir une prédominance chez les

non-fumeurs [1-2-6]. La prévalence moyenne de la maladie varie de 1 à 40 cas pour

100 000 personnes, mais peut atteindre 50 cas et plus dans les pays à forte

prédominance [1-2-6]. Par contre, la prévalence de la maladie est fort probablement

sous-estimée. En effet, les symptômes étant non spécifiques, variables et la rémission

souvent spontanée, la sarcoïdose est parfois non diagnostiquée et même condondue

avec d'autres pathologies. Finalement, des agrégations spatiales et familiales sont

parfois observées. Il est donc probable que certains facteurs environnementaux

(exposition à des agents) ou des prédispositions génétiques puissent influencer à la

hausse la prévalence de la sarcoïdose [1-2-4].

1.3 Etiologie

L'étiologie de la sarcoïdose demeure l'un des aspects les moins bien connus

de la maladie. De nombreuses recherches sont présentement en cours afin

d'identifier un agent causal [1-2-3-4]. Étant donné la variabilité des symptômes

cliniques, une possible susceptibilité génétique et la similarité de la maladie à

d'autres maladies granulomateuses, il est très difficile d'arriver à une conclusion

valable [1-2]. Ainsi, diverses hypothèses sont avancées pour expliquer l'apparition

de la maladie.

1.3.1 Facteurs génétiques

II est de plus en plus accepté que divers facteurs génétiques soient impliqués dans le

développement de la sarcoïdose. Des prédispositions génétiques pourraient être

responsables, entre autres, des divers tableaux cliniques présentés par la maladie. De

plus, cela expliquerait les prévalences variables entre les différents groupes ethniques

ainsi que la présence d'agrégations familiales dans des populations à prévalence

normale[l-2]. Ces prédispositions semblent reliées à la régulation de la réponse

immunologique à un antigène ou à la fonction des lymphocytes T [2]. Des études sur

plusieurs gènes (sujets atteints ou sains) furent effectuées et quelques uns ont plus

particulièrement attiré l'attention. Des polymorphismes de gène codant pour des

cytokines proinflammatoires et autres molécules semblent fréquemment associés à la

pathologie. Ces polymorphismes furent retrouvés, par exemple, dans les gènes

codant pour : le tumor necrosis factor-oc (TNF-a), l'interleukine-1 (IL-1),

l'angiotensin converting enzyme (ACE), le récepteur de la vitamine D, le transporter

associated with antigen processing (TAP) et le natural résistance associated

macrophage protein (NRAMP) [1-2-4]. Ce type de mutation peut mener à une

susceptibilité à la sarcoïdose et non à la maladie elle-même. Grâce à ces découvertes,

il fut suggéré que les différentes formes prises par la maladie pourraient être

directement reliées aux différents haplotypes . En dernier lieu, il a été démontré chez

certains patients atteints la présence de microsatellite d' acide désoxyribonucléique

(ADN) instable ou une perte d'hétérozygosité [2].

1.3.2 Agents infectieux

Certaines observations suggèrent qu'une exposition à un agent spécifique présent

dans l'environnement pourrait conduire au développement de la sarcoïdose [4]. La

prévalence de la sarcoïdose semble variable selon la saison, le lieu géographique et

même l'occupation du patient. Cela laisse supposer la présence d'un agent dans

l'environnement pouvant contribuer à déclencher le processus associé à la maladie

[2]. Dans le cas d'une sarcoïdose pulmonaire, l'inhalation de particules présente dans

l'air ouvre directement une porte d'entrée à l'agent étiologique. Plusieurs agents

infectieux peuvent être impliqués dans la maladie comme : les virus (herpès,

rétrovirus, Epstein-Barr), les bactéries (Propionibacterium acnés, Borrelia

burgdorferi, Mycoplasma, Chlamedia, Nocardia) et les mycobactéries (Mycobacteria

tuberculosis, Mycobacteriaparatuberculosis) [1-2-5].

Les anticorps contre ces agents ont tous été détectés dans les sérums de patients

atteints de sarcoïdose. Par contre, il est possible que cela soit dû à une infection

accessoire (autre) et non à une réponse spécifique à l'agent causal [1].

1.3.3 Agents organiques et inorganiques

Une dernière hypothèse explorée est l'inhalation d'un agent inorganique (béryllium,

zirconium et aluminium) ou organique qui une fois internalisé par les macrophages

agissent comme des antigènes [2-7]. Ces agents sont difficilement dégradable et

demeurent donc intacts dans les macrophages. En définitive, il n'existe toujours

aucune preuve irréfutable identifiant l'agent ou les agents mis en cause dans cette

pathologie [4].

1.4 Symptômes

Les symptômes associés à la sarcoïdose pulmonaire sont très nombreux et

variables. Principalement, cette variabilité dépend de l'origine ethnique, de la durée

de la maladie, du ou des organes touchés et de la gravité de l'atteinte granulomateuse

[1-2-6]. De plus, il existe trois manifestations de la sarcoïdose dont les tableaux

cliniques sont différents [1-2].

Tableau 1.2 : Symptômes associés à la sarcoïdose

Manifestations cliniques Fréquence (%)Symptômes respiratoires 30Toux sèche 30Dyspnée 28Douleur thoracique 15Uveitis aiguë 7-25Lymphadénopathie périphérique 15-37Lésion de la peau 4-12Érythème 4-33Fatigue 27Perte de poids 28Fièvre 10-17

Adapté de la référence [2]

La première forme de la maladie, la sarcoïdose asymptomatique est la plus répandue.

La majorité des patients atteints de sarcoïdose (30-50%) ne présentent aucun

symptôme physique incommodant et la maladie est souvent diagnostiquée par hasard

[1-2-6]. La seconde forme est la sarcoïdose avec symptômes non spécifiques. Les

manifestations physiques de cette atteinte sont d'ordre général et ceux-ci incluent la

fièvre, une perte de poids et d'appétit, une grande fatigue accompagnée de faiblesse et

de la sudation nocturne[ 1-2-6]. La dernière forme de sarcoïdose est celle présentant

des symptômes spécifiques à l'organe atteint. Pour ce qui est de la sarcoïdose

pulmonaire, les malades présentent, en plus des symptômes spécifiques, diverses

difficultés respiratoires. Les patients rapportent avoir le souffle court (dyspnée), un

sifflement respiratoire persistant, une toux sèche ainsi qu'une douleur thoracique [1-

2-3-6]. Finalement, il est bon de noter que la sarcoïdose peut évoluer vers une forme

dite chronique lorsqu'il y a fibrose au niveau pulmonaire [1].

1.5 Diagnostic

Le diagnostique de la sarcoïdose n'est pas aisé à confirmer dû à l'absence de

tests spécifiques et à la grande diversité de tableaux cliniques [2]. Trois critères

furent proposés afin d'arriver à établir hors de tout doute raisonnable le diagnostique

de sarcoïdose. Il est essentiel que le tableau clinique et radiologique soit compatible

à celui de l'atteinte, qu'il y ait des évidences histologiques de la présence de

granulomes non-caséeux et finalement que les autres maladies pouvant présenter des

similitudes avec la sarcoïdose soient écartées [1-2].

Plusieurs tests ou procédures peuvent être utiles afin d'apporter des appuis au

diagnostique. L'histoire clinique et l'examen physique du patient est le premier test

pouvant permettre de suspecter une sarcoïdose. En effet, la présence des symptômes

d'ordre généraux ou spécifiques (partie 1.4) peuvent orienter le spécialiste sur la

bonne voie [6]. Lorsqu'une sarcoïdose pulmonaire est soupçonnée, l'obtention de

biopsies souvent associée à un LBA est l'un des meilleurs outils de diagnostique [1-

2-3-6].

Grâce à la bronchoscopie, des biopsies transbronchiques et un lavage

bronchoalvéolaire sont effectués pour analyse. La biopsie transbronchique sera

analysée afin de vérifier l'état des poumons et déterminer s'il y a présence de

granulomes non-caséeux caractéristiques de la sarcoïdose [6]. Le liquide récolté lors

du LBA sera lui aussi afin de démontrer l'augmentation des lymphocytes et de

caractériser leur sous-population. Une des caractéristiques d'un LBA d'un patient

atteint de sarcoïdose est un changement dans le ratio des cellules CD4 et CD8 [2].

Ceci sera discuté dans les sections à venir.

Il est aussi possible d'utiliser des techniques moins invasives comme la tomographie

axiale [1-2-6] , car un fort pourcentage (environ 90%) des patients démontrent des

anormalités pulmonaires caractéristiques lors des radiographies [6]. Il peut aussi être

utile d'effectuer des tests de fonctions pulmonaires telle la spirométrie, mais ceux-ci

ne sont pas toujours corrélés avec les résultats obtenus en tomographie. Dans la

majorité des cas, les tests de fonctions pulmonaires sont normaux. Des analyses

sanguines (compte de globules blancs et rouges, calcium...) sont nécessaires afin

d'exclure l'hypercalcémie [1-6]. Finalement, il appert important de s'assurer qu'on

est bien en présence d'une sarcoïdose et non d'une tuberculose. Pour ce faire, le test

cutané à la tuberculine confirme ni infirme la présence d'une tuberculose mais ne fait

que démontrer si le sujet a été en contact avec le bacille tuberculeux[l].

1.6 Traitements

Une forte proportion des patients atteints de sarcoïdose (+ de 60%) ne reçoit

aucun traitement et la maladie s'estompe d'elle-même. Pour les patients ayant une

forme plus sévère, chronique ou dont les organes touchés sont d'une importance

vitale, un traitement peut s'avérer nécessaire [2-6]. Il n'y a pas de traitement bien

défini pour cette maladie. Les traitements proposés ne visent qu'à contrôler les

symptômes et à prévenir la perte irréversible de fonction des organes touchés [6]. De

plus, il n'existe aucune thérapie visant à traiter la « cause » de la sarcoïdose vu son

étiologie inconnue [1].

Le traitement de première ligne pour la majorité des cas de sarcoïdose (surtout

pulmonaire) est l'utilisation systémique de corticostéroïdes [1-2-3-6]. Cet agent est

celui qui agit le plus rapidement, qui est le plus fiable et celui dont les chances de

succès sont les plus élevées. La prednisone est le corticostéroïde le plus utilisé [1-6].

Les corticostéroïdes sont des anti-inflammatoires efficaces mais présentant de

nombreux effets secondaires. La prise de poids, le diabète, l'hypertension,

l'ostéoporose, l'insomnie, l'acné, le glaucome et l'apparition de cataracte ne sont que

quelques-uns des effets secondaires rencontrés lors de la prise de cet agent. Ces effets

secondaires contribuent à rendre l'usage des corticostéroïdes controversé[2-3-6].

Il existe d'autres thérapies possibles selon l'organe touché ou lorsque le patient

démontre une résistance au traitement précédent. L'hydroxychloroquine est efficace

chez un tiers des patients et surtout chez ceux souffrants d'atteinte cutanée.

L'hydroxychloroquine fut longtemps utilisée pour le traitement de la malaria et

inhibe la présentation de l'antigène [1-2-6]. Le méthotrexate est efficace chez 60 à

80% des patients, mais doit être pris sur une longue période. Cet agent inhibe la

production de TNF-a par les macrophages et est le traitement de prédilection lors

d'une sarcoïdose cortico-résistante [1-3-6]. L'azathioprine est un inhibiteur de la

prolifération lymphocytaire efficace chez la moitié des malades [2-6]. Le

cyclophosphamide agit de la même façon que l'azithioprine mais présente des effets

secondaires plus marqués et n'est donc utilisé que lors de sarcoïdose très sévère [2-3-

6]. De plus, il existe de nombreux autres agents utilisés seul ou en combinaison et

dont nous ne discuterons pas dans ce mémoire. Finalement, de nombreuses

recherches portant sur des traitements nouveaux et innovateurs sont en cours et

demeurent d'une grande importance pour les patients touchés.

1.7 Granulomes; contenu et formation

L'un des aspects importants de la sarcoïdose est le développement de

granulomes présents surtout dans l'appareil pulmonaire. Le granulome est composé

de plusieurs types de cellules arrangées de façon très compacte. Le centre du

granulome contient des monocytes/macrophages ainsi que des cellules épithéloïdes.

Il contient aussi des cellules particulières appelées cellules géantes multinucléées

provenant de l'agrégation de plusieurs macrophages [4-8]. Ce centre est entouré par

des cellules T majoritairement de type CD4+, de cellules plasmatiques et quelques

rares cellules T CD8+. Telle une barrière, une enveloppe composée de collagène, de

fibronectine, de fibrine et de protéoglycane entoure l'agrégat cellulaire [4-8-9].

Macrophage

FibronectineCollagèneFibrineprotéoglycane

Cellule géantemultinucléée

Cellule T

Figure 1.1 : Schéma d'un granulome non-caséeux. Le granulome est composé, en son centre, demacrophages et de cellules géantes multinucléées (en jaune). Ces cellules sont entourées de cellules Tmajoritairement CD4+ (en bleu) qui sont elle même entourée d'une enveloppe composée defibronectine, collagène, fibrine et protéoglycane (en noir).

Adaptée de la référence [8]

La formation de granulomes est en premier lieu un processus visant à protéger

l'organisme. En effet, la fonction du granulome lors d'une infection est de contenir le

pathogène (inconnu pour la sarcoïdose) afin de prévenir sa dissémination et de

restreindre la réponse inflammatoire [9]. Par contre, une infection granulomateuse

chronique peut causer des dommages et de la fibrose aux tissus environnants. La

formation « normale » d'un granulome est divisée en quatre phases distinctes;

l'initiation, l'accumulation, la régression et la résolution [4-9]. L'initiation est

caractérisée par l'arrivée de macrophages attirés par des stimulus inflammatoires et

qui vont commencer à créer le noyau du granulome. Lors de la phase suivante, des

cellules T CD4+ vont s'accumuler autour du noyau et recruter d'autres cellules

effectrices (ex : cellule T) et plus de macrophages. Cette phase est la plus importante

lors de la formation du granulome car sans l'apport en cellules T CD4+, le granulome

ne pourrait pas devenir mature. C'est durant la phase de régression qu'il y aura

diminution de la quantité de pathogènes. Finalement, lors de la phase de résolution, la

population de cellules infiltrées va graduellement diminuer et le processus de

cicatrisation va s'enclencher [9].

1.8 Caractéristiques cellulaires

Un processus immunitaire important à lieu dans l'appareil respiratoire juste avant

la formation de granulomes et se poursuit durant la maturation de ceux-ci. Deux

phénomènes dominent cette réponse immunitaire; l'activation des macrophages et

monocytes et l'activation des lymphocytes T [11-12]. Le contenu cellulaire des LBA

de patients atteints de la maladie est déjà bien caractérisé. Le liquide récolté lors du

LBA démontre une forte augmentation du nombre de cellules totales accompagnée

d'un pourcentage élevé en lymphocyte T de type CD4+ [4-11-12].

10

1.8.1 Le lymphocyte T

Dans un poumon normal, la quantité de lymphocytes retrouvés dépasse

rarement 10% de la quantité totale de cellules. En terme de quantité totale de

lymphocytes, il est peu fréquent de retrouver plus de 1 X 106 lymphocytes dans un

LBA d'un individu normal [4]. De plus, on retrouve deux fois plus de lymphocytes T

CD4+ que de lymphocytes T CD8+ dans un poumon normal (ratio normal de 2) [4-

10-11]. Lors d'une sarcoïdose pulmonaire, le nombre de lymphocyte T augmente

drastiquement. La quantité de lymphocytes T dénombrée peut être jusqu'à vingt-cinq

fois supérieure à celle normalement retrouvée [4]. Ainsi, le pourcentage de

lymphocytes est fortement augmenté causant par le fait même une diminution de

celui des macrophages.

Une des caractéristiques importantes de cette maladie permettant de consolider un

diagnostique de sarcoïdose est le ratio de cellules CD4+/CD8+. Le déséquilibre

macrophage/lymphocyte retrouvé lors de cette atteinte est attribuable aux

lymphocytes T CD4+. Lors de la progression de la maladie, il y aura une

augmentation des deux types de lymphocytes T soient les CD4+ et les CD8+. Par

contre, il y aura une augmentation beaucoup plus marquée des lymphocytes T CD4+

causant un débalancement du ratio habituel (ratio CD4/CD8 anormal variant entre 5

et 15) [4-11]. L'augmentation du nombre de lymphocytes dans les poumons peut être

dû à deux mécanismes différents : le recrutement des lymphocytes T de la circulation

sanguine périphérique et la prolifération de ces même cellules dans le tissu

lymphoïde. Il a été suggéré que des cytokines chimioattractives coopèrent à

l'expansion du bassin de lymphocytes dans les granulomes. De plus, des cytokines

produites par les macrophages alvéolaires peuvent servir de facteur de croissance

pour les lymphocytes infiltrant le tissu inflammé [11].

Il

1.8.2 Le macrophage alvéolaire

Chez une personne en santé, la contribution de la circulation sanguine au

bassin de macrophage est relativement basse (environ 1,25%). Par contre, chez les

malades, il y a production de facteurs chimiotactiques pour les leucocytes qui

permettent de recruter des monocytes du sang et ainsi favoriser le développement de

granulomes. Ainsi, il y aura une augmentation importante du « trafic »

macrophagique dans les poumons de patients ayant la sarcoïdose [11]. De plus, 90%

des cellules retrouvées dans les LBA normaux sont des macrophages soit 9 X 106

cellules. Lorsqu'un individu est atteint de sarcoïdose, la quantité de macrophages

alvéolaires augmente [4-11]. Par contre, dû à la très forte augmentation de la quantité

de lymphocytes, le pourcentage de macrophages par rapport aux cellules totales

présentes dans le LBA diminue. Les macrophages jouent un rôle important dans la

présentation de l'antigène, le recrutement et l'activation des cellules T et finalement

dans le relâchement de cytokines. Chez un patient atteint de sarcoïdose, les

macrophages alvéolaires ont une capacité de présentation de l'antigène supérieur aux

macrophages alvéolaires normaux. Les macrophages s'agrègent au site de formation

du granulome. Ces macrophages présentent un phénotype similaire à celui des

monocytes et sont fréquemment appelés les monocytes/macrophages [11].

1.8.3 Le neutrophile

Une personne non-fumeuse et en santé présente très peu de cellules

polymorphonucléaires (PMN) dans le LBA (moins de 5%). Par contre, ce type

cellulaire est retrouvé en plus grande quantité dans le LBA de patients atteints de

sarcoïdose pulmonaire et présentant des signes radiologiques de fîbrose pulmonaire.

De plus, une augmentation de la concentration de granules libérés par le neutrophile

est décelée chez ce même type de patient [4]. La migration du PMN vers le site de la

fîbrose est médiée par les macrophages alvéolaires qui en relâchant des

chimioattractants vont attirer ces cellules. Les neutrophiles semblent jouer un rôle

dans la destruction des cellules pulmonaires et de la matrice extracellulaire [4].

12

1.9. Les cytokines et chimiokines

Les cytokines et chimiokines influencent de nombreuses propriétés

physiologiques des cellules. Par exemple, elles peuvent agir sur la prolifération, la

différenciation, l'activation et la chimiotaxie. Ce sont des médiateurs très importants

qui affectent les fonctions cellulaires et la communication entre cellules. De

nombreuses données expérimentales ont contribué à associer le relâchement de

cytokines au développement de la fibrose pulmonaire [13]. La sarcoïdose étant une

maladie pulmonaire CD4 helper de type I (TH1) pouvant mener à la fibrose, il fut

proposé que des variations dans la quantité de cytokines relâchées par les cellules

pulmonaires pourraient jouer un rôle prépondérant [4-12-13]. Ainsi, plus de 20

cytokines furent reliées à la pathologie lors d'études réalisées en 1999 [4]. Les

paragraphes suivants traiteront de certaines de ces molécules.

1.9.1 Interleukine-1 (IL-1)

L'IL-1 est une cytokine pro-inflammatoire produite majoritairement par les

macrophages alvéolaires [4-13-14]. Dans les poumons, cette cytokine a une activité

de facteur de croissance accessoire pour les cellules T. De plus, cette molécule

stimule le développement des granulomes et de la fibrose en induisant la

prolifération des fibroblastes et en augmentant la production de collagène [4-13].


L'IL-2 est une cytokine produite par les cellules Thl [14]. Cette molécule contribue

à l'expansion de la population des cellules T activées en se liant à des récepteurs à

triple chaîne. Elle est aussi impliquée dans la régulation de la production

d'immunoglobines et augmente la cytotoxicité des lymphocytes T cytotoxiques.

Finalement, il est bon de préciser que cette cytokine semble aussi impliquée dans

l'activations de certaines fonctions des macrophages alvéolaires [4-13].

13


L'IL-4 est une cytokine produite par les cellules Th2 [14]. Elle sert de cofacteur pour

la prolifération de plusieurs lignées cellulaires comme les fîbroblastes [4]. Elle agit en

synergie avec l'IL-2 afin de stimuler la croissance des cellules T[13]. Comme la

sarcoïdose est une maladie de type Thl, cette cytokine est retrouvée en faible quantité

lors de la phase aiguë de la maladie. La production de celle-ci est majoritairement liée

à la phase de fibrose pulmonaire (chronicité) lors de laquelle le profil Thl laisse plus

de place au profil Th2 [4-13].


L'IL-6 est une cytokine produite par les cellules T, les macrophages alvéolaires, les

cellules endothéliales et les fîbroblastes [4]. Cette molécule stimule les cellules B et

la prolifération des cellules T. De plus, elle peut provoquer de la fièvre et activer la

synthèse des protéines de la phase aiguë [13].

1.9.5Interleukine-10(IL-10)

L'IL-10 est une cytokine anti-inflammatoire relâchée par les cellules Th2 et les

macrophages alvéolaires [4-15]. Elle est retrouvée en concentration importante dans

les LBA de patients atteints de sarcoïdose [15]. Elle inhibe la sécrétion de diverses

cytokines pro-inflammatoires comme l'interferon (IFN) et l'IL-2. L'IL-10 stimule la

croissance des mastocytes et contribue à réguler les fonctions des cellules

présentatrices d'antigènes [4-13]. Cette cytokine joue donc un rôle important dans le

contrôle de la réponse inflammatoire et est impliquée dans le processus de résolution

spontané de la sarcoïdose pulmonaire.

14


L'IL-12 est une cytokine de type Thl sécrétée majoritairement par les

monocytes/macrophages [16]. Il existe trois formes de cette cytokine; le monomère

p40, l'homodimère p40 et l'hétérodimère p70 [17]. L'IL-12 induit la différentiation

des précurseurs de cellules T (ThO) en cellules de type Thl et stimule l'activité

lytique des cellules T pulmonaires activées [4]. De plus cette molécule stimule, en

synergie avec Pinterleukine-18 (IL-18), la production d'IFN-gamma [18]. De

nombreuses études ont démontré une augmentation de la quantité d'IL-12 dans les

LBA de patients atteints de sarcoïdose pulmonaire.


L'IL-13 est une cytokine anti-inflammatoire qui partage certaines des propriétés de

l'IL-4. Elle est produite par les cellules T de type CD4 et est déjà impliquée dans

certaines pathologies comme l'asthme. Cette molécule inhibe la sécrétion de

plusieurs cytokines comme le TNF chez des sujets sains. Elle pourrait aussi avoir un

effet anti-inflammatoire ou influencer la réponse Thl chez des sujets atteints de

sarcoïdose [19]. De plus, l'IL-13 est un chimioattractant qui pourrait avoir une

importance particulière dans le recrutement de monocytes dans les poumons de

patients atteints de sarcoïdose [4-13]. Une étude récente a démontré une

augmentation de l'expression de l'IL-13 dans les LBA et les cellules mononucléaires

sanguines chez les malades. Comme il est fréquent de retrouver des patients

présentant des symptômes atténués, il est possible q'un mécanisme impliquant des

cytokines anti-inflammatoires contibue à améliorer l'état des patients. Il fut proposé

que cette cytokine puisse constituer un de traitement pour cette maladie [19].

1.9.8Interleukine-15(IL-15)

15

L'IL-15 est une cytokine partageant plusieurs activités biologiques et le récepteur de

l'IL-2. Cette molécule est sécrétée en grande quantité par les macrophages

alvéolaires lors d'une sarcoïdose pulmonaire [4-13]. L'IL-15 stimule la prolifération

et la chimiotaxie des cellules T en plus d'induire l'activation des cellules natural

killer (NK) [13]. Ces caractéristiques contribuent à favoriser le développement de

granulomes pulmonaires.


L'IL-18 est une cytokine produite par les monocytes/macrophages. Cette molécule

agit en synergie avec l'IL-12 afin d'induire la production d'IFN-gamma par les

cellules de type Thl [16]. Ainsi, ces deux cytokines coopèrent au développement

d'une réponse inflammatoire de type Thl. De plus, l'IL-18 inhibe la production de

l'IL-10, une cytokine anti-inflammatoire [13]. Il est déjà connu que l'IL-18 est

exprimée au site inflammatoire de certaines pathologies de type Thl comme la

maladie de Crohn [18]. Plusieurs études ont démontré une augmentation de

l'expression de 1*11-18 dans les LBA de patients souffrants de sarcoïdose pulmonaires

comparativement à ceux des sujets normaux [16-18].

