Marquages immunohistochimiques IMMUNOCYTOCHIMIE...

APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATIONNEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE

I - Immunocytochimie : généralités

II - Préparation des tissus

A - Fixation

B - Inclusion

III - Traceurs

IV - Microscopie de fluorescence

A - Microscopie de fluorescence conventionnelle

B - Microscopie confocale à balayage laser

V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence

VI - Microscopie électronique

A - Microscopie électronique en transmission

B - Techniques de marquages en microscopie électronique

C - Applications aux marquages multiples

IMMUNOCYTOCHIMIE

Technique directe Technique indirecte

Anticorps

Traceur

Antigène

Tissu

Marquages immunohistochimiques

Test de spécificité par compétition

Sensibilité

Ac I

Ac II

Traceur 2Traceur 1

Marquages multiples

Marquages multiples

- Spécificité respective des anticorps et des méthodes de révélation

- Absence de réactions croisées

Spécificité

- Sensibilité respective des anticorps, des réactifs et des systèmes de révélation

- Limitations liées au masquage potentiel de sