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Cours IFSI 2010 S1 Pr G. Arlet Les microbes Microbiologie médicale Professeur Guillaume Arlet Hôpital Tenon, AP-HP Faculté de Médecine, UPMC Cours IFSI 2010 Semestre 1

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Les microbesMicrobiologie médicale

Professeur Guillaume ArletHôpital Tenon, AP-HP

Faculté de Médecine, UPMC

Cours IFSI 2010 Semestre 1

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Définition

»Micro-organismes• Etres vivants microcopiques• Uniquement visible qu’au microscope• Premiers êtres vivants sur terre• Environ 3 à 4 miliards d’années

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Evolutionen millions d’année

4500 3000 2000 1000 0

ArchaebactériesCellule eucaryote

9E. coli

0,03

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Classification des microbes• Etres unicellulaires : protistes• La division cellulaire génère deux individus• Protistes eucaryotes (vrai noyau)

– Protozoaire– Algues– Champignons et levures

• Protistes procaryotes – Bactéries

• Acaryotes : virus

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LES BACTERIESDéfinition

Etre vivant, unicellulaire, de petite taille (généralement 1 micro de diamètre et quelques microns de longueur).

Cellule procaryote donc dépourvue d’un véritable noyau : absence de membrane nucléaire, chromosome unique en général.

Paroi rigide faite d’un constituant spécifique : peptidoglycane ou mureine.

Classification est fondée sur les caractères morphologiques, tinctoriaux, biochimiques, antigéniques génétiques

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Structure générale

CapsuleParoi

Membrane cytoplasmique

Pili sexuel

Flagelles

Pili communsChromosome

Ribosomes

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Rôle du peptidoglycane

Propriétés du Peptidoglycane

forme et rigidité de la bactérieaffinité tinctoriale selon l’épaisseur :

coloration de Gramsensibilité au lysozyme, aux antibiotiques

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peptidoglycane

PorineMembrane externeAcides téchoiques LPS

espace périplasmique

Membrane cytoplasmique

Bactérie à Gram positif Bactérie à Gram négatif

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Autres composants de la paroi bactérienne

Membrane externe (Gram -) :lipopolysaccharide (LPS), endotoxine, antigène somatique O

Membrane interne (Gram -) ou cytoplasmique (Gram +) :barrière osmotique métabolisme énergétique.

Capsule (inconstante) : polysaccharidique, virulence, (opsonisation) : S. pneumoniae

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Appendices externesFlagelles : 15 à 20µ de long Mobilité

Protéine antigénique : antigène HImplantation

Polaire Péritriche

Monotriche Lophotriche

Pili. : 0,2 à 5 µ de longStructure et fonctions : poils raides, en protéine,sexuels (transfert génétique), communs (adhésion) : Escherichia coli, Neisseria gonorrheae

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Spore : chez bacilles à gram positif , Bacillus, Clostridium

Formation : sporulation (intracytoplasmique)sécheresse, chaleur, appauvrissement du milieuformation de la préspore, maturation, germination

FonctionConservation du patrimoine génétiquerésistance aux agents physiques et chimiques.

Température, chaleur (100°C), UV, Rayons X, agents chimiquesStérilisation : Chaleur humide à 120°C

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LES CONSTITUANTS INTERNESCytoplasme

Acide désoxyribonucléique : Chromosome, ADN surenrouléPlasmideRéplication sur les deux brins (< 20 min.)

Acides ribonucléiques : messager, de transfert, RibosomalSmall ARN

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Morphologie quelques exemples

Coques Gram + en amas

Coques Gram + en chainettes

Bacilles gram –mobiles péritriches

Bacilles Gram -capsulés

Bacille Gram –mobile polaire

Diplocoques Gram + capsulés

Bacilles Gram + sporulés

Vibrions, Campylobacter

SpirillesTréponème

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LA CROISSANCEConditions physicochimiques

- Températurebactéries mésophiles - optimum de 20°C à 40°C.certaines bactéries (psychrophiles) cultivent mieux à 4°C.bactéries thermophiles

-pH en général optimum de croissance à la neutralité

-Pression osmotique saumure (NaCl > 30 %) empêche la croissance

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- Pression partielle d’02type respiratoire :

Aéro Anaerobie Aérobie Microaérophile Anaérobie

LA CROISSANCE

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Quelques exemples de temps de génération

Escherichia coli : 17 minutes

Staphylococcus aureus : 30 minutes

Lactobacillus acidophilus : 75 minutes

Mycobacterium tuberculosis : 20 heures

Treponema pallidum : 33 heures

LA CROISSANCE

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Génétique :Les outils de l’évolution bactérienne

• Mutation• Acquisition d’ADN étranger

– Transformation – Transduction– Conjugaison– Transposons conjugatifs

• Remodelage interne– Séquences d’insertion– transposons

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CARACTERES DES MUTATIONS

1/ Rareté : 1 individu sur 106-108

2/ SpontanéitéLa bactérie mutante pré-existe au sein de la populationavant même tout contact avec l’agent sélectif

3/ DiscontinuitéLa modification s’effectue en une seule étape selon la loi du tout ou rien,

4/ Stabilité et transmissible à la descendance.

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Plasmides

Gènes de résistance

Gènes de virulence

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CONJUGAISON

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Flores bactériennes humaines

Pr. Guillaume ARLETUFR de Médecine

Université Pierre et Marie Curie

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Homme et bactériesquelques notions

Homme : 1013 cellules eucaryotes et 1014 bactéries

Nouveaux nés : stériles à la naissance

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Flore humainequelques définitions

• Flore commensale (cum mensa)• Flore saprophyte• Flore transitoire

Notion de virulence• Bactérie pathogène stricte• Bactérie pathogène opportuniste

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Les flores humainesFlores humaines

• peau : 102-106/cm2

• rhinopharynx 108/ml • oropharynx : 108/ml • digestive : 102-1011/g • vagin : 108/ml

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Le corps humain

Les régions stériles• trachée, bronches, poumons

• sous la peau• les urines

• séreuses et organes

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Flore bactérienne cutanée• La peau est située en première ligne dans la défense vis-

à-vis des infections.• La flore cutanée normale a un rôle de protection contre

les infections par plusieurs mécanismes : l’interférence bactérienne, la production d’acides gras, et même par la production de peptides antimicrobiens.

• Plus de 200 espèces bactériennes identifiées

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Variation quantitative de la flore cutanée

• Régions sébacées : 105-106/cm2

– De part et d’autre des narines, – Régions pileuses– Conduit auditif externe

• Régions humides : 106-107/cm2

– Aisselles– Périnée– Espaces interdigitaux– Nombril

• Régions sèches : 102/cm2

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Flore aérienne supérieureRhinopharynx Oropharynx

• Staphylocoque doré (orifices narinaires en particulier)• Streptocoques, dont S. pneumoniae• Haemophilus, dont H.influenzae• Neisseria (éventuellement Neisseria meningitidis dont le portage

est transitoire)• Anaérobies, corynébactéries, lactobacilles.

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Flore digestive humaine

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Flore digestive humaine : rôle1. Commensalité

• Participation à la digestion alimentaire• Synthèse de vitamines (K, folates, B)

2. Résistance à l’infection Effet de barrière

• Bactériocines• Encombrement stérique• Métabolites toxiques• Déplétion alimentaire

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Effet de barrière

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Flore vaginale• Les lactobacilles acidophiles (bacilles de Döderlein),

par leur sécrétion d'acide lactique entretiennent unpH bas qui limite la flore de colonisation et permet lafécondation).

• Streptocoque (Streptocoque B essentiellement)• Corynébactéries• Bifidobacterium.• Après la ménopause, les anaérobies et

entérobactéries sont plus abondantes.

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Flore bactérienne et antibiotiques

• Flore commensale habituellement sensible• Flore soumise à pression de sélection• Émergence de la résistance• Transfert de la résistance

– Transformation (acquisition d’ADN nu)– Conjugaison (acquisition de plasmides R)

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Flore bactérienne et système immunitaire

• Système immunitaire et flore digestive• La flore digestive permet le développement

du système immunitaire digestif et sa stimulation permanente

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Conflit hôte-bactérienotion de virulence

• Apport constant de bactéries extérieures• Pas d’implantation dans la très grande

majorité des cas• Rarement maladies infectieuses• Origine commensale parfois

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Bactéries pathogènesla tenue de combat

Pili communs PeptidoglycanePili sexuels

Flagelles

internalines

sidérophores cytotoxines LPScapsule

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Bactéries pathogènes : la tenue de combat

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Conflit hôte-bactériescritères de virulence

PropriétésInfection

Bactéries virulentes Bactéries opportunistes

Hôte ImmunocompétentImmunodéprimé

Rupture des barrières

Dose infectante faible forte

Pathogénicité forte faible

Persistance oui non

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Conflit hôte-bactérieBactéries virulentes/doses infectantes

Bactérie Maladie Dose infectante

Voie de pénétration

Salmonella typhi Fièvre typhoïde ≤ 105 orale

Shigella dysenteriae Dysenterie bacillaire 10 orale

Mycobacterium tuberculosis Tuberculose 1-10 respiratoire

Yersinia pestis Peste 1-10 piqûre

Rickettsia prowazeki Typhus 1-10 piqûre

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Pouvoir pathogène bactérien

• Pénétration dans l’organisme• Multiplication locale• Expression de la pathogenicité• Diffusion dans l’organisme• Résistance au système immunitaire• Persistance dans l’organisme

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Expression du pouvoir pathogène

Bactéries « toxiques » « invasives »

pénétration Oui Oui

multiplication locale +++ +

toxines +++ +/-

diffusion Non +++

tableau intoxination infection diffuse

traitement symptomatique antibiotique

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Les outils de la virulence• Implantation : adhésines, pili• Production de toxines très puissantes• Pénétration intracellulaire : internalines• Destruction tissulaire enzymes : cytotoxines• Résistance à la phagocytose et au complément :

capsule et lipopolysaccharide• Captation du fer : sidérophores• Survie intracellulaire

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Les pathogènes opportunistes

• Pathogènes car diminution des défenses• « Immunodépréssion »

– Maladies du sang, cancer, etc…– Age : NN et personnes agées– Terrain : diabète, alcoolisme, insuffisant

respiratoire– Iatrogène : sondage, KT, réanimation– Médicaments : corticoides, AINS

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Le Choléral’agent pathogène

• Vibrio cholerae– Bacille à Gram -– halophile – très mobile – vit dans les eaux alcalines salées – Épidémies– Circonstances de survenue

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• Diarrhées profuses• Selles « eaux de riz » très liquides• Déshydratation• Décès• Traitement par réhydratation

Le Cholérale tableau clinique

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Le Cholérala physiopathologie

Cl-

NaCl

HCO3-

Adénylate cyclase

Protéine G

ATPAMPc

kinase

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Le Tétanos

• Quel est mon nom ? : Clostridium tetani• Qui suis je ? : Un bacille gram + anaérobie• D’ou viens-je ? : le cheval est mon ami• Pourquoi je résiste ? : je sporule • Que fais-je ? : je donne le Tétanos

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Le Tétanos

• Plaie cutanée• Germination• Multiplication locale• Elaboration de la toxine• Blocage de la transmission

des neurotransmetteurs• Paralysie et asphyxie

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Les Salmonelles

• Adhésion aux cellules jéjuno-iléales• Invasion par invasine qui

reconnaissent les intégrines des cellules

• Réarrangement du cytosquelette• Persistance, survie et multiplication

dans le phagosome

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• Pénétration par les cellules M• Invasion par le complexe IpaB-IpaC secrété par

un système de sécrétion de type 3• Ipa (invasion plasmid antigen)• Lyse des phagosomes• Apoptose des macrophages• Pénétration des autres cellules épithéliales

Les Shigelles

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Les Shigelles

Cellule MCellule épithéliale

Polynucléaire

Macrophage

apoptoseCaspase 1

IL-1ßactivé

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Les pathogènes opportunistes• Pathogènes car diminution des défenses• « Immunodépréssion »

– Maladies du sang, cancer, etc…– Age : NN et personnes agées– Terrain : diabète, alcoolisme, insuffisant

respiratoire– Iatrogène : sondage, KT, réanimation– Médicaments : corticoides, AINS

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Staphylococcus aureus• Portage nasal chez 10 à 40% des individus• 103 à 104 / cm2

• 60% des individus sont porteurs de manière intermittente

• Durée du portage de plusieurs mois à plusieurs années

• Autres sites :vagin, périnée, peau, plaies

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Staphylococcus aureus

S. aureus expriment de nombreux facteurs de virulence

• 1ère étape colonisation de la peau et des muqueuses – rôle des acides lipoteichoïques– Pénétration par effraction ou brûlure

• Colonisation des tissus sous jacents• Résistance à la phagocytose • Élaboration de toxines

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Staphylococcus aureus

• Multiplication et Dissémination• Sidérophores en phase post exponentielle de

croissance• Coagulase qui se lie à la prothrombine qui se

transforme en thrombine activée qui transforme le fibrinogène en fibrine

• Staphylokinase qui fragmente le caillot en envoie des micro-embols septiques dans la circulation

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Staphylococcus aureus

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Escherichia coli• E. coli responsables d’infections intestinales

– ETEC E. coli enterotoxinogènes• Epidémies enfants pays EVD, diarrhées du voyageur (turista)

– EPEC E. coli entéropathogènes pays EVD• Diarrhées aigueset chroniques dans les écoles et les crèches

– EIEC E. coli entéroinvasifs• Syndromes dysentériques

– EHEC E. coli entérohémmoragiques• Colites hémmorragiques et SHU

– EAggEC E. coli entéroaggrégatifs• Diarrhées chez nourrissons et enfants pays EVD

– DAEC E. coli Adhésion diffuse

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Escherichia coliinfections extraintestinales

– Infections urinaires, pyélonéphrites– Méningites néonatales– Cholécystites– Septicémies– Infections suppuratives diverses

ExPEC

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Escherichia coliExPEC :

• Adhésion par – FimH– P fimbriae (opéron pap), – S fimbriae– Adhésine non fimbriale (Afa)

• Capsule K1 : résistance à la phagocytose• Cytotoxines

– Hémolysines A (opéron à 4 gènes)– Toxine dermonécrotique CNF 1

• Sidérophores – aérobactine, – yersiniabactine

• Recepteurs de ces sidérophores (IutA, FyuA)

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Transmission des bactéries• Réservoirs• Modalités de transmission

– Directe– Indirecte

Les infections liées aux soins

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Réservoirs- Strictement humain

selon la matière infectante* selles (fièvre typhoïde, diarrhées)* sécrétions génitales (maladie vénérienne, IST)* chancre (maladie vénérienne, IST)* air expulsé (méningococcie, charbon, tuberculose)* accouchement (fièvre puerpérale)

- animal* salive (pasteurellose)* délivrance* lait* carcasses (ganglions)

- autres * eau (choléra.........)* aliment (TIAC, Listeria........)* ectoparasites (maladies vectorielles)

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Transmission - Voies de contamination. directe

* homme à homme- gouttelettes : méningocoque, bacille tuberculeux- main (dysenterie bacillaire, S. aureus, ILS)- contact vénérien- mère à enfant (transmission verticale)

* animal à homme- morsure, griffade, léchage- contact direct (maladie professionelle)

* ectoparasites- morsure de tiques (borréliose de Lyme)- puces, poux.......

. indirecte* eau, aliments (Brucella, Salmonella, Listeria........) * air (Coxiella burnetii.......)* autres (étables.......)

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Fièvre QSyndrome pseudo-grippal

+ pneumonie atypiqueRéservoirs animaux

Bactérie intracellulaire obligatoire Coxiella burnetii

Variant résistant (spore ?)Petites épidémies

spore ?

Transmission aérienne

Résistance

Année Source Nb. cas Principaux signes cliniques

2002 ovine 99 Fièvre, céphalées, TRA*2000 fumier (chèvre) 10 Fièvre, céphalées, myalgies2001 fumier (ovin) 5 Fièvre, céphalées, TRA1996 ovine 29 Fièvre, céphalées, TRA90-95 ovine 289 Fièvre, céphalées, TRA

* TRA, augmentation des transaminases

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La transmission manuportée• Cause de transmission des ILS• Malades fragiles• Malades en réanimation• Transmission en ville• Transmission des BMR

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AntibiotiquesModes d’action

Mécanismes de résistance

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DéfinitionAgents antibactériens naturels ou obtenus par synthèse ou par

semi-synthèse présentant une activité :

• liée à un mécanisme d’action spécifique• exercée à de faibles concentrations• sur certaines espèces bactériennes (spectre d’activité large ou

limite)• relativement lente• bactériostatique ou bactéricide

une toxicité sélectivement dirigée contre les bactéries

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CLASSIFICATION :

• Par famille et la structure chimique de base– ß-lactamines, – aminosides, – quinolones

• Par le spectre– Gram +/-– Anti-pseudomonas

• Par mécanismes d’action– Paroi– Acides nucleiques– Synthèse protéique

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Antibiotiques et Bactéries• ß-lactamines• Aminosides• Fluoroquinolones• Tetracyclines • Trimethoprime & sulfamides • Chloramphenicol • Rifampicine• fosfomycine

• Macrolides• Glycopeptides

Gram +Gram -

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Cibles potentielles des antibiotiques

ADN

ARN Ribosomes Protéines

Membranecytoplasmique

Pompes efflux

Porines

Peptidoglycane

Membrane externe

PeptidoglycanePLP

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MECANISMES D'ACTION DES ATB - CIBLESMécanisme d'action Familles d'ATBInhibiteurs de la synthèse de β-lactamines (PBP)la paroi bactérienne (PG) Glycopeptides (D-Ala-D-Ala)

Fosfomycine (précurseurs)

Inhibiteurs de la synthèse Aminosidesdes protéines Tétracyclines

ChloramphénicolMacrolides

Inhibiteurs de la synthèse des ANou du fonctionnement de l’ADN• synthèse des précurseurs Sulfamides• réplication de l'ADN Quinolones• inhibition de l'ARN polymérase Rifampicine

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Résistance acquise de soucheUne bactérie est dite résistante par événement génétique acquis lorsqu’elle peut croître en présence de concentration d’antibiotique plus élevée que la concentration qui inhibe les souches normales de l’espèce

Population « normale »

Population R

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SUPPORT GENETIQUE DE LARESISTANCE ACQUISE

CHROMOSOMIQUEMutation

Spontanée, rare, stable,Spécifique de l’ATB

ou d’une famille

Transmission verticale

⇒ Dissémination de la R

= descendance= épidémies de souches

PLASMIDIQUE ou TRANSPOSABLE

+/- stable

Transmission

verticale horizontalemême espèce ou

espèces différentes

⇒ Dissémination de la R

= épidémies de souchesde plasmides, de gènes

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MECANISMES DE RESISTANCE ACQUISE AUX ANTIBIOTIQUES

→ Défaut de pénétration de l’ATB = IMPERMÉABILITÉ

→ Inactivation de l’ATB = SYSTÈME ENZYMATIQUE

→Modification de la cibleDéfaut de liaison entre ATB et cible = AFFINITÉ

→ Efflux actif = EXCRÉTION

→ Nouvelle voie de synthèse : by pass

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SARM AP-HP

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Enterocoque et R glycopeptidesERV

• Colonisation plutôt qu’infection• Épidémie souterraine dans les hôpitaux

2007 2008

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Prevalence of resistance to extended-spectrum cephalosporins among E. coli isolates from bacteraemias(European Antimicrobial Resistance Surveillance System)

2002 2007

R C3G chez E. coli

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Carbapénémases

• Classe A : KPC– New-York, Grece, Israel– K. pneumoniae (50%), E. cloacae, E.

coli– Cas d’importation : Paris

• Classe B (MBL) : VIM, (IMP), (NDM)– Italie, Grèce, Tunisie – K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa– Cas d’importation : Paris

• Classe D : OXA-48; OXA-23/-58/-40

Tic TzAmxPip

Ctx Amc CazFox

Imp

Atm TccCf

Mox

Fep

Ma

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Mise en évidence des bactéries

Pr Guillaume ArletFaculté de Médecine Pierre et Marie Curie, UPMC

Hôpital Tenon, AP-HP

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Rôle du laboratoire de Bactériologie médicale

• Caractérisation de la bactérie responsable du syndrome infectieux– Méningites– Pneumonies– Infections urinaires– Angines– Septicémies– Infections gynécologiques– Cholécystite

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Origine bactérienne du sepsis ?

