Microbiologie des céréales et des farines · Spécialité: Microbiologie, Hygiène et...
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Microbiologie des céréales et des farines Formation IFIM 11 - 12 avril 2018 A. Tantaoui Elaraki
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Microbiologie des céréales et des
farines
Formation IFIM
11-12 avril 2018
A. Tantaoui Elaraki
Organisation de la formation
Document support pédagogique Power Point
Document support en Word
Projection Data show
Discussion de cas concrets
Evaluation de la formation par les participants
Durée: 2 jours
Programmation: 11 & 12 avril 2018
Présentation de l’animateur
Nom: Abdelrhafour TANTAOUI ELARAKI
Spécialité: Microbiologie, Hygiène et Biotechnologie
Alimentaires
Fonctions:
- Professeur de l’Enseignement Supérieur (Institut
Agronomique et Vétérinaire Hassan II, Rabat; Sup’Agro,
Casablanca)
- Ex. Directeur de Sup’Agro, Casablanca
- Ex. Président de la MSM (Société Marocaine de
Mycotoxicologie)
Nom et prénom
Formation initiale: niveau et spécialité
Formation (initiale et continue) en microbiologie,
biochimie, biologie cellulaire
Fonctions dans l’entreprise (ou à l’IFIM)
Ancienneté: nombre d’années dans l’entreprise (ou à
l’IFIM) et dans le poste actuel
Présentation des participants
Objectifs
Objectif général:
Connaître les microorganismes de contamination des céréales et dérivés et les analyses microbiologiques qui s’y appliquent
Objectifs spécifiques:
- Connaître le monde microbien et les différentes catégories de microorganismes des aliments
- Connaître les différentes catégories de microorganismes de contamination des céréales et dérivés
- Connaître les principes généraux des méthodes d’analyse microbiologique des céréales et dérivés
Contenu général
1- Le monde microbien
2- Les germes de contamination des céréales et des farines
3- Moisissures toxinogènes et problématique des mycotoxines
4- Principes des méthodes d’analyse microbiologique des céréales et dérivés
Introduction générale
8
Flore microbienne
Spécifique:
- normale,
- « utile »
- à favoriser (parfois
ensemencée)
Flore microbienne
de contamination:
- indésirable,
- « nuisible »
- à combattre (à tuer ou
à inhiber)
Dans les denrées alimentaires:
9La microbiologie alimentaire (sens large):
science consacrée à l’étude des microbes en
relation avec les aliments
Dans la pratique, on distingue:
- Microbiologie industrielle alimentaire: études
des espèces « utiles »
- Microbiologie alimentaire (sens strict): étude
des espèces indésirables (et de leurs
interactions avec les produits alimentaires)
Interactions microorganisme / aliment et
influence des paramètres de l’environnement10
microorganisme aliment
Paramètres
de l’environ-
nement
1- Le monde microbien
12 1- Le monde microbien
1.1- Définitions
1.2- Différents types de microbes
1.3- Les microbes sont partout
1.4- Principales propriétés des microorganismes
13
Les Microbes: êtres vivants microscopiques,
invisibles à l’œil nu:
- Virus: taille < 0,3 µm*
- Bactéries: 1 à 10 µm environ
- Levures: 10 à 25 µm environ
- Moisissures: mycélium à taille indéterminée
- Protozoaires: jusqu’à 300 µm
* 1μm = 10-3 mm
1.1- Définitions
BacilleCoque
Virus
de la
variole
Virus de la
Poliomyélite Bactériophage
Virus de la
mosaïque du
tabac
Petit virus
sphérique
0 0,5 1µm
Taille comparée des bactéries et des virus
Taille de certaines catégories de microbes
comparée à celles d’autres particules
Eventail des tailles des virus, des bactéries et des
protozoaires
17
o Manifestations de la vie:
- Nutrition
- Respiration
- Reproduction
o Vie: Interactions entre être vivant et son milieu
Notion de vie
18
Souris en plastique Souris vivante
blé blé
19
Microbes
Virus Bactéries LevuresAlgues
unicellulairesProtozoaires
Microorganismes
Fongiques
Microbes d’intérêt alimentaire
Microorganismes
d’intérêt alimentaire
Microorganismes
Moisissures
1.2- Différentes types de microbes
20 Les Bactéries
- Morphologie
- Classification Gram + / Gram –
- Structure cellulaire
- Sporulation
- Mode de division
21
Morphologie
bactérienne
Différentes formes
de cellules bactériennes
22 Formes dominantes
ronde
(coccus)
allongée
(bâtonnet)
23Structure cellulaire
- Cellules procaryotes (simples): paroi, membrane
cytoplasmique, cytoplasme, noyau avec un
chromosome unique circulaire et sans paroi
nucléaire
- Présence de flagelles ou de capsule chez
certaines espèces
24
25
Schéma de la coloration de Gram
Classification en Gram positives et Gram négatives (coloration de Gram)
26 Sporulation
- Formation de spores résistantes (espèces sporulées)
Spores
27
Forme végétative
Spore libre
SPORULATION
MULTIPLICATION
Sporulation et germination de la spore bactérienne
Conditions favorables Conditions défavorables
28 Reproduction
Reproduction par division de la
cellule mère en 2 cellules filles
identiques
(scission binaire ou scissiparité)
29 Les Levures
Morphologie
Structure cellulaire
Reproduction
30 Morphologie
- Etat unicellulaire dominant, formes variées, souvent
ovoïde ou globuleuse
31Structure cellulaire
Cellule eucaryote avec
paroi, membrane
cytoplasmique,
cytoplasme, noyau vrai
(membrane nucléaire
et plusieurs
chromosomes),
vacuole, réticulum
endoplasmique, etc.
32Reproduction
- Reproduction surtout par
bourgeonnementbourgeons
Cicatrices de bourgeonnement
33
Levures mieux adaptées que les bactéries aux
milieux acideset/ou
riches en sucres
34
Moisissures
Morphologie et structure
Reproduction
35Morphologie et structure
- Micro-organismes filamenteux
36
Filaments non cloisonnés filaments cloisonnés Moisissure sur l’épiderme d’une plante
Structure filamenteuse des moisissures
Structure détaillée d’un filament du mycélium
38 Reproduction
Reproduction par spores (pas spécialement résistantes)
39
Aspects des culturesen milieu solide
Colonies de
Bactéries Levures
Thalles de
moisissures
40
Moisissures mieux adaptées
que les bactéries
aux milieux acides
et/ou
relativement secs
41 1.3- Les microbes sont partout
Les microbes dans la nature
Sources de contamination des produits
L’Homme: source de contamination majeure
42
Le sol
L’eau
L’air
Les plantes, les animaux domestiques
Les insectes et autres nuisibles
L’Homme
L’environnement en général
Les microbes dans la nature
43 Le sol: plusieurs milliards par gramme (sol cultivé)
L’eau: océans, mers, lacs, cours d’eau, marécages,
eaux usées, etc.
L’air: poussières et autres particules
Les plantes, les animaux domestiques et les
produits qui en dérivent
« Les nuisibles » (vermine): insectes, rongeurs,
oiseaux, etc. ;
L’Homme
L’environnement en général: parterre, murs,
plafonds, vêtements, ustensiles, matériel, etc.
44
Matières premières
Milieu
Main-d’œuvre
Matériel
Manipulations ou Modes opératoires
Sources de contamination des produits alimentaires
45 Matières premières
La contamination varie selon:
- la nature des intrants (matières premières, additifs, emballages, etc.)
- les traitements appliqués (histoire de chaque intrant depuis son origine)
- les conditions de stockage et de transport
46Milieu
- Bâtiment
- Sol
- Air (poussières)
- Eau
- etc.
47Matériel
La flore apportée par le matériel varie notamment avec:
- La nature des produits traités à l’aide de ce matériel
- L’usage du matériel en question
- Le nettoyage et la désinfection adoptés
48 Manipulations
- Tout traitement appliqué depuis l’obtention des
matières premières jusqu’à l’utilisation des produits
finis
- Chaque traitement peut avoir un effet sur la qualité
hygiénique d’un produit
49
Matériel Manipulations
Matières
premières MilieuMain d’œuvre
Diagramme de cause à effet d’IshikawaDiagramme en arête
de poisson
50 L’homme: source de contamination
L’individu sain: flore commensale
L’individu malade: flore pathogène et/ou
toxinogène
Le porteur sain: flore pathogène (dont il ne souffre
pas)
51 L’individu sain
- Peau (surtout la main)
- Cheveux et cuir chevelu
- Sous les ongles
- Les cavités ouvertes: bouche, narines, oreilles, etc.
- L’intestin: plusieurs milliards de cellules microbiennes par gramme.
52Cuir chevelu:102 à 103 bactéries/cm2
Aisselles:106 à 107 bactéries/cm2
Mains:106 bactéries/cm2
Front: 104 à105 Bactéries/cm2
Sécrétions nasales:107 bactéries/g
Salive:108 bactéries/g
Matières fécales:109 bactéries/g
53
Nombre de particules de plus de 0,5 µm émises par minute selon l’activité de l’individu
54
Une toux faible:4 500
Nombre de Gouttelettes
de Pflügge émises
Un éternuement:20 000 à 40 000
55 L’individu malade
Flore pathogène et/ou toxinogène:
- Sur la peau (plaies ouvertes, furoncles) et dans le cuir chevelu
- Dans la gorge et les voies respiratoires: tuberculose, grippe, angine, pharyngite, bronchite, etc.
- Dans l’intestin: maladies parfois très graves (choléra, typhoïde), gastro-entérites, etc.
- Dans les yeux: conjonctivites
56 Le porteur sain
- Individu hébergeant un microbe pathogène sans
montrer de signes de maladie
- Constitue une source de contamination pour son
entourage
- Contamine les produits alimentaires qu’il manipule
57 Conclusion
- Toute personne libère dans l’environnement des
microbes variés
- Toute personne peut contaminer les personnes de son
entourage avec des microbes dangereux
- Toute personne peut contaminer les produits manipulés
avec des microbes indésirables
1.4- Principales propriétés des microorganismes
Croissance et métabolisme très rapides
Activités enzymatiques intenses
Grandes capacités d’adaptation
59Croissance et métabolisme très rapides
VR bactéries > VR levures > VR moisissures
60
o Exemples:
• Escherichia coli (bactérie) se divise toutes les 20 min dans les conditions optimales (temps de génération Tg); 3 divisions cellulaires/heure, soit multiplication de l’effectif de population par 8 chaque heure
• Saccharomyces cerevisiae (levure) a besoin de 100 min pour se diviser; multiplication de l’effectif de population par 1,6 en une heure
61
0 h
1 h
2 h
3 h
4 h
5 h
6 h
7 h
8 h
9 h
10 h
1
8
64
512
4 096
32 768
262 144
2 097 152
16 631 216
133 049 728
1 064 397 824
Evolution de
l’effectif
d’Escherichia coli
en fonction du
temps dans des
conditions
optimales
62
Consommation très rapide des nutriments
Libération très rapide de substances de déchets pouvant être:
o responsables d’odeurs, de couleurs, de
goûts anormaux, etc. (propriétés
sensorielles ou organoleptiques)
o toxiques (troubles sanitaires chez le
consommateur)
63
L’Homme
Consomme
l’équivalent de
son poids en
10 jours
La sauterelle
Consomme
l’équivalent de
son poids en
24h
La bactérie
Consomme
l’équivalent de
10000 fois
son poids
de sucre en
1 heure
64
Activités enzymatiques puissantes et diversifiées:
glucidases, protéases, lipases, etc.
Grandes capacités d’adaptation aux différents
milieux (composition, pH, etc.) et aux conditions
de l’environnement (température, oxygénation,
etc.)
2- Les germes de contamination
des
céréales et dérivés
66 2- Les germes de contamination des
céréales et dérivés
2.1- Nature de la microflore de
contamination
2.2- Conditions de contamination et de
développement
2.3- Conséquences
67 2.1- Nature de la microflore de contamination
- Les bactéries
- Les levures
- Les moisissures
68 Les bactéries
Origine principale: sol
Principaux ordres:
o Eubacteriales (ordre le plus représenté): familles Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae, Bacillaceae, Micrococcaceae, etc.
o Pseudomonadales: genres Pseudomonas, Xanthomonas, Aeromonas, etc.
69
Familles Genres et espèces % des grains
contaminés
% du peuplement
bactérien
Achromobacteriaceae
Bacillaceae
Enterobacteriaceae
Lactobacillaceae
Micrococcaceae
Pseudomonadaceae
Flavobacterium sp.
Bacillus cereus
B. pumilus
B. subtilis
Aerobacter sp.
Erwinia sp.
Escherichia coli
Paracolobacterium sp.
Leuconostoc sp.
Lactobacillus sp.
Streptococcus sp.
Micrococcus candidus
M. caseolyticus
Pseudomonas sp.
90
18
46
36
54
55
9
90
9
Présence
Présence
48
18
73
15
1
4
3
15
4
1
28
1
3
1
6
Fréquence d’apparition et importance relative (%) des principales
bactéries présentes sur blé et seigle (Kosmina, 1977)
70
Autres groupes bactériens (moins fréquents):
o Actinomycètes: Streptomyces albus et S. griseus
o Bactéries pathogènes et/ou toxinogènes
(Staphylococcus, Salmonella, Clostridium, etc.):
• Contamination possible des farines par
l’intermédiaire des rongeurs ou des insectes
• Risques d’accidents sanitaires graves si
incorporation dans produits hydratés crus ou semi-
cuits (aliments pour enfants, pâtes réfrigérées, etc.)
71 Les levures
Levures: champignons microscopiques le
plus souvent unicellulaires et non pigmentés
Principaux genres:
o Saccharomyces
o Candida
o Hansenula
o Pichia
Saccharomyces
Hansenula
Pichia
Principaux genres de
levuresdes céréales
73
Le nombre des levures dépasse rarement quelques centaines par gramme de grain
Nombres très élevés si:
o Humidité élevée des grains à la récolte
o Conditions climatiques humides à la récolte
o Pré-stockage humide avant séchage
74
Les moisissures
Généralités
Nature de la mycoflore de contamination
Conditions de contamination et de
développement
Conséquences
75Généralités
o Champignons microscopiques (micromycètes) filamenteux
o Toujours présents sur les grains de céréales, puis dans farines, sons et autres produits
o Plus de 120 espèces recensées sur blés en conservation
o Un même échantillon de blé ne porte que 5 à 6 espèces dominantes
76
o Reproduction par émission de spores très variées
o Deux grands types se spores de la reproduction
asexuée
Conidies ou conidiospores
Se forment à l’air libre sur
un conidiophore (parfois des
têtes conidiennes
caractéristiques)
Parfois micro & macroconidies
Sporangiospores
Se forment dans un sac
(sprocyste) porté par un
sporangiophore
Sporangiospores
Sporocyste
entierSporocyste
ouvert
78
Sporocyste entier
avec spores à
l’intérieur
Sporocyste ouvert
à maturité pour
libérer les spores
79
Aspergillus
Têtes conidiennes
d’Aspergillus
a: monsériée
b: bisériée
Aspergillus sp.
80
Stipe = conidiophore
Penicillium
Têtes conidiennes:
a & b: monoverticillé; c: polyverticillé
symétrique; d: polyverticillé asymétrique
Nature de la mycoflore de contamination
o Mycoflore du champ
o Mycoflore de stockage
o Mycoflore d’altération avancée
82
Mycoflore du champ
- Espèces qui contaminent les grains avant récolte
- Certaines sont incapables de se développer plus tard (conservation)
- Comprend des espèces indifférentes (Alternaria, Cladosporium, etc.) et d’autres parasites (Fusarium, Septoria)
83 Principales moisissures du champ
Claviceps purpurea
Sclerotinia sclerotiorum
Fusarium graminearum**
Aspergillus flavus*
Rhizoctonia leguminicola
Helianthosporium biseptatum
Alternaria
Cladosporium
Verticillium
Septoria
* également au stockage
** également stockage et
altération ,avancée
L’ergot du seigleClaviceps purpurea
Aspergillus flavus
Penicillium
Attaques fongiques au champ du maïs
86
Aspergillus flavus sur maïs
Fusarioses des céréales
Fusarioses des céréales
Fusarium
sur maïs
F. graminearumsur blé
Grains fusariés
90
Mycoflore de stockage
- Flore peu abondante à la récolte, devient
dominante au stockage
- Très abondante dans les recoins des entrepôts
et silos
- Flore très sporulante (contaminations
secondaires lors de manutention et
transformation des grains)
91
o Espèces capables de pousser avec des taux d’humidité de 15 à 16%
o Comprend des espèces toxinogènes
o Principaux genres:
Penicillium
Aspergillus
Fusarium
92
• Genre Aspergillus
Aspergillus flavus*
A. parasiticus
A. ochraceus
A. clavatus
A. fumigatus
A. rubrum
A. chevalieri
A. niger
A. glaucus* Également au champ
93
Penicillium islandicum
P. citrinum
P. rubrum
P. citreoviride
P. cyclopium
P. viridicatum
Penicillium urticae
P. verruculosum
P. puberulum
P. expansum
P. rugulosum
P. palitans
P. roquefortii
• Genre Penicillium
94
• Genre Fusarium et autres
Fusarium graminearum *
F. tricinctum
F. nivale
F. moniliforme
Chaetomium globosum
* Également au champ et
d’altération avancée
Aspergillus glaucus
Aspergillus nigerAspergillus niger
Aspergillus
Aspergillus et Penicillium
98
Mycoflore d’altération avancée
- Se développe en cas de conservation dans des
conditions extrêmement médiocres
- Peut contenir des espèces sans signification
particulière quand on les trouve en petit
nombre
99
Pithomyces chartarum
Stachybotrys atra
Periconia minutissima
Fusarium sporotrichioides
Cladosporium sp.
Alternaria longipes
Fusarium graminearum*
Chaetomium globosum
Dendrochium toxicum
Myrothecium verrucaria
Trichothecium roseum
Trichoderma viride
Absidia
Mucor
Rhizopus
o Principaux genres et espèces
* Également au champ
et au stockage
moisissure en silo de stockage
Altération avancée des Céréales par moisissure
05/04/2018
101
Pithomyces chartarum
Stachybotrys atra
Periconia minutissima
F. sporotrichioides
Cladosporium sp.
Alternaria longipes
Ch. globosum
Dendrochium toxicum
Myrothecium verrucaria
Trichothecium roseum
Trichoderma viride
Absidia
Mucor
Rhizopus
F. graminearum
Aspergillus flavus
Flore du
champ
Flore de
stockage
Flore
d’altération
avancée
A.: Aspergillus
Ch.: Chaetomium
F.: Fusarium
P.: Penicillium
Différentes
flores
fongiques des
céréales
102
2.2- Conditions de contamination et de développement
- Humidité
- Température
- Composition de l’atmosphère
- Composition et structure du produit
103Humidité
Exigences des micro-organismes
Teneur en eau et activité de l’eau du grain
Conséquences pour les micro-organismes des
céréales et dérivés
104Exigences des micro-organismes
o Chaque espèce exige une activité de l’eau (aw)
minimale pour sa croissance
o Chaque espèce a aussi une aw optimale de croissance
o Les exigences de certains métabolismes (ex.
toxinogenèse) diffèrent de celles de la croissance.
aw =
Pression de vapeur du milieu
Pression de vapeur de l’eau
105
o De façon générale (sauf exceptions):
• bactéries plus hygrophiles que levures
• levures plus hygrophiles que moisissures
o Espèces osmophiles ou osmotolérantes: adaptées aux faibles aw dues aux fortes concentrations en sucres (surtout levures)
o Espèces xérophiles ou xérotolérantes: adaptées aux milieux relativement secs (surtout moisissures)
o Espèces halophiles ou halotolérantes: adaptées aux faibles aw dues aux fortes concentrations en sel (surtout bactéries)
106
aw min. (en moyenne)
Bactéries : 0,90-0,91
Levures : 0,88
Moisissures : 0,80
Bac. halophiles : 0,75
Mois. xérophiles : 0,65
Lev. osmophiles : 0,60
aw min. (cert. espèces)
Candida utilis : 0,94
Mucor spinosus :0,93
Candida zeylanoides: 0,90
Aspergillus glaucus : 0,70
A. echinulatus : 0,64
Saccharomyces rouxii : 0,62
Minimum absolu: 0,6
107 Teneur en eau et activité de l’eau des grains
Isotherme d’adsorption:
courbe des teneurs en
eau en fonction de
l’activité de l’eau à une
température donnée,
quand le produit est en
phase de
réhumidification (HR de
l’air >100 aw)
Isotherme de désorption:
courbe des teneurs en
eau en fonction de
l’activité de l’eau à une
température donnée,
quand le produit est en
phase de séchage (HR de
l’air <100aw)
Notions d’isothermes de sorption
HR: Humidité Relative
108
20
18
16
14
12
10
0,7 0,8 0,9
Sorption
Désorption 1
Activité de l’eau
Teneur en
eau (%)
Bactéries
Levures osmophiles
Levures
Moisissures xérotolérantes
Moisssures
hygrophiles
Isothermes
de sorption
du blé vers
20°C et
zones d’activité
des différentes
catégories de
micro-
organismes
109
Les moisissures de stockage peuvent se contenter d’aw
relativement faibles
Les levures viennent ensuite
Les bactéries sont les plus exigeantes en eau libre
110
Conséquences:
o Cas des moisissures xérophiles ou xérotolérantes
o Cas des levures
o Cas des bactéries
111
aw
Cas des moisissures xérophiles ou xérotolérantes
112
50
100
43210 Temps (mois)
Croissance pondérale (% du maximum)
aw 0,70
Effet de l’activité de
l’eau des grains sur la
croissance d’Aspergillus
candidus*
* Moisissure xérotolérante très
commune sur céréales
113
Conséquences: plus l’aw des grains est faible:
o Plus la vitesse de développement est faible (pente de la phase exponentielle)
o Plus le niveau maximum atteint en phase stationnaire est réduit
o Plus la phase de latence est longue: pas d’altération microbienne apparente
114
50
100
43210 Temps (mois)
Croissance pondérale (% du maximum)
aw 0,70
Limite de la phase
de latence
Vitesse de croissance
Niveau maximum
(phase stationnaire)
Effets de l’aw des grains sur les paramètres de croissance
des micro-organismes (exemple d’Aspergillus candidus)
115
20
18
16
14
12
10
0,7 0,8 0,9
Sorption
Désorption 1
Activité de l’eau
Teneur en
eau (%)
Levures osmophiles
Moisissures xérotolérantes
Une humidité de 16%
(aw de 0,78 à 20-25°C)
ne permet pas de
stopper le développement
des moisissures
xérotolérantes
(Aspergillus glaucus).
Une aw de 0,70 ralentit
nettement la croissance,
d’où une conservation
de plusieurs mois
116
Farines de blé 13-15
Riz 13-15
Amidon 18
Viande dégraissée séchée 15
Légumes déshydratés 14-20
Fruits déshydratés 18-25
Lait en poudre entier 8
Œuf entier déshydraté 10-11
Teneur critique: « alarm water content »
à 20°C, HR de l’air: 70% (en %)
117
Remarque: le développement, même lent, des moisissures,
s’accompagne de production d’eau métabolique; l’aw
tendra donc à s’élever (la température aussi)
Risque de développement
d’espèces plus exigeantes en eau
Altérations visibles et
Irréversibles des grains
118 Cas des levures
Il existe des levures capables de se développer aux
faibles aw (levures osmophiles ou osmotolérantes)
Ces levures préfèrent les milieux très riches en sucres
Posent surtout problèmes en pâtisserie (très rarement sur
grains ou farines)
119 Cas des bactéries
Généralement incapables de se développer aux aw
habituelles des grains et farines
Exigent généralement des aw > 0,90 (produits fortement
réhumidifiés)
120 Température
Pour la croissance de chaque espèce:
• Température minimale
• Température optimale
• Température maximale
température
Vitesse de
croissance
T maxT min T opt
121
La température optimale de la plupart des moisissures
de stockage des céréales avoisine les 30°C
Un échauffement peut survenir suite à un
développement fongique (hot spot)
Les fluctuations de température accélèrent
l’altération fongique des grains (ex.: fluctuations de 25
à 40°C par rapport à 30°C constante)
122
Moisissures en général aérobies
Certaines (microaérophiles) sont peu
exigeantes: se contentent de 5% d’Oxygène
En dessous de
0,5%, croissance
très difficile
Moisissures microaérophiles:
Penicillium roqueforti
Fusarium spp
Quelques Mucorales
Composition de l’atmosphère
123
Conservation de grains semi-humides (20% environ) possible sous atmosphère neutre (anaérobiose)
Inconvénient: perte du pouvoir germinatif
Réservée aux céréales destinées à des usages particuliers: alimentation animale, amidonnerie, etc.
124
La zone du germe est la plus favorable aux
micro-organismes (richesse biochimique);
généralement point de départ du
développement fongique
Même pour des aw faibles (0,75-0,85), les
moisissures xérotolérantes peuvent utiliser les
lipides du germe comme sources de Carbone
grâce à leurs lipases
Composition et structure du produit
125
Les enveloppes externes du caryopse du blé :
substrat moins favorable au développement
des moisissures que les couches profondes
Pour une humidité de 17,5-18%:
- Grain entier (enveloppes intactes): visiblement moisi
après 15 à 20 jours
- Grain « pelé » (enveloppes altérées mécaniquement):
visiblement moisi en 5 à 6 jours
126
Grains endommagés à la récolte plus susceptibles à l’attaque microbienne que grains intègres
Brisures souvent beaucoup plus contaminées que grains entiers
Farines plus faciles à attaquer que les grains correspondants (mêmes raisons)
127
2.3- Conséquences
- Conséquences organoleptiques: odeurs de
moisi; acidité
- Conséquences technologiques: pouvoir
germinatif des grains; valeur boulangère de
la farine
- Conséquences hygiéniques: mycotoxines
128 Conséquences organoleptiques
o Odeurs de moisi ou de renfermé
• Dues à des substances volatiles
• Persistent dans les produits finis, même après
cuisson
• L’analyse du pain (Chromatographie en Phase
Gazeuse) permet de déterminer la proportion
de farine altérée utilisée dans sa fabrication
129
o Acidité
• Les moisissures des céréales produisent des
lipases et des lipoxygénases
• Les lipases libèrent des acides gras par hydrolyse
des lipides (lipolyse)
• Acides gras libres responsables de goûts
indésirables
130
• On observe souvent une lente acidification des
grains et des farines au stockage sans
développement de moisissures
• Cette acidification est due aux lipases formées
par les moisissures du champ ou du pré-
stockage
131
• Les lipoxygénases oxydent les acides gras en
peroxydes, qui réagissent avec:
Les groupements Thiol (R-S-H) des acides, ce qui
altère la qualité du gluten
Les carotènes, ce qui provoque le
blanchissement de la farine
132
ISO 7305: 1998
70 mg pour 100 g de
Farine (matière sèche)
exprimée en acide sulfurique
AOAC 939.05
50 mg d’Hydroxyde de
Potassium pour la
neutralisation des acides
gras libres dans 100 g de
farine (en matière sèche)
Normes pour
l’acidité grasse
des farines
133 Conséquences Technologiques
Perte du pouvoir germinatif des grains
Valeur boulangère très peu touchée en
général (pas de déformation significative de
l’alvéogramme Chopin)
Dans les cas extrêmes, les peroxydes
peuvent altérer la qualité du gluten
134 Conséquences hygiéniques
Certaines moisissures (toxinogènes) produisent
dans les grains ou la farine des substances très
dangereuses pour la santé du consommateur:
les mycotoxines
Voir Troisième Chapitre
3- Moisissures toxinogènes et
problématique des mycotoxines
136
3.1- Historique, définitions
3.2- Principales mycotoxines et mycotoxicoses
3.3- Conditions de toxinogenèse
3.4- Devenir des mycotoxines au cours des
traitements technologiques
3.5- Présence de mycotoxines dans les
produits céréaliers marocains
3.6- Prévention, protection du consommateur
3- Moisissures toxinogènes et problématique des mycotoxines
1373.1- Historique,
définitions
Historique
o Antiquité:
ergotisme
(feu de Saint
Antoine);
gangrène
des
extrémités
Ergotisme:
feu de la
Saint Antoine
ou Mal des
Ardents
05/04/2018
139 Agent causal
- Fin XVIIIème siècle: association avec l’ergot du seigle
- XVIIème siècle: responsabilité reconnue du pain fait avec de la farine de seigle.
- Ce seigle était atteint par l'ergot du seigle dû à un champignon:
Claviceps purpurea
05/04/2018
140
Claviceps purpurea sur seigle
Claviceps purpurea sur blé
05/04/2018
141
- Attaque de la moelle osseuse
- Nombreux décès en Europe de l’Est (ex- URSS, années 1930
et 1940), Europe centrale, Etats-Unis, Finlande et Chine.
- Mycotoxines responsables: trichothécènes, produits par
des Fusarium
o 1930-40: Stachybotryotoxicose chez le cheval (ex.
