MÉMOIRE DE DIPLÔME D’ÉTUDES SPECIALISÉES...

Année2016 N°

MÉMOIREDEDIPLÔMED’ÉTUDESSPECIALISÉESDEBIOLOGIEMÉDICALE

Conformémentàl’arrêtédu10Septembre1990Tientlieude

THÈSEPourle

DOCTORATENMÉDECINEDiplômed’État

par

NicolasTARLÉNéle25Septembre1986àCambrai(59)

L’optimisationdestestsELISAanti-FP4modifiéest-ellepossibleenutilisantunanticorpsmonoclonaldethrombopénieinduitepar

l’héparine(5B9)?

Présentéeetsoutenuepubliquementle27Octobre2016devantunjurycomposéde:PrésidentduJury:ProfesseurYvesGruel,Hématologie,transfusion,PU-PH,FacultédeMédecine-Tours MembresduJury: ProfesseurClairePouplard,Hématologie,PU-PHFacultédePharmacie-ToursProfesseurHervéWatier,Immunologie,PU-PH,FacultédeMédecine-ToursProfesseurGillesPaintaud,Pharmacologiefondamentale,pharmacologieclinique,PU-PH,FacultédeMédecine–Tours

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RemerciementsÀMonsieurleprofesseurYvesGruel,c’estunhonneurdevousavoirentantquePrésidentduJury.Votrerigueurscientifiqueetvotrebienveillancem’onttoujourspousséàdonnerlemeilleurdemoi-même.ÀMadameleProfesseurClairePouplard,jevoussuisextrêmementreconnaissantdem’avoirfaitconfiancepourmeneràbiencetravail.Votresoutieninconditionnelainsiquevotrebonnehumeurontétéuneforcepourmoi.Jevousadressemesamitiéslesplussincères.ÀMonsieurleProfesseurHervéWatier:pouravoiracceptédejugercetravail,soyezassurédemagratitude.ÀMonsieurleProfesseurGillesPaintaud:pouravoirlagentillessedevenirjugercetravail,jevousadressemesremerciementslesplussincères.ÀlasociétéStago,jetenaisàvousremercierpourl’aidematériellequevousavezpum’apporterainsiquepourvotreréactivitépourrépondreàmesquestions.

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Àmesparents,vousm’aveztoujourssoutenuetjesaisàquelpointjen’aipasétéfacileàvivre.Mercid’avoirtoujourscruenmoietdem’avoirpermisdedevenirl’hommequejesuisaujourd’hui.ÀLaurie,masœur,pourtousnosfousrirespartagés.‘Z’avezpasl’heure?’ÀMélissa,mercidepartagermavie.Debellesaventuresnousattendentetj’aibienhâtequ’ellescommencent!ÀEvan,monBro,pouravoirégayémascolaritédelasixièmeàaujourd’hui.ÇayestonlatientnotreGoodLife!ÀAlban,MathieuetArnaud,monnoyaudurorléanaisdepuistantd’années.C’estunplaisirquedevousavoiràmescôtés.Àmesamisproches,Steph,Popo,Fredo,Narine,Damich,MP,Kiki,Gui,Josy,Paulo,Maxou,Bourdoch’,Kéké,FrankyetOliv,pourtouslesbonsmomentspassésensembleetceuxàvenir,j’vouskiffeputain!ÀlapromotiondeBiologieMédicale2012:EveAnne,David,Candice,BenoitetMartin.Lesmeilleurs!

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Résumé Lediagnosticbiologiquedesthrombopéniesinduitesparl’héparine(TIH)reposesurladétectiond’anticorps(Ac)dirigéscontreleFP4modifiéparl’héparine.LestestsELISAsontcourammentutilisésdansnoslaboratoiresetleurcompterendudoitmentionnerleseuildepositivitédutestainsiquel’absorbancemesurée,unevaleursupérieureà1étantassociéeàuneplusforteprobabilitédeTIH.Cependant,l’ECATrapportedescoefficientsdevariationsinter-essaiscomprisentre16et37%selonlestrousses.NousavonsrécemmentdéveloppéunAcmonoclonald’isotypeIgG(5B9),possédantunfragmentFchumainetquireconnaîtspécifiquementleFP4modifiéparl’héparine. L’objectifdecetravailaétéd’évaluerl’intérêtd’utilisercetAc5B9commecalibrantdesdifférentestroussescommercialisées:ASSERACHROM®HPIA–IgG(Stago),HAT45G®(GTI)etZYMUTEST®HIAIgG(HYPHEN).Lorsdechaqueexpérimentation,unegammed’étalonnageaétéréaliséeavecdesconcentrationscroissantesd’Ac5B9(0à10μg/mL)etlesabsorbancesmesuréesaveclesplasmasde7patientspositifsontétésystématiquementconvertiesen‘équivalent5B9’.L’expressiondesrésultatsdeces7patientsen‘équivalent5B9’n’apaspermisdediminuerlavariabilitéinterkits. Dansunsecondtemps,nousavonsévaluél’intérêtdel’Ac5B9pourstandardiserlesrésultatsauseind’uneseuletrousse,latrousseAsserachromHPIAIgG(Stago).Danscebut,nousavonsréalisélestestsdanslesconditionsextrêmesenfaisantvarierlatempératuredelapièceainsiquelestempsd’incubationdel’échantillon,del’immunoconjuguéetdusubstrat.Quelquessoientlesconditionsexpérimentalestestées,lacourbedecalibrationestd’allurehyperboliqueavecuncoefficientdecorrélationégalà0.99.L’expressiondesrésultatsen‘équivalent5B9’diminueconsidérablementleCVdedeuxéchantillons,C1etunPoolau1/5ème,maispasceluidelaréférenceHPIApermettantdedéfinirleseuildepositivitédutest. UnprojetmulticentriqueprospectifencollaborationaveclasociétéStagoetvisantàétudierl’intérêtdel’utilisationducalibrant5B9aveclatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGestencoursderédaction.UneanalyseencourbeROCpermettraderedéfinirleseuildepositivitédutest.Motsclés:Thrombopénieinduiteparl’héparine,ELISA,FP4,Anticorps,standardisation

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Abstract LaboratorytestingforthediagnosisofHeparininducedthrombocytopenia(HIT)isbasedonthedetectionofantiplateletfactor4(PF4)/heparinantibodies.ELISAarecommonlyusedandresultsshouldmentionthecutoffvalueofthetestaswellasthemeasuredabsorbance,avaluehigherthan1beingassociatedwithahighprobabilityofHIT.However,theECATfoundationreportsbetween-testsvariationsfrom16to37%dependingonmanufacturers.WerecentlydevelopedanIgGchimericmonoclonalantibody(5B9),withahumanFcfragmentthatonlyrecognizesPF4modifiedbyheparin. Theaimofthisstudywastoassesstheusefulnessof5B9asacalibratorfordifferentcommercialisedELISAkits:ASSERACHROM®HPIA–IgG,HAT45G®andZYMUTEST®HIAIgG.Duringeachexperiment,acalibrationrangewasperformedwithincreasingconcentrationsof5B9(0to10μg/mL)andmeasuredabsorbanceswith7plasmasamplesfrompositivepatientsweresystematicallyconvertedin‘equivalent5B9’.Expressionofresultsinthese7patientsin‘equivalent5B9’didn’treducevariationsbetweenthedifferentmethodsevaluated. Then,weassessedtheusefulnessof5B9asacalibratorwithinonekit,AsserachromHPIAIgG(Stago).Forthispurpose,weperformedtestsinextremeconditionswithvariationsoftheroomtemperatureorincubationtimeofsample,immunoconjugateandsubstrate.Whatevertheexperimentalconditions,calibrationcurvewashyperbolicwithacorrelationcoefficientof0,99.Expressionofresultsin‘equivalent5B9’oftwosamplesC1andaplasmaPooldilutedat1:5greatlydecreasedthebetween-testvariationsbutnotfortheHPIAreferenceusedtodefinethecut-offvalue. AprospectivemulticentrestudyincollaborationwithStagoandassessingtheusefulnessof5B9asacalibratoroftheASSERACHROM®HPIA–IgGkitisinprogress.AROCcurveanalysiswillfurtherdefinethecut-offvalueoftheassay.Keywords:Heparininducedthrombocytopenia,ELISA,PF4,Antibody,standardization

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Faculté de Médecine – 10, boulevard Tonnellé – CS 73223 – 37032 TOURS Cedex 1 – Tél : 02.47.36.66.00 – www.med.univ-tours.fr 1

05/10/2016

UNIVERSITE FRANCOIS RABELAIS FACULTE DE MEDECINE DE TOURSFACULTE DE MEDECINE DE TOURS

DOYEN Pr. Patrice DIOT

VICE-DOYEN

Pr. Henri MARRET

ASSESSEURS Pr. Denis ANGOULVANT, Pédagogie

Pr. Mathias BUCHLER, Relations internationales Pr. Hubert LARDY, Moyens – relations avec l’Université Pr. Anne-Marie LEHR-DRYLEWICZ, Médecine générale Pr. François MAILLOT, Formation Médicale Continue

Pr. Patrick VOURC’H, Recherche

SECRETAIRE GENERALE Mme Fanny BOBLETER

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DOYENS HONORAIRES

Pr. Emile ARON (†) – 1962-1966 Directeur de l’Ecole de Médecine - 1947-1962 Pr. Georges DESBUQUOIS (†)- 1966-1972

Pr. André GOUAZE - 1972-1994 Pr. Jean-Claude ROLLAND – 1994-2004 Pr. Dominique PERROTIN – 2004-2014

PROFESSEURS EMERITES Pr. Catherine BARTHELEMY

Pr. Philippe BOUGNOUX Pr. Etienne DANQUECHIN-DORVAL Pr. Loïc DE LA LANDE DE CALAN

Pr. Noël HUTEN Pr. Olivier LE FLOCH

Pr. Yvon LEBRANCHU Pr. Elisabeth LECA

Pr. Gérard LORETTE Pr. Roland QUENTIN

Pr. Alain ROBIER

PROFESSEURS HONORAIRES P. ANTHONIOZ – A. AUDURIER – A. AUTRET – P. BAGROS – G. BALLON – P.BARDOS – J.L. BAULIEU – C. BERGER – JC. BESNARD – P. BEUTTER – C. BINET – P. BONNET – M. BROCHIER – P. BURDIN – L. CASTELLANI – B. CHARBONNIER – P. CHOUTET – J.P. FAUCHIER – F. FETISSOF – J. FUSCIARDI – P. GAILLARD – G. GINIES – A. GOUAZE – J.L. GUILMOT – M. JAN – J.P. LAMAGNERE – F. LAMISSE – J. LANSAC – Y. LANSON – J. LAUGIER – P. LECOMTE – G. LELORD – E. LEMARIE – G. LEROY – Y. LHUINTRE – M. MARCHAND – C. MAURAGE – C. MERCIER – J. MOLINE – C. MORAINE – J.P. MUH – J. MURAT – H. NIVET – L. POURCELOT – P. RAYNAUD – D. RICHARD-LENOBLE – M. ROBERT – J.C. ROLLAND – A. SAINDELLE – J.J. SANTINI – D. SAUVAGE – B. TOUMIEUX – J. WEILL

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PROFESSEURS DES UNIVERSITES - PRATICIENS HOSPITALIERS ALISON Daniel .................................................. Radiologie et imagerie médicale ANDRES Christian ............................................. Biochimie et biologie moléculaire ANGOULVANT Denis ........................................ Cardiologie ANGOULVANT Théodora .................................. Pharmacologie clinique ARBEILLE Philippe ............................................ Biophysique et médecine nucléaire AUPART Michel.................................................. Chirurgie thoracique et cardiovasculaire BABUTY Dominique ........................................... Cardiologie BALLON Nicolas ................................................ Psychiatrie ; addictologie BARILLOT Isabelle ............................................. Cancérologie ; radiothérapie BARON Christophe ............................................ Immunologie BERNARD Louis ............................................... Maladies infectieuses et maladies tropicales BODY Gilles ....................................................... Gynécologie et obstétrique BONNARD Christian .......................................... Chirurgie infantile BONNET-BRILHAULT Frédérique ..................... Physiologie BRILHAULT Jean ............................................... Chirurgie orthopédique et traumatologique BRUNEREAU Laurent ........................................ Radiologie et imagerie médicale BRUYERE Franck .............................................. Urologie BUCHLER Matthias ............................................ Néphrologie CALAIS Gilles ..................................................... Cancérologie, radiothérapie CAMUS Vincent ................................................. Psychiatrie d’adultes CHANDENIER Jacques ..................................... Parasitologie, mycologie CHANTEPIE Alain .............................................. Pédiatrie COLOMBAT Philippe ......................................... Hématologie, transfusion CONSTANS Thierry ........................................... Médecine interne, gériatrie CORCIA Philippe ................................................ Neurologie COSNAY Pierre .................................................. Cardiologie COTTIER Jean-Philippe ..................................... Radiologie et imagerie médicale COUET Charles.................................................. Nutrition DE TOFFOL Bertrand ........................................ Neurologie DEQUIN Pierre-François .................................... Thérapeutique DESTRIEUX Christophe .................................... Anatomie DIOT Patrice ....................................................... Pneumologie DU BOUEXIC de PINIEUX Gonzague ............... Anatomie & cytologie pathologiques DUCLUZEAU Pierre-Henri ................................. Endocrinologue, diabète, et maladies métaboliques DUMONT Pascal ................................................ Chirurgie thoracique et cardiovasculaire EL HAGE Wissam .............................................. Psychiatrie adultes EHRMANN Stephan ........................................... Réanimation FAUCHIER Laurent ............................................ Cardiologie FAVARD Luc ...................................................... Chirurgie orthopédique et traumatologique FOUQUET Bernard ............................................ Médecine physique et de réadaptation FRANCOIS Patrick ............................................. Neurochirurgie FROMONT-HANKARD Gaëlle ........................... Anatomie & cytologie pathologiques GOGA Dominique .............................................. Chirurgie maxillo-faciale et stomatologie GOUDEAU Alain ................................................ Bactériologie-virologie, hygiène hospitalière GOUPILLE Philippe ............................................ Rhumatologie GRUEL Yves ...................................................... Hématologie, transfusion GUERIF Fabrice ................................................. Biologie et médecine du développement et de la reproduction GUYETANT Serge ............................................. Anatomie et cytologie pathologiques GYAN Emmanuel ............................................... Hématologie, transfusion HAILLOT Olivier ................................................. Urologie HALIMI Jean-Michel ........................................... Thérapeutique HANKARD Régis ................................................ Pédiatrie HERAULT Olivier ................................................ Hématologie, transfusion HERBRETEAU Denis ......................................... Radiologie et imagerie médicale HOMMET Caroline ............................................. Gériatrie LABARTHE François .......................................... Pédiatrie LAFFON Marc .................................................... Anesthésiologie et réanimation chirurgicale, médecine d’urgence LARDY Hubert .................................................... Chirurgie infantile LARIBI Saïd ........................................................ Médecine d’urgence LARTIGUE Marie-Frédérique ............................. Bactériologie-virologie LAURE Boris ...................................................... Chirurgie maxillo-faciale et stomatologie LECOMTE Thierry .............................................. Gastroentérologie, hépatologie LESCANNE Emmanuel ...................................... Oto-rhino-laryngologie LINASSIER Claude ............................................ Cancérologie, radiothérapie MACHET Laurent ............................................... Dermato-vénéréologie MAILLOT François ............................................. Médecine interne

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MARCHAND-ADAM Sylvain ............................... Pneumologie MARRET Henri ................................................... Gynécologie-obstétrique MARUANI Annabel ............................................. Dermatologie-vénéréologie MEREGHETTI Laurent ....................................... Bactériologie-virologie ; hygiène hospitalière MORINIERE Sylvain........................................... Oto-rhino-laryngologie MOUSSATA Driffa .............................................. Gastro-entérologie MULLEMAN Denis ............................................. Rhumatologie ODENT Thierry ................................................... Chirurgie infantile OUAISSI Mehdi .................................................. Chirurgie digestive PAGES Jean-Christophe .................................... Biochimie et biologie moléculaire PAINTAUD Gilles ............................................... Pharmacologie fondamentale, pharmacologie clinique PATAT Frédéric .................................................. Biophysique et médecine nucléaire PERROTIN Dominique ....................................... Réanimation médical, médecine d’urgence PERROTIN Franck ............................................. Gynécologie-obstétrique PISELLA Pierre-Jean ......................................... Ophtalmologie QUENTIN Roland ............................................... Bactériologie-virologie, hygiène hospitalière REMERAND Francis .......................................... Anesthésiologie et réanimation, médecine d’urgence ROINGEARD Philippe ........................................ Biologie cellulaire ROSSET Philippe ............................................... Chirurgie orthopédique et traumatologique ROYERE Dominique .......................................... Biologie et médecine du développement et de la reproduction RUSCH Emmanuel ............................................ Epidémiologie, économie de la santé et prévention SAINT-MARTIN Pauline ..................................... Médecine légale et droit de la santé SALAME Ephrem ............................................... Chirurgie digestive SALIBA Elie ........................................................ Biologie et médecine du développement et de la reproduction SANTIAGO-RIBEIRO Maria ............................... Biophysique et médecine nucléaire SIRINELLI Dominique ........................................ Radiologie et imagerie médicale THOMAS-CASTELNAU Pierre ........................... Pédiatrie TOUTAIN Annick ................................................ Génétique VAILLANT Loïc ................................................... Dermato-vénéréologie VELUT Stéphane ............................................... Anatomie VOURC’H Patrick ............................................... Biochimie et biologie moléculaire WATIER Hervé ................................................... Immunologie PROFESSEUR DES UNIVERSITES DE MEDECINE GENERALE LEBEAU Jean-Pierre LEHR-DRYLEWICZ Anne-Marie PROFESSEURS ASSOCIES MALLET Donatien .............................................. Soins palliatifs POTIER Alain ..................................................... Médecine Générale ROBERT Jean .................................................... Médecine Générale MAITRES DE CONFERENCES DES UNIVERSITES - PRATICIENS HOSPITALIERS BAKHOS David .................................................. Physiologie BARBIER Louise ................................................ Chirurgie digestive BERNARD-BRUNET Anne ................................ Cardiologie BERTRAND Philippe .......................................... Biostatistiques, informatique médical et technologies de communication BLANCHARD Emmanuelle ............................... Biologie cellulaire BLASCO Hélène ................................................ Biochimie et biologie moléculaire CAILLE Agnès .................................................... Biostatistiques, informatique médical et technologies de communication DESOUBEAUX Guillaume ................................. Parasitologie et mycologie DOMELIER Anne-Sophie ................................... Bactériologie-virologie, hygiène hospitalière DUFOUR Diane .................................................. Biophysique et médecine nucléaire FOUQUET-BERGEMER Anne-Marie ................. Anatomie et cytologie pathologiques GATAULT Philippe ............................................. Néphrologie GAUDY-GRAFFIN Catherine ............................. Bactériologie-virologie, hygiène hospitalière GOUILLEUX Valérie ........................................... Immunologie GUILLON Antoine .............................................. Réanimation GUILLON-GRAMMATICO Leslie ....................... Epidémiologie, économie de la santé et prévention HOARAU Cyrille ................................................. Immunologie HOURIOUX Christophe ...................................... Biologie cellulaire IVANES Fabrice ................................................. Physiologie

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LE GUELLEC Chantal ........................................ Pharmacologie fondamentale, pharmacologie clinique MACHET Marie-Christine ................................... Anatomie et cytologie pathologiques PIVER Éric.......................................................... Biochimie et biologie moléculaire ROUMY Jérôme ................................................. Biophysique et médecine nucléaire PLANTIER Laurent ............................................. Physiologie SAMIMI Mahtab .................................................. Dermatologie-vénéréologie TERNANT David ................................................ Pharmacologie fondamentale, pharmacologie clinique ZEMMOURA Ilyess ............................................ Neurochirurgie MAITRES DE CONFERENCES DES UNIVERSITES AGUILLON-HERNANDEZ Nadia ....................... Neurosciences DIBAO-DINA Clarisse ......................................... Médecine Générale LEMOINE Maël .................................................. Philosophie MONJAUZE Cécile ............................................. Sciences du langage - orthophonie PATIENT Romuald ............................................. Biologie cellulaire RENOUX-JACQUET Cécile ............................... Médecine Générale CHERCHEURS INSERM - CNRS - INRA BOUAKAZ Ayache ............................................. Directeur de Recherche INSERM – UMR INSERM 930 CHALON Sylvie .................................................. Directeur de Recherche INSERM – UMR INSERM 930 COURTY Yves ................................................... Chargé de Recherche CNRS – UMR INSERM 1100 DE ROCQUIGNY Hugues .................................. Chargé de Recherche INSERM – UMR INSERM 966 ESCOFFRE Jean-Michel ................................... Chargé de Recherche INSERM – UMR INSERM 930 GILOT Philippe ................................................... Chargé de Recherche INRA – UMR INRA 1282 GOUILLEUX Fabrice .......................................... Directeur de Recherche CNRS – UMR CNRS 7292 GOMOT Marie .................................................... Chargée de Recherche INSERM – UMR INSERM 930 HEUZE-VOURCH Nathalie ................................ Chargée de Recherche INSERM – UMR INSERM 1100 KORKMAZ Brice ................................................. Chargé de Recherche INSERM – UMR INSERM 1100 LAUMONNIER Frédéric ..................................... Chargé de Recherche INSERM - UMR INSERM 930 LE PAPE Alain ................................................... Directeur de Recherche CNRS – UMR INSERM 1100 MAZURIER Frédéric ........................................... Directeur de Recherche INSERM – UMR CNRS 7292 MEUNIER Jean-Christophe ............................... Chargé de Recherche INSERM – UMR INSERM 966 PAGET Christophe ............................................. Chargé de Recherche INSERM – UMR INSERM 1100 RAOUL William ................................................... Chargé de Recherche INSERM – UMR CNRS 7292 SI TAHAR Mustapha .......................................... Directeur de Recherche INSERM – UMR INSERM 1100 WARDAK Claire ................................................. Chargée de Recherche INSERM – UMR INSERM 930 CHARGES D’ENSEIGNEMENT Pour l’Ecole d’Orthophonie DELORE Claire ................................................. Orthophoniste GOUIN Jean-Marie ............................................. Praticien Hospitalier MONDON Karl .................................................... Praticien Hospitalier PERRIER Danièle .............................................. Orthophoniste Pour l’Ecole d’Orthoptie LALA Emmanuelle .............................................. Praticien Hospitalier MAJZOUB Samuel ............................................. Praticien Hospitalier Pour l’Ethique Médicale BIRMELE Béatrice ............................................. Praticien Hospitalier

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SERMENTD’HIPPOCRATE

EnprésencedesMaîtresdecetteFaculté,demescherscondisciples

etselonlatraditiond’Hippocrate,jeprometsetjejured’êtrefidèleauxloisde

l’honneuretdelaprobitédansl’exercicedelaMédecine.

Jedonneraimessoinsgratuitsàl’indigent,

etn’exigeraijamaisunsalaireau-dessusdemontravail.

Admisdansl’intérieurdesmaisons,mesyeuxneverrontpascequis’ypasse,malanguetairalessecretsquimeserontconfiésetmonétatne

servirapasàcorromprelesmœursniàfavoriserlecrime.

RespectueuxetreconnaissantenversmesMaîtres,

jerendraiàleursenfantsl’instructionquej’aireçuedeleurspères.

Queleshommesm’accordentleurestime

sijesuisfidèleàmespromesses.Quejesoiscouvertd’opprobreetméprisédemesconfrères

sij’ymanque.

11

TABLEDESMATIÈRES

Listedestableaux 15

Listedesfigures 16

Listedesabréviations 18

Introduction 19

I.PREMIÈREPARTIE:GÉNÉRALITÉS 20

CHAPITRE1:PHYSIOPATHOLOGIEDESTHROMBOPÉNIESINDUITES

PARL’HÉPARINE 20

CHAPITRE2:TABLEAUCLINIQUEDESTHROMBOPÉNIESINDUITES

PARL’HÉPARINE 21

1.Délaid’apparitiondelathrombopénie 21

2.IncidencedesTIH 22

3.Complicationscliniques 22

3.1Lesthromboses 22

a.Thrombosesartérielles 22

b.Thrombosesveineuses 23

3.2Lesnécroses 23

3.3Lesréactionssystémiques 23

3.4Lesmanifestationshémorragiques 23

CHAPITRE3:TRAITEMENTDESTHROMBOPÉNIESINDUITESPARL’HÉPARINE24

12

CHAPITRE4:DIAGNOSTICDESTHROMBOPÉNIESINDUITESPARL’HÉPARINE26

1.Scoresdeprobabilitéspré-tests 27

2.Diagnosticbiologiquedesthrombopéniesinduitesparl’héparine 28

2.1Lestestsimmunologiques 28

2.1.1Lestestsrapides 28

a.Immunofiltrationsurgel(ID-ParticlegelImmunoassay®BioRad) 28

b.Immunochromatographiesurmembrane(STicExpert®HITStago) 29

c.Testsrapidesautomatisés 29

>HemosIL®HIT-Ab 29

>HemosIL®AcuStarHIT 30

d.Performancesdestestsrapides 30

2.1.2Lestestsimmunoenzymatiquesclasiques 30

a.Différentesciblesantigéniques 31

>ComplexesFP4/H 31

>ComplexesFP4/Polyvinylsulfate(PVS) 31

>ComplexesH/Sulfatedeprotamineavecajoutdelysatplaquettaire31

b.PerformancesdestestsELISA 31

2.2Lestestsfonctionnels 32

a.Lestestsd’agrégationplaquettaire 32

b.LetestHIPA(HeparinInducedPlateletAggregation) 33

c.Letestdelibérationdesérotonineradiomarquée 33

d.Cytométrieenflux 34

e.Performancesdestestsfonctionnels 34

3.Stratégiediagnostiquedesthrombopéniesinduitesparl’héparine 35

CHAPITRE5:ÉVALUATIONEXTERNEDELAQUALITÉDESTESTSELISA 37

13

II.DEUXIÈMEPARTIE:TRAVAILPERSONNEL 39

1.MATÉRIELSETMÉTHODES 39

1.1Anticorpsmonoclonal5B9etgammed’étalonnage 39

1.2LestestsELISA 39

a.LetestZYMUTEST®HIAIgG(HYPHEN®,Neuville-sur-oise,France) 39

1.Dépôtdulysatplaquettaireetfixationdesanticorpshéparine-dépendants 40

2.dépôtdel’immunoconjuguéspécifiquedel’IgGhumaine 40

3.Développementdelaréaction 41

4.Validationtechniqueetinterprétationdesrésultats 41

b.LetestHAT45G®(ImmucorGTIDiagnostics®,Waukesha,USA) 41

1.Fixationdesanticorpsanti-facteur4plaquettairemodifiéparl’héparine 42

2.Dépôtdel’immunoconjuguéanti-IgG 42


4.Validationtechniqueetinterprétationdesrésultats 43

c.LetestASSERACHROM®HPIA–IgG(DiagnosticaStago,Asnièress/seine,France)43

1.Fixationdesanticorpsanti-facteur4plaquettairemodifiéparl’héparine 43

2.Dépôtdel’immunoconjuguéanti-IgG 44


4.Validationetinterprétationdesrésultats 44

1.3Echantillonspatients 46

1.4LecteurdeplaqueELISA 47

2.RÉSULTATS 48

1èrepartie:StandardisationdesdifférentestroussesELISAàl’aidedel’anticorps

monoclonaldeTIH5B9 48

A.Gammesd’étalonnageréaliséesavecl’anticorpsmonoclonal5B9 48

B.Standardisationdesabsorbancesmesuréesaveclesplasmasdespatients 51

14

2èmepartie:StandardisationdelatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGen

conditionsextrêmes 54

A.Variationdelatempérature 54

B.Variationdeladuréed’incubationdel’échantillon 56

C.Variationdutempsd’incubationdel’immunoconjugué 58

D.Variationdutempsd’incubationdusubstrat 60

E.Intérêtdelagammed’étalonnageenAc5B9appliquéàtroiséchantillonsdepatients

63

3.DISCUSSION 65

III.ANNEXES 68

IV.RÉFÉRENCESBIBLIOGRAPHIQUES 70

15

Listedestableaux

TableauI:CaractéristiquescliniquesetbiologiquesdesTIHd’aprèsT.Warkentin(17).

26

TableauII:RésultatsdesEEQdel’échantillonpositifdel’ECATpourlesannées2011à

2013. 38

TableauIII:CaractéristiquesdestestsELISAutiliséspourlarecherched’Achéparine-

dépendants. 45

TableauIV:Tableaurécapitulatifdescaractéristiquesdeséchantillonsutilisés 46

TableauV:Tableaudesabsorbancesmoyennespourchaquepointdegamme

d’étalonnage. 50

TableauVI:Valeursmoyennesd’absorbanceà450nm(Abs450)etd’équivalent5B9

deC1etdelaréférenceHPIAselonlatempératurederéalisationdel’expérimentation.

55

TableauVII:Valeursmoyennesd’absorbanceà450nmetd’équivalent5B9deC1,du

Pool1/5èmeetdelaréférenceHPIAselonletempsd’incubationdel’échantillon. 57

TableauVIII:Valeursmoyennesd’absorbanceà450nmetd’équivalent5B9deC1,du

Pool1/5èmeetdelaréférenceHPIAselonletempsd’incubationdel’immunoconjugué.

59

TableauIX:Valeursmoyennesd’absorbanceà450nmetd’équivalent5B9deC1,du

Pool1/5èmeetdelaréférenceHPIAselonletempsd’incubationdusubstrat. 61

TableauX:Absorbancesà450nmetéquivalent5B9deséchantillonsP12àP14selon

lesdifférentesvariationsdestempsd’incubation. 64

16

Listedesfigures

Figure1:DémarchebayésiennepourlediagnosticdeTIHd’aprèsPouplardetGruel.35

Figure2:DémarchebayésiennepourlediagnosticdeTIHd’aprèsCuker. 36

Figure3:Gammed’étalonnageenAc5B9delatrousseASSERACHROM®HPIA–IgG

(Stago).Moyenne+/-Ecarttype.n=5expérimentations. 49

Figure4:Gammed’étalonnageenAc5B9delatrousseHAT45G®(GTI).Moyenne+/-

Ecarttype.n=5expérimentations. 49

Figure5:Gammed’étalonnageenAc5B9delatrousseZYMUTEST®HIAIgG

(HYPHEN).Moyenne+/-Ecarttype.n=5expérimentations. 50

Figure6:Coefficientsdevariationsinter-essaisselonlaconcentrationenAc5B9. 51

Figure7:AbsorbancedeséchantillonsP1àP7selonlatrousseutilisée. 52

Figure8:Equivalent5B9enμg/mLdeséchantillonsP1àP7selonlatrousseutilisée.53

Figure9:Gammesd’étalonnagedelatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGà

températureambianteetà30°C.Moyenne+/-Ecarttype.n=5expérimentations. 54

Figure10:EchantillonC1etréférenceHPIAenabsorbanceetenéquivalent5B9selon

latempératurederéalisationdel’expérimentation.n=5expérimentations. 55

Figure11:Gammesd’étalonnagedelatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGavec

incubationdespointsdegammesde30minutes,1heureet1h30minutes.Moyenne+/-


Figure12:EchantillonsC1,Pool1/5èmeetréférenceHPIA.Résultatsindiquésen

absorbanceetenéquivalent5B9selonletempsd’incubationdel’échantillon. 57


incubationdel’immunoconjuguéde30minutes,1heureet1h30minutes.Moyenne+/-


Figure14:EchantillonsC1,Pool1/5èmeetlaréférenceHPIAenabsorbanceeten

équivalent5B9selonletempsd’incubationdel’immunoconjugué.n=4

expérimentations. 59


incubationdusubstratde3,5et7minutes. 60

17

Figure16:EchantillonsC1etPool1/5èmeenabsorbanceetenéquivalent5B9selonle

tempsd’incubationdusubstrat.n=3expérimentations. 61

Figure17:Valeursenabsorbanceetenéquivalent5B9deséchantillonsP12,P13et

P14selonlavariationdutempsd’incubationdel’échantillon,del’immunoconjuguéet

dusubstrat.n=1expérimentation. 63

18

ListedesabréviationsAbs450 Absorbanceà450

Ac Anticorps

AMM Autorisationdemisesurlemarché

AVK AntivitamineK

CIVD Coagulationintravasculairedisséminée

CV Coefficientdevariation

ELISA Enzymelinkedimmunosorbentassay

EP Emboliepulmonaire

FacteurXa FacteurXactivé

FP4 Facteur4plaquettaire

FP4/H Facteur4plaquettairemodifiéparl’héparine

HBPM Héparinedebaspoidsmoléculaire

HEPscore HITExpertProbabilityscore

HIPA Heparininducedplateletaggregation

HNF Héparinenonfractionnée

Ig Immunoglobuline

IL10 Interleukine10

INR InternationalNormalisedRatio

NC Nonconnu

PNPP p-nitrophénylphosphate

PRP Plasmaricheenplaquettes

PVS Polyvinylsulfate

SRA Testdelibérationdesérotonineradiomarquée

TCA Tempsdecéphalineactivée

TIH Thrombopénieinduiteparl’héparine

TMB 3,3’,5,5’-Tetraméthylbenzidine

TVP Thromboseveineuseprofonde

ULR Unitédelumièrerelative

19

INTRODUCTION

Lesthrombopéniesinduitesparl’héparine(TIH)sontunecomplicationraremais

potentiellementgravedestraitementsanticoagulantshépariniques,dueàuneréponse

immuneatypiqueàl’héparine.Celle-ciestresponsabled’unesynthèsed’anticorps(Ac)

d’isotypeIgGdirigéscontrelefacteur4plaquettaire(FP4)modifiéparl’héparine

(FP4/H).

LaTIHestunsyndromeclinico-biologiquedontlediagnosticreposesur

l’existencedesignescliniquesévocateursassociésàdestestsbiologiquespermettantde

détectercesAchéparine-dépendantspathogènes.Enpremièreintention,cesAcsont

recherchésparunemétodeimmunoenzymatique.Lorsqu’untestELISAspécifiqueest

réalisé,l’absorbancemesuréepermetderendreunrésultatqualitatifmaiségalement

d’apprécierlaquantitéd’Acanti-FP4/Hencirculation.

Ilexistecependantunegrandevariabilitéinter-essaisdesvaleursd’absorbance

carellessontdépendantesdesconditionsderéalisationdecestestsELISA.

Danscecontexte,l’objectifdemontravailaétéd’évaluers’ilétaitpossiblede

standardiserlesdifférentestroussesELISAspécifiquesdesAcdeTIHenutilisantunAc

monoclonaldéveloppédansnotrelaboratoire.

20

I.PREMIÈREPARTIE:GÉNÉRALITÉS

CHAPITRE1:PHYSIOPATHOLOGIEDESTHROMBOPÉNIESINDUITES

PARL’HÉPARINE

LaTIHestunecomplicationimmunoallergiquedestraitementsparhéparinedueàune

réponseimmunespécifiquedirigéecontrelefacteurplaquettaire4modifiépar

l’héparine.

LeFP4estunechémokinedelafamilledesCXCL4libéréedesgranules∝lorsde

l’activationplaquettaireetquiselieàdessubstancespolyanioniquescommel’héparine.

CetteliaisonentraineunchangementconformationnelduFP4etl’apparitiondenéo-

épitopesquivontinduirelasynthèsed’anticorpsspécifiques.

L’affinitédel’héparineetdespolysaccharidespourleFP4dépendgrandementde

leurlongueuretdeleurdegrédesulfatation(1).L’héparinenonfractionnéeestdece

faittrèsimmunogènepuisqueleslargesfragmentspolysaccharidiquesselient

fortementauxtétramèresdeFP4etmodifientfortementsastructure.Leshéparinesde

baspoidsmoléculaireayantpardéfinitiondesfragmentspluscourtsetunecharge

électronégativeplusfaible,modifientmoinslastructureduFP4etsontdoncmoins

immunogènes.

Laréponseimmuneàl’héparine,lorsqu’elleseproduit,estatypique

Eneffet,ellesecaractériseparl’apparitionconcomitanted’Acanti-FP4/HdeclasseIgM,

IgAetIgG.Lemécanismedecetteréponseimmuneresteenpartieincompris.

Cescaractéristiquessontinhabituellespouruneréponseimmuneprimaireet

pourraientêtreexpliquéesparlefaitquelesmêmesépitopesantigéniquesexpriméspar

leFP4modifiéparl’héparineaientétéformésavanttouteexpositionàl’héparine.

Denombreuxpolysaccharidessulfatésautresquel’héparinecommeles

polysaccharideschargésnégativementprésentsàlasurfacedebactéries(2)peuvent

induiredesmodificationsconformationellesduFP4similairesàceuxinduitspar

l’héparine.DesAcanti-FP4/Hontainsiétémisenévidencechezdespatientssouffrants

deparodontites,infectionsfréquentesduesàdesgermesàGramnégatif.

21

Lesraisonsexpliquantpourquoiseulementunepartiedespatientstraitéspar

héparinesynthétisedesAcanti-FP4modifiéparl’héparineetpourquoiunelarge

proportiondespatientsimmunisésnedéveloppepardeTIHnesontpasentièrement

élucidées.

Desvariationsgénétiquesdupromoteurdel’IL10pourraientavoirunrôleimportant

danslaréponseimmuneassociéeauxtraitementsparhéparineetinfluencerle

développementd’Achéparine-dépendants.(3)

LesAcpathogènessontprincipalementd’isotypeIgG1etleurprésenceàtauxélevéest

associéeàunrisquemajorédeTIH.

LerôledespolymorphismesgénétiquessituéssurlesgènescodantpourFcɣRIIA(42)

ouCD148(43)aégalementétédémontré,expliquantenpartiepourquoiseulement

certainspatientsayantdéveloppésdesAcanti-FP4/Hdéveloppentunethrombopénie

associéeounonàdesthromboses.Eneffet,laTIHestconnuepoursonhautrisquede

complicationthrombotiqueartérielouveineux.LerôlecentraldesAcdeclasseIgG

découledeleurcapacitéàactiverlescellulesparleurrécepteurFc.

LesAcdeTIHpourraientégalementselierauxcellulesendothéliales,auxleucocyteset

auxmonocytes,etentrainerlasynthèsedefacteurtissulairequiestlefacteur

déclenchantprincipaldelacoagulation.(4,5)

CHAPITRE2:TABLEAUCLINIQUEDESTHROMBOPÉNIESINDUITES

PARL’HÉPARINE

1.Délaid’apparitiondelathrombopénie

LaTIHapparaitgénéralementdansles5à14jsuivantl’introductiond’héparine.

Ellesemanifesteparunechutedelanumérationplaquettairesupérieureà40%dela

numérationplaquettaireinitialeouparunenumérationplaquettaireinférieureà100

G/L.(6).

Toutefois,ilexistedescirconstancesd’apparitionretardée,jusqu’à3semaines

aprèsl’introductiondutraitement,enparticulierlorsd’untraitementparhéparinede

baspoidsmoléculaire(HBPM),oud’apparitionprécoce,inférieureà5jours,encasde

traitementhépariniquedanslestroismoisprécédents.(6)

22

2.IncidencedesTIH

Ilestdifficiled’évaluerl’incidenceexactedesTIHenraisondelarelativerareté

decettepathologieetdel’existencedenombreuxparamètresquipeuventmodifiercette

incidence.

Eneffet,lerisquededévelopperuneTIHestplusélevésoushéparinenonfractionnée

(HNF)quesousHBPMavecuneincidencedelamaladiedel’ordrede1à5%avecles

HNFetde0,5%aveclesHBPM(7).CerisquemoindreaveclesHBPMestdûaufaitque

lesfragmentsdefaiblepoidsmoléculaireontuneaffinitéplusfaiblepourlefacteur4

plaquettaireetmodifientmoinssastructuretridimensionnelle(8).Ainsilerisquede

TIHaveclefondaparinux(Pentasaccharide)estquasimentnuletestestiméàmoinsde

0,001%(9).

L’administrationparvoieintraveineuseetl’utilisationd’héparineàdosecurativesont

dessituationsquientrainentunemajorationdurisquedeTIH(10).

LerisquedeTIHvarieégalementselonl’indicationdutraitementparhéparine.Eneffet,

ilestplusélevélorsdechirurgieorthopédiqueprothétiqueoudechirurgiecardiaque

quelorsd’unepriseenchargemédicale(11).

Ilsembleégalementquelesfemmessoientplusàrisquequeleshommes.Cephénomène

estretrouvédansdenombreusespathologiesauto-immunes(10).

3.Complicationscliniques

3.1Lesthromboses

Lasurvenued’unethromboselorsd’untraitementhépariniquedoitfaire

suspecteruneTIHmêmeenl’absencedethrombopénie.

Lesthrombosessontobservéesdansprèsd’uncassurdeux.

LesthrombosesartériellessonttypiquesdelaTIHmaissontmoinsfréquentesqueles

thrombosesveineuses.(12,13)

a.Thrombosesartérielles

Lesthrombosesartériellesontétédécritespourlapremièrefoisen1979par

TowneJBetcoll.Ils’agitd’unthrombusricheenplaquettes,enfibrineetenleucocytes,

d’aspectblanchâtremacroscopiquementd’oùsonnomde«WhiteClotSyndrome»ou

«Syndromeducaillotblanc»(14).

23

Cesthrombosestouchentpréférentiellementl’aorteetlecarrefouriliofémoral,donnant

lieuàdesischémiesdesmembresinférieurs,maiségalementlesartèrescérébralesetles

artèrescoronairesresponsablesd’accidentvasculairecérébrauxischémiqueset

d’infarctusdumyocardepouvantengagerlepronosticvitaldupatient.(11).

CesévènementsthrombotiquesartérielsexpliquentlamortalitéélevéedesTIH.

b.Thrombosesveineuses

Lesthrombosesveineusesreprésententlescomplicationsthromboemboliques

lesplusfréquemmentobservéesavecenpremièrelignelesthrombosesveineuses

profondes(TVP)(50%descas)associéesounonàuneemboliepulmonaire(EP)(25%

descas).

LesTVPsontleplussouventproximalesetconcernentprincipalementlesveinesdes

membresinférieurs,laveinecave,lesveinessurrénaliennesetlesveinescérébrales.

L’existencedethrombosesveineusesinfracliniquedoitfaireréaliseruneéchographie

dopplerdesmembresinférieursdefaçonsystématiquecheztoutpatientsuspectdeTIH

etlorsdetoutdiagnosticdeTIH.(15).

3.2Lesnécroses

Desnécrosescutanéesaupointd’injectiondel’héparineontétédécriteset

peuventaccompagnerunecoagulationintra-vasculairedisséminée(CIVD).

3.3Lesréactionssystémiques

Dessignesdechocsystémiquepeuventsurvenirdanslesminutessuivant

l’injectionintraveineused’héparine:fièvre,détresserespiratoireaigüe,douleurs

abdominales,flush,tachycardie,céphalées,diarrhées,hypertension.

Cesépisodess’accompagnentleplussouventd’unechutebrutaleetconcomitantedela

numérationplaquettairedevantfairesuspecteruneTIH.

3.4Lesmanifestationshémorragiques

LesTIHsontunmodèleoriginaldethrombopéniemédicamenteusecarellessont

exceptionnellementassociéesàdeshémorragies.

Onretrouverarementdessaignementsaupointd’injection,despétéchiesoudes

ecchymosessuperficielles.

24

CHAPITRE3:TRAITEMENTDESTHROMBOPÉNIESINDUITESPAR

L’HÉPARINE

EnFrance,lesmédicamentsdisponiblesetautoriséspourletraitementd’uneTIH

sontledanaparoïdesodique(Orgaran®)etdepuis2011,l’argatroban(Arganova®).Le

fondaparinux(Arixtra®)quiinhibesélectivementlefacteurXactivé(Xa),n’apas

l’autorisationdemisesurlemarché(AMM)pourcetteindicationmaissonutilisation

peutnéanmoinsêtrediscutéedanscertainscas.

Ladécisionessentielleestl’arrêtdetoutehéparinothérapiesilediagnosticest

fortementsuspecté,etlamiseenrouted’untraitementanticoagulantsubstitutifen

raisondutrèsfortrisquethrombotiqueassociéauxTIH.

Lechoixdutraitementsubstitutifseferaaprèsavoirvérifiélafonctionrénale,la

fonctionhépatiqueainsiquelepoidsdupatient.

Ledanaparoïde(Orgaran®)estunmélanged’héparanesulfate,dechondroïtine

sulfateetdedermatanesulfate,inhibantessentiellementlefacteurXaenprésence

d’antithrombine,ettrèsfaiblementlathrombine.

CommelesHBPM,ilestéliminéparlesreinsetn’aquepeud’effetsurletempsde

céphalineactivée(TCA).Unrisquedesurdosageexistedonc,notammentchez

l’insuffisantrénalchezlequelilestdoncpréférabledeprescrirel’argatroban.

Lasurveillancedel’activitéanti-Xasousdanaparoïdeestrecommandéesurtoutsi

lafonctionrénaleestaltéréeetchezlespatientsdepoidsextrêmes.L’activitéanti-Xa

mesuréeparuneméthodespécifiqueseraévaluéeaprèslebolusetadaptationdela

dosehoraireetseramaintenueentre0,5et0,8U/mL.

IlexistederarescasdeTIHpersistantessousdanaparoïdesodiquedûàla

présencederéactioncroiséeaveclesAcanti-FP4.Ilfautlasuspecterenl’absencede

correctiondelathrombopénieà72hdetraitementouencasd’aggravationdecelle-ci.

L’argatroban(Arganova®)estuninhibiteurdirectdelathrombinequiest

éliminéparlefoie.Ilestdonccontre-indiquéencasd’insuffisancehépatocellulaire

sévère(scoredeChild-Pugh≥3).

Ilestadministréparvoieparentéraleàlaposologiede2μg/kg/min.Ellepeutêtre

diminuéeà1voire0,5μg/kg/minencasdecomorbiditéoudechirurgierécente.

25

LasurveillanceesteffectuéeparmesureduTCA2haprèsadaptationdesdosesavecune

ciblecompriseentre2et3.

Lefondaparinux(Arixtra®)n’apasl’AMMdanscetteindicationmaispourraêtre

utiliséàdosecurative(7,5mg/j)enparticulierencasdegrossesse(16)ousile

danaparoïdesodiqueestindisponible.

Ilestparcontrecontre-indiquédansl’insuffisancerénalesévère.

Sonsuiviseraeffectuéparlamesured’uneactivitéanti-Xaspécifique.

UnrelaisparunantivitamineK(AVK)estréalisédèsquepossibleàcondition

quelanumérationplaquettairesesoitcorrigée.

Laciblethérapeutiquedel’INRestcompriseentre2et3.

26

CHAPITRE4:DIAGNOSTICDESTHROMBOPÉNIESINDUITESPAR

L’HÉPARINE

Lathrombopénieinduiteparl’héparineestunsyndromeclinico-biologiquedontlediagnosticreposesurunesymptomatologieévocatricedelamaladieetlamiseen

évidenced’Acanti-FP4activantlesplaquettesenprésenced’héparine(17).

LessignescliniqueslesplusévocateurssontreprisdansletableauI.

TableauI:CaractéristiquescliniquesetbiologiquesdesTIHd’aprèsT.Warkentin(17).

Critèrescliniques Critèresbiologiques

Thrombopénieoudiminutiondeplusde

40%delanumérationplaquettaire

associéeounonà:

A.Thromboseveineuseprofonde

Emboliepulmonaire

Thromboseveineusecérébrale

Hémorragiebilatéraledessurrénales

B.Thromboseartérielle

Ischémieaiguëdesmembresinférieurs

AVC

Infarctusdumyocarde

C.Nécrosescutanéesaupointd’injection

D.Réactionssystémiquesaprèsinjection

E.CIVD

A.Testd’activationplaquettairepositif

B.Testantigéniquepositif

Ainsi,unpatientquidéveloppedesAchéparine-dépendantssansthrombopénieni

complicationcliniqueprésentesimplementuneséroconversion.

Demême,unpatientdontlessymptômessontévocateursd’uneTIHmaischezquiles

testsbiologiquessontnégatifs,nedoitpasêtreconsidérécommeayantuneTIH.

27

1.Scoresdeprobabilitéspré-tests

Deuxscoresclinico-biologiquesontétédécritsafind’aideràladémarche

diagnostiqued’unethrombopénieinduiteparl’héparine.

Lepluslargementappliquéestlescoredes4T’s(Thrombocytopenia,Timing,

ThrombosisetoThercauseofthrombocytopenia)élaboréparT.Warkentin(Annexe1).

Cescoresebasesur4paramètres:

-LaprofondeurdelaThrombopénie.

-Sondélaid’apparitionaprèsl’introductiondel’héparine.(Timing)

-Lasurvenueoul’extensiond’uneThrombose.

-L’existenced’autrescausespossiblesdethrombopénie.(oThercause)

Ilattribuedespoints(0,1ou2)pourchaqueitemetlasommedespointsde

chaqueitempermetdedéterminer3niveauxderisquededévelopperuneTIH:

-FaiblerisquedeTIHpourlesscores≤3,

-RisqueintermédiairedeTIHpourlesscoresde4ou5,

-RisqueélevédeTIHpourlesscores≥6.

Lavaleurprédictivenégatived’unscoreinférieurouégalà3estde99,8%(18),

cequipermetd’exclurelasurvenued’uneTIHsansréaliserd’examenbiologique

complémentaire.(19)

Lavaleurprédictivepositived’unscoresupérieurouégalà4estde14%cequi

estinsuffisantetnécessitelaréalisationdetestsbiologiquespourconfirmerouinfirmer

lapathologie.

GrueletPouplardontmontréquelescoredes4T’sn’estpasapplicableaprès

chirurgiecardiaque.Eneffet,enpost-opératoired’unechirurgiecardiaqueavec

circulationextra-corporelle,ilesttrèsfréquentderetrouverunethrombopénieetcette

thrombopéniepeutperdurerpendantplusieursjours.Ilsontainsimontréquel’étudedu

profild’évolutiondelanumérationplaquettaireaprèschirurgierestel’outilleplusfiable

pouridentifierlespatientsàrisquedeTIH(20).

Afind’améliorerlaspécificitéduscorepré-test,Cukeraproposéen2010,un

nouveauscorenomméscoreHEP(HITExpertProbability)(21)(Annexe2).

Cescorereposesurhuitcritères:

-L’amplitudedelachutedelanumérationplaquettaire,

-Ledélaid’apparitiondelathrombopénie,

-Lenadirdelanumérationplaquettaire,

28

-Lamiseenévidenced’unethrombose,

-Laprésencedenécrosecutanée,

-Lasurvenuedesaignements,

-L’existenced’uneréactionsystémiqueàl’injectiond’héparine,

-Larecherched’autrescausespossiblesdeTIH.

L’utilisationdecescoreserévèlefastidieusecarilnécessitederépondreà

beaucoupd’itemsdontilestparfoisdifficilederecueillirlesinformations.Deplus

aucunevaleurseuiln’aétédéfiniepourdiscriminerlaprobabilitédeTIH.

Uneseuleétuderéaliséesurunnombrelimitédepatients(47casdeTIH

suspectée)aétéàcejourpubliéeetnemontrepasdedifférenceentermesde

performanceentrecesdeuxtests.(22).

2.DiagnosticbiologiquedesTIH

Deuxtypesdetestssontdisponiblespourmettreenévidencelaprésenced’Ac

héparine-dépendants:

-LestestsimmunologiquesquidétectentlafixationdesAchéparine-dépendantssurla

ciblesantigénique.

-Lestestsfonctionnelsquidémontrentl’aptitudedecesAcàactiverlesplaquettesen

présenced’héparine.

2.1.Lestestsimmunologiques

Parmilestestsimmunologiques,nousdevonsdissocierlestestsrapidesdestests

classiquesELISA.

2.1.1Lestestsrapides

Lestestsrapidessontdestestsunitairesadaptésàundiagnosticd’urgence.Ils

peuventêtreeffectuésdanstousleslaboratoiresnonspécialisésetpermettentde

rendreunrésultatqualitatif(positif,négatif,douteux)enmoinsd’uneheureaprèsle

prélèvementsanguin.CestestsnepermettentpaslaquantificationdesAc.

a.Immunofiltrationsurgel(ID-ParticlegelImmunoassay®BioRad)

Cetestestbasésuruneimmunofiltrationsurgel.

DesbillesdelatexrecouvertesdeFP4/Hsontincubéesavecleplasmaoule

sérumdupatientsuspectdeTIH.Aprèscentrifugationdudispositif,lesbillesdelatex

29

sontretenuesàlasurfacedugellorsquedesAcanti-FP4/Hsontprésentsdansleplasma

depatientsoutombentaufonddupuitsenl’absenced’Ac.

b.Immunochromatographiesurmembrane(STicExpert®HITStago)

LeSticExpert®HIT(Stagodiagnostica,Asnières,France)estuntest

immunochromatographiquesurmembraneconçupourladétectionqualitative

spécifiquedesIgGdirigéscontrelescomplexesPF4/Hdanslesérumouleplasma

humain.LesAcantiFP4/HdupatientsefixentauxcomplexesmacromoléculairesFP4/H

biotinilésprésentsdansletamponderéaction.CescomplexesAcanti-FP4/H/Ag

migrentlelongdelamembraneetentrainentaveceuxdesnanoparticulesd’or

recouvertesd’unAcanti-biotine.

CesnouveauxcomplexesAcanti-FP4/H/complexesH/FP4/nanoparticulesd’orsont

ensuiteimmobilisésauniveaudelalignetestsensibiliséepardesAcantiIgGhumaines.

Lesnanoparticulesd’orenexcèscontinuentleurmigrationàtraverslamembraneetse

retrouventcapturéesauniveaudelalignetémoin(C)pardesanticorpsspécifiques.Une

lignebienvisibleapparaîtaprèsuntempsd’incubationde10minutes.

c.Testsrapidesautomatisés

Apparusen2010,cestestsimmunoenzymatiquesprésententl’avantaged’être

entièrementautomatiséesetontundélaideréponsedel’ordrede30minutesaprès

obtentionduplasmaquandlestechniquesmanuellesdetypeELISAdemandent

approximativement3h.Deplus,leurutilisationpeutêtreenvisagéesimplementpourun

seuléchantillonalorsqu’onpréfèreratravaillersuruneséried’échantillonsdepatients

pourlestechniquesELISA.

Cesontdestestsquantitatifsdontlerésultatestrenduenunitésdelumièrerelative

(RelativeLightUnitRLU),proportionnelleàlaquantitéd’Acanti-FP4/Hprésentsdansle

plasma.

Leurseuildepositivitéestfixéà1RLU/mL.(23).

Cependant,leurmiseenœuvrerequiertdeposséderunautomatedetypeAcLTOPou

AcLAcuStardufabricantWerfen.

2troussessontdisponibles:

>HemosIL®HIT-Ab

LekitHemosIL®HIT-Ab(PF4-H)estundosageimmunologiqueautomatisésur

billedelatex.UnanticorpsmonoclonalmimantlesanticorpshumainsdeTIHest

30

adsorbésurlesparticulesdelatex(24).EnprésencedecomplexesFP4/Polyvinylsulfate

etdeplasmadepatient,uneréactiond’agglutinationcompétitivesemetenplace.

L’importancedel’agglutinationestinversementproportionnelleàlaconcentration

d’anticorpsanti-FP4/Hprésentsdansl’échantillonetestdéterminéeenmesurantla

diminutiondelalumièretransmisedueàlaformationd’agrégats.

>HemosIL®AcuStarHIT

LatrousseHemosIL®AcuStarHITestuntestimmunologiqueen2étapesqui

utiliseunedétectionenchimiluminescence.Dansunpremiertemps,lePF4complexéau

PVSadsorbésurlesparticulesmagnétiquespeutcapturer,s’ilssontprésents,lesAc

anti-FP4/Hduplasmadupatient.Aprèsuneincubationpuisséparationdesparticules

magnétiquesetlavage,untraceurconstituéd’unAcanti-Ighumainemarquéà

l’IsoluminolestajoutéaumilieuréactionneletsefixesurlesAcanti-PF4/Héparine

dépendantscapturéssurlesparticules.Aprèsunesecondeincubationetséparationdes

particulesmagnétiques,laréactiondechimiluminescencesedéveloppeetestmesurée

parunsystèmeoptique.LesULRssontdirectementproportionnellesàlaconcentration

d’Anti-PF4/Héparinedel’échantillon.

Les2kitsréactifs:HemosIL®AcuStar-AbetHemosIL®AcuStar-IgGdiffèrentseulement

parl’isotypedesAcantiFP4/Hreconnus.LepremierestdirigécontrelesIgG,AetM,

alorsquelesecondestdirigéspécifiquementcontrelesIgG.

d.Performancesdestestsrapides

Lesvaleursprédictivesnégativesdestestsrapidessontdel’ordrede100%cequi

permetd’exclurelediagnosticdeTIHencasdenégativitédutest.

Néanmoins,leursvaleursprédictivespositivessontde:45%pourlePaGIA,42%pour

l’HemosIL®AcuStar-Ab,66%pourleSTICexpertet71%pourl’HemosIL®AcuStar-IgG

cequiestinsuffisantpourconfirmeraveccertitudelediagnosticdeTIH(25).Ilenestde

mêmepourHemosIL®HIT-Abpourlequelilestretrouvéunevaleurprédictivepositive

de45,5%.(26)

Ainsi,toutrésultatpositifoudouteuxnécessitelaréalisationd’untest

immunoenzymatiquepermettantd’évaluerlaconcentrationenAcanti-FP4/H.(19)

2.1.2Lestestsimmunoenzymatiquesclassiques

LestestsimmunoenzymatiquesELISA(Enzymelinkedimmunosorbentassay)

permettentladétectionetla«quantification»d’AcantiPF4modifiésparl’héparine.

31

CestroussesdiagnostiquespeuventêtrepolyspécifiquesetdétecteràlafoislesIgG,IgA

etIgMouspécifiquesdesIgG.Lesrecommandationsactuellespréconisentd’utiliserun

testspécifiquedesIgG,puisquecesontlesseulsanticorpspathogènes.

Cestechniquessontàlafoisqualitatives,signantlaprésenceoul’absenced’anticorpset

quantitativespuisquelamesuredel’absorbanceestcorréléeàlaconcentrationenAc

anti-FP4/Hprésentschaquepuits.Leurréalisationnécessiteuniquementunlecteurde

plaqueELISA.Ledélaiderendudurésultatestdel’ordrede3à4haprèsréceptiondu

prélèvement.

IlexistedifférentestroussesELISAsurlemarché,quidiffèrentparleurcible

antigénique.

a.Différentesciblesantigéniques

>ComplexesFP4/H

LatrousseASSERACHROM®HPIAIgGdeSTAGOutilisedesplaquesELISA

sensibiliséesavecdescomplexesFP4/H.

>ComplexesFP4/Polyvinylsulfate(PVS)

LatrousseHAT45G®(LifecodesImmucor)utilisedesplaquessensibiliséespar

duFP4/polyvinylsulfate(FP4/PVS).LePVS,chargéélectronégativement,mime

l’héparineetinduitàlasurfaceduFP4desnéo-antigènesreconnusparlesAcdeTIH

présentsdansleplasmaoudusérum.

>ComplexesH/Sulfatedeprotamineavecajoutdelysatplaquettaire

LatrousseZYMUTEST®HIAIgGdeHYPHENn’utilisepaslefacteur4

plaquettairemodifiécommecibleantigéniquecequiladifférenciedesautrestrousses

commercialisées.Lesmicroplaquessontsensibiliséespardel’héparinefixéepardu

sulfatedeprotamine.LeFP4estapportésousformeliquideparunlysatplaquettaireet

sefixeàl’héparineprésenteaufonddespuits.LesAcanti-FP4/Hreconnaissentalorsle

complexesulfatedeprotamine/Héparine/FP4.

b.PerformancesdestestsELISA

LestestsELISApolyspécifiquesetspécifiquesdesIgGontuneexcellente

sensibilitépuisquecelleciestsupérieureà95%.Néanmoinsleurspécificitéreste

médiocreets’établitautourde85%(27).

32

Ilestrecommandéd’utiliseruntestspécifiquedesIgG.Eneffet,ceuxciprésententune

meilleurespécificitésanspertedesensibilitéetleurvaleurprédictivepositiveestbien

meilleurequepourlestestspolyspécifiques(28).

T.Warkentinaproposé(29)demodifierleseuildepositivitédutestELISAetde

l’augmenteràuneabsorbancesupérieureouégaleà1afind’augmentersaspécificité.De

nombreusesétudesmontrentquecelapermeteneffetd’augmenterlaspécificitésans

pertedesensibilitémaisellesonttoutesétéeffectuéesavecuneseuletrousse

commercialisée(GTI)ouavecdestestsELISA«maison».D’autresétudesseraientdonc

nécessairesavecleskitscommercialiséspard’autresfabricantsafindepouvoirvalider

cetteproposition.(30,31).

EnraisondelatrèsbonnesensibilitédestestsELISA,lorsqueceluiciestnégatif,

lediagnosticdeTIHpeutêtreécarté.Enrevanche,siletestELISAestpositif,la

pathogénicitédesanticorpsdétectésdoitêtredémontréeetnécessitelaréalisationd’un

testd’activationplaquettaire.

2.2Lestestsfonctionnels

Lestestsfonctionnelsd’activationplaquettairesontlesseulscapablesd’affirmer

lediagnosticdeTIHetimpliquentl’utilisationdeplaquetteshumainesdesujetssains.

Dufaitdeleurcomplexitédemiseenœuvre,ilsnesontréalisésquedansdescentres

spécialiséscequienfaitdestestspeucompatiblesavecl’urgence.

Lepremieràavoirétémisaupointestletestd’agrégationplaquettaireàlafindes

années70.Letestdelibérationdesérotonineradiomarquée,élaboréparSheridanen

1986,estdevenule«goldstandard»dudiagnosticfonctionneldelaTIH.Afinde

s’affranchirdelasérotonineradiomarquée,Greinacheramisaupointunenouvelle

méthoded’agrégationplaquettaireréalisésurplaquetteslavéesenmicroplaqueELISA,

letestHIPA(Heparininducedplateletaggregation).

Plusrécemment,destechniquesdecytométrieenfluxontétédéveloppéesmaissont

encoremalstandardisées.

a.Lestestsd’agrégationplaquettaire

Lestestsd’agrégationplaquettairesontréaliséssurduplasmaricheen

plaquettes(PRP)etmettentenévidenceuneagrégationdesplaquettesdetémoinssains

induiteparleplasmadupatientenprésencedeconcentrationsvariablesd’héparine.

33

Lavariabilitéderéponsedesplaquettesd’unsujetsainauxAcdeTIHnécessitede

sélectionnerlesdonneursetdetesterlesplaquettesd’aumoins5donneursdifférents

avantdepouvoirconclurequeletestestnégatif(32).Labonneréponsedesplaquettes

estévaluéeentestant,lorsdechaquesérie,l’agrégabilitédesplaquettesaucollagèneet

entestantégalementleplasmad’unpatientconnupouravoirdesAcdeTIH.Demême

ons’assureradel’absenced’agrégabilitéspontanéeenl’absenced’héparine.

