Microscope optique

1. oculaire2. glissière de réglage de l'écartementinter-pupillairep p3. tube binoculaire4. potence5 tourelle porte-objectif5. tourelle porte objectif6. vernier de positionnement avec vis dedéplacement bidirectionnel du chariot7 chariot de fixation et de7. chariot de fixation et depositionnement de la lame porte-objet8. platine porte-objet9 i ét i d i i t9. vis macrométrique de mise au point10. vis micrométrique de mise au point11. vis de réglage de la hauteur ducondenseur12. pied

Microscope optique

Microtome à paraffine

Coupes : confection de rubansCoupes : confection de rubansRuban (contenant du tissu) obtenu à partir d’un spécimen donné.

Etapes de préparation du frotti sanguin

CryostatsCryostatsCoupes à congélation

Coupe histologique , MOEpithélium vaginalp gH & E

VaisseauxVaisseaux sanguins

FibroblastesFibroblastes peu actifs

Fib dFibres de collagène

Coupe histologique , MOp g q ,Tissu conjonctif lâcheH & E Espaces vides alvéolaires

séparant les fibres decollagènecollagène

Coupe histologique , MOTissu conjonctif lâcheH & E /coloration de l’élastineH & E /coloration de l élastine

Coupe histologique , MOCoupe histologique , MOTissu conjonctif denseH & E

Coupe histologique , MOTi l i ( ié l i )Tissu musculaire (strié squelettique)H & E

Coupe histologique , MOTissu nerveux (cervelet)Tissu nerveux (cervelet)H & E

Coupe histologique, MOTrichrome de MassonTissu conjonctif coloré en bleu,Paroi du gros intestin bordée,g ,du côté de la lumière par unépithélium de revêtementsimple (flèche)simple (flèche)

Coupe histologique, MOT i h d MTrichrome de MassonTissu conjonctif coloré en bleu

MUC : muqueuse, SM : sous muqueuse, CMO : couche musculaire oblique, CMC : couche musculaire circulaire, CML : couche musculaire longitudinale

Coupe histologique, MOC l i PAS ( i l )Coloration : PAS (rouge-violet)Mise en évidence des glucidesLe PAS colore en rouge-violet :1 : mucus des cellules caliciformes2 : le plateau strié

Coupe histologique, MOColoration : PAS (rouge violet)Coloration : PAS (rouge-violet)Les glandes de Bruner du duodénum ontune sécrétion mucoïde PAS+1 l iè t b l i1 : lumière tubulaire2 : nombreuses ramifications latérales

Coupe histologique, MOPAS/H & EPAS/H & E1 : bordure en brosse2 : membrane basale

1

22

TCP t b t é i lTCP : tube contourné proximalTCD : tube contourné distal

Coupe histologique, MOBleu Alcian (mucus sécrété par les

li if fl h )¢ caliciformes, flèche)

Coupe histologique, MOTissu nerveuxTissu nerveuxMéthode : bleu de toluidine et orOr : détail sur la forme duneurone et met en évidence laneurone et met en évidence laprésence d’un cytosquelette dansles prolongements (dendrites et

)axones)Coloration bleue : noyaux descellules de soutien avoisinantes

Coupe histologique , MOTissu nerveux (cervelet)Bielschowsky/Rouge neutreBielschowsky/Rouge neutreMise en évidence du trajet des axones .Les axones sont colorés en noir par l’argent, et les corps cellulaires sont contre colorés par le rouge neutresont contre colorés par le rouge neutre.

Coupe histologique, MOColoration : Noir soudanGros globules graisseux colorés en noirGros globules graisseux colorés en noirCoupe à congélation permet laconservation des graisses

Frottis vaginal, MOColoration : PapanicolaouEtalement de cellules obtenues par raclage p gde la surface de l’épithélium pavimenteux stratifié bordant le col utérin

Frottis buccal MO H & EFrottis buccal, MO, H & E

Frottis sanguin , MOMay-Grünwald-Giemsa (MGG)Globules rouge (érythrocytesGlobules rouge (érythrocytes,hématies)Présentant une coloration rose dueà l é d’ d éà la présence d’une grande quantitéd’hémoglobine.La région centrale apparaîtfaiblement colorée du fait de leurforme particulière de disquebiconcave.

Frottis sanguin , MOMay Grünwald Giemsa (MGG)May-Grünwald-Giemsa (MGG)

Frottis sanguin , MOFrottis sanguin , MOMay-Grünwald-Giemsa (MGG)

Frottis sanguin , MOFrottis sanguin , MOMay-Grünwald-Giemsa (MGG)

Frottis sanguin , MOFrottis sanguin , MOMay-Grünwald-Giemsa (MGG)

Frottis sanguin , MOFrottis sanguin , MOMay-Grünwald-Giemsa (MGG)lymphocytes

Cellule de l’oreille observée en microscopie confocale à fluorescence.Cellule de l oreille observée en microscopie confocale à fluorescence.

une cellule d’embryon deune cellule d embryon desouris visualisée encontraste de phase. Lescontours sont entourésd’une ligne blanche.

Neurone du cervelet marqué par une moléculefluorescente visualisé au microscope à fluorescencep

Microscope électronique à transmission (MET)( )

Tube sous videTube sous vide

Grille porte-objet

Microscope électronique à transmission (MET)

Microscope électronique à transmission (MET)

Un ultramicrotome

Spécimen : inclusion en résine

Bloc en résine

CCoupes ultrafines

eau

Couteau en diamant

Deux types de grilles :1/ sous forme de grillage

2/ présentant un trou au milieu = mono-trou

Pour les mono-trous, avant le dépôt des coupes sur ces dernières, il estnécessaire de préparer la grille de manière à obturer les trous par une matièrelaissant passer les électrons. Pour cela, on utilise une solution de collodion.

Aspect ultrastructural, MET

REGREG

noyau

Aspect ultrastructural, MET

mitochondrie

Citernes de REGREG

Aspect ultrastructural, MET

Têtes de flèches : Citernes de REGFlèches : ribosomesFlèches : ribosomes

Aspect ultrastructural, MET

L ib f t dLes ribosomes forment des amas = polysomes ou polyribosomes (cercles)

Aspect ultrastructural, METCellules sécrétrice de protéines

noyaunoyau

REG éti l d l i l iREG :réticulum endoplasmique granulaire GZ : vésicules de sécrétion bordées par une membrane, grains de zymogène, répartis dans la partie apicale du cytoplasme

Aspect ultrastructural, METFibroblaste1 ll l i1: corps cellulaire2 : Prolongements (plusieurs)

Globules rouge (H) (érythrocytes, hématies), METAvec cette technique la forme observée dépend du plan de sectionAvec cette technique, la forme observée dépend du plan de section

technique de cryodécapage (réplique)

1 : tissu placé sur un support2 : congélation3 : le tissu est placé dans une cloche sous videp4 : le tissu congelé est fracturé5 : surface du tissu6 : ombrage de la surface libérée6 : ombrage de la surface libérée7 : réplique de la surface isolée par digestion enzymatique du tissu8 : photographie de la réplique montrant l’enveloppe du noyau et ses pores

C l i é i METColoration négative MET

Adénovirus Mosaïque du tabac Mosaïque du tabacAcide phosphotüngstique

qAcétate d’uranyle

qMolybdate d’ammonium

Coloration négative MET : Actine

Image en cryodécapage, ombrageréplique, MET(1) n bras de mélanoc te infiltré entre(1) un bras de mélanocyte infiltré entredeux cellules épithéliales (2).Le trait de fracture révèle les feuillets

b i d l imembranaires de plusieursmélanosomes (= organites cellulaires).Les cellules épithéliales sont rempliesde tonofilaments.

2

Préparation par cryodécapage, METSur cette préparation le plan de clivageSur cette préparation, le plan de clivagea intéressé une partie de l’enveloppenucléaire et les pores nucléaires PN sontl bi i ibl O balors bien visible. On observe

également le contour de la membraneplasmique MP et des mitochondries.

Préparation par cryodécapage, METCellule de racine d’oignonLa partie supérieure de la figure correspond au noyau (N) et montre les complexes des poresp p g p y ( ) p pnucléaires (np) et l’enveloppe nucléaire (ne). Dans le cytoplasme on peut observerl’appareil de Golgi (G) et une grosse vacuole (V), (pc), paroi cellulaire

Microscope électronique à balayage (MEB)⇒ Observation des cellules en trois dimensions

Frottis sanguin , MEBGlobules rouge (érythrocytesGlobules rouge (érythrocytes,hématies) en forme biconcave

MEBTissu musculaire (strié squelettique)

Coloration au FEULGENColoration au FEULGEN

La métaphase : lesL'anaphase : les deux chromatides de chaqueMise en évidence de La métaphase : les

chromosomes seregroupentprogressivement à

chromatides de chaque chromosome sont séparées. Les deux lots d h fil

Mise en évidence de l’ADN

progressivement àl'équateur du fuseau.

de chromosomes fils montent vers les pôles

Digestion enzymatique Exemple : mise en évidence des acides nucléiques par le TEST DE BRACHETExemple : mise en évidence des acides nucléiques par le TEST DE BRACHETsur des coupes sériées. (Coloration : Vert de méthyle-Pyronine (V.M.P.))

Cytoplasme

Noyau

V.M.P. DNase + V.M.P.

RNase +

y pNucléole

ARNV.M.P.+

V.M.P.

ADNCoupe témoin : - chromatine : vert (V M )

- Dans le noyau, seule le nucléole- chromatine : vert (V.M.)

- Nucléole : rose (P)- Cytoplasme : rose (P) - Dans le noyau, seule la

chromatine est colorée en vert

est colorée en rose- Cytoplasme : rose

- Cytoplasme : non coloré

Immunochimie 1/ Méthode directe : l’anticorps primaire estcouplé soit à la peroxydase soit à une substancefluorescente (fluorescéine, rhodamine)

Marqueur fluorescent

enzymefluorescent

anticorps primaireanticorps primaire

Antigène recherchéAntigène

recherché

2/ Méthode indirecte :2/ Méthode indirecte :Emploi de Molécules fluorescentes

(fluorochromes) :(fluorochromes) :

Anticorps primaireAnticorps secondaire fluorescent (fluorescéinefluorescent (fluorescéine, rhodamine)

Antigène recherché

2/ Méthode indirecte :2/ Méthode indirecte : Emploi d’un anticorps secondaire couplé à la

peroxydase (enzyme détectée après incubation avec unperoxydase (enzyme détectée après incubation avec unsubstrat incolore qui se colore après réaction) :

HRP =peroxydase

Anticorps primaireAnticorps secondaire

Antigène recherché

couplé à la peroxydase

2/ Méthode indirecte (amplification) :2/ Méthode indirecte (amplification) :Emploi d’un anticorps secondaire biotinylé :

⇒Complexe Avidine-Biotine

HRP

Anticorps secondaire Avidine

HRP

A ti i i

pbiotinylé

Anticorps primaire

Antigène recherché

2/ Méthode indirecte (amplification) :2/ Méthode indirecte (amplification) :A la place de l’Avidine on peut utiliser la StreptAvidine

Immunohistochimie : kératine marquée au niveau de l’épithélium (MO)Anticorps secondaire couplé à la peroxydase

Immunofluorescence :Fibroblaste observé au microscope confocale :Visualisation tridimensionnelle, localisation intracellulaire deplusieurs marqueurs fluorescents

Immunofluorescence : microfilaments d’actineCytosquelette d'Actine et de Smooth Muscle Actin deCytosquelette d Actine et de Smooth Muscle Actin defibroblastes de souris « nouveau né » en culture primaire.

Immunofluorescence :Cellule observée au microscope photonique à fluorescence,Cellule observée au microscope photonique à fluorescence,les filaments du cytosquelette apparaissent en rouge

Immunohistochimiel i d i l l (Emploi de particules opaques aux électrons (pour

MET) ex: or colloïdal) :

Eclatement cellulaire :1/ choc osmotique1/ choc osmotique2/ Sonication : Elle consiste en ladestruction des cellules par les ultrasonsdestruction des cellules par les ultrasons.Une tige de métal (le "sonicateur") àg ( )l’extrémité très fine est introduite dans lasuspension de cellules et induite à vibrer

i lviolemment.Les vibrations sont des ondes depression ultrasoniques qui causent lapression ultrasoniques qui causent lacroissance de bulles par un phénomèneappelé "cavitation". Ces bulles sont

i tsoumises à un grand stress par les ondesultrasoniques.

sonicateur

Eclatement cellulaire :3/ Broyeurs mécaniques :y q

Broyeurs : un couteau tourne à grande vitesse ds un bol

Homogénéiseurs : Potter En faisant tourner et descendre

id t l i t d l b lrapidement le piston dans le bol, on force les ¢ à passer dans l'espace libre entre le piston et la paroi dulibre entre le piston et la paroi du bol. Par cisaillement, les membranes cellulaires s'ouvrent et libèrent les organites.Suivant la taille des cellules, on utilise des Potter de "clearance"utilise des Potter de "clearance" différentes. La "clearance" est l'espace compris entre le piston etl espace compris entre le piston et la paroi du bol.

CentrifugeusesCentrifugeuses

t

Centrifugeuse

rotor

g

Centrifugation différentielle

di t di ti di t tigradient discontinu gradient continu

Pour centrifugation en gradient de densité (ultracentrifugation)

Centrifugation en gradient de densité (ultracentrifugation)

Fraction d’organites

Lysosomes 1.12 g/cm3

mitochondriesDensité croissance mitochondries 1.18 g/cm3

peroxysomes 1 23 g/cm3

Densité croissance de saccharose g/cm3

Avant centrifugation Après centrifugation

1.23 g/cm

g p g

Centrifugation à l’équilibre ou centrifugation isopycnique ( t if ti di t d(centrifugation en gradient de densité).

Equipement : Electrophorèse verticaleEquipement : Electrophorèse verticale

Electrophorèse verticale : Exemple de gel après migration

standard E1 E2

E : échantillonsE : échantillons

El t h è ti lElectrophorèse verticale

Générateurs pour électrophorèse

Exemple d’électrophorèse : Électrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétate de cellulose

E h ill ili é l i d hé l bi A S

et S sur bande d acétate de cellulose (électrophorèse horizontale)

Echantillons utilisés : solutions des hémoglobines A et Sdu commerce dissoutes à raison de 2,5 mg/mL dans dutampon d'électrophorèsetampon d électrophorèse.

Pour chaque "membre de la famille", on place ds untube Eppendorf étiqueté 100 µL de solution.pp q µ

Echantillons :- individus homozygotes pour HbA : 100 µL de la

l i d'hé l bi Asolution d'hémoglobine A,- individus homozygotes pour HbS : 100 µL de lasolution d'hémoglobine Ssolution d hémoglobine S,- individus hétérozygotes : 50 µL de la solutiond'hémoglobine A et de 50 µL de la solutiong µd'hémoglobine S. 1/11

Électrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétate d ll lde cellulose

1 M tt à t l b d1. Mettre à tremper les bandesd'acétate de cellulose dans le tampond'électrophorèse (tampon tris-véronal)pendant 10 à 20 minutes.

2/11

Électrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétateÉlectrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétate de cellulose

2 E l' è d t l t l2. Essorer l'excès de tampon en plaçant lesbandes entre deux feuilles de papierabsorbant (essuie-tout).

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Électrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétateÉlectrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d acétate de cellulose

3 Placer la bande sur le portoir en veillant3. Placer la bande sur le portoir en veillantà disposer la face absorbante vers le haut.

L b d d it êt t d t t é itéLa bande doit être tendue et ses extrémitésdoivent dépasser suffisamment pourtremper dans le tampon une fois le supportplacé dans la cuve.

NB Le dispositif de fixation de la bandesur le support varie selon les fabricants.

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Électrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétate de cellulosede cellulose

4. Remplir les deux compartiments de lacuve avec un même volume de tamponcuve avec un même volume de tampond'électrophorèse.5. Mettre en place le(s) support(s) danslla cuve.

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Électrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétate p gde cellulose

6. Prélever un échantillon et ledé l b d déjà ldéposer sur la bande, déjà en place surson support, au tiers de l'extrémité,côté cathode (borne noire) en prenantgarde que la bande soit biengarde que la bande soit bienhorizontale et que l'échantillon necoule pas.

On peut prélever et déposer les échantillons soit avecune micropipette, soit avec un capillaire, soit avec unapplicateur comme celui présenté ci-dessous réaliséavec un bouchon et deux trombonnes pour permettre

dé ôt li é iun dépôt linéaire.6/11

Électrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétate p gde cellulose

7. Recommencer pour chaque échantillon7. Recommencer pour chaque échantillonen laissant un espace suffisant pour nepas risquer la fusion des échantillons quidiffusent légèrement lors du dépôtdiffusent légèrement lors du dépôt.

Utiliser un applicateur différent pourh é h till i bichaque échantillon ou sinon, bien

nettoyer l'applicateur entre chaquedépôt.

8. Fermer la cuve et mettre sous tension(environ 1 h de migration à 150 V).

7/11

Électrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétate p gde cellulose

9. Après migration, placer les9. Après migration, placer lesbandes dans la solution derouge ponceau pendant 10minutesminutes.

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Électrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétate p gde cellulose

10. Décolorer le fond dans des10. Décolorer le fond dans desbains successifs d’acide acétique à5 %.Agiter le cas échéant pourAgiter le cas échéant pouraccélérer la décoloration.

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Électrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétate p gde cellulose

RésultatsL'hémoglobine S moinschargée que l'hémoglobineA i d lA en raison de lasubstitution d'un acideglutamique par une valineglutamique par une valineen position 6 de la chaînede la bêta globine migremoins loin et peut ainsi êtredistinguée sur la banded' ét t d ll ld'acétate de cellulose.

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Électrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétate p gde cellulose

Solutions Tampon tris-véronalTris (hydroxyméthyl) aminométhane : 7,2 g ( y y y ) , gAcide diéthylbarbiturique : 1,82 g Diéthylbarbiturate de sodium : 10,2 g Eau distillée : 1 LEau distillée : 1 L Solution de coloration : rouge ponceauRouge ponceau : 2gAcide trichloracétique : 30gAcide trichloracétique : 30gEau distillée : 1 L Solution de décolorationA id éti à 5 %Acide acétique à 5 %

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Exemple d’électrophorèse : mettre en évidence la molécule d’hémoglobine d’un sujet g j

atteint de drépanocytose.

⇒ deux électrophorèses en // : l’hémoglobinedu sujet malade (S) et celle du sujet saintémoin (C pour contrôle)témoin (C pour contrôle).On constate une ≠ce entre les deux sujets :* bandes qui n’∃ pas chez le sujet malade(bandes N et C) : Ces protéines st absenteschez ce sujet.* bandes supplémentaires chez le sujet maladebandes supplémentaires chez le sujet malade(A2) : cette protéine n’∃ que chez le sujet

malade.* b d S ’ ê i h l* bande S n’est pas au même niveau chez lesdeux sujets : La protéine a subit unemodification (un acide aminé ≠ par ex) qui se( p ) qtraduit par une charge ≠.

chromatographie sur couche mincechromatographie sur couche mince

Révélation par fluorescence de la position des composantsp p

Étuve incubateur CO2

Hotte de culture

Flacons de culture cellulaireboîtes de culture rempliesde milieu nutritif

Immunofluorescence sur culture cellulaireImmunofluorescence sur culture cellulaire

Immunofluorescence sur culture cellulaire

Culture de fibroblastes

Fibroblastes en cultureFib bl t hi t l i Fibroblastes en cultureFibroblastes en coupe histologique ,

Numération cellulaire

Il existe deux grands types principaux de cellules de numération :Il existe deux grands types principaux de cellules de numération :-Cellule de Thoma.-Cellule de Malassez (la plus courante).