URSS)
o 1945: intoxication de porcs (Maroc)
o ATA (Aleucie Toxique Alimentaire)
05/04/2018
142 Découverte des aflatoxines
- UK (1960): 100000 dindes et canards tués
(période de Noël);
- Turkey-X disease (maladie X du dindon);
- Farine d’arachide (Brésil):
. spores d’ Aspergillus flavus
. substance toxique associée
Aflatoxine
05/04/2018
143 Nouvelle orientation
Aspergillus flavus, considérée comme une
moisissure banale, s’est révélée
extrêmement dangereuse
Depuis, on a découvert des centaines
d’autres mycotoxines
Toutes les moisissures doivent être
suspectées
144 Définitions
Mycotoxine: métabolite fongique non
antigénique (faible poids moléculaire)
capable de provoquer des syndromes
spécifiques chez l’Homme et/ou les animaux
Mycotoxicose: syndrome spécifique
provoqué par une mycotoxine; non
infectieuse et non contagieuse
(contrairement à mycose)
145
Une espèce toxinogène peut produire une ou
plusieurs mycotoxines
Une même mycotoxine peut être produite par
une ou plusieurs espèces de moisissures
146 3.2- Principales mycotoxines et
mycotoxicoses
Mycotoxines « classiques »
Mycotoxines « émergentes »
Mycotoxicoses
o Intoxication chronique et intoxication aiguë
o Diversité des syndromes
147
Mycotoxines Moisissures productrices
Aflatoxines B1 & B2
Aflatoxines B1, B2, G1 & G2
Toxine T-2
Déoxynivalénol (ou nivalénol)
Zéaralénone
Fumonisine B1
Ochratoxine A
Patuline
Ergotamine
Aspergillus flavus
A. parasiticus
Fusarium sporotrichioides
F. graminearum
F. graminearum
F. moniliforme (F. verticillioides)
A. ochraceus, Penicillium verrucosum, etc.
Plusieurs espèces
Claviceps purpurea
Principales mycotoxines « classiques »
05/04/2018
148
Très variable
Parfois plusieurs variantes chimiques formant
un groupe de mycotoxines. Exemples:
- les aflatoxines;
- les fumonisines;
- les trichothécènes, etc.)
148
Nature chimique des mycotoxines
05/04/2018
149Principales Aflatoxines
Structure des Aflatoxines B1, B2, G1 et G2
05/04/2018
150
150
Ochratoxines
05/04/2018
151
Citrinine
05/04/2018
152 Patuline
05/04/2018
153Zéaralénone
154
T2-Toxine
05/04/2018
155 Trichothécènes
05/04/2018
156 Fumonisines
157
Mycotoxines Moisissures Effets biologiques
Enniatines
Beauvéricine
Fusaroproliférine
Espèces de Fusarium
Espèces de Fusarium, Beauveriabassiana
Espèces de Fusarium
Phytotoxicité
Fragmentation de l’ADN
Activité antibactérienne
Toxique pour Artemiasalina; cytotoxicité sur lymphocytes B
Tératogène
Mycotoxines émergentes
- Produites par plusieurs espèces de
Fusarium (F. tricinctum, F. avenaceum)
- 35 molécules d’ENs ont été isolées dont :
A, A1, B, B1
- Activité biologique: phytotoxique.
Enniatines
Enniatine A
- Produite par certaines espèces de
Fusarium (F. proliferatum, F. poae,
etc.) et Beauveria bassiana.
- Induit une fragmentation de l’ADN.
- A une activité antibactérienne
Beauvéricine
Beauvericine
160
- Produite par des espèce de Fusarium
(F. subglutinans)
- Activité biologique contre Artemia
salina
- Cytotoxique aux lignes cellulaires
des Lymphocytes B
- Tératogène
Fusaproliférine
Fusaroproliférine
161
o Chroniques ou aiguës
Intoxication Chronique Aiguë
Dose Faible Forte
Durée Longue (effet cumulatif)
Courte
Signes cliniques (ex:
aflatoxicose)
Manque d’appétit
Ralentissement de croissance
Perte de poids
Fatigue générale
Cancer
Mort
brutale
Mycotoxicoses
162
Mycotoxines
Encéphalomalacie
Fumonisine
Fusarium moniliforme
Cancer
Aflatoxines
Aspergillus flavus
Hémorragie poumon et cerveau
Patuline
Plusieurs espèces
Hémorragie du foie
Rubratoxine
Penicillium rubrum
Troubles intestinaux
Austidiol
Aspergillus ustus
Activité trémorgène
Penitrème
Penicillium crustosum
Nécrose hépatique
Stérigmatocystine
Aspergillus versicolor
Syndrome de la bave
Slaframine
Rhizoctonia leguminicola
Néphrotoxicité
Ochratoxine
P. verrucosum; A. ochraceus
Œstrogène
Zéaralénone
F. graminearum
Aperçu sur la diversité des syndromes mycotoxiques
163
3.3- Conditions de toxinogenèse
Conditions liées à la moisissure
Conditions liées au substrat
Conditions liées à l’environnement
Autres paramètres pour les céréales
164 Conditions liées à la moisissure
Au niveau des genres
Les plus importants
Assez
importants
À ne pas
oublier
Aspergillus
Penicillium
Fusarium
Stachybotrys
Alternaria
Trichothecium
Claviceps
165
Au niveau des espèces:
o Certaines espèces sont réputées toxinogènes,
d’autres non
o Pour céréales et légumineuses, surtout les
espèces de stockage
o Parfois espèces de la flore du champ (ex.:
Aspergillus flavus, Fusarium graminearum)
166
Au niveau des souches:
o Toutes les souches d’une espèce peuvent
être toxinogènes (A. parasiticus; aflatoxines)
o Dans une espèce, souches toxinogènes et
d’autres non (limites des techniques
d’analyse) (A. flavus; aflatoxines)
o Pouvoir toxinogène variable parmi les
souches d’une même espèce
167
Substrat Souche NRRL 3000
Souche NRRL 2999
Souche NRRL 3145
Arachide
Soja
Maïs
Blé
Riz
Sorgho
107
19
53
79
107
72
104
2,8
47
19
185
88
8,5
0,06
5,5
7,1
10,6
5,7
Variabilité du pouvoir toxinogène entre les souches d’une
même espèce fongique: cas d’Aspergillus parasiticus
(aflatoxines totales en μg/g)
168
Influence de l’espèce de céréale
Influence de l’activité de l’eau
Conditions liées au substrat
169
Souche NRRL 3000
Souche NRRL 2999
Souche NRRL 3145
Arachide
Soja
107
19
104
2,8
8,5
0,06
Riz
Sorgho
Maïs
Blé
107
72
53
79
185
88
47
19
10,6
5,7
5,5
7,1
Effet de l’espèce de céréale sur la production de mycotoxines
dans les grains, en comparaison avec 2 légumineuses:
cas de 3 souches d’Aspergillus parasiticus (aflatoxines totales en μg/g)
Influence de l’espèce de céréale
170
Moisissure Mycotoxine Aw min de croissance
Aw min de toxinogenèse
A. flavus
A. parasiticus
A. ochraceus
A. ochraceus
P. expansum
Aflatoxines
Aflatoxines
Ochratoxines
Ac.pénicillique
Patuline
0,70-0,75
0,70
0,85-0,88
0,85-0,88
0,91
0,83-0,87
0,80
0,88
0,97-0,99
0,99
Influence de l’activité de l’eau
Toxinogenèse généralement plus exigeante que
croissance
Valeurs optimales de l’activité de l’eau (aw) pour la croissance de
certaines moisissures et la production de leurs mycotoxines
171 Conditions liées à l’environnement
Température
Oxygénation
Humidité Relative de l’air
172 Température
Moisissure Toxines Optimum Minmum
A. flavus
A.parasiticus
A. ochraceus
P. expansum
A. clavatus
F. roseum
Fusarium sp.
Aflatoxines
Aflatoxines
Ochratoxine
Patuline
Patuline
Zéaralénone
T2-Toxine
25-28
25-30
25
20-22
20-25
10
0-5
8-10
10-13
12
0-4
12
<10
<0
Températures optimales et minimales de
toxinogenèse de certaines moisissures
173
Oxygénation
o Les moisissures ont besoin d’oxygène
o L’aération des locaux de stockage:
Prévient l’accumulation d’humidité, mais ….