Letestestconsidérépositifsionmetenévidenceuneagrégationplaquettaireavecdes

concentrationsfaiblesd’héparine,voisinesdecellesutiliséesenthérapeutique(0,1à0,5

UI/mL).Pointcapital,cetteagrégationdoitêtreinhibéepourdefortesconcentrations

d’héparine(10à100UI/mL).

b.LetestHIPA(HeparinInducedPlateletAggregation)

LetestHIPA,élaboréparGreinacheren1991(33),utiliselesplaquetteslavéesde

quatredonneurssains.L’utilisationdeplaquetteslavées,commepourletestde

libérationdesérotonineradiomarquéepermetd’augmenterlasensibilitédutestmais

ajouteunedifficultétechnique.Lesplaquettessontincubéesdanslespuitsd’uneplaque

ELISAnonsensibiliséeaveclesérumdupatientsoitenprésenced’untampon(témoin

négatif),d’uneconcentrationthérapeutiqued’héparine(0,1à0,5UI/mL)etenfinen

présenced’uneforteconcentrationenhéparine(10ou100UI/mL).Desagitateurs

magnétiquessontutiliséscommesourcesdeforcesdecisaillementsetlaformation

d’agrégatsplaquettairesestdéterminéevisuellementtouteslescinqminutes.

Laduréedutestestdetrenteminutesetletestestconsidérépositifsil’onretrouveune

agrégationplaquettaireauxconcentrationsthérapeutiquesenhéparinechezaumoins

deuxdonneursetenl’absenced’agrégationauxfortesconcentrationsd’héparine.

c.Letestdelibérationdesérotonineradiomarquée

Cetteméthodeestbaséesurlalibérationducontenudesgranulesdenseslors

d’uneactivationplaquettaire.Lesplaquettesd’unsujetsainsontmarquéesavecdela

sérotonineradiomarquéeau14Cquis’incorporepassivementdanslesgranulesdenses.

Aprèslavagedesplaquettes,celles-cisontincubéesenprésenced’héparineàdifférentes

concentrationsetdeplasmadepatient.

Laprésenced’Acpathogènesactivateursinduituneactivationdesplaquettesavec

libérationducontenudesgranulesdanslesurnageant.

34

Laradioactivitéainsilibéréeseramesurée.

Lesrésultatssontexprimésenpourcentagedelibérationdesérotonine.Lecritèrede

positivitéestunpourcentagedelibérationsupérieurà20%pourdefaibles

concentrationsd’héparine(0,1et1UI/mL)etunpourcentagedelibérationinférieurà

20%enprésenced’uneforteconcentrationd’héparine(10ou100UI/mL)ainsiqu’en

absenced’héparine(34).

d.Cytométrieenflux

Cetestestbeaucoupmoinsstandardiséetutiliséseulementparquelqueséquipes

(35).Lacytométrieenfluxdétecteuneaugmentationd’expressiondeprotéines,

marqueursd’activationplaquettaire,commelap-selectine,grâceàunanticorps

radiomarqué(anti-CD62Ppourlap-selectine),enprésenced’héparineàune

concentrationpharmacologique(0,2à0,3UI/mL)ouélevée(100à200UI/mL).

e.Performancesdestestsfonctionnels

Lestestsfonctionnelsdoiventsystématiquementêtreréalisésenprésenced’au

moinsdeuxconcentrationsdifférentesd’héparine.L’unedoitêtreprochedecelles

obtenuesenthérapeutique(0,1à1UI/mL)etdoitpermettred’induireuneactivation

plaquettaire.L’autreconcentrationd’héparineestplusélevée(10ou100UI/mL)etdoit

inhiberl’activationplaquettaireprécédemmentobtenuepourdefaiblesconcentrations

d’héparine.Cetteinhibitionpourdefortesconcentrationsd’héparineestprimordiale

pourmaintenirlaspécificitédutest.LeSRAestletestquipossèdelaspécificitélaplus

élevée,100%,ainsiquelameilleurevaleurprédictivepositive(36).

Lestestsd’agrégationplaquettaireontunebonnespécificité,prochede100%,maisune

sensibilitépouvantvarierde39à81%selonlaréactivitédesplaquettestestées(37).

Lestechniquesdecytométrieenfluxsontpeuutilisées.Plusieursétudesretrouventdes

performancesprochesdecellesdesautrestestsfonctionnelstoutenrestantunpetitpeu

inférieures(35).

35

3.Stratégiediagnostiquedesthrombopéniesinduitesparl’héparine

PouplardetGruelontproposésunalgorithmedécisionnelbasésurunedémarche

bayésienne(32)quiassocielescoredes4T’saveclesrésultatsdesdifférentstests

biologiques(figure1).

Figure1:DémarchebayésiennepourlediagnosticdeTIHd’aprèsPouplardetGruel(32).

36

Commesoulignésurcetalgorithme,3niveauxdeconclusionssontpossibles:

-TIHexclue

-TIHcertaine

-TIHnonconfirmée

Seloncetalgorithme,lesauteursprennentenconsidérationlavaleurdel’absorbanceet

distinguentlesabsorbancesinférieuresà1,cellescomprisesentre1et2etles

absorbancessupérieuresà2.

Lavaleurabsoluedeladensitéoptiquemesuréelorsdelaréalisationd’untestELISAde

diagnosticdeTIHesteneffetunedonnéetrèsimportantepourl’interprétationdutest.

AinsiCukerproposeuneautredémarchebayésienne(38)enintégrantàlafoislescore

des4T’setladensitéoptiquemesuréeenELISAaveclekitHAT45®polyspécifiquepour

diagnostiqueruneTIH.(Figure2).

Figure2:DémarchebayésiennepourlediagnosticdeTIHd’aprèsCuker(38).

37

Cettedémarcheaboutitégalementàtroisconclusionsclinico-biologiques:

-LaTIHpeutêtreexclueetl’héparinepeutêtrepoursuivie.

-LaTIHresteincertaineetilestrecommandéd’arrêterl’héparine.Untest

fonctionneldoitêtreréalisépourconfirmerouinfirmerlediagnostic.

-LaTIHestconfirméeetl’héparinedoitêtrearrêtéeimmédiatement.

Cetalgorithmen’aétéàcejourvalidéparaucuneétudeprospectiveetiln’estpas

certainqu’ilsoitapplicableauxdeuxautrestroussesELISAcommercialisées.

Deplus,ilestrecommandéd’utiliserunetrousseELISAspécifiquedesIgGcequin’est

paslecasdecetravail.

CHAPITRE5:ÉVALUATIONEXTERNEDELAQUALITÉDESTESTSELISA

L’ECATFoundationestunorganismeindépendantnéerlandaispermettantaux

laboratoiresquilesouhaitentd’évaluerleurpratique.

ConcernantladétectiondesAcanti-FP4/H,lesexercicesontlieuunefoisparanavec

l’envoisimultanédedeuxéchantillons.

Lesrecommandationsdecetorganismesont:

-d’utiliserunkitnerecherchantquelesIgGplutôtquelesIgG,AetMafin

d’augmenterlaspécificitédutestsansenaltérersasensibiité.Decefait,ondiminuele

risquedefauxpositif.

-debienfaireapparaîtresurlecompterendubiologique,lavaleurabsoluede

l’absorbancemesuréelorsdelaréalisationd’untestELISAcardenombreusesétudes

ontdémontréquelerisquedeTIHétaitfortementcorréléàl’absorbance.

Pourunmêmeéchantillonpositif,lesvariationsinter-essaissontimportantesquelque

soitlatrousseutiliséeavecdescoefficientsdevariations(CV)allantde16à39%.Les

résultatsdesexercices2011–2012et2013sontreprésentésdansletableauII.

38

TableauII:RésultatsdesEEQdel’échantillonpositifdel’ECATpourlesannées2011à2013

(39)

Pourunmêmekit,ilestintéressantdenoterquelesCVpeuventvarierdemanière

importanted’uneannéeàl’autreetqu’aucunetendanced’améliorationdesCV

n’apparaîtaufildesannées.

CommetouslestestsELISA,lesELISAanti-FP4sonttrèsdépendantsdes

conditionsderéalisationetenparticulierdelatempératuredelapièceoùilssont

effectuésainsiquedurespectdestempsd’incubationsdel’échantillon,de

l’immunoconjuguéetdusubstrat.

Acejour,aucunestandardisationdestroussesn’estproposéeetlacorrélationdes

absorbancesd’unetrousseàl’autren’ajamaisétéétudiée.Chaquekitpossèdeun

contrôlepositif,uncontrôlenégatifetunseuildepositivitéquiestfixepourlestrousses

GTIetHYPHENetvariablepourlatrousseSTAGO.

Nousavonsdéveloppéaulaboratoireunanticorpsmonoclonal5B9quimime

parfaitementlesAcdeTIH.CetanticorpsestuneIgG1anti-FP4/Hconstituéd’unechaine

légèremurine,d’unechainelourdechimériquedontlapartievariableestmurine,et

d’unepartieconstantehumaine.Ilestcapabledeselierdefaçonspécifiqueaux

complexesFP4/Halorsqu’iln’interagitquetrèsfaiblementavecleFP4seul.Ilest

égalementcapabled’induireuneagrégationplaquettairehéparine-dépendante,

entièrementinhibéeparl’Acanti-FcɣRIIA.

Danscecontexte,nousavonscherchés’ilétaitpossibled’étalonnerlestrousses

ELISAanti-FP4enutilisantcetAcmonoclonalcommeetenexprimantlesrésultatsen

équivalent5B9afind’homogénéiserlesrésultatsd’unetrousseàl’autre.

39

II.DEUXIÈMEPARTIE:TRAVAILPERSONNEL

1.MATÉRIELSETMÉTHODES

1.1.Anticorpsmonoclonal5B9etgammed’étalonnage

Afinderéaliserunegammed’étalonnageavecl’anticorpsmonoclonal5B9,nous

sommespartid’unesolutionmèred’Ac5B9à1mg/mLcongeléeà-80°C.

Ladécongélations’estfaitrapidementenmettantl’aliquot5minutesaubainmarieà

37°Cetnousavonsutiliséunnouvelaliquotd’Ac5B9àchaqueexpérimentationafin

d’éviterlescyclesdedécongélation/congélationpouvantnuireàlaqualitédel’Ac.

Nousavonsréaliséensuiteunedilutioninitialedel’Ac5B9au1/100èmedansdudiluant

échantillonpropreàchaquetroussecommercialeafind’obteniruneconcentration

initialede10µg/mL.Enfin,desdilutionsencascadeaudemiontétéréaliséesen‘diluant

échantillon’jusqu’àuneconcentrationfinalede0,32µg/mL.

Notregammed’étalonnagecomprenaitdonc,pourchaqueexpérimentation,les

sixpointsdegammesuivants:0,32–0,63–1,25–2,5–5-10µg/mL.

1.2.LestestsELISA

LestestsELISAontétéréalisésavectroistroussescommercialiséesenFrance

pourlarecherched’anticorpshéparine-dépendants.

Ilssedistinguententreeuxparleurcibleantigénique.

a.LetestZYMUTEST®HIAIgG(HYPHEN®,Neuville-sur-oise,France):

Cibleantigénique:Sulfatedeprotamine/Héparine+lysatplaquettaire

LarecherchedesanticorpsdeTIHétaitréaliséeaulaboratoireavecdestrousses

prêtesàl’emploietcontenant:

• 12barrettesde8puits,sensibiliséespardel’héparinenonfractionnée,

biologiquementdisponible,saturée,stabilisée,etemballéedansunsachet

aluminiumenprésenced’undéshydratant.

• 2flaconsde50mLdediluantéchantillon,prêtsàl’emploi.

• 3flaconsdecontrôlepositiflyophilisés,àreconstituerpar1mLdediluant

échantillonafind’obtenirlecontrôlepositifprêtàl’emploi.

40

• 3flaconsdecontrôlenégatiflyophilisés,contenantduplasmahumainnormal

dilué.Aprèsreconstitutionavec1mLdediluantéchantillon,lecontrôlenégatif

étaitprêtàl’emploi.

• 3flaconsdelysatplaquettairelyophilisé.Areconstituerpar2mLd’eaudistillée,

afind’obtenirleréactifprêtàl’emploi.

• 3flaconsd’immunoconjugué(anticorpspolyclonauxdechèvre)spécifiquedela

partieFcɣdel’IgGhumaine,coupléàlaperoxydaseetlyophilisé.

L’immunoconjuguéprêtàl’emploiétaitobtenuaprèsreconstitutionpar7,5mL

dediluantpourimmunoconjugué.

• 1flaconde25mLdediluantpourimmunoconjugué.

• 1flaconde50mLdesolutiondelavage,20foisconcentrée.

• 1flaconde25mLdesubstrat:3,3’,5,5’-Tetraméthylbenzidine(TMB),

contenantdel‘eauoxygénée.

• 1flaconde6mLdesolutionstopcontenantdel’acidesulfurique0,45M.

Lemodeopératoiredel’industrielétaitlesuivant:

1.Dépôtdulysatplaquettaireetfixationdesanticorpshéparine-dépendants

Leséchantillons(plasmas)despatientsàtesterétaientdiluésau1/100èmeen

diluantéchantillon.

Uncontrôlepositifetuncontrôlenégatiflyophilisésétaientreconstituésavec1mLde

diluantéchantillonetétaientprêtsàl’emploi.

Lelysatplaquettairelyophiliséétaitreconstituéavec2mLd’eaudistilléeetétaitdéposé

aufonddechaquepuitssousunvolumede50μL.

Leséchantillonsainsiquelescontrôlesétaientdéposésimmédiatementsousunvolume

de200μL.

Lediluantéchantillonétaitégalementdéposéseulsousunvolumede200μLafinde

déterminerleblancdelaréaction.

Aprèsuneheured’incubationàtempératureambiante,lespuitsétaientlavés5foisde

suiteaveclasolutiondelavagediluéeau1/20ème.

2.dépôtdel’immunoconjuguéspécifiquedel’IgGhumaine

L’immunoconjuguélyophiliséétaitreconstituéàl’aidede7,5mLdediluantpour

immunoconjuguéetdéposéaufonddetouslespuitssousunvolumede200μL.

41



3.Développementdelaréaction

LesubstratTMBétaitdéposéaufonddespuitssousunvolumede200μLen

respectantunintervalledetempsdéfiniàl’avanceentrechaquebarrette.

Précisément5minutesaprèsl’introductiondusubstrat,laréactionétaitarrêtéepar

l’ajoutde50μLd’acidesulfurique0,45Maufonddespuits.

Après10minutesdestabilisationàtempératureambiante,lesabsorbancesétaientlues

à450nm.

4.Validationtechniqueetinterprétationdesrésultats

Lescontrôlesfournisdanslecoffretpermettaientdevaliderlabonneréalisation

dudosage.

L‘expérimentationétaitvalidéesil’absorbanceducontrôlepositifestsupérieureou

égaleà1etsil’absorbanceducontrôlenégatifétaitinférieureouégaleà0,25à

températureambiante(compriseentre18et25°C).

Leseuildepositivitédeséchantillonsestde0,5lorsquelaréactionétaitréaliséeà

20±1°C.

b.LetestHAT45G®(ImmucorGTIDiagnostics®,Waukesha,USA):

Cibleantigénique:FP4/Polyvinysulfate

Ladétectiondesanticorpsanti-PF4/Hétaitfaiteàl’aidedeplaquessensibilisées

paruncomplexeFP4/PVSquimimaitlacibleantigéniqueforméeinvivoparleFP4et

l’héparine.

LatrousseHAT45G®contient:

• 12barrettesde8puitssensibilisésparlecomplexeFP4/PVSavecsupport.

• 1flaconde50mLdesolutiondelavageconcentrée10fois.

• 1flaconde30mLdediluantéchantillon.

• 1flaconde80μLd’immunoconjuguéanti-IgGhumainecoupléeàlaphosphatase

alcaline.L’immunoconjuguéétaitàdiluerau1/100èmedansdudiluant

échantillonavantutilisation.

• 6flaconsde50mgsubstratp-nitrophénylphosphate(PNPP)lyophilisé,à

reconstitueravec0,5mLd’eaudistillée.

• 1flaconde14mLdetamponsubstratquidevaitêtreprotégédelalumière.

42

• 1flaconde100μLdecontrôlepositifcontenantdusérumd’originehumaineà

dilueravantutilisation.