1.9.10 Interferon-gamma (IFN-gamma)

L'IFN-gamma est une cytokine produite par les lymphocytes de type Thl et par les

macrophages [14]. Elle est sécrétée principalement en réponse à la stimulation

synergique exercée par l'IL-12 et l'IL-18 [18]. Cette molécule augmente les

fonctions accessoires des cellules présentatrices d'antigènes, augmente les fonctions

cytotoxiques des macrophages et lymphocytes et régule la sécrétion de certaines

cytokines durant la sarcoïdose pulmonaire [4-13]. La production d'IFN-gamma est

fortement augmentée dans les LBA de patients atteints de sarcoïdose pulmonaire

[18].

16

1.9.11 Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha)

Le TNF-a est une chimiokine sécrétée, dans les poumons, surtout par les

macrophages alvéolaires [14-20]. Elle est sécrétée en quantité très importante chez les

patients atteints de sarcoïdose pulmonaire. Cette molécule est particulièrement

importante dans la phase initiale de la sarcoïdose. Il fut démontré qu'un relâchement

important de TNF-a par des cellules isolées de LBA était relié à la présence

d'agrégats de macrophages alvéolaires [20]. Ces agrégats de macrophages sont les

prédécesseurs de granulomes proprement dit. Ainsi, le TNF-a joue un rôle primordial

dans le recrutement et maintenance des granulomes pulmonaires. Le TNF-a est aussi

un stimulateur et un régulateur de la sécrétion de certaines cytokines (ex; IL-1 et IL-

6) [4].

1.10 Distinction entre sarcoïdose, alvéolite allergique et tuberculose

1.10.1 L'alvéolite allergique

L'alvéolite allergique est une maladie pulmonaire qui est causée par une réponse

immunologique à divers agents inhalés. Ces agents peuvent être des bactéries, des

moisissures et des protéines animales. Les symptômes physiques de l'alvéolite

allergique ressemblent beaucoup à ceux présents lors de sarcoïdose. De plus, lors de

cette affection, des granulomes sont retrouvés dans le parenchyme pulmonaire [27].

Tout comme la sarcoïdose, l'alvéolite allergique est caractérisée par une forte

accumulation de cellules inflammatoires dans les poumons des patients. Elle présente

une augmentation du nombre de lymphocytes dans le liquide du LBA plus élevée

que lors d'une sarcoïdose. Contrairement à la sarcoïdose, cette maladie est marquée

par une prédominance des lymphocytes de type CD8+. En effet, on remarque une

diminution du ratio CD4/CD8 lors de l'alvéolite allergique tandis qu'on dénote une

augmentation de celui-ci lors d'une sarcoïdose [27].

17

1.10.2 La tuberculose

La tuberculose est une maladie provoquée par une mycobactérie appelée

Mycobacterium tuberculosis. Cette mycobactérie est contractée par aspiration dans

l'appareil pulmonaire. Lorsque le pathogène est inhalé, celui-ci est phagocyté par les

cellules dentritiques et les macrophages alvéolaires [28]. Suite à cela, il y aura

formation de granulomes pulmonaires. Comparativement aux granulomes

sarcoïdiens, la formation de granulomes lors de la tuberculose est un processus

considéré comme bénéfique pour le patient. En effet, le granulome à pour but de

circonscrire l'inflammation et d'empêcher la dissémination de la mycobactérie. La

principale différence entre la tuberculose et la sarcoïdose est le type de granulome en

présence. En effet, les granulomes présents lors de la tuberculose sont des

granulomes caséeux tandis qu'ils sont non-caséeux dans l'autre pathologie [8]. Le

terme caséeux signifie que le centre du granulome est nécrosé.

Sur le plan cellulaire, la tuberculose est elle aussi une pathologie de type Thl

présentant une augmentation de lymphocyte majoritairement de type CD4+. Cette

augmentation demeure légèrement inférieure à celle rencontrée lors d'une sarcoïdose

pulmonaire. Bien que l'augmentation du ratio CD4/CD8 est légèrement moins

prononcée lors de la tuberculose, cet indice ne permet pas de distinguer à coup sûr ces

deux pathologies [29].

1.11 Modèles animaux de granulomes pulmonaires

II existe dans la littérature scientifique un certain nombre de publications

décrivant divers modèles animaux de maladies pulmonaires granulomateuses.

Chacun des modèles présente des caractéristiques particulières pouvant le relier à une

ou plusieurs pathologies. Cette section vise à expliquer deux des principaux modèles

et à en faire ressortir les caractéristiques distinctes.

IX

1.11.1 Le béryllium

Tel que mentionné à la section 1.3.3 le béryllium est un composé qui pourrait être

impliqué dans la sarcoïdose pulmonaire. Le béryllium peut induire une affection

aiguë pouvant s'attaquer à la peau, les muqueuses et l'appareil respiratoire. Il peut

aussi induire une pathologie chronique granulomateuse systémique ressemblant à

beaucoup à la sarcoïdose pulmonaire [21-22]. La berylliose et la sarcoïdose sont

deux pathologies qui furent, durant un temps, considérées comme identiques. Elles

impliquent toute deux la formation de granulomes non-caséeux dans les poumons,

une lymphocytose à prédominance CD4+ et une augmentation de l'activation des

macrophages [21]. Durant les années 1990, les modèles animaux (souris, rat, chien,

cochon d'inde...) de berylliose étaient considérés comme les meilleurs modèles de

sarcoïdose. Il est maintenant connu que la berylliose est une maladie à part entière

qui s'apparente à la sarcoïdose. Ces modèles demeurent donc des modèles de

berylliose et non de sarcoïdose pulmonaire, bien que les caractéristiques soient

pratiquement les mêmes. En effet, comme l'agent étiologique de la berylliose est le

béryllium, l'injection, l'instillation ou l'inhalation de cette substance à tout type

d'animaux provoque une berylliose.

1.11.2 L'adjuvant complet de Freund (CFA)

Le CFA est une émulsion d'eau dans l'huile contenant des mycobactéries tuées. Le

CFA est un produit qui est normalement utilisé pour provoquer une augmentation de

la production d'anticorps. Cet effet est accompagné d'une réponse inflammatoire

sévère [24]. Le CFA provoque aussi des lésions de type granulomateuses au site

d'injection. L'inflammation est provoquée par la présence de mycobactéries dans

l'émulsion. Il fut démontré lors de quelques études que les injections intraveineuse

(IV) de CFA à des rats provoquaient, dans les poumons, la formation de granulomes

non-caséeux contenant des cellules épithéloides et des cellules géantes entourées de

lymphocytes [25-26]. Ces manifestations sont très semblables à celles retrouvées

chez les patients souffrants de sarcoïdose pulmonaire.

La réaction granulomateuse étant variable d'un animal à l'autre, une équipe de

chercheurs français a développé une technique d'analyse de la progression de la

maladie par tomographie axiale [26]. Ce modèle fut évalué en histopathologie par

cette même équipe, mais aucune analyse cellulaire ou immunologique ne fut réalisée.

Ce modèle est celui qui se rapproche le plus de la sarcoïdose pulmonaire tant par la

présence de granulomes que par la composition de ceux-ci. De plus, il existe un

certain nombre de pistes impliquant les mycobactéries dans l'apparition de la maladie

[1-2-5]. Comme le CFA contient des mycobactéries, il utilise un facteur étiologique

possible de la sarcoïdose pulmonaire. C'est donc sur ce modèle que se basera ce

projet de recherche.

1.12 Nicotine

1.12.1 Récepteurs nicotiniques

Les récepteurs nicotiniques sont des protéines transmembranaires (ligand-gated ion

channel) présents sur les cellules excitables et non-excitables de l'organisme [30-31].

Le ligand naturel de ces récepteurs est l'acétylcholine (ACh) qui une fois liée à son

récepteur, va permette l'ouverture de canaux à ions. Ces canaux à ions peuvent être

par exemple des canaux permettant l'échange d'ions calcium (Ca2+). L'ouverture de

ces canaux permet de modifier le potentiel de membrane et la dépolarisation des

cellules [30-32-33].

20

Exetiteuf

intérieur

Figure 1.2; Récepteur nicotinique.

Adapté du site internet http://www.usc.edu/hsc/pharmacy/ced/autonomic/nl-nicotinic.html

1.12.2 Les agonistes de récepteurs nicotiniques

Les agonistes des récepteurs nicotiniques sont des molécules qui peuvent se lier aux

récepteurs nicotiniques. Ces agonistes peuvent entrer en compétition avec le ligand

naturel des récepteurs nicotiniques (ACh) et ont un effet inhibiteur sur le

développement de l'inflammation [32]. Il existe de nombreux agonistes de ces

récepteurs qui sont soit d'origine naturelle ou synthétique. La nicotine est un des

agonistes pouvant se lier aux récepteurs et ayant des effets anti-inflammatoires

lorsque liée. La nicotine est une molécule qui traverse aisément la barrière hémato-

encéphalique et crée donc une dépendance [34]. Par contre, il existe certains

agonistes qui n'ont pas la faculté de traverser cette barrière et qui ne créeent donc pas

de dépendance. Le diméthylphenylpiperazinium (DMPP) est un exemple d'agoniste

des récepteurs nicotiniques de nature synthétique qui ne cause pas de dépendance

[34-35]. Le DMPP possède, tout comme la nicotine, des effets anti-inflammatoires

[35]. Le DMPP permet de diminuer le relâchement cytokines pro-inflammatoires

telles que l'IL-1 et du TNF-a des cellules splénique et de l'IL-6 et du TNF-a des

macrophages [36].

21

Chapitre 2

Objectif général et objectifs spécifiques

22

2. OBJECTIFS GENERAUX ET SPECIFIQUES

2.1 Objectif général

Vous avez pu constater lors de la lecture du chapitre précédent que la

sarcoïdose pulmonaire est une maladie qui demeure méconnue sous plusieurs aspects.

Il semble désormais évident que seules des recherches poussées nous permettront

d'approfondir nos connaissances sur cette pathologie. De plus, la recherche d'une

thérapie efficace pour traiter la maladie est l'un des principaux points d'intérêt, vu

l'absence de traitement adapté. Pour mener à terme ces recherches, il est nécessaire

d'avoir un modèle animal sur lequel tester et valider nos hypothèses. L'objectif

général de ce projet de recherche est donc de mettre au point un modèle animal de

sarcoïdose pulmonaire s'approchant le plus de la réalité clinique.

2.2 Objectifs spécifiques

Pour arriver à un modèle de sarcoïdose pulmonaire efficace et réalisable, ce

projet à pris ses bases sur un ébauche de modèle réalisée par une équipe française

[24]. Les objectifs spécifiques sont donc les suivants :

Tester le modèle préexistant et apporter les modifications nécessaires afin de

rendre le modèle fidèle à la pathologie et éthiquement acceptable;

- Dresser un profil complet des caractéristiques (cellulaires, radiologiques,

histopathologiques et immunologiques) de ce nouveau modèle afin de préciser

sa similitude avec la sarcoïdose pulmonaire;

- Tester une thérapie potentielle basée sur l'utilisation des agonistes des

récepteurs nicotiniques.

Chapitre 3

Méthodologie

24

3. Méthodologie

3.1 Projet #1 Efficacité d'un agoniste nicotinique (DMPP) sur un modèle de base

de sarcoïdose pulmonaire (réalisée une fois)

3.1.1 Induction du modèle et radiologie

Trente rats Wistar (250-300g) ayant nourriture et eau ad libium furent utilisés

dans cette étude. Les animaux furent séparés en trois groupes de 10 animaux; le

groupe contrôle recevant de la saline (gr contrôle), le groupe recevant du CFA

uniquement et le groupe recevant du CFA et du DMPP. Au jour 0, tous les animaux

furent examinés par tomographie axiale. Au jour 1 et 2, une IV de CFA (0.6 ml/kg)

fut effectuée dans la veine de la queue sur les animaux du groupe CFA et DMPP

endormis à l'isofurane. Les animaux du groupe contrôle furent endormis selon le

même processus et reçurent des injections de saline. Les rats des groupes CFA et

DMPP reçurent des injections sous-cutanées (se) de vancomycine durant les 3 jours

suivant les deux injections (jour 3 à 5) afin d'éviter les infections au niveau du site

d'injection. Les animaux du groupe DMPP furent traités avec du DMPP (2mg/kg)

par voie intrapéritonéale (IP) une fois par jour à partir du jour 3 et ce durant 30 jours.

Au jour 33, tous les animaux subirent une seconde tomographie axiale qui sera

comparée à celle du jour zéro afin d'évaluer l'atteinte. L'échelle de gravité de

l'atteinte varie de normale à très sévère. Le radiologue agissait à l'aveugle pour

l'analyse. Trente-cinq jours après la première injection de CFA, les animaux furent

endormis à la kétamine/xylazine et sacrifés par ponction cardiaque.

3.1.2 Lavages broncho-alvéolaires

Immédiatement après les sacrifices, des LBA furent effectués sur tous les animaux.

Les poumons furent lavés avec 50 ml de saline stérile (5 X 10 ml). La saline fut

injectée dans la trachée et récupérée par aspiration après chaque aliquote.

3.1.3 Histopathologie

Après les lavages, des morceaux d'un poumon de chaque rat furent collectés, fixés

dans la paraformaldéhyde, inclus dans la paraffine, coupés puis colorés à

l'hématoxyline-éosine. Les lames furent analysées à l'aveugle par un pathologiste et

un score situé entre 0 et 25 fut attribué pour chaque échantillon.

3.1.4 Analyses cellulaires

Les fluides récoltés lors des LBA furent centrifugés (7min/ 1500 rmp). Un « pool »

des cellules récoltées après centrifugation (5 tubes) fut effectué pour chaque animal et

re-suspendues dans 3 ml de saline. Des comptes totaux et différentiels furent

effectués pour chaque rat. Pour les comptes différentiels, la technique du cytospin

(75 000 cellules/lame) en duplicata fut utilisé avant la coloration et le décompte.

Le cytométrie de flux a été utilisée afin d'identifier les lymphocytes CD4+ et CD8+.

Les anticorps employés sont les suivants; Pe-cy5-mouse anti-rat CD4 (mouse

IgG2ak, 0.2 mg/ml), Pe-Cy5-mouse (mouse IgG2ak, 0.5 mg/ml), Fitc-mouse anti-rat

CD8 (mouse IgGlk, 0.5 mg/ml) and Fitc-mouse (IgGlk, 0.5 mg/ml). Le Pe-cy5-

mouse anti-rat CD4 et le Fitc-mouse anti-rat CD8 furent utilisés à lp.g par million de

cellules. Le Pe-Cy5-mouse a été utilisé à 20 jxg par million de cellules alors que le

Fitc-mouse fut utilisé à 0,5 |ig par million de cellules.

3.1.5 analyses statistiques

Les résultats furent analysés par test T non apparié en utilisant le logiciel Stat View.

Une valeur de p<0,05 fut considéré comme statistiquement significatif.

26

3.2 Projet #2 Modification du modèle existant et analyses supplémentaires

3.2.1 Induction du modèle

Trente rats Wistar (250-300g) ayant nourriture et eau ad libium furent utilisés

dans cette étude. Les animaux furent divisés en deux groupes; le groupe contrôle

(n=10) recevant de la saline et le groupe CFA (n=20). Au jour 1, une seule injection

IV de CFA (0.6 ml/kg) fut effectuée dans la veine de la queue sur les animaux du

groupe CFA endormis à l'isofurane. Les animaux du groupe contrôle furent endormis

selon le même processus et reçurent une injection de saline. Les rats furent pesés à

toutes les semaines afin de vérifier l'état des animaux des deux groupes. Quarante-

cinq jours après l'injection de CFA, tous les rats furent endormis par injection à la

kétamine/xylazine et sacrifiés par ponction cardiaque. Le sang fut conservé dans des

tubes individuels.

3.2.2 Lavages broncho-alvéolaires

Immédiatement après les sacrifices, des LBA furent effectués sur tous les animaux.

Les poumons furent lavés avec 50 ml de saline stérile (5 X 10 ml). La saline fut

injectée dans la trachée et récupérée par aspiration après chaque aliquote. Le premier

aliquote de chaque animal fut récolté séparément pour des analyses de cytokines.

3.2.3 Histopathologie

Après les lavages, des morceaux de poumon et d'un ganglion thoracique de chaque

rat furent collectés, fixés dans la paraformaldéhyde, inclus dans la paraffine, coupés

puis colorés à Phématoxyline-éosine. Les lames furent analysées à l'aveugle par un

pathologiste et un score situé entre 0 et 25 fut attribué pour chaque échantillon.

27

3.2.4 Analyses cellulaires

Les fluides récoltés lors des LBA furent centrifugés (7min/ 1500 rmp). Un « pool »

des cellules récoltées après centrifugation (5 tubes) fut effectué pour chaque animal et

re-suspendu dans 3 ml de saline. Des comptes totaux et différentiels furent effectués

pour chaque rat. Pour les comptes différentiels, la technique du cytospin (75 000

cellules/lame) en duplicata fut utilisé avant la coloration et le décompte.

La cytométrie de flux a été utilisée afin d'identifier les lymphocytes CD4+ et CD8+.

Les anticorps utilisés sont les suivants; Pe-cy5-mouse anti-rat CD4 (mouse IgG2ak,

0.2 mg/ml), Pe-Cy5-mouse (mouse IgG2ak, 0.5 mg/ml), Fitc-mouse anti-rat CD8

(mouse IgGlk, 0.5 mg/ml) and Fitc-mouse (IgGlk, 0.5 mg/ml). Le Pe-cy5-mouse

anti-rat CD4 et le Fitc-mouse anti-rat CD8 furent utilisés à lfig par million de

cellules. Le Pe-Cy5-mous a été utilisé à 20 jig par million de cellules alors que le

Fitc-mouse fut utilisé à 0,5 jig par million de cellules.

3.2.5 Analyses de cytokines

Quatre ml du surnageant de LBA de chaque animal furent concentrés (6 à 11 fois) par

centrifugation sur filtre (Amicon ultra 15 ml). Quatre cytokines Thl (IFN-y, TNF-oc,

IL-12p40+70, IL-18) et deux cytokines Th2 (IL-13, IL-4) ont été dosées dans les

concentrés de surnageants en utilisant les ensembles de measures par ELISA (IFN-y;

Biosource International, sensitivity <13 pg/ml TNF-oc; Biosource International,

sensitivity <4pg/ml IL-12 p40+70; Biosource International, sensitivity <3pg/ml IL-

18; Biosource International, sensitivity <4pg/ml, IL-13; Biosource International,

sensitivity 1.5pg/ml, IL-4 : Biosource International, <2pg/ml).

3.2.6 Analyses statistiques

Les résultats furent analysé par test de T non apparié en utilisant le logiciel Stat

View . Une valeur de p<0,05 fut considéré comme statistiquement significatif.

28

Chapitre 4

Résultats

4. RESULTATS

4.1 Projet #1 Efficacité des agonistes nicotiniques sur le modèle de base de

sarcoïdose pulmonaire


À la suite des injections du jour 2, un certain nombre de décès furent constatés dans

les cohortes de rats du groupe CFA et DMPP. Ces décès sont survenus entre la

première et la douzième heure suivant la seconde injection de CFA. Le taux de décès

pour ces deux groupes réunis était de 15%, ce qui correspond à 3 décès sur les 20

animaux. Une autre réaction indésirable fut observée au cours de cette expérience : la

nécrose. En effet, trois cas de nécrose au niveau du site d'injection (queue) furent

dénombrés dans le groupe DMPP. Cette nécrose devenait visible en milieu de

protocole, c'est-à-dire autour du jour 22, mais demeurait sous contrôle jusqu'au

sacrifice des animaux. Finalement, il y eut une période fébrile variant de 2 à 4 jours

chez tous les animaux ayant reçu du CFA.

4.1.2 Tomographie axiale

II fut démontré grâce à la tomographie de départ (jour 0) que tous les animaux utilisés

lors de ce protocole étaient en parfaite santé (figure 1.3).

Figure 1.3 : Tomographie axiale d'un rat du groupe contrôle (gauche) et CFA (droite).

30

Il n'y avait ni nodules, ni inflammation ou maladie pulmonaire quelconque ayant pu

fausser nos résultats (tableau 1.3 et 1.4). Les animaux du groupe contrôle

présentaient des résultats identiques lors de la tomographie axiale finale réalisée au

jour 33 (tableau 1.3).

Tableau 1.3 : Résultats des tomographies axiales effectuées aux jours 0 et 33 sur lesrats du groupe contrôle

# du rat

lAà5A!Bà5B

RésultatTomographie

jour 0Normale [0]


jour 33Normale [0]

Pour le groupe 2 (CFA seul), les tomographies axiales finales démontrent une grande

variabilité de résultats. L'atteinte pulmonaire était visible en tomographie axiale et

quantifiable (figure 1.4). Tous les animaux sauf un seul démontrent une atteinte

pulmonaire dont la sévérité varie. La gravité de l'atteinte oscille entre normale et très

sévère (tableau 1.4). Pour ce qui est du groupe DMPP, le degré de sévérité varie

autant que pour le groupe CFA. Les animaux ont une atteinte variant de normale à

très sévère (tableau 1.4). Afin de pouvoir compiler ces résultats, un score variant de 0

(normal) à 5 (très sévère) fut attribué pour chaque animal et des moyennes furent

calculées pour chaque groupe. Les résultats, une fois convertis, font état d'une

atteinte pour le groupe contrôle de zéro (normal), pour le groupe CFA de 3,2

(modérée) et pour le groupe DMPP de 2,3 (légère) (figure 1.4).

31

Tableau 1.4 : Résultats des tomographies axiales effectuées aux jours 0 et 33 sur les rats des groupesCFA et DMPP

# du ratgroupeCFA6A8A9A10A6B7B8B9B


jour 0normalnormalnormalnormalnormalnormalnormalnormal


Jour 33normalléger

très légertrès sévèretrès sévère

modérémodérésévère

# du ratgroupeDMPP

11A12A13A10B11B1214

13B14B15B


jour 0normalnormalnormalnormalnormalnormalnormalnormalnormal


Jour 33modérémodéré

très sévèrelégerléger

modérémodérénormalnormal

654

3

2

1

0

Contr™le

ICFA

Groupes

DMPP

Figure 1.4; Résultats obtenus en tomographie axiale. Le p-value entre les groupes CFA/contrôle etDMPP/contrôle est de 0,0001. Non significatif entre les groupes CFA et DMPP.

4.1.3 Analyses histopathologiques

Les résultats en histopathologie ont démontré la présence d'inflammation et de

granulomes chez tous les animaux ayant reçu les injections de CFA y compris ceux

obtenant un score normal en tomographie (figure 1.5).

32

Les coupes pulmonaires des animaux du groupe contrôle ne présentant aucune

anomalie ont servi de comparatif pour l'attribution d'un score aux coupes des rats

atteints (figure 1.5).

groupe contrôle groupe CFA

Figure 1.5 : Coupes histologiques de poumons de rats des groupes contrôle et CFA

Les animaux du groupe contrôle ont donc obtenu un score moyen de 0 (poumon

normal). Les groupes CFA et DMPP ont obtenu un score très similaire de 19 et 18 ce

qui défini leur atteinte comme modérée (figure 1.6).

25 -i

20 -1510

5 H0

contrôle DMPP

Figure 1.6 : Résultats obtenus en histologie. P-value entre les groupes contrôle/CFA etcontrôle/DMPP < 0,0001.

33

4.1.4 Comptes cellulaires totaux et différentiels

Lors des comptes cellulaires totaux (nombre de cellules X 105 /ml) effectués sur les

LBA, une augmentation du nombre de cellules totales d'un facteur de 5 fut notée

entre le groupe contrôle (0,53 X 105 /ml) et les deux autres groupes (2,86 X 105 /ml

et 2,62 X105 /ml) (figure 1.7). Par contre, il n'y a aucune différence notable ou

statistiquement valable entre les groupes CFA et DMPP. Les comptes différentiels

réalisés sur les mêmes échantillons démontrent une augmentation de 5,5 fois la

quantité de macrophages pour les deux groupes ayant reçu le CFA comparativement

au groupe contrôle (figure 1.7). Aucune différence significative n'est notée entre le

groupe CFA et DMPP. Finalement, une augmentation de 7 fois la quantité de

lymphocytes est présente entre le groupe contrôle et les deux autres groupes (figure

1.7). Aucune différence significative n'est notée entre le groupe CFA et DMPP.

5

4,5

4

3,S

3

I

0,'»

I)

lymphocytesI macrophagesI cellules totales

groupe

Figure 1.7 : Comptes cellulaires totaux et différentiels pour les trois groupes.

En plus de l'augmentation de la quantité de tous les types cellulaires analysés, les

résultats démontrent un changement des proportions de cellules en présence. Un

LBA normal contient approximativement 90% de macrophages et 10% de

lymphocytes. Les comptes différentiels réalisés font état d'une diminution (90% ->

73-79%) du pourcentage de macrophages et une augmentation (9% -> 25-19%) de

celui des lymphocytes entre le groupe contrôle et les groupes CFA et DMPP (figure

1.8).

100908070605040302010

I macrophages

I lymphocytes

contr™le CFA DMPP

groupes

Figure 1.8 : Pourcentages des cellules en présence dans le LBA

4.1.5 Analyse du ratio CD4/CD8

Lors de l'analyse par cytométrie de flux, seule la moitié des échantillons furent

analysés dû à une erreur de manipulation. Il fut constaté que tous les animaux ayant

reçu le CFA démontraient une nette augmentation de la quantité de lymphocytes

CD4+ comparativement au groupe contrôle (figure 1.9). En effet, nous avons obtenu

une augmentation de deux fois le ratio CD4/CD8 entre le groupe contrôle et les deux

autres groupes (figure 1.10). Aucun changement significatif de ratio ne fut observé

entre le groupe CFA et le groupe DMPP.

B2 vs B1 iso B 7 vs B6 iso

i: "marqué CD4

isotypique

i:

b)

B 1 2 vs B1 0 iso

C)

Figure 1.9 : Marquage CD4 sur les cellules des LBA. a) rat contrôle b) rat CFA c) rat DMPP

5 -

4

3

2

1

0

contrôle Freund + DMPP

Figure 1.10 : Ratio CD4/CD8

4.2 Projet #2 Modification du modèle existant et analyses supplémentaires


L'injection d'une seule dose de CFA a permis d'enrayer la mortalité post-injection,

problème majeur causé par la double injection. Ce changement au modèle de base a

aussi permis d'éliminer les cas de nécrose au site d'injection. Les animaux, comme

pour le modèle de base, ont démontré une période fébrile d'un ou deux jours suivant

l'injection de CFA. Cet épisode était confirmé par une prise de poids moins élevée

chez le groupe CFA que chez le groupe contrôle lors de la première semaine

seulement.

36

4.2.2 Analyses histologiques

Dans cette étude, 18 rats sur les 20 injectés au CFA démontrent la présence de lésions

dans les échantillons analysés (figure 1.11 a). Il n'y avait pas d'évidence de

granulomes ou d'inflammation chez tous les animaux du groupe contrôle et chez

deux rats du groupe CFA (figure 1.11 b). Le score moyen obtenu pour le groupe

contrôle était de 0, donc les poumons peuvent être considérés comme normaux. Pour

le groupe CFA, le score moyen était de 11 (p=0,0005) et les poumons furent

considérés comme moyennement atteints (figure 1.12).

a) b)Figure 1.1 T : Résultats d'histologie après 45 jours. Coloration à l'hématoxyline-éosine.a) coupe pulmonaire d'un rat du groupe contrôle b) coupe pulmonaire d'un rat du groupe CFA

20

18

12

8

4

0

ooooo

£8°

contrôleGroupes

CFA

Figure 1.12 : Score histologique

37

L'analyse histologique des ganglions a pu démontrer que chez les animaux du groupe

CFA, les ganglions étaient aussi atteints (résultats non présentés). En effet, les

ganglions analysés démontraient la présence d'inflammation et de pseudo-

granulomes.

4.2.3 Comptes cellulaire totaux et différentiels

Les résultats des comptes cellulaires totaux démontrent une nette augmentation du

nombre de cellules totales entre les deux groupes. Chez les animaux du groupe

contrôle, on retrouve 0,63 X 105 cellules/ml comparativement à 2,51 X 105 pour le

groupe CFA (p=0,003), ce qui correspond à une augmentation de quatre fois le

nombre de cellules (figure 1.13). On dénote aussi une augmentation très forte de la

quantité de lymphocytes, les niveaux augmentant de 25 fois entre les deux groupes

(p=0,0098).

• cellules totales• macrophage

lymphocytes

T

contrôle CFA

groupe

Figure 1.13 : Comptes cellulaires totaux et différentiels

38

Pour ce qui est des comptes cellulaires différentiels, on dénote, comme pour le

modèle de base, un débalancement dans le pourcentage des cellules retrouvées. Ce

changement cellulaire est plus prononcé pour ce modèle que pour le précédent.

Une très forte augmentation du pourcentage de lymphocytes est notée pour le groupe

CFA (figure 1.14). En effet, le pourcentage moyen de lymphocytes retrouvés dans

les LBA des rats contrôle est de 5% tandis qu'il est de 37% pour les rats CFA ce qui

correspond à une augmentation de 7 fois (p=0,0002). Le pourcentage moyen de

macrophages démontre des résultats inverses, il passe de 95% à 60% pour le groupe

CFA, une diminution de 1,5 fois par rapport au groupe contrôle (p=0,0003) (figure

1.14).

100

90

80

70

60

50

40

30

70

10

0

I macrophagesI lymphocytes

contrôle CFA

groupes

Figure 1.14 : Pourcentages des cellules en présence dans le LBA

4.2.4 Analyse du ratio CD4/CD8

L'analyse par cytométrie de flux à permis de démontrer qu'une forte population de

cellules marquées CD4 était retrouvée chez tous les animaux du groupe CFA (figure

1.15). La présence de cette population particulière fait apparaître un ratio CD4/CD8

deux fois supérieur pour le groupe CFA (p=0,0003) (figure 1.16).

39

Contrôle

Figure 1.15 : Marquage des cellules CD4+ et CD8+. Les cellules CD4+ sont entourées en rouge.

4.2.5 Analyses immunologiques

L'analyse des eytokines de type Thl a démontré qu'il y a augmentation pour le

groupe CFA de trois des quatre eytokines testées. L'IFN-y augmente de deux log

(p=0,045), le TNF-a de deux log et demi (p=0,0003) et l'IL-12 de deux log

(p=0,0024) entre le groupe contrôle et le groupe CFA (figure 1.16). Il n'y a aucune

augmentation notable de l'IL-18 et des deux eytokines Th2, l'IL-4 et l'IL-13 (non

présenté).

• IFN6 -] IL-18

• TNF5 - BIL-12

contrôle

Figure 1.16 : Analyses immunologiques

CFA

groupe

40

Chapitre 5

Discussion et Conclusions

42

5.DISCUSSION ET CONCLUSIONS

La sarcoïdose pulmonaire est une maladie encore mal comprise et qui

provoque de nombreux questionnements dans le domaine médical et scientifique.

L'ignorance de l'agent causal, des traitements non adaptés, un tableau clinique

variable et l'absence de modèle permettant d'effectuer des recherches comptent parmi

les difficultés rencontrées par les médecins et chercheurs. La découverte d'un effet

secondaire provoqué par le CFA qui, jusque-là, était utilisé en immunologie fit

germer l'idée d'une nouvelle utilisation de celui-ci. L'adjuvant complet de Freund

injecté par voie IV à des rats provoquait la formation de granulomes dans les

poumons, qui lorsque analysés en tomographie axiale et en histologie, démontraient

un profil ressemblant à celui de la sarcoïdose [26]. C'est sur ces bases que s'est

orienté ce projet de recherche.

5.1 Induction des modèles (comparaison)

Lors de ce projet, deux techniques d'induction différentes furent tentées. La

première technique consistait en deux injections IV de CFA à une journée

d'intervalle. Ce modèle, bien que donnant un très bon profil inflammatoire,

comportait beaucoup trop d'effets indésirables. En effet, le taux de mortalité (15%)

associé à cette méthode demeure un obstacle majeur à son utilisation. Ces décès

peuvent être dus à diverses causes. L'injection de CFA peut causer, dans certains

cas, une réaction appelée hypersensibilité sévère fatale. Cette réaction qui est une

forme de réaction allergique très sévère est suivie d'un œdème pulmonaire massif

[37]. Il est aussi possible que ces décès soient provoqués par une embolie pulmonaire

massive [37] ou par l'injection accidentelle d'une bulle d'air dans la veine. En plus

du taux de mortalité élevé, la nécrose était l'autre obstacle majeur. Les lésions

nécrosées au niveau de la queue (site d'injection) sont causées par la composante non

organique du CFA; l'huile [37-38]. Lors de l'injection, une petite quantité de CFA se

retrouvant dans l'espace péri-veineux cause probablement la nécrose.

Le second modèle ne comportant qu'une seule injection de CFA apporte les correctifs

nécessaires à rendre le traitement moins toxique et mieux toléré par les animaux. En

effet, ce deuxième modèle semble être plus doux en ce sens qu'aucun décès ne fut

constaté et qu'aucune nécrose apparente ne fut décelée. L'injection unique de CFA a

permis d'éliminer les décès apparaissant toujours après la seconde injection. De plus,

réduire de moitié le nombre d'injection permet de réduire d'autant la probabilité

d'une injection péri-veineuse causant accidentellement la nécrose.