• Infections virales : – angine, – syndrome grippal, – méningites

• Infections parasitaires :– Diarrhées sanglantes– Paludisme

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Infections bactériennes et syndrome inflammatoire

• Bactéries: – réaction macrophages et polynucléaires (pus)

• Virus – réaction macrophage et lymphocytes

• Parasites – réaction à P. oesinophiles

Pb des bactéries intracellulaires : réaction lymphocytaire

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Les grandes étapes de l’identification bactérienne

• Examen direct au microcope : 1 heure– Cytologie, – coloration de Gram, morphologie

• Culture : 24 heures• Identification : 24-48 heures• Etude de la sensibilité aux antibiotiques

: 24-48 heures

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Un bon prélèvement

• Méningites: LCR par ponction lombaire• Pneumonies : ECBC, Aspiration

bronchique• Infections urinaires : ECBU• Sepsis grave : hémocultures• Cholécystite : prélèvement opératoire• Angine : écouvillonage pharyngé

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Un bon prélèvement

• Stérilité : ECBU, LCR, Sang• Problèmes des flores normales humaines

– ORL– Digestive– Gynécologique– Cutanée

• Problème des bactéries fragiles et anaérobies

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Quelques prélèvements

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peptidoglycane

PorineMembrane externeAcides téchoiques LPS

espace périplasmique

Membrane cytoplasmique

Bactérie à Gram positif Bactérie à Gram négatif

Rappel sur la paroi bactérienne

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Morphologie quelques exemplesCoques Gram + en amas

Coques Gram + en chainettes

Bacilles gram –mobiles péritriches

Bacilles Gram -capsulés

Bacille Gram –mobile polaire

Diplocoques Gram + capsulés

Bacilles Gram + sporulés

Vibrions, Campylobacter

SpirillesTréponème

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ECBU à Escherichia coli

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Hémoculture à Campylobacter

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Méningite à méningocoque

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Endocardite à Streptocoque

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Culture• Différents milieux

– Standard– Enrichis (sang frais, sang cuit)– Sélectif

• Température– 37, 30, 44

• Atmosphère : – normale, – CO2, – anaérobie

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Les modalités de l’isolement

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Un isolement parfait

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Isolements sélectifs

Gélose de Chapman pour S. aureus

Gélose de Drigalski pour entérobactéries

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Milieux enrichis

Gélose au sang frais Gelose Chocolat

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Identification bactérienne

• Méthodes biochimiques– Mise en évidence de métabolites– Fermentation des sucres

• Méthodes antigéniques– Mise en évidence d’antigènes de surface

• Méthodes moléculaires– PCR

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Identification biochimique

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Cours IFSI 2010 S1 Pr G. Arlet

Identification antigénique

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Antibiogramme

0,252 8 32 32 8 20,25

0,252 8 32 32 8 20,25 0,252 8 32 32 8 20,25

0,252 8 32 32 8 20,25

J0 J+1

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Antibiogramme BMRAMX TIC TZP

MA CXM FOX

PIP

CTX

IPMATM

TCCAMC

CAZ

FEP

MOX

CF

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Apport de la biologie moléculaire à la bactériologie médicale

• Identification bactérienne

• Mise en évidence de gènes de virulence

• Mise en évidence de gènes de résistance

• Épidémiologie moléculaire

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Les grands problèmes actuels• Pays très pauvres

– Choléra, Tuberculose, Lèpre – Diarrhées, Pneumonies

• Pays riches– Tuberculose, E. coli, S. aureus, P. aeruginosa– Pneumonies, IST – Infections liées aux soins, Légionellose

Un problème majeur émergent dans le monde La résistance aux antibiotiques