Methodes de Daignostic en Virologie
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METHODES DE METHODES DE DAIGNOSTIC EN DAIGNOSTIC EN
VIROLOGIEVIROLOGIE
Pr. Ag. O. BAHRIPr. Ag. O. BAHRI
Laboratoire de Virologie CliniqueLaboratoire de Virologie Clinique
Institut Pasteur de TunisInstitut Pasteur de Tunis
METHODES DIRECTES
Détection et caractérisation du virus ou l’un de ses constituants
METHODES INDIRECTES
Détection, titrage et caractérisation des anticorps spécifiques
Prélèvement = acte clé pour le diagnostic virologique
Qualité du prélèvement Fiabilité du diagnostic
- Réaliser le bon prélèvement au bon moment et dans le
bonnes conditions
- Le choix du ou des échantillons, de leurs modalités de
prélèvement, de transport et de conservation doivent être de
qualité optimale.
Quels sont les prélèvements réalisés pour un
diagnostic virologique ?
- Diagnostic indirect: anticorps présents dans différents
liquides biologiques (plasma ou sérum selon que le sang est
prélevé avec ou sans anticoagulant) 5 à 10ml de sang veineux suffisent pour effectuer la
recherche de plusieurs marqueurs ou faire plusieurs sérologies Conservation des échantillons de plasmas ou de sérums au
congélateur
- Diagnostic direct:
* Sang
* LCR
* Selles
* Prélèvements broncho-pulmonaires: Sécrétions nasales, LBA, ……
* Prélèvements de gorge
* Urines
* Prélèvements cutanés (vésicules, ulcérations)
* Prélèvements génitaux
* Prélèvements conjonctivaux
* Biopsies tissulaires
Choix du prélèvement à réaliser
Choix du site en fonction de la clinique, du virus à rechercher et de la physiopathologie de l’infection virale
• Porte d’entrée
• Sites de multiplication
• Site d’excrétion des virus
Réalisation des prélèvements
- Importance+++ de la qualité du prélèvement
- Réalisation le plus tôt possible après le début des signes cliniques (multiplication+++ pendant phase d’incubation)
Acheminement des prélèvements au laboratoire
- Milieux de transport pour virologie (+++ pour culture de virus)
- Transport rapide
- Sécurité
- Importance des renseignements cliniques transmis au virologue avec le prélèvement
TECHNIQUES D’ETUDE DIRECTES
Visualisation des Visualisation des particules viralesparticules virales
Microscopie électronique:Microscopie électronique:PrincipePrincipe
- Visualisation de la particule virale
- Agrandissement 10 – 40 fois
celui du microscope optique
Microscopie électronique:Microscopie électronique:PrincipePrincipe
Coloration négative par ajout de produit contrastant
Mise en évidence des différentes structures de l’objet - Particule virale: aspect clair - Produit contrastant: aspect sombre
Microscopie électronique: Microscopie électronique: Avantages et limitesAvantages et limites
AVANTAGES AVANTAGES
– – virus non cultivables virus non cultivables gastro-entérites virales : gastro-entérites virales : rotavirus, calicivirus, rotavirus, calicivirus, astrovirus….astrovirus….
– – Nouveaux virusNouveaux virus
– – Immuno-microscopie Immuno-microscopie électronique (augmente électronique (augmente la sensibilité)la sensibilité)
LIMITESLIMITES
– – Techniques coûteuses Techniques coûteuses (équipement)(équipement)
– – Techniques lourdes et Techniques lourdes et demandant un personnel demandant un personnel expérimentéexpérimenté
– – Manque de sensibilité: Manque de sensibilité: Nécessité d’une bonne Nécessité d’une bonne concentration suffisante des concentration suffisante des échantillons à étudier échantillons à étudier (virus: > 10(virus: > 1066 copies/ml) copies/ml)
Isolement viral Isolement viral sur Support biologique sur Support biologique
Virus = Parasite intra-cellulaire obligatoireVirus = Parasite intra-cellulaire obligatoire
Culture possible sur cellules vivantes SENSIBLESCulture possible sur cellules vivantes SENSIBLES
Systèmes biologiques Systèmes biologiques utilisablesutilisables
Systèmes Systèmes inin vivovivo Animaux de laboratoireAnimaux de laboratoire
SourisSouris RatRat SingeSinge Furet ……Furet ……
Hôtes animaux naturelsHôtes animaux naturels Vecteurs naturelsVecteurs naturels
Insectes (Moustiques)Insectes (Moustiques) TiquesTiques
SystèmesSystèmes in ovoin ovo Œuf de poule embryonnéŒuf de poule embryonné
Systèmes Systèmes ex vivoex vivo Organes isolésOrganes isolés Cultures cellulairesCultures cellulaires
Inoculation à l’œuf de poule embryonné (OPE)
- Depuis 1932:
Utilisation pour nombreux virus
- Intérêt actuel limité- Isolement virus grippal- Production de souches vaccinales
Inoculation à l’OPEInoculation à l’OPEDétection du virus amplifiéDétection du virus amplifié
Inoculation à l’OPEInoculation à l’OPEDétection du virus amplifiéDétection du virus amplifié
Technique d’hémadsorption
Culture de cellules: base diagnostique virologiqueCulture de cellules: base diagnostique virologique
Dissociation des cellules par action enzymatique (trypsine)Dissociation des cellules par action enzymatique (trypsine)
Trois types de lignées cellulaires- Cellules primaires- Lignées diploïdes- Lignées continues
Cellules primaires Cellules primaires
- Origine: Tissus normaux (organismes adultes/embryonnaires++)
- Caractéristiques: a- Sensibilité+++
b- Nombre de passages limité
Lignées diploïdes Lignées diploïdes
- Origine: Fibroblastes humains
- Caractéristiques: a- Sensibilité bonne aux virus
b- Nombre de passages limité
Cultures primaires et secondairesCultures primaires et secondaires
trypsine
trypsine
Culture Ire
trypsine
Culture IIre
Nombre de passages : 2-3 ¢ épith, 50 fibroblastes
Multiplication tapis continu
Aspect originel : épithélioïde ou fusiforme
Confluence : inhibition de contact : monocouche
Les lignées continuesLes lignées continues
- Origine: Tumeurs malignes ou transformation spontanée ou viro-induite de cultures primaires ou secondaires
- Caractéristiques: a- Capacité de prolifération infinie
b- Acquisition possible de nouveaux caractères
c- Stockage dans l’azote liquide
d- Susceptibilité différente en fonction des virus
Inoculation par un prélèvement contenant un virus
Culture de cellules saines
Effet cytopathogène (ECP)
ECP = Modification de la morphologie des ECP = Modification de la morphologie des cellules infectées par un virus suivie d’une lyse cellules infectées par un virus suivie d’une lyse
cellulaire plus ou moins rapidecellulaire plus ou moins rapide
Paramètres définissant l’ECP- Nature des cellules montrant l’ECP- Type de l’ECP- Délai d’apparition de l’ECP
ECP généralement caractéristique ECP généralement caractéristique
d’un groupe ou genre viral d’un groupe ou genre viral Nécessité de typage Nécessité de typage
Cas du virus de la rougeoleCas du virus de la rougeole
Cellules B95a non infectées ECP sous forme de syncythium
S’agit-il du virus de la rougeole ou autre paramyxovirus?