Favorise la dispersion des spores
174
HRE > HR air
H2OH2O
HRE < HR air
L’aw du produit diminue L’aw du produit augmente
Humidité relative de l’air
Elle permet réabsorption d’eau dans le produit si
elle est élevée
175
Autres paramètres pour les céréales
FACTEURS PHYSIQUES Au champ
A la récolte
Au stockage
Humidité
rapidité de séchage
réhumidification
humidité relative
Température
Endommagement mécanique
Broyage des grains
« Hot spots »
Temps
+
-
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+: a un effet -: n’a pas d’effet
176
FACTEURS CHIMIQUES Au champ
A la récolte
Au stockage
CO2
O2
Nature du substrat
Nutrition minérale
Traitements chimiques
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+: a un effet -: n’a pas d’effet
177
FACTEURS BIOLOGIQUES Au champ
A la récolte
Au stockage
Variété de plante
Stress (plante)
Vecteurs invertébrés
Infection fongique
Souche fongique
Charge de spores
Écosystème microbien
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+: a un effet -: n’a pas d’effet
178 3.4- Devenir des moisissures et des mycotoxines
au cours des traitements technologiques
Mouture
Traitements thermiques
Fermentation
Panification
179 Mouture
o Contamination fongique des farines
• Les spores de la mycoflore du champ: surtout dans le son (faible sporulation)
• Celles de la mycoflore de stockage: grande dispersion dans la farine (forte sporulation; spores à surface sèche)
• Dans les machines du moulin, résidus de farine sur lesquels se développent des espèces fongiques
• Développement de moisissures dans les silos de stockage
180
Céréale Mycotoxine Distribution (%)
Maïs Aflatoxine B1
Enveloppes 5-31; Farine de son 7-12; Germe 30-49; « Grits* » 3-6;
Farine à faible taux de lipides 2-3;
Farine à taux de lipides élevé 14-15
Riz Aflatoxine B1 Son 95; riz poli 95
Blé dur Aflatoxine B1 Concentration augmente avec taux d’extraction (maximum dans le son)
Orge, blé Ochratoxine A Concentration similaire dans farine et son
o Distribution des mycotoxines; mouture sèche
* préparation à base de maïs moulu
181
Mycotoxine Parties Fibres Gluten Amidon Germe
Solubles
Aflatoxine B1
Zéaralénone
T2-Toxine
39-42 20-38 13-17 1 6-10
17-26 15-19 49-56 0 9-11
64-70 9-11 6-13 3-6 8-12
o Distribution des mycotoxines; mouture humide du
maïs (distribution des toxines en %)
182 Traitements thermiques
o Grande thermostabilité en général
• Aflatoxines
• Ochratoxine A
A l’état sec, stables jusqu’au point de fusion
Résistent à 150°C plusieurs heures
Moins résistantes en présence d’humidité
Relativement stable à la chaleur
Après autoclavage de céréales
pendant 3h, reste 12,5 à 17%
183
Effet de l’humidité sur le devenir des mycotoxines
Produit Mycotoxine Traitement Humidité Destruction
Riz Aflatoxine B1 Cuisson 4 X Riz
8 X Riz
48-49%
75-82%
Orge Patuline Stockage aw 0,70
aw 0,90
½ Vie 13j
½ Vie 7j
Orge Citrinine Stockage aw 0,70
aw 0,90
½ Vie 8j
½ Vie 2j
Farine d’avoine
Ochratoxine A Autoclavage Pas d’eau
50% eau
87,5%
74%
184 Fermentation
Fermentation alcoolique (bière):
disparition de l’ochrtatoxine A de l’orge
Fermentation alcoolique (pain):
- Farine contaminée par Aflatoxine B1 : 225 µg/kg
- Taux résiduel dans le pain après cuisson: 44 µg/kg
185 Effet de la panification
Niveaux de contamination initiale de la farine
40 à 225 µg/kg
Taux résiduels (TR) après pétrissage
13 – 100%
TR 1ère fermentation
(2h de pointage)
11,5 - 65%
TR 2ème fermentation
(1h d’apprêt)
9,5 – 65%
TR après cuisson 7,8 - 40%
Produits analysés Contaminés Taux
Blé
Orge
Maïs
Son de blé
107
75
50
54
0
0
1
0
-
-
18*
-
Total 286 2 2
Produits analysés
Contaminés
OTA ZEA
Blé
Orge
Maïs
Son de blé
87
75
43
14
0
3*
0
0
0
0
0
0
Total 219 3 0
186
Aflatoxine B1 Ochratoxine A & Zéaralénone
* 1,13 – 2,83 μg/kg
Tantaoui Elaraki et al., Actes Inst. Agron. Vét., 1994, 14, 11-6
* μg/kg
Céréales3.5- Présence de mycotoxines dans des
produits céréaliers marocains
187
Fumonisine B1, Ochratoxine A & Zéaralénone
188
Ochratoxine A dans le pain
- % de contamination: 48% (0.14 - 150 ng/g)- 26 % échantillons LMR (Europe) (3ng/g)- La présence d’OTAdans le pain est due à la contamination de la matière première (farine)
>
Déoxynivalénol dans le blé dur
189
Ennouari et al., Food Control 32 (2012) 115-118
190
(mg/Kg)
Enniatines dans le blé, le maïs et l’orge
Zinedine et al., Food Control 22 (2011) 1-5
191
Beauvéricine et Fusaroproliférine dans le blé, le
maïs et l’orge
Zinedine et al., Food Control 22 (2011) 1-5
192
Enniatines dans des « breakfast » et aliments
pour enfants à base de céréales
Mahnine et al., Food Chemistry 124 (2011) 481-485
Mahnine et al., Food Chemistry 124 (2011) 481-485
Beauvéricine et Fusaroproliférine dans des « breakfast »
et aliments pour enfants à base de céréales
Sifou et al., Food Control 22 (2011) 1826-1830
Enniatines dans le riz
Mycotoxines dans la semoule de couscous
Nombre d’échantillons 98
Nombre de toxines recherchées 22
Nombre d’échnatillons contaminés
(au moins une toxine)
96
Plus haute incidence ENB, ENB1, ENA1, ZEA
Co-présence Fréquente
Zinedine et al. Food Chemistry 214 (2017): 440-446
Mycotoxines dans les pâtes alimentaires
Nombre
d’échantillons
40 106
Nombre de
toxines
recherchées
7 13
Principaux
resultats
50% positifs DON
(conc. > limit
max. europ.)
80% positifs aux
Enniatines &
ZEA
Bouafifsa et al., Inter Conf Mycotoxins & Cancer (2016)
197 3.6- Prévention, protection du consommateur
Aspects réglementaires
Aspects techniques
Contrôles
o Analyses mycologiques des céréales
o Recherche et dosage des mycotoxines
o Application de la démarche HACCP
198 Aspects réglementaires
o Dans plusieurs pays ou communautés de pays (UE),
des teneurs maximales sont fixées pour les
principales mycotoxines, pour l’alimentation
humaine et pour différents types d’animaux
(volailles, veaux, vaches laitières, etc.)
o Réglementation marocaine pour les mycotoxines:
arrêté conjoint du ministre de l’agriculture et de la
pêche maritime et du ministre de la santé n° 1643-
16 du 23 chaâbane 1437 (30 mai 2016) publié au
Bulletin Officiel n° 6514 du 03/11/2016
Produits
Limites maximales (µg/kg)
B1 B1+B2+G1+G2 M1
2.1.11- Toutes céréales et tous produits dérivés, y compris
produits de céréales transformés, à l’exception des
produits 2.1.12, 2.1.15 & 2.1.17
2,0 4,0 -
2.1.12- Maïs et riz destinés à être soumis à un traitement
de triage ou à d’autres méthodes physiques avant
consommation humaine ou utilisation comme ingrédients
de produits alimentaires
5,0 10,0 -
2.1.15- Préparations à base de céréales et aliments pour
bébés destinés aux nourrissons et enfants en bas âge
0,10 - -
2.1.17- Aliments diététiques destinés à des fins
médicinales spéciales, spécifiquement pour les
nourrissons
0,10 - 0,025
Réglementation marocaine pour les Aflatoxines (extrait du
décret conjoint MAPM et MS n° 1643-16
Produits
Limites maximales
(µg/kg)
2.2.1- Céréales brutes 5,0
2.2.2- Tous produits dérivés de céréales brutes, y compris produits
de céréales transformés et céréales destinées à la
consommation humaine directe, à l’exception des produits 2.2.9,
2.2.10 & 2.2.14
3,0
2.2.9- Préparations à base de céréales et aliments pour bébés
destinés aux nourrissons et enfants en bas âge
0,5
2.2.10- Aliments diététiques destinés à des fins médicinales
spéciales, spécifiquement pour les nourrissons
0,5
2.2.14- Gluten de blé non vendu directement au consommateur 8,0
Réglementation marocaine pour l’Ochratoxine A (extrait du décret conjoint MAPM et MS n° 1643-16
Produits
Limites maximales
(µg/kg)
Seuil d’alerte(µg/kg)
Date limite d’application seuil d’alerte
2.4.1- Céréales brutes autres que blé dur, avoine, riz et maïs - 1250 4 ans
2.4.2- Blé dur et avoine bruts - 1750 4 ans
2.4.3- Maïs brut à l’exception du maïs brut destiné à être transformé par mouture humide
1750 - -
2.4.4- Céréales destinées à la consommation humaine directe, farine de céréales, son et germe en tant que produit fini commercialisé pour consommation humaine directe, à l’exception des produits 2.4.7, 2.4.8, 2.4.9 et des produits à base de riz
- 750 4 ans
2.4.5- Pâtes sèches - 750 4 ans
2.4.6- Pain (y compris petits produits de boulangerie), pâtisseries,biscuits, collations aux céréales et céréales pour petit-déjeuner
- 500 4 ans
2.4.7- Préparations à base de céréales et aliments pour bébés destinés aux nourrissons et enfants en bas âge
200 - -
2.4.8- Fractions de mouture de maïs dont la taille est > 500 microns 750 - -
2.4.9- Fractions de mouture de maïs dont la taille est ≤ 500 microns 1250 - -
Réglementation marocaine pour le Déoxynivalénol (extrait du
décret conjoint MAPM et MS n° 1643-16
Produits
Limites maximales
(µg/kg)
Seuil d’alerte(µg/kg)
Date limite d’application seuil d’alerte
2.5.1- Céréales brutes autres que maïs et riz - 100 4 ans
2.5.2- Maïs brut à l’exception du maïs brut destiné à être transformé par mouture humide
350 - -
2.5.3- Céréales destinées à la consommation humaine directe, farine de céréales, son et germe en tant que produit fini commercialisé pour consommation humaine directe, à l’exception des produits 2.5.6, 2.5.7, 2.5.8 et 2.5.9 et des produits à base de riz
- 75 4 ans
2.5.4- Huile de maïs raffinée - 400 4 ans
2.5.5- Pain (y compris petits produits de boulangerie), pâtisseries,biscuits, collations aux céréales et céréales pour petit-déjeuner, à l’exception des collations au maïs et des céréales pour petit-déjeuner à base de maïs
- 50 4 ans
2.5.6- Maïs destiné à la consommation humaine directe, collation à base de maïs et céréales pour petit-déjeuner à base de maïs
100 - -
2.5.7- Préparations à base de céréales et aliments pour bébés destinés aux nourrissons et enfants à bas âge
20 - -
2.5.8- Fractions de mouture de maïs dont la taille est > 500 microns 200 - -
2.5.9- Fractions de mouture de maïs dont la taille est ≤ 500 microns 200 - -
Réglementation marocaine pour la Zéaralénone (extrait du décret conjoint MAPM et MS n° 1643-16
Mycotoxines Produits alimentaires Limites
marocaines 1
(µg/Kg)
Limites
européennes 2
(µg/Kg)
Aflatoxine B1 Céréales et produits dérivés
Aliments pour bébés incluant produits à base de céréales
Epices
Pistaches, amandes
Figues sèches
Fruits secs destinés à la consommation humaine directe
2
0.1
5
8
6
-
2
0.1
5
-
-
2
Aflatoxines
totales
B1+B2+G1+G2
Céréales et produits dérivés
Epices
Pistaches, amandes
Figues sèches
4
10
10
10
4
10
-
-
Aflatoxine M1 Lait liquide
Lait pour bébés
0.05
-
0.05
0.025
Limites marocaines pour les aflatoxins dans différents produits
alimentaires (comparées aux limites européennes)
1 Bulletin Officiel du Royaume du Maroc (2016)2 European Commission (2006)
205 Aspects techniques
Plusieurs paramètres influent sur le
développement des moisissures toxinogènes
et l’apparition des mycotoxines. Deux
aspects très importants:
o L’humidité des grains et des farines
o L’intégrité des grains
206
o L’humidité des grains et des farines
À la récolte: éviter de récolter par temps humide
Au pré-stockage: déshydratation des grains (cas du maïs)
Au stockage (grains et farines): entrepôts divers, commerces, ménages, etc.
Au transport: surtout maritime
207
o Intégrité des grains
Eviter tout endommagement des grains:
• Mécanique: récolte, battage, etc.
• Biologique:
Insectes: au champ et au stockage
Champignons (espèces parasites ou
saprophytes non toxinofgènes): au champ et au
stockage
05/04/2018
208Espèce non
toxinogène
Moisissure
Espèce
toxinogène Souche
toxinogène
Souche non toxinogène
Substrat
défavorable
Substrat
favorable
Environt
défavorable Environt
favorable
Traitements
technologiquesAliment moisi sans
mycotoxines
Aliment sain
Aliment moisi avecmycotoxines
Consommation humaine ou animale
Aliment non moisi avecmycotoxines
209 Contrôles
Analyses mycologiques
Recherche et dosage des mycotoxines
Application de la démarche HACCP
210
Recherche et dosage des mycotoxines
Extraction: solvants appropriés
Purification de l’extrait (éliminer lipides, pigments, etc.)
Séparation chromatographique
Révélation (souvent par UV)
Confirmation (souvent par dérivation chimique)
Quantification (HPLC par exemple)
211
Application de la démarche HACCP
o HACCP: démarche consistant à prévoir les dangers que pourraient encourir le consommateur et prendre les mesures nécessaires pour le protéger
o Les mycotoxines sont incluses dans les dangers biologiques
212
BPF:BONNES
PRATIQUESDE
FABRICATION
BPH:BONNES
PRATIQUESD’HYGIENE
QUALITE
4- Principes des méthodes
d’analyse microbiologique des
céréales et dérivés
4- Principes des méthodes d’analyse
microbiologique des céréales et dérivés
4.1- Numération des propagules de moisissures
dans une farine
4.2- Recherche, dans les grains de céréales, de
moisissures susceptibles de représenter un
danger
4.3- Identification des 3 genres importants :
Aspergillus, Penicillium et Fusarium.
4.1- Numération des propagules de moisissures dans les farines
Principe
Les moisissures se trouvent sous différentes formes susceptibles de donner naissance à un nouveau mycélium :
- spores de toutes sortes,
- fragments de filament,
- touffes de filaments, etc.
Chacun de ces éléments est une unité de propagation ou propagule.
La technique de numération consiste à:
- suspendre une quantité donnée de farine dans un milieu liquide dispersant;
- ensemencer des dilutions successives de cette suspension mère dans un milieu nutritif gélosé favorable
- incuber (température, durée)
- compter le nombre de « thalles » qui proviennent, en principe, chacun d’un propagule.
217Mode opératoire
Bien homogénéiser l’échantillon de farine avant de commencer l’analyse
Dans un récipient stérile, peser aseptiquement 1g de cette farine
Ajouter 9 ml d’eau physiologique stérile (8,5 g de NaCl/l) avec 0,1% de tween 80 (favorise la dispersion des spores) : 1ml de cette suspension mère représente 0,1g de farine
Agiter fortement
218
Dilution 100 10-1 10-2 10-3 10-n
1ml 1ml 1ml 1ml
Solution
de
dilution:
tubes
de 9ml
Procéder à une série de dilutions décimales de la suspension mère dans des tubes à essais contenant 9 ml d’eau physiologique stérile au tween 80 (le nombre de dilutions dépendra de la charge présumée de la farine en moisissures)
Solution mère: 1g
+ 9ml eau distillée
stérile au tween
Dans une série de boîtes de Petri, répartir 1ml de chacune des dilutions préparées précédemment
Couler aseptiquement dans chaque boîte 15 à 20 ml de milieu gélosé stérile ramené à 45-48°C, puis bien homogénéiser : les milieux utilisés sont le milieu de Sabouraud Agar, le milieu MEA (Malt ExtractAgar) ou le Czapeck-Dox Agar
Après solidification, incuber les boîtes 6j à 25°C ou 4j à 30°C
220 Technique d’ensemencement
Dilutions 100 10-1 10-2 10-n
. . . .
. . . .
..
….
…
. . .
. ..
.. .
. .
. .
n0 n1 n2 nn
Ensemencement
(en double) sur
milieu gélosé
incubation
Lecture et
interprétation
. .
.. .
. .
. .. ..
221
Lecture et interprétation
- Sélectionner les boîtes avec un nombre de
colonies n tel que m<n<M
- Le minimum m et le maximum M varient selon
la taille moyenne des colonies concernées,
généralement:
.pour les bactéries, entre 30 et 300
.pour levures et moisissures, entre 10 et 100
223
N =∑ C
(n1 + 0,1n2)d
∑ C: somme des colonies comptées dans toutes les boîtes retenues (avec nombre de colonies entre 10 et 100)
n1: nombre de boîtes retenues à la 1ère dilution
n2: nombre de boîtes retenues à la 2ème dilution
n3: nombre de boîtes retenues à la 3ème dilution
d: facteur de dilution correspondant à la 1ère dilution
N =(n1 + 0,1n2 + 0,01n3 )d
∑ C
2 dilutions successives
retenues
3 dilutions successives
retenues
224
Expression des résultats
- Le chiffre trouvé est arrondi à 2 chiffres
significatifs (ex.: 28350 à 28000; 11500 à 12000)
- le nombre d’UFC/g ou/ml trouvé est converti
en un nombre compris entre 1,0 et 9,9
multiplié par 10x,(ex. 28000 converti en 2,8.104
Principe
Laver soigneusement les grains de leurs poussières de surface pour enlever les moisissures sans intérêt;
disposer les grains à la surface d’un milieu nutritif gélosé approprié dans des boîtes de Petri;
après incubation, observer le développement éventuel de moisissures;
Isoler ces moisissures pour étude et identification éventuelle.
4.2- Recherche, dans les grains de céréales, de
moisissures susceptibles de représenter un danger
Mode opératoire
Prélever aseptiquement quelques grains de la céréale à
étudier ;
Les placer dans un flacon contenant de l’alcool à 76° ou
de l’eau physiologique stérile et agiter légèrement pour
débarrasser les grains de leurs moisissures de surface sans
intérêt (en cas d’utilisation d’alcool, repasser les grains
rapidement dans de l’eau distillée ou de l’eau
physiologique stériles sans agitation pour supprimer les
restes d’alcool) ;
Disposer quelques grains à l’aide de pinces stériles à la surface d’un milieu gélosé dans une boîte de Petri, de préférence le sillon vers le bas ;
Incuber comme précédemment ;
Observer le développement éventuel de moisissures partant des grains : on peut regarder les boîtes toutes les 24 heures à partir du 2ème
jour ;
Repiquer et purifier les souches en boîte de Petripar les techniques microbiologiques classiques en vue de l’identification et/ou la conservation.
Principe
Observation microscopique de cultures ou de
prélèvements de cultures. Noter notamment :
la nature cloisonnée ou non des filaments végétatifs ;
la forme et le cloisonnement éventuel du conidiophore ;
la forme spécifique de la tête conidienne ;
la forme, la taille et le caractère unicellulaire ou
pluricellulaire des conidies ;
d’autres aspects spécifiques à chaque genre.
4.3- Identification des 3 genres importants:
Aspergillus, Penicillium et Fusarium
Modes opératoires
- Observations des cultures in situ dans une boîte
de Petri
- Observations de cultures sur lames
- Technique du scotch
- Observation entre lame et lamelle
Observations des cultures in situ dans une boîte de Petri
- Observer directement les « thalles » de moisissures en
plaçant la boîte de Petri sous l’objectif du microscope
- Observer de préférence les parties périphériques des
« thalles » (peu denses)
- Avantages de cette technique: simplicité, possibilité
de regarder les structures intactes de la moisissure
- Inconvénient: on ne peut généralement pas passer à
des forts grossissements.
Observations de cultures sur lames
- Etaler soigneusement en couche mince un petit volume d’un
milieu gélosé approprié sur une lame porte-objets stérile
- Ensemencer par touche centrale avec la souche à identifier
- Placer la lame à l’intérieur d’une boîte de Petri vide stérile,
avec un peu d’eau stérile pour éviter la déshydratation du
milieu, puis incuber à 25-30°C.
- Quand le développement de la moisissure est jugé suffisant,
placer la lame sous l’objectif du microscope et observer.
- Cette technique permet de plus forts grossissements que la
précédente, mais elle nécessite la culture préalable sur lame.
Technique du scotch (ou du drapeau)
- Appliquer une bande de scotch sur la partie à
prélever d’un « thalle », puis coller la bande sur
une lame porte-objets et observer.
- Avantages: technique simple et pratique,
Inconvénient: risque de briser les structures de la
moisissure au cours du prélèvement.
Observation entre lame et lamelle.
- Déposer une goutte d’eau sur une lame porte-objets
- Prélever, à l’aide d’un stylet (ou d’une lame de rasoir), une fraction suffisante (mais la plus fine possible) d’une culture sur milieu gélosé de la souche à étudier et la déposer dans la goutte d’eau
- Avant d’observer, recouvrir délicatement le prélèvement d’une lamelle, sans trop écraser le mycélium et sans laisser de bulles d’air entre la lame et la lamelle.
- Inconvénient: les spores ont tendance à se disperser dans l’eau, ce qui défait les têtes conidiennes
- Remarque : pour améliorer la qualité de l’observation, on peut ajouter dans l’eau du « bleu coton ».
Observation entre lame et lamelle
Technique du drapeau
Aspergillus
- Cellule podale: foot cell
- Conidiophore non cloisonné
- Vésicule (forme variée)
- Métules et phialides (bisérié) ou phialides seules (unisérié)
- Conidies en ligne à partir des phialides
Penicillium
- Conidiophore cloisonné
- Conidiophore simple (a et b)
ou ramifié (c et d)
- Tête conidienne décisive pour
identification des espèces
Fusarium
- Microconidies (uni- ou
bicellulaires)
- Macroconidies (multicellulaires)
en fuseau
- Chlamydospores: formes de
résistanc
Conclusion générale
245Entre aliment et
microorganismes:
un combat à mort
رحم هللا عبدا عمل عمال ف أتقنهحديث شريف
من غشنا ف ليس مناحديث شريف