• 1flaconde100μLdecontrôlenégatifcontenantdusérumd’originehumaineà

dilueravantutilisation.

• 1flaconde14mLdesolutiond’arrêtconstituéedeNaOHà3M.

LemodeopératoiredutestHAT45G®étaitlesuivant:

1.Fixationdesanticorpsanti-facteur4plaquettairemodifiéparl’héparine

Lasolutiondelavagedevaitêtrediluéepréalablementau1/10èmeeneau

distillée.300μLdecettesolutionsontdéposésaufonddespuitspuisincubés5à10

minutesàtempératureambiante.

Leséchantillonsainsiquelescontrôlessontdiluésau1/50èmeendiluantéchantillon.

Lespuitsétaientvidésetleséchantillonsainsiquelescontrôlesétaientdéposésaufond

despuitssousunvolumede50μL.


déterminerleblancdelaréactionetlaplaqueétaitrecouverted’unfilmadhésif.

Laplaqueétaitensuitemiseàincuberaubainmarieà37°Cpendant30minutespuisles

puitsétaientlavés3foisdesuiteaveclasolutiondelavagepréalablementdiluée.

2.Dépôtdel’immunoconjuguéanti-IgG

L’immunoconjuguéétaitdiluéau1/100èmeendiluantéchantillonpuiscelui-ci

étaitdéposéaufonddespuitssousunvolumede50μL.

Aprèsavoirrecouvertlaplaqued’unfilmadhésif,celle-ciétaitànouveaumiseàincuber

aubainmarieà37°Cpendant30minutes.

Unenouvelleétapede3lavagessuccessifsétaiteffectuéeaveclasolutiondelavage

diluée.


LesubstratPNPPétaitréhydratéavec0,5mLd’eaudistilléepuisdiluéau

1/100èmeendiluantsubstrat.Leproduitobtenuétaitàconserveràl’abridelalumière.

100μLdesubstratdiluéétaitajoutéaufonddespuitsàintervallesréguliersetles

barrettesétaientànouveaurecouvertesd’unfilmadhésifpuisplacéesprécisément30

minutesàl’obscurité.

43

Laréactionétaitarrêtéeparledépôtde100μLdesolutiond’arrêtetlesabsorbances,

luesà405nmdansles15minutessuivantl’arrêtdelaréaction.

4.Validationtechniqueetinterprétationdesrésultats

L‘expérimentationétaitvalidéesil’absorbanceducontrôlepositifétait

supérieureouégaleà1,8etsil’absorbanceducontrôlenégatifétaitinférieureouégaleà

0,3àtempératureambiante.

Leséchantillonsétaientconsidéréscommepositifspourdesabsorbancessupérieuresou

égalesà0,4à405nm.

c.LetestASSERACHROM®HPIA–IgG(DiagnosticaStago,Asnièressurseine,France):

Cibleantigénique:FP4/Héparine

LarecherchedesanticorpsdeTIHétaitréaliséeàpartirdecoffretsprêtsà

l’emploiASSERACHROM®HPIA–IgGcontenant:

• 6barrettesde8puitssensibiliséesparlecomplexePF4/H.

• 1flaconde50mLdesolutiondelavage,20foisconcentrée.

• 3flaconsde30mLdediluantéchantillon.

• 6flaconsd’immunoconjuguéanti-IgGhumainecoupléeàlaperoxydase.

L’immunoconjuguédoitevaitêtrereconstituépar2mLdediluantéchantillon

avantutilisation.

• 6flaconsde8mLsubstratTMB.

• 3flaconsde«RéférenceHPIA».Unplasmahumainlyophilisécontenantdans

anticorpsanti-PF4/Hétaitutilisédanscetest.Ildevaitêtrereconstituépar1mL

dediluantéchantillon.

• 3flaconsdecontrôlepositiflyophilisé,àreconstitueravec1mLdediluant

échantillon.

• 3flaconsdecontrôlenégatiflyophilisé,àreconstitueravec1mLdediluant

échantillon.

Lemodeopératoireétaitdécritparlefournisseur:

1.Fixationdesanticorpsanti-facteur4plaquettairemodifiéparl’héparine

Leséchantillonsàtester(plasmas)étaientdiluésau1/101èmeen«diluant

échantillon».

44

Leséchantillons,lescontrôlesetlasolution«HPIAréférence»étaientdéposésaufond

despuitssousunvolumede200μL.


déterminerleblancdelaréaction.



2.Dépôtdel’immunoconjuguéanti-IgG

L’immunoconjuguépréalablementreconstituéavec2mLdediluantéchantillon

étaitdéposéaufonddespuitssousunvolumede200μL.




LesubstratTMBétaitdéposéaufonddespuitssousunvolumede200μLen

respectantunintervalledetempsdéfinientrechaquebarrette.

Aprèsexactement5minutesd’incubationàtempératureambiante,laréactionétait

arrêtéeendéposant50μLd’acidesulfurique1Maufonddespuits,toujoursen

respectantl’intervalledetempsdéfiniprécédemment.

Lalecturedesabsorbancess’effectuaità450nm,aumoins15minutesaprèsarrêtdela

réaction.

4.Validationetinterprétationdesrésultats

Lecontrôlepositifetlecontrôlenégatifpermettaientdevalider

l’expérimentation.Leursvaleursétaientindiquéesdanslepapillonfourniavecla

trousse.

Unéchantillonétaitconsidérécommepositifsilavaleurdesonabsorbanceétait

supérieureàunpourcentagedelavaleurd’absorbancedelaréférenceHPIA.

Cepourcentageétaitécritsurunpapillonfourniaveclecoffretetpouvaitvarierd’unlot

àl’autre.

Lescaractéristiquesdesdifférentestroussesutiliséessontregroupéesdansletableau

III.

45

TableauIII:CaractéristiquesdestestsELISAutiliséspourlarecherched’Achéparine-

dépendants

ZYMUTESTHIAIgGASSERACHROM®

HPIAIgGHAT45G®

cibleantigénique

ComplexesSulfatede

protamine/Héparine+

lysatplaquettaire

ComplexesFP4/H ComplexesFP4/PVS

Anticorpsrecherchés Anticorpsanti-FP4/H

Dépôtdeséchantillons

Dilutionau1/100ème

Incubation1hà

températureambiante

Dilutionau1/101ème

Incubation1hà

températureambiante

Dilutionau1/50ème

Incubation30minutes

aubainmarieà37°C

Lavages 5 3

Dépôtde

l'immunoconjuguéanti-

IgG

Coupléàlaperoxydase

Incubation1hàtempératureambiante

Coupléàla

phosphatasealcaline

Incubation30minutes

aubainmarieà37°C

Lavages 5 3

RévélationSubstrat:TMB

Incubation5minutesàtempératureambiante

Substrat:PNPP

Incubation30minutes

àl'obscurité

Arrêtdelaréaction H2SO40,45M H2SO41M NaOH3M

Lecturedel'absorbance 450nm 450nm 405nm

Seuildepositivité 0,5

Pourcentagedela

solutionHPIAde

référence

0,4

46

1.3.Echantillonspatients

Quatorzeplasmasdepatientsayantuntitresignificatifd’anticorpsdeTIHontété

sélectionnés.Dans12cas,lediagnosticdeTIHavaitétéconfirméparuntestde

libérationdesérotonineradiomarquée.Lesdeuxpatientsrestantsavaienteuune

recherched’AcdeTIHpositivemaisletestdelibérationdesérotonineradiomarquée

étaitnégatif.

Lescaractéristiquesdeces14échantillonssontreprésentéesci-dessousdansletableau

IV.

TableauIV:Tableaurécapitulatifdescaractéristiquesdeséchantillonsutilisés

Trousseutilisée Absorbance

%agedelibérationde

sérotonineenprésencede

0-0,1-0,5-10UI/mLd’HNF

Thrombose

P1 HAT45®G/A/M 2,836 15-89-84-66-5 Non

P2 HAT45G®G/A/M 2,165 78-95-93-93-40 Oui

P3 HAT45G®G/A/M 2,595 8-42-27-15-1 Non

P4 HAT45G®G/A/M 2,5 74-82-38-8 Non

P5 HAT45G®G/A/M 2,182 5-35-25-8 Oui

P6 HAT45G®G/A/M 2,845 20-90-69-11 Non

P7 HAT45G®G/A/M 3 19-94-51-1 Non

P8 HAT45G®G/A/M 2 4-45-48-0 Non

P9 HAT45G®G/A/M >2 NC Non

P10 HAT45G®G/A/M 3,2 5-54-45-2 Non

P11 HAT45G®G/A/M 2,5 0-4-50-0 Oui

P12 HAT45G®G/A/M 1,596 0-4-2-1-0 Non

P13 HAT45G®G/A/M 1,224 3-2-1-1-3 NC

P14 ZYMUTEST®G/A/M 0,604 29-36-36-27 NC

L’échantillonP8étaitappeléC1toutaulongdecetravail.

Unpoolde4plasmasaétéréaliséavecleséchantillonsP8,P9,P10etP11etutiliséaprèsdilutionau1/5èmeenplasmanormal(Cryocheck®,Cryopep).Nousl’avonsnomméPool1/5èmedanscetravail.

47

1.4.LecteurdeplaqueELISA

Nousavonsutiliséunlecteurd’absorbanceElx800TMdelamarqueBioTek®.La

lectureaétéeffectuéauxlongueursd’ondespréconiséesparnos3fabricantsde

trousses,respectivement450nmpourlestroussesASSERACHROM®HPIA–IgGdechez

StagoDiasgnostica®etZYMUTEST®HIAIgGdechezHYPHEN®et405nmpourla

trousseHAT45G®(ImmucorGTIDiagnostics®).

48

2.RÉSULTATS

1èrepartie:StandardisationdesdifférentestroussesELISAàl’aidede

l’anticorpsmonoclonaldeTIH5B9.

Afind’évaluerlapossibilitéd’utiliserl’Ac5B9lorsdelastandardisationdes

différentestrousses,nousavonstestés7échantillonsdepatientsconnuspouravoirun

titresignificatifd’anticorpsantiFP4modifiéparl’héparineavectroiscoffretsELISA

différentsutiliséspourlediagnosticdeTIH.Unegammed’étalonnagea

systématiquementétéréaliséeavecl’Ac5B9.

Touslesrésultatssontainsiexprimésenabsorbanceeten«équivalent5B9».

A.Gammesd’étalonnageréaliséesavecl’anticorpsmonoclonal5B9

AveclatrousseASSERACHROM®HPIA–IgG(Stago)(figure3)etlatrousse

HAT45G®(GTI)(figure4),nousobtenonsdescourbesdecalibrationd’allure

hyperboliqueavecpourchacuned’elle,uncoefficientR2égalà0,99.Onremarqueun

infléchissementdelacourbelorsquel’Ac5B9atteintuneconcentrationsupérieureou

égaleà2,5μg/mLaveccesdeuxtroussescequitémoigned’unesaturationdusignal.

49

Figure3:Gammed’étalonnageenAc5B9delatrousseASSERACHROM®HPIA–IgG(Stago).

Moyenne+/-Ecarttype.n=5expérimentations.

Figure4:Gammed’étalonnageenAc5B9delatrousseHAT45G®(GTI).Moyenne+/-Ecart

type.n=5expérimentations.

y=0,7224ln(x)+1,2067R²=0,98948

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Absorbanceà450nm

ConcentrationenAc5B9enµg/mL

Gammed'étalonnageASSERACHROM® HPIA– IgG(Stago)

y=0,716ln(x)+0,9707R²=0,98532

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Absorbanceà405nm


Gammed'étalonnageHAT45G®(GTI)

50

L’amplitudedesabsorbancesmesuréesaveccesdeuxkitssontsimilaires

puisqu’ellesvariententre0,41et2,75aveclatrousseASSERACHROM®HPIA–IgG,et

entre0,32et2,64aveclatrousseHAT45G®.

AveclatrousseZYMUTEST®HIAIgG(HYPHEN)(figure5),l’alluredelacourbe

decalibrationestlinéaireavecuncoefficientdecorrélationR2égalà0,97.Les

absorbancesvariententre0,12et2,07.

Figure5:Gammed’étalonnageenAc5B9delatrousseZYMUTEST®HIAIgG(HYPHEN).

Moyenne+/-Ecarttype.n=5expérimentations.

Lesabsorbancesmoyennesdenosgammesd’étalonnagepourchaquetroussetestée

sontreprésentéesdansletableauV.

TableauV:Tableaudesabsorbancesmoyennespourchaquepointdegammed’étalonnage.

ConcentrationenAc5B9enμg/mLAbsorbanceASSERACHROM®

HPIA–IgG 0,41 0,79 1,34 1,97 2,48 2,75

AbsorbanceHAT45G® 0,32 0,52 1,01 1,61 2,20 2,64

AbsorbanceZYMUTEST®HIAIgG 0,12 0,21 0,39 0,77 1,36 2,07

y=0,2026x+0,1536R²=0,9732

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Absorbanceà450nm


Gammed'étalonnageZYMUTEST®HIAIgG(HYPHEN)

51

Quellequesoitlatrousseutilisée,lescoefficientsdevariations(CV)inter-essaiscalculés

pourchaquepointdegamme,variententre5et37%,avecunenetteaugmentationdes

CVpourlesfaiblesconcentrationsd’Ac5B9.(Figure6)

Figure6:Coefficientsdevariationsinter-essaisselonlaconcentrationenAc5B9.

AveclatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGdeStago,lescoefficientsdevariationssont

inversementproportionnelsàlaconcentrationenAc5B9etvarientde6à28%.Ce

phénomènen’estpasobservépourlatrousseZYMUTEST®HIAIgGpuisquelesCV

varientde11à21%avecdesCVprochesde20%pourdesconcentrationsenAc5B9

comprisesentre0,63et2,5μg/mL.AveclatrousseHAT45G®deGTI,nousobservonsde

trèsfortsCV,supérieursà20%pourdesconcentrationsenAc5B9comprisesentre0,32

et2,5μg/mL.

B.Standardisationdesabsorbancesmesuréesaveclesplasmasdes

patients

Dansunsecondtemps,nousavonsregardésilaréalisationd’unecourbedecalibration

lorsdechaqueessaiassociéeàuneexpressiondesrésultatsen«Equivalent5B9»,

permettaitdestandardiserlesrésultatsobtenusaveclesplasmasdepatients.

Danscebut,nousavonstestéleséchantillonsdeplasmasde7patientssurchacunedes

troistrousses.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

0,32 0,63 1,25 2,50 5,00 10,00

CV%

del'absorbance

ConcentrationenAc5B9enμg/mL

GTI

HYPHEN

STAGO

52

Lesabsorbancesmesuréesavecchaquetroussesontprésentéessurlafigure7ainsique

lesmoyennescalculéesaveclesabsorbancesmesuréespourunmêmeéchantillonavec

lestroiskitscommerciaux.

Figure7:AbsorbancedeséchantillonsP1àP7selonlatrousseutilisée.

OnnotequepourleséchantillonsP1,P4etP7,lesrésultatsexprimésenabsorbance

sonttrèscomparablesquelquesoitlekitutiliséalorsquepourlesautreséchantillons,

desvariationsdeplusde0,5d’absorbancesontobservéesd’unetrousseàl’autre.

Ceciestparticulièrementremarquableavecl’échantillonP5,pourquil’absorbanceest

de0,55aveclekitZYMUTEST®HIAIgG,1,28aveclatrousseASSERACHROM®HPIA–

IgGet1,95aveclatrousseHAT45G®.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7

Absorbancemoyenne

AbsorbanceStagoà450nm AbsorbanceGTIà405nm

AbsorbanceHyphenà450nm

Absorban

ceenDO

53

Al’aidedescourbesdecalibrationspropreàchacunedestroussesetréalisées

lorsdechaqueexpérimentation,nousavonségalementexprimélesrésultatsdechaque

échantillonen«équivalent5B9».Cesrésultatssontreprésentéssurlafigure8.

Figure8:Equivalent5B9enμg/mLdeséchantillonsP1àP7selonlatrousseutilisée.

L’expressiondesrésultatsenéquivalent5B9nepermetpasdediminuerlesvariations

derésultatsdespatientsàl’exceptiondel’échantillonP5.Nousobservonségalement

quetousleséchantillons,àl’exceptiondeP5,ontdesrésultatsenéquivalent5B9plus

élevésaveclatrousseZYMUTEST®HIAIgGcequin’étaitpasobservélorsqueles

résultatsétaientexprimésenabsorbance.

0

5

10

15

20

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7

Equivalent5B9moyen

Equivalent5B9Stago Equivalent5B9GTI

Equivalent5B9Hyphen

Equivalent5B9

enμg

/mL

54

2èmepartie:StandardisationdelatrousseASSERACHROM®HPIA–IgG

enconditionsextrêmes Danslamesureoùlesrésultatsdelapremièrepartiedecetravailmontrentque

l’anticorpsmonoclonal5B9nepermetpasdestandardiserlesrésultatsdespatients

lorsqu’ilssonttestéssurdeskitsdifférents,nousavonsévaluésil’anticorps5B9pouvait

permettredediminuerlescoefficientsdevariationsinter-essaispourunemême

trousse.

LatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGaétéutiliséedansladeuxièmepartiedece

travailpuisqu’elleutilisedesplaquessensibiliséespardescomplexesFP4/Hetqueces

mêmescomplexesontétéutiliséspourimmuniserlessourisaveclesquellesnousavons

obtenuleclone5B9.LesdifférentesétapesdutestELISAontétésoumisesàdes

conditionsderéalisationsextrêmes.

A.Variationdelatempérature

Nousavonstoutd’abordréalisélestestsenrespectantlesrecommandationsdu

fournisseurquistipulentderéaliserlestestsàtempératureambiante(20±2°C)etnous

noussommesmisàunetempératureextrêmede30°C.Lesgammesd’étalonnagesont

représentéessurlafigure9.

Figure9:Gammesd’étalonnagedelatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGàtempérature

ambianteetà30°C.Moyenne+/-Ecarttype.n=5expérimentations.

y=0,9073ln(x)+1,3996R²=0,99782

y=0,8212ln(x)+1,3333R²=0,99721

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 1 2 3 4 5

Absorbanceà450nm


Gammesd'étalonnageASSERACHROM® HPIA– IgGVariationdelatempératurederéalisationde

l'expérimentation

30°C

T° Ambiante

55

Nousobtenonsdescourbesdecalibrationd’allurehyperboliqueavecuncoefficientR2à

0,99quellequesoitlatempératureàlaquelleontétéeffectuéslestests.

Unetempératureélevéelorsdelaréalisationdesexpérimentationsnemodifiepas

l’alluredelagammed’étalonnagenil’amplitudedesabsorbancesmesurées.Lorsde

chaqueexpérimentation,nousavonsexprimélesrésultatsdenotreéchantillonC1ainsi

queceuxdelaréférencedukitHPIAenabsorbanceetenéquivalent5B9(TableauVI).

Lesrésultatssontreprésentéssurlafigure10.

TableauVI:Valeursmoyennesd’absorbanceà450nm(Abs450)etd’équivalent5B9deC1et

delaréférenceHPIAselonlatempératurederéalisationdel’expérimentation.

C1 RéférenceHPIA

Abs450 Equivalent5B9 Abs450 Equivalent5B9

30°CMoyenne 0,92 0,64 1,97 2,23

Valeursextrêmes [0,83-0,98] [0,53-0,82] [1,69-2,15] [1,58-2,83]

Températureambiante

Moyenne 0,93 0,64 1,88 2,1

Valeursextrêmes [0,72-1,11] [0,44-0,77] [1,62-2,26] [1,54-2,85]

CVglobal% 12 17 11 23

Figure10:EchantillonC1etréférenceHPIAenabsorbanceetenéquivalent5B9selonla

températurederéalisationdel’expérimentation.n=5expérimentations.

0

,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

C1 Référence

Equi

vale

nt 5

B9

Abso

rban

ce à

450

nm

56

Lorsquelesrésultatssontexprimésenabsorbance,lesCVdeC1etdelaréférenceHPIA

sonttrèsproches,respectivementde12et11%.Al’inverse,silesrésultatssont

exprimésenéquivalent5B9,leCVaugmenterespectivementà17et23%.

B.Variationdeladuréed’incubationdel’échantillon

Dansunsecondtemps,nousavonsfaitvarierladuréed’incubationdeséchantillonsC1,

Pool1/5ème,référenceHPIAetdespointsdegammed’étalonnageparrapportaux

conditionspréconiséesparlefabricant.Nousavonsainsitestédestempsd’incubation

de30minutes,1heureet1heure30minutes.

Lesgammesd’étalonnagepourcestroistempsd’incubationsontreprésentéessurla

figure11.

Figure11:Gammesd’étalonnagedelatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGavecincubationdes

pointsdegammesde30minutes,1heureet1h30minutes.Moyenne+/-Ecarttype.n=5

expérimentations.

y=0,8027ln(x)+1,3879R²=0,99754

y=0,8071ln(x)+1,3121R²=0,99575

y=0,7875ln(x)+1,1922R²=0,99419

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 1 2 3 4 5

Absorbanceà450nm


Gammesd'étalonnageASSERACHROM® HPIA– IgGVariationdutempsd'incubationdel'échantillon

1h30

1h

30min

Tempsd'incubation

57

LesrésultatsdeséchantillonsC1,Pool1/5èmeainsiqueceuxdelaréférenceHPIAsont

exprimésàlafoisenabsorbanceetenéquivalent5B9etprésentésdansletableauVIIet

surlafigure12.

TableauVII:Valeursmoyennesd’absorbanceà450nmetd’équivalent5B9deC1,duPool

1/5èmeetdelaréférenceHPIAselonletempsd’incubationdel’échantillon.

C1(n=5) Pool1/5ème(n=1) RéférenceHPIA(n=5)

Abs450 Equivalent5B9

Abs450

Equivalent5B9 Abs450 Equivalent

5B9

1h30Moyenne 1 0,62 1,3 0,81 2,06 2,4Valeursextrêmes [0,77-1,18] [0,54-0,71] [1,73-2,21] [1,61-3,54]

1hMoyenne 0,94 0,63 1,18 0,77 1,89 2,09Valeursextrêmes [0,77-1,11] [0,52-0,75] [1,65-2,04] [1,57-2,97]

30minutesMoyenne 0,81 0,63 0,96 0,64 1,61 1,75Valeursextrêmes [0,73-0,91] [0,55-0,71] [1,58-1,63] [1,34-2,11]

CVglobal% 16 12 15 12 12 30

Figure12:EchantillonsC1,Pool1/5èmeetréférenceHPIA.Résultatsindiquésenabsorbanceet

enéquivalent5B9selonletempsd’incubationdel’échantillon.

0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Equi

vale

nt 5

B9 e

n μg

/mL

Abso

rban

ce à

450

nm

C1 Pool 1/5ème

Référence HPIA

58

Lorsquelesrésultatsdel’échantillonC1sontexprimésenabsorbances,lesvaleurs

variententre0,73et1,18avecunCVglobalde16%.Lorsquelesrésultatssontexprimés

enéquivalent5B9,leCVdesrésultatsdiminueà12%cequidiminuedefaçon

importantel’impactdeladuréed’incubationdel’échantillonsurlerésultatfinal.

OnobservelemêmephénomèneaveclePool1/5èmepuisqueleCVglobalpassede15%

lorsquelesrésultatssontexprimésenabsorbance,à12%silesrésultatssontexprimés

enéquivalent5B9.

DesrésultatsdifférentssontobtenusaveclaréférenceHPIA.Eneffet,lesrésultats

obtenusenabsorbancevariententre1,58et2,21avecunCVde12%,etcedernier

augmenteà30%silesrésultatssontexprimésenéquivalent5B9.

C.Variationdutempsd’incubationdel’immunoconjugué

Nousavonségalementfaitvarierladuréed’incubationdel’immunoconjuguépar

rapportauxconditionspréconiséesparlefabricant.Nousavonsainsitestéune

incubationde30minutes,1heureet1heure30minutesdel’immunoconjugué.

Lesgammesd’étalonnageobtenuesdanscestroisconditionssontreprésentéessurla

figure13.

Figure13:Gammesd’étalonnagedelatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGavecincubationde

l’immunoconjuguéde30minutes,1heureet1h30minutes.Moyenne+/-Ecarttype.n=4

expérimentations.

y=0,6975ln(x)+1,3729R²=0,97914

y=0,7072ln(x)+1,257R²=0,98971

y=0,5846ln(x)+0,9314R²=0,98952

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 2 4 6 8 10

Absorbanceà450nm


Gammesd'étalonnageASSERACHROM® HPIA– IgGVariationdutempsd'incubationdel'immunoconjugué

1h30

1h

30minutes

Tempsd'incubation

59

LeséchantillonsC1,Pool1/5èmeetlaréférenceHPIAontététestésdanscestrois

conditionsetlesrésultatssontreprésentéssurlafigure14etdansletableauVIII.

TableauVIII:Valeursmoyennesd’absorbanceà450nmetd’équivalent5B9deC1,duPool

1/5èmeetdelaréférenceHPIAselonletempsd’incubationdel’immunoconjugué.


Abs450 Equivalent5B9 Abs450 Equivalent

5B9 Abs450 Equivalent5B9

1h30Moyenne 1,13 0,65 1,06 0,59 1,9 1,68Valeursextrêmes [0,90-1,41] [0,54-0,80] [0,69-1,47] [0,34-0,72] [1,41-2,38] [1,02-2,31]

1hMoyenne 0,96 0,61 0,93 0,6 1,61 1,47Valeursextrêmes [0,71-1,24] [0,51-0,70] [0,57-1,22] [0,35-0,72] [1,26-2,04] [0,97-1,87]

30minutes

Moyenne 0,7 0,62 0,66 0,58 1,14 1,28Valeursextrêmes [0,52-0,94] [0,54-0,70] [0,44-0,92] [0,40-0,69] [0,89-1,49] [0,89-1,68]

CVglobal% 29 14 34 24 29 31

Figure14:EchantillonsC1,Pool1/5èmeetlaréférenceHPIAenabsorbanceetenéquivalent5B9

selonletempsd’incubationdel’immunoconjugué.n=4expérimentations.

0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

C1 Pool 1/5ème

Référence HPIA

Equi

vale

nt 5

B9 e

n μg

/mL

Abso

rban

ce à

450

nm

60

Lesvaleursdesabsorbancesmesuréesavecl’échantillonC1varientde0,52à1,41avec

unCVglobalégalà29%.Lorsquelesrésultatssontexprimésenéquivalent5B9,leCV

diminueà14%.OnobservelemêmephénomèneaveclePool1/5èmedontles

absorbancesvarientde0,44à1,47avecunCVenabsorbanceestde34%etquidiminue

à24%silesrésultatssontexprimésenéquivalent5B9.

AveclaréférenceHPIA,lesvaleursenabsorbancevariententre0,89et2,38avecunCV

de29%etl’expressiondesrésultatsenéquivalent5B9nepermetpasdediminuerleCV

desrésultatspuisqu’ilaugmentelégèrementà31%.

D.Variationdutempsd’incubationdusubstrat

Nousavonsfinalementfaitvarierladuréed’incubationdusubstratparrapportaux

conditionspréconiséesparlefabricant.Nousavonsdonctestéuneincubationdu

substratde3,5et7minutes.

Lesgammesd’étalonnageobtenuesdanscestroisconditionssontreprésentéesdansla

figure15.

Figure15:Gammesd’étalonnagedelatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGavecincubationdu

substratde3,5et7minutes.

y=0,4521ln(x)+0,6817R²=0,99002

y=0,6743ln(x)+1,0545R²=0,99209

y=0,8652ln(x)+1,3387R²=0,99099

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 1 2 3 4 5

Absorbanceà450nm


Gammesd'étalonnageASSERACHROM®HPIA– IgGVariationdutempsd'incubationdusubstrat

3minutes

5minutes

7minutes

Tempsd'incubation

61

Lesvaleursenabsorbanceetenéquivalent5B9deséchantillonsC1,Pool1/5èmeetdela

référenceHPIAsontreprésentéesdansletableauIXetsurlafigure16.

TableauIX:Valeursmoyennesd’absorbanceà450nmetd’équivalent5B9deC1,duPool

1/5èmeetdelaréférenceHPIAselonletempsd’incubationdusubstrat.




3minutes


5minutes


7minutes


CVglobal% 45 10 44 11 33 12

Figure16:EchantillonsC1etPool1/5èmeenabsorbanceetenéquivalent5B9selonletemps

d’incubationdusubstrat.n=3expérimentations.

0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

C1 Pool 1/5ème

Référence HPIA

Equi

vale

nt 5

B9 e

n μg

/mL

Abso

rban

ce à

450

nm

62

LorsquelesrésultatsdeC1sontexprimésenabsorbances,lesvaleursvariententre0,30

et1,30avecunCVde45%.Unefoisexprimésenéquivalent5B9,leCVestde10%.

OnobservelemêmephénomèneaveclePool1/5èmeavecunCVquipassede44%

lorsquelesrésultatssontexprimésenabsorbance,à11%lorsquelesrésultatssont

exprimésenéquivalent5B9.Desrésultatscomparablessontobservésaveclaréférence

HPIA.

63

E.Intérêtdelagammed’étalonnageenAc5B9appliquéàtroiséchantillonsdepatients

AfindeconfirmerlesrésultatsobtenusavecnosleséchantillonsC1etlePool1/5ème,nousavonsrépéténosexpérimentationsavec3échantillonsdenouveauxpatientsnommésP12,P13etP14enfaisantvarierlestempsd’incubationdel’échantillon,del’immunoconjuguéetdusubstrat.Lesrésultatssontprésentéssurlafigure17etdansletableauX.

Figure17:Valeursenabsorbanceetenéquivalent5B9deséchantillonsP12,P13etP14selon

lavariationdutempsd’incubationdel’échantillon,del’immunoconjuguéetdusubstrat.n=1

expérimentation.

0

,25

,5

,75

1

1,25

1,5

1,75

2

2,25

P14 P13 P12

Abso

rban

ce e

n D

O

Equi

vale

nt 5

B9 e

n μg

/mL

64

TableauX:Absorbancesà450nmetéquivalent5B9deséchantillonsP12àP14selonles

différentesvariationsdestempsd’incubation.

P12 P13 P14



Moyenne 1,66 1,46 0,6 0,35 0,36 0,26Valeursextrêmes [1,17-2,16] [1,23-1,83] [0,39-0,83] [0,33-0,38] [0,24-0,51] [0,23-0,30]CVglobal% 18 15 25 4 29 8

Onremarquequepourlestroiséchantillonsétudiés,P13etP14ontuncomportement

identiqueavecunetrèsnettediminutionduCVlorsquelesrésultatssontexprimésen

équivalent5B9.EneffetleCVpassede25%à4%avecl’échantillonP13etde29à8%

avecl’échantillonP14lorsquelesrésultatssontexprimésrespectivementen

absorbancesetenéquivalent5B9.Cesdeuxéchantillonsontdesabsorbances

inférieuresà1.

Avecl’échantillonP12,lesvaleursdesabsorbancesvariententre1,17et2,16avecunCV

desrésultatsde18%etl’expressiondesrésultatsenéquivalent5B9nediminueque

légèrementleCVquipasseà15%.

65

3.DISCUSSION

LapremièreétapedudiagnosticbiologiquedeTIHreposesurlaréalisationd’un

testimmunoenzymatiqueetlestestsELISAsontlespluscourammentutilisés.

Cestestspermettentd’informerlecliniciensurl’absenceoulaprésenced’anticorpsanti-

FP4/Hetlerésultatnumériquedel’absorbancedonneégalementuneindicationsur

l’importancedelaréponseimmune.Plusieurstravauxontmontréquelavaleurde

l’absorbanceestcorréléeaurisquedeTIH(29,38)etcertainsauteursproposentde

conclureàuneTIHcertainesil’absorbanceestsupérieureà2sansavoirrecoursaux

testsd’activationplaquettaire(38).