ECP généralement caractéristique ECP généralement caractéristique
d’un groupe ou genre viral d’un groupe ou genre viral Nécessité de typage Nécessité de typage
Immunofluorescence
Préparation d’un frottis sur lame à puits
ECP généralement caractéristique ECP généralement caractéristique
d’un groupe ou genre viral d’un groupe ou genre viral Nécessité de typage Nécessité de typage
Immunofluorescence
Cellules non infectées Fluorescence spécifique du virus de la rougeole
ECP généralement caractéristique ECP généralement caractéristique
d’un groupe ou genre virald’un groupe ou genre viral
Cellules saines
Cellules infectées par un entérovirus
Manipulation sous hotte à flux laminaire
Asepsie rigoureuse
Limites Limites de la culture de cellulesde la culture de cellules
1- Problèmes liés aux virus1- Problèmes liés aux virus
- Absence de système cellulaire universel- Absence de système cellulaire universel- Virus non cultivables- Virus non cultivables- Virus à culture lente- Virus à culture lente- ECP absent ou discret- ECP absent ou discret- Virus de culture dangereuse- Virus de culture dangereuse
Limites Limites de la culture de cellulesde la culture de cellules
2- Problèmes liés à la technique2- Problèmes liés à la technique- Entretien coûteux et délicat des cellules- Entretien coûteux et délicat des cellules- Asepsie rigoureuse- Asepsie rigoureuse- Organisation particulière du laboratoire- Organisation particulière du laboratoire
3- Problèmes liés aux prélèvements3- Problèmes liés aux prélèvements- Collection très précoce- Collection très précoce- Stérilité- Stérilité- Conditions d’acheminement adéquat au laboratoire- Conditions d’acheminement adéquat au laboratoire
TECHNIQUES D’ETUDE DIRECTES
Détection des antigènes Détection des antigènes virauxviraux
-Immunocytodiagnostic:Immunocytodiagnostic:
Immunofluorescence Immunofluorescence Immunoperoxydase Immunoperoxydase
Antigènes intracellulaires
-Détection d’antigènes Détection d’antigènes solubles:solubles: ELISA ELISA Agglutination au latex Agglutination au latex Immunochromatographie Immunochromatographie
Antigènes libres
Détection des antigènes Détection des antigènes virauxviraux
IMMUNOCYTODIAGNOSTICIMMUNOCYTODIAGNOSTIC
Immunofluorescence Immunofluorescence Immunoperoxydase Immunoperoxydase
Technique Technique d’immunofluorescenced’immunofluorescence
PrincipePrincipe IF indirecte IF directe
Détection des antigènes par IF
Applications: Rage
Détection des antigènes par IF
Applications: Adénovirus
Cellules infectées par adénovirus
Détection des antigènes par IF
AVANTAGES
- Rapidité de la technique
- Recherche simultanée de plusieurs antigènes viraux pour un même prélèvement (Ex: viroses respiratoires)
LIMITES
- Qualité du prélèvement (présence de cellules obligatoires)
Technique Technique d’immunoperoxydase d’immunoperoxydase
(Enzyme: Peroxydase)
Coloration
Substrat
Coloration
Substrat
Identification du HSV par immunoperoxydase
MRC5 infectés par HSV
Détection des antigènes Détection des antigènes virauxviraux
DETECTION D’ANTIGENES SOLUBLESDETECTION D’ANTIGENES SOLUBLES
ELISA ELISA Agglutination de microparticules en latex Agglutination de microparticules en latex
Immunochromatographie Immunochromatographie
Technique ELISATechnique ELISAPrincipePrincipe
Technique ELISATechnique ELISA
AVANTAGES
- Rapidité du test
- Moins de contrainte concernant la qualité du prélèvement
Technique d’agglutination Technique d’agglutination au latex:au latex:
Principe et applicationPrincipe et application
Détection des rotaviruset des adénovirus
dans les selles
- Particules de latex sensibilisées par des anticorps spécifiques- Antigène présent Agglutination visible à l’œil nu- Rapidité+++
TECHNIQUES D’ETUDE DIRECTES
Hydrogen Bonds
LaLa séséquencequence nucléotidique nucléotidique
Cytosine (C)
Adénine (A)
Thymine (T)
Guanine (G)
Désoxyribose (Sucre) Acide phosphorique
(Phosphate)
Guanine (G)
Thymine (T)
Adénine (A)
Cytosine (C)
Bases des techniques moléculaires:1- Complémentarité entre les bases nucléotidiques2- Possibilité de dénaturation/renaturation des acides nucléiques
Techniques de biologie Techniques de biologie moléculairemoléculaire
Trois étapes nécessairesTrois étapes nécessaires
Extraction du génome viralExtraction du génome viral
Hybridation et/ou amplificationHybridation et/ou amplification