Objectif le dénombrement cellulaire : savoir combien de cellules contient notre jmilieu. Le volume de comptage est déterminé par :

-la surface du quadrillage gravé sur la lame.q g g-la profondeur de la chambre.

Cellule de Malassez

1/5

→ le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm3 = 10-6 dm3

→ chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible soit 0 01 mm3 = 10-→ chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm 108 dm3

2/5

Étapes de réalisation- Procurez-vous une cellule de Malassez.- Lorsque la suspension cellulaire est trop concentrée réaliser une dilutionLorsque la suspension cellulaire est trop concentrée, réaliser une dilution préalable. - Placer la cellule de comptage sur une surface plane. Homogénéiser la suspension cellulaire et prélever celle ci à l’aide d’une pipette Pasteur Remplir la chambre decellulaire, et prélever celle ci à l aide d une pipette Pasteur. Remplir la chambre de comptage par capillarité, en plaçant la pointe de la pipette légèrement inclinée près de la lamelle sur la plate-forme centrale quadrillée.

L li d i ê f i l f i b ll d’ i f iLe remplissage doit être fait en une seule fois, sans bulles d’air, et sans fairedéborder le liquide dans les rigoles. Laisser sédimenter les cellules sur lequadrillage quelques minutes, et passer à la numération.- Observer à l’objectif x10 pour repérer la position du quadrillage, et vérifierl’homogénéité de la répartion des cellules à compter (si la répartition estmauvaise, recommencer)., )- Observer ensuite à l’objectif x40 pour réaliser le comptage (1 rectangle par

champ).- Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalité des 100Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalité des 100

rectangles du quadrillage.

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Numérotation des cellules en culture

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Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compterseulement celles qui chevauchent 2 arêtes du rectangle sur 4 (en pratique, on choisitde prendre en compte les cellules chevauchant la ligne horizontale supérieure et lade prendre en compte les cellules chevauchant la ligne horizontale supérieure, et laligne verticale droite).

Après avoir effectué la manipulation, on calcule la concentration cellulaire de la suspension de cellules étudiéesuspension de cellules étudiée.

Soient : -n : nombre de cellules comptées.-V : volume de comptage.V : volume de comptage.-f : facteur de dilution.-N : nombre de cellules par litres.

Si on a n cellules dans V litres, alors on a N cellules dans un litre :N x V = n x 1 N = n / VSi la solution avait été diluée : N = (n / V) x f

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AUTORADIOGRAPHIE : mise en évidence des macromolécules marquées

Cristaux de bromure d’argent en couche monocristalline (émulsion nucléaire)

Rayons émis par 3H

Coupe histologique (100 nm)

Rayons émis par 3H

Protéine en cours de synthèse

Ribosomes (en fait, polysomes

Citerne du REG

associés aux membranes de REG)

cristaux de bromure d’argent

Emulsion photo-radiographique

Spécimen (cellule marquée)

support

Autoradiographie

Cytomètre de flux

Les cytomètres de flux permettent donc de :1 – Dénombrer ≠tes populations ¢res (identifiées chacune par un fluorochrome)2 – Trier des ¢3 – Quantifier le nb de marqueur exprimé par une ¢

Principe de fonctionnement d’un cytomètre de flux

Vibrateur à ultrasonsSuspension cellulaireManchon liquide

AnalyseurLaser

Gouttelettes chargées positivementGouttelettes chargées positivement

Gouttelettes chargées négativement

Ch él t i Signal de chargesChamps électrique détecteurs Signal de charges

collecteur

F : marqueur fluorescentE : enzymeE : enzymeR : radio-isotope

Hybridation in situ : Cas de sonde à nucléotides couplés à la digoxigénine ⇒ Détection par immunomarquagep q g

Spectrophotomètre