Àcejour,iln’existeaucunestandardisationdestestsELISAetlaproposition

d’AdamCukerd’évaluerlaprobabilitédeTIHuniquementsurlerésultatdel’absorbance

estbaséesurdestravauxréalisésaveclatrousseHAT45G®deGTIetn’estpeut-êtrepas

applicableauxabsorbancesmesuréesaveclesautrestroussescommercialisées.

Deplus,l’éditionspécialedelafondationECATpubliéeen2014soulignel’absencede

standardisationdecestroussesetmontre,enutilisantlesrésultatsdesévaluations

externesdelaqualité,quepourunmêmeéchantillonpositifavecuneabsorbance

prochede2,lescoefficientsdevariationssontcomprisentre16et37%selonles

troussesutilisées.Lesrecommandationsdel’ECATinsistentsurl’importancede

reporterlesabsorbancesmesuréesdemanièrequantitativesurlescompte-rendusdes

testsELISAtransmisauxcliniciens.

Danscecontexte,ilnousaparuintéressantd’envisagerunestandardisationdes

différentestroussesELISAcommercialiséesetledéveloppementparl’équipeduPr.

Gruel,d’unanticorpsmonoclonaldeTIHayantunfragmentFchumainnousa

rapidementconduitàenvisagercetravail.

Lesrésultatsdelapremièrepartiedecetteétudefontapparaîtreun

comportementtrèsprochedel’Ac5B9surlacibleantigéniqueFP4/HouFP4/PVS

commeentémoignentleurscourbesdecalibrationd’alluresimilaires.Leprocédéde

fixationdel’héparineauxplaquesELISAinfluencefortementlamodification

conformationelleduFP4.

66

LestravauxdeSuhetal(40)ontmontréquelorsquel’héparineestplaquéeaufonddes

puitsavecunepertedesaflexibilité,leFP4n’estpasmodifiédefaçonoptimale.Ces

résultatspourraientexpliquerlesdifférencesobservéesentrelestroussesquiutilisent

descomplexesFP4/PVSouFP4/HetlatrousseZYMUTEST®HIAIgG(HYPHEN)qui

utilisedel’héparinefixéeparlesulfatedeprotamine.

Lorsqueleséchantillonsde7patientsayanttousdéveloppésdesanticorpspathogènes

(positifenSRA)sonttestésaveclestroistroussesetlesrésultatsexprimésen

absorbanceouenéquivalent5B9,nousobservonsquel’expressionenéquivalent5B9ne

permetpasdediminuerlavariabilitédesrésultatsinterkits.

Ilesticiimportantdesoulignerquelaréponseimmunitairedéveloppéeaucoursdes

TIHestpolyclonaleetC.Pouplardavaitbienmontréqu’uncertainnombredepatients

développaientdesanticorpsquireconnaissaientdefaçonidentiqueleFP4seulou

complexéàl’héparine(41)alorsquel’Ac5B9nereconnaîtqueleFP4complexéà

l’héparine.L’ensembledecesrésultatsnousconduisentàrenoncerauprojetde

standardisercestroistroussesELISAenutilisantunmêmeanticorpsmonoclonal.

Dansladeuxièmepartiedecetteétudenousavonscontinuécetteapprochede

standardisationmaisenutilisantuneseuletrousse.

LatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGaétéchoisiedanslamesureoùelleutilisait

commecibleantigéniquelecomplexeFP4/Hàl’originedelaréponseimmune

développéeaucoursdelaTIH.Deplusl’Acmonoclonal5B9aétéobtenuaprès

immunisationdesourisGammaPrim™aveccesmêmescomplexes.

Lorsquenousutilisonslatroussedansdesconditionsextrêmes,ilestintéressantde

noterquelekitn’estpassensibleauxvariationsdetempératureetqu’unediminutionou

uneaugmentationsensible(±30minutes)dutempsd’incubationdel’échantillon

n’impactequetrèsmodérémentlerésultat,qu’ilsoitexpriméenabsorbanceouen

équivalent5B9.

Deplus,uneparticularitédelatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGestladéfinitiondu

seuildepositivitédutestquivaried’uneexpérimentationàl’autrepuisqu’ilestdéfini

parunpourcentagedel’absorbancemesuréeaveclaréférenceHPIAfourniedanslekit.

LorsquelesrésultatsdelaréférenceHPIAsontexprimésenabsorbanceouen

équivalent5B9,onobserveunetrèsfortevariabilitédurésultatenfonctiondeladurée

d’incubationdel’échantillon.Lacompositiondecetteréférencen’estpasconnuemaisil

semblequesoncomportementsoittrèsdifférentdeceluideséchantillonsplasmatiques.

67

Eneffet,lorsquenousavonsfaitvarierladuréed’incubationdel’immunoconjuguéoudu

substrat,l’expressiondesrésultatsenéquivalent5B9diminueconsidérablementleCV

deséchantillonsC1etduPoolau1/5èmemaispasceluidelaréférence.

Lapertinenced’utiliserlaréférenceHPIApourdéfinirleseuildepositivitédutest

devraitdoncêtreétudié.

Actuellement,larédactiond’unprojetmulticentriquevisantàétudierl’intérêtde

l’utilisationducalibrant5B9aveclatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGestencours.

CeprojetseraréalisédefaçonprospectiveetincluratoutesuspiciondeTIH.Le

diagnosticbiologiquedeTIHseraconfirméparuntestdelibérationdesérotonine

radiomarquéeetdesrenseignementscliniquessuffisantsdevrontêtrecolligésde

manièreàévaluerdefaçonpréciselaprobabilitécliniquedelaTIH.

Deplus,àl’aided’uneanalyseencourbeROC,leseuildepositivitédutestseraredéfini.

L’inclusiond’unnombreminimalde500patientsseranécessairepourcetravailafin

d’obtenirenviron50casdethrombopéniesinduitesparl’héparine.

68

III.ANNEXESAnnexe1

HEMATOLOGIE-TROUSSEAU

Score probabilité clinique TIH

Ref : LBM N DE004 01 Version : 01

Applicable le : 03-03-2014

Ref : LBM N DE004 01 Version : 01 - Page 1 sur 1

Nom : Sexe : Service : Prénom : Date d'inclusion : DDN : Thrombopénie: Diminution de plus de 50% de la numération plaquettaire + 2 Et plaquettes nadir ≥ 20 G/L sans chirurgie dans les 3 derniers jours

Diminution de 30 à 50% de la numération plaquettaire + 1 Ou plaquettes entre 10 et 19 G/L Ou diminution de plus de 50% de la numération plaquettaire avec chirurgie (3 derniers jours) Diminution de moins de 30% de la numération plaquettaire 0 Ou plaquettes < 10 G/L Délai de survenue Chute de la numération plaquettaire (ou thrombose) 5 à 10 jours + 2

après le début de l'héparine ou dans un délai de 24 heures si héparinothérapie récente (5 à 30 jours derniers jours)

Ou après plus de 10 jours d'héparinothérapie + 1 Ou dans un délai de 24 heures si héparinothérapie semi récente (de 31 à 100 jours) Thrombopénie survenant avant 4 jours de traitement sans héparinothérapie 0 dans les 100 derniers jours Thromboses / Clinique Nouvelle thrombose (confirmée) ou nécrose cutanée ou réaction systémique après + 2 injection d'héparine en bolus (HNF) ou hémorragie surrénalienne

Extension ou récidive d'une thrombose préexistante + 1 Ou suspicion de thrombose non prouvée (imagerie en attente) Ou érythème cutanée après injection d'héparine. Aucun événement 0

Autre diagnostic de thrombopénie Aucune autre cause possible de thrombopénie + 2 Autre cause possible : sepsis sans documentation bactériologique + 1 Thrombopénie associée à une ventilation mécanique Autres Autre cause probable de thrombopénie : chirurgie dans les 72 heures, 0 bactériémie/fongémie confirmée, chimiothérapie/radiothérapie dans les 20 derniers jours, purpura post-transfusionnel, CIVD due à une cause autre que la TIH, plaquettes < 20G/L et administration d’un médicament thrombopéniant (cf tableau), lésions cutanées non nécrotiques au site d’injection, autres…

Probabilité clinique de TIH (pré-test) Score 0 – 3 : Faible risque de TIH Score 4 – 5 : Risque modéré

Score 6 – 8 : Risque élevé de TIH

Médicaments impliqués dans des thrombopénies immunes médicamenteuses : Relativement fréquents : Antagonistes de la GP IIb/IIIa (abciximab…), quinine/quinidine, sulfamides antibactériennes, carbamazépine, vancomycine Moins fréquents : amitryptyline, amoxicilline/pipéracilline, céphalosporines (ceftazidime, ceftriaxone), célécoxib, ciprofloxacine, lévofloxacine, esoméprazole, fentanyl, furosémide, sels d’or, métronidazole, naproxene, oxaliplatine, phénytoïne, propranolol, ranitidine, rifampicine, triméthoprime… (Liste non exhaustive)

69

Annexe2

HITExpertProbabilityHEPScore

Nom: Sexe: Service:

Prénom: Dateinclusion:

DDN:

1-Amplitudedelachutedesplaquettes(mesuréeduchiffredebaseaunadirdepuisl’expositionàl’héparine) <30% -1 30-50% 1 >50% 3

2-Délaidesurvenuedelathrombopénie:• →sansexpositionrécenteàl’héparine(TIHtypique)

Chutedesplaquettes<4joursd’expositionàl’héparine -2Chutedesplaquettesà4joursd’expositionàl’héparine -2Chutedesplaquettesentre5-10joursd’expositionàl’héparine -3Chutedesplaquettesentre11-14joursd’expositionàl’héparine -2Chutedesplaquettes>14joursd’expositionàl’héparine -1

• →avecexpositionàl’héparinedansles100jours(TIHd’apparitionrapide)• Chutedesplaquettes<48hdere-expositionàl’héparine 2• Chutedesplaquettes>48hdere-expositionàl’héparine -1

3-Nadir(numérationplaquettairelaplusbasse):• ≤20G/L -2• >20G/L 2

4-Thrombose(sélectionnerunseulitem):• →TIHtypiquesuspectée:

• Nouvellethromboseveineuseouartérielle≥4joursd’expositionàl’héparine 3• Extensiond’unethromboseveineuseouartériellepréexistantesoushéparine 2

• →TIHd’apparitionrapide:• Nouvellethromboseveineuseouartérielleaprèsexpositionàl’héparine 3• Extensiond’unethromboseveineuseouartériellepréexistantesoushéparine 2

5-Nécrosecutanée:• Nécrosecutanéeauxsitesd’injectionsous-cutanésdel’héparine 3

6-Réactionsystémiqueaigüe:• Réactionsystémiqueaigüeaprèsinjectiond’héparineenbolusIV 2

7-Saignements:

• Saignements,pétéchiesouhématomesétendues -1

8-Autrescausesdethrombopénies(sélectionnertouslesitemsquis’appliquent):• Présenced’unepathologieavecthrombopéniechronique -1• Introductiond’unmédicamentthrombopéniantnon-héparinique -2• Infectionsévère -2• CIVDsévère(fibrinogène<0.1g/LetD-dimères>5000ng/mL) -2• Dispositifintra-artérielàdemeure(ballonintra-aortique,ventilationmécanique,ECMO) -2• Circulationextra-corporelle(CEC)dansles96h -1• Pasd’autrecauseévidente 3

70

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75

Vu,leDirecteurdeThèse

Vu,leDoyen

delaFacultédeMédecinedeTOURS

76

Thèse 2015. – 20016.

D O C T O R A T e n M E D E C I N E

Diplôme d’Etat

D.E.S. de Biologie Médicale

Présentée et Soutenue le 27 Octobre 2016 Dépôt de sujet de thèse, proposition de jury,

NOM : TARLE Prénoms : Nicolas – Romain – Aymeric Date de naissance : 25/09/1986 Nationalité : Française Lieu de naissance : Cambrai (Nord) Domicile : 134 Avenue Charles Péguy. 45800 Saint Jean de Braye Téléphone : 06 74 09 67 54 Directeur de Thèse : Mme Claire Pouplard, Professeur, Praticien hospitalier, UFR Pharmacie – TOURS Titre de la Thèse : L’optimisation des tests ELISA anti-FP4 modifié est-elle possible en utilisant un anticorps monoclonal de thrombopénie induite par l’héparine (5B9) ?

JURY Président : M. Yves Gruel, Professeur, Praticien hospitalier, UFR Médecine - TOURS Membres : Mme Claire Pouplard, Professeur, Praticien hospitalier, UFR Pharmacie – TOURS M. Hervé Watier, Professeur, Praticien hospitalier, UFR Médecine – TOURS M. Gilles Paintaud, Professeur, Praticien hospitalier, UFR Médecine – TOURS Avis du Directeur de Thèse Avis du Directeur de l’U.F.R. à Tours, le Signature Signature

77

TARLÉNicolas77pages–10tableaux–17figures–2annexes.Résumé:Lediagnosticbiologiquedesthrombopéniesinduitesparl’héparine(TIH)reposesurladétectiond’anticorps(Ac)dirigéscontreleFP4modifiéparl’héparine.LestestsELISAsontcourammentutilisésdansnoslaboratoiresetleurcompterendudoitmentionnerleseuildepositivitédutestainsiquel’absorbancemesurée,unevaleursupérieureà1étantassociéeàuneplusforteprobabilitédeTIH.Cependant,l’ECATrapportedescoefficientsdevariationsinter-essaiscomprisentre16et37%selonlestrousses.NousavonsrécemmentdéveloppéunAcmonoclonald’isotypeIgG(5B9),possédantunfragmentFchumainetquireconnaîtspécifiquementleFP4modifiéparl’héparine.L’objectifdecetravailaétéd’évaluerl’intérêtd’utilisercetAc5B9commecalibrantdesdifférentestroussescommercialisées:ASSERACHROM®HPIA–IgG(Stago),HAT45G®(GTI)etZYMUTEST®HIAIgG(HYPHEN).Lorsdechaqueexpérimentation,unegammed’étalonnageaétéréaliséeavecdesconcentrationscroissantesd’Ac5B9(0à10μg/mL)etlesabsorbancesmesuréesaveclesplasmasde7patientspositifsontétésystématiquementconvertiesen‘équivalent5B9’.L’expressiondesrésultatsdeces7patientsenéquivalent5B9n’apaspermisdediminuerlavariabilitéinterkits.Dansunsecondtemps,nousavonsévaluél’intérêtdel’Ac5B9pourstandardiserlesrésultatsauseind’uneseuletrousse,latrousseAsserachromHPIAIgG(Stago).Danscebut,nousavonsréalisélestestsdanslesconditionsextrêmesenfaisantvarierlatempératuredelapièceainsiquelestempsd’incubationdel’échantillon,del’immunoconjuguéetdusubstrat.Quelquessoientlesconditionsexpérimentalestestées,lacourbedecalibrationestd’allurehyperboliqueavecuncoefficientdecorrélationégalà0.99.L’expressiondesrésultatsenéquivalent5B9diminueconsidérablementleCVdedeuxéchantillons,C1etunPoolau1/5ème,maispasceluidelaréférenceHPIApermettantdedéfinirleseuildepositivitédutest.UnprojetmulticentriqueprospectifencollaborationaveclasociétéStagoetvisantàétudierl’intérêtdel’utilisationducalibrant5B9aveclatrousseASSERACHROM®HPIA–IgGestencoursderédaction.UneanalyseencourbeROCpermettraderedéfinirleseuildepositivitédutest.Motsclés:Thrombopénieinduiteparl’héparine,ELISA,FP4,Anticorps,standardisationJury:PrésidentduJury:ProfesseurYvesGruel,Hématologie,transfusion,PU-PH,FacultédeMédecine-ToursMembresduJury:ProfesseurClairePouplard,Hématologie,FacultédePharmacie-ToursProfesseurHervéWatier,Immunologie,PU-PH,FacultédeMédecine-ToursProfesseurGillesPaintaud,Pharmacologiefondamentale,pharmacologieclinique,PU-PH,FacultédeMédecine–Tours

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