La formation de granulomes dans les poumons des animaux semblent avoir été

provoquée par la présence des mycobactéries dans le CFA. Les mycobactéries

demeurent, encore à ce jour, un agent dont ont suspecte l'implication dans les cas de

sarcoïdose pulmonaire. Bien que de nombreuses études ne supportent pas cette

hypothèse, il semble de plus en plus acquis qu'un certain pourcentage des cas de

sarcoïdose serait provoqué par cet agent [39]. Ainsi, les mycobactéries en émulsion

dans le CFA semblent créer un modèle représentant une forme possible de sarcoïdose

pulmonaire.

5.2 Analyses par tomographie axiale

La tomographie axiale ne fut utilisée que pour le premier modèle à double

injection. En effet, les résultats obtenus ne furent pas à la hauteur de nos attentes. Le

modèle de granulomes pulmonaires chez le rat semble bien fonctionner et cela est

prouvé par l'aggravation évidente de l'état de l'appareil pulmonaire. Par contre, les

résultats obtenus en comparant les groupes s'avéraient non significatifs. Cette

méthode présente des limitations importantes comme une qualité visuelle très

moyenne comparativement à celle obtenue par l'équipe ayant mise au point le

protocole tomographique [27]. De plus, la gravité de l'atteinte était très variable et ce

à l'intérieur du même groupe. Les résultats obtenus demeurent donc qualitatifs et non

quantitatifs. À la lumière de ces résultats, la tomographie axiale fut abandonnée pour

le modèle à injection unique. Il est bon de préciser que le traitement expérimental au

44

DMPP n'a pas donné les résultats escomptés. Il n'y eut aucune différence

significative prouvant que l'utilisation de cet agoniste puisse avoir contribué à

améliorer l'état des animaux.

5.3 Analyses histopathologiques

L'histopathologie a permis d'obtenir des résultats beaucoup plus précis que

ceux obtenus en radiologie. Les données du premier modèle (2 injections) montrent

des granulomes non-caséeux bien formés, la présence de cellules géantes

multinucléées, de cellules épithéloides et d'inflammation [4-8]. Ces caractéristiques

sont représentatives des granulomes rencontrés lors de biopsies de patients atteints de

sarcoïdose pulmonaires. De plus, ces analyses ont démontré que les poumons des rats

des groupes CFA ou DMPP semblant normaux en tomographie (3 animaux)

s'avéraient présenter des atteintes lorsque observés en histopathologie. Par contre, il

n'y eut aucune différence entre l'état des animaux traités au DMPP et celui des

animaux du groupe CFA. Pour ce qui est du second modèle (1 injection), les résultats

histopathologiques tendent à montrer des poumons présentant des pseudo-granulomes

ou granulomes en formation. Il y a aussi chez ce modèle présence d'inflammation

qui démontre une réaction de l'animal au CFA injecté. Ainsi, il fut démontré que

l'injection IV de CFA avait pour effet d'induire des granulomes en tout point

ressemblant à ceux présents lors de la sarcoïdose pulmonaire. Ces résultats permettent

d'écarter la thèse selon laquelle nous serions en présence d'un modèle s'apparentant

d'avantage à la tuberculose. En effet, les granulomes retrouvés chez les patients

atteints de tuberculose sont de type caséeux comparativement à ceux-ci [8]. Par

contre, ces données entrent en contradiction avec les résultats obtenus par une autre

équipe en 1989 [40]. Ceux-ci, après caractérisation des granulomes, avaient défini

ceux-ci comme caséeux ce que nous tentons de réfuter par cette étude.

45

5.4 Analyses cellulaires

II fut démontré dans le chapitre 1 que certaines caractéristiques cellulaires

étaient typiques de la sarcoïdose pulmonaire. En effet, l'augmentation de la quantité

de cellules totales ainsi qu'une lymphocytose prononcée sont deux de ces

caractéristiques [4]. Nous avons noté lors de ces deux études que l'injection de CFA

causait une forte augmentation de la quantité de cellules totales. Ces deux modèles

ont permis de tirer une conclusion importante; une seule injection de CFA est

suffisante pour causer une augmentation cellulaire qui est significativement valable.

En effet, nous pouvons constater qu'une injection unique de CFA cause une hausse

de 4 fois la quantité de cellules totales ce qui démontre clairement un profil

inflammatoire.

De plus, nous sommes en présence de deux modèles provoquant une lymphocytose

caractéristique de la sarcoïdose pulmonaire humaine. Contrairement à nos attentes, le

modèle à injection unique démontre une augmentation de la quantité et du

pourcentage de lymphocytes plus élevée que le modèle à double injection. Ce

phénomène peut être dû à la durée plus longue du second protocole qui pourrait avoir

contribué à cette lymphocytose élevée. Finalement, il n'y eut aucune différence entre

le groupe DMPP et le groupe CFA que ce soit au niveau du nombre de cellules totales

ou de la quantité de lymphocytes. Ainsi, le traitement n'apporta pas d'amélioration

de l'inflammation pulmonaire chez les animaux.

5.5 Analyse du ratio CD4/CD8

Le ratio CD4/CD8 est l'un des indices les plus révélateur d'une sarcoïdose

pulmonaire. De nombreuses études ont révélé qu'un ratio CD4/CD8 élevé était signe

d'une sarcoïdose [4-11]. Lors de ces études, nous avons constaté que le ratio retrouvé

était doublé entre les groupes contrôle et les groupes recevant du CFA.

Cet indice permet de réfuter la thèse selon laquelle nous serions en présence d'un

modèle d'alvéolite allergique. En effet, le ratio CD4/CD8 diminue lors d'une

alvéolite allergique et ce phénomène est causé par l'augmentation du nombre de

lymphocytes de type CD8 [27].

5.6 Analyses immunologiques

II est déjà reconnu que la sarcoïdose pulmonaire est une maladie

inflammatoire à profil Thl. Ainsi, lors du processus inflammatoire, il y a

relâchement par les divers types cellulaires de cytokines principalement de type Thl.

Les données obtenues par ELISA ont permis de confirmer une sécrétion accrue de 3

cytokines Thl, l'IL-12, le TNF et l'IFN. Ces trois cytokines sont retrouvées en

grande quantité dans les poumons de patients souffrant de sarcoïdose [14-18-20]. De

plus, nous dénotons une absence de sécrétion ou une sécrétion minime des deux

cytokines de type Th2 testées ce qui confirmer le profil recherché pour ce modèle. Par

contre, l'absence d'augmentation de la production d'IL-18, une autre cytokine Thl,

semble contradictoire avec les résultats attendus.

5.7 Traitement expérimental au DMPP

II est déjà connu que le DMPP possède des effets anti-inflammatoires sur un

modèle murin d'asthme [35]. Pour ce qui est de ce présent modèle de sarcoïdose

pulmonaire, nous avons supposé que comme cette maladie présente une forte

inflammation, il serait possible de la diminuer grâce à cet agoniste. L'utilisation du

DMPP n'a causé aucune amélioration significative que ce soit au niveau cellulaire

qu'au niveau physiologique. Il est possible que la durée du traitement n'aie pas été

appropriée et qu'ainsi, les effets n'aie pas eu le temps d'apparaître. La quantité de

DMPP injectée aux animaux était fonction du poids des animaux au départ (300g), et

les rats au terme du protocole pesaient en moyenne 450g.

47

Ainsi, la quantité d'agoniste injectée aurait pu être révisée au cours du protocole en

fonction du poids de l'animal. De plus, l'injection IP n'était peut-être pas la

meilleure voie à utiliser pour administrer le traitement. Il est possible qu'une

administration par voie intra-nasale aurait pu être plus appropriée pour traiter cette

pathologie. En conclusion, le traitement que nous avons tenté sur le premier modèle

s'est avéré inefficace et ce malgré le fait que le DMPP a déjà fait ses preuves dans

d'autres modèles tel l'asthme et l'alvéolite allergique intrinsèque.

Tous ces résultats mis en perspective démontrent bien que ce modèle expérimental de

sarcoïdose pulmonaire pourrait être fort utile lors de recherches subséquentes. Il reste

beaucoup à faire pour réellement comprendre cette pathologie et la maîtriser. Ce

modèle se veut un outil de compréhension mais surtout un instrument utile pour la

découverte de traitements pouvant mener à une amélioration ou une guérison pour les

patients.

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