Révélation des hybrides ou des amplifiatsRévélation des hybrides ou des amplifiats
TCGATACGCT
AGCTATGCGA
hybridation simple
extraction ARN
ADN CibleCible: séquence de génome : séquence de génome
viral choisie pour l’étudeviral choisie pour l’étude Sonde nucléique marquée:Sonde nucléique marquée:
ADN ou ARN ADN ou ARN Marquage de la sonde:Marquage de la sonde:
Sonde chaudeSonde chaude Sonde froideSonde froide
Révélation des hybrides Révélation des hybrides formésformés
Hybridation moléculaire
Principe de la technique Principe de la technique d’ADN branchésd’ADN branchés
Hybridation en milieu liquide avec amplification du signal
Polymerase Chain Reaction Polymerase Chain Reaction Principe Principe
Amplification in vitro d’une région spécifique d'un acide nucléique
obtention d’une quantité suffisante pour la détection et l’étude
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
Cas des génomes à ARN: Cas des génomes à ARN: RT-PCR RT-PCR
- ADN cible
- Amorces
- Taq Polymérase
- Tampon (sels, cations bivalentes
- MgCl2
- dNTP
Révélation des produits Révélation des produits amplifiésamplifiés
Migration des produits amplifiés sur gel
Avantages de la PCRAvantages de la PCR SensibilitéSensibilité++++++
Rapidité de réalisation Rapidité de réalisation Standardisation actuellement possible pour certains infections viralesStandardisation actuellement possible pour certains infections virales
Inconvénients de la PCR • Coût et appareillage spécial• Risque de résultats faussement négatifs
- Présence d’inhibiteurs dans les prélèvements- Utilisation de contrôles internes
• Risque de résultats faussement positifs
- Contamination inter-échantillons
- Contamination par les produits des PCR précédentes
Séparation totale des activités pré et post PCR Séparation totale des activités pré et post PCR par manipulation dans 3 locaux différentspar manipulation dans 3 locaux différents
Pièce de préparation de réactifsPièce de préparation de réactifs Pièce de traitement des échantillonsPièce de traitement des échantillons Pièce d’analyses des produits amplifiésPièce d’analyses des produits amplifiés
Conditions de manipulation de la PCR
– Utilisation de témoins et de contrôles• Témoin négatif et témoin positif• Contrôles d’extraction, d’amplification et d’hybridation
METHODES DIRECTES
Détection et caractérisation du virus ou l’un de ses constituants
METHODES INDIRECTES
Détection, titrage et caractérisation des anticorps spécifiques
Anticorps élaborés par l’hôte infecté en réponse à l’infection virale
Tests Tests sérologiquessérologiques
Techniques sérologiques
Inhibition de l’hémagglutination(IHA)
Inhibition de l’hémagglutination(IHA)
Séroneutralisation
Réaction de fixation du complément
Immunofluorescence
Principe de l’ELISA
Variantes de l’ELISA
Détection des IgM par ELISADétection des IgM par ELISA
Risques: - Faux Positifs (Facteur rhumatoïde)
- Faux négatifs (Présence d’IgG spécifiques)
Détection des IgM par ELISADétection des IgM par ELISA
Technique d’immunocaptureELISA indirecte
Prétraitement des sérums
Avant réaction
Importance de l’avidité des IgG
Avidité FAIBLE Infection RECENTE
Avidité FORTE Infection ANCIENNE
Tests de confirmation Tests de confirmation - Western Blot
- Immunoblot
Tests de confirmation Tests de confirmation - Western Blot
- Immunoblot
Tests de confirmationTests de confirmation
Tests de confirmation Tests de confirmation
Western Blot VIH-1• 1: Contrôle +• 2: Contrôle -• A: Négatif• B: Indéterminé• C: Positif
ConclusionConclusion
MultiplicitéMultiplicité++++++ des moyens d’étude des virus des moyens d’étude des virus
Techniques d’utilisation variable en fonction du virus en cause Techniques d’utilisation variable en fonction du virus en cause Savoir faire le bon choix des testsSavoir faire le bon choix des tests
Avoir le maximum de renseignements possibles sur le diagnostic ou Avoir le maximum de renseignements possibles sur le diagnostic ou l’étude à réaliser l’étude à réaliser
Avoir les bons prélèvements collectés au bon momentAvoir les bons prélèvements collectés au bon moment
S’aider d’une bonne recherche bibliographique pour les travaux de S’aider d’une bonne recherche bibliographique pour les travaux de recherche pour faire le bon choix des techniquesrecherche pour faire le bon choix des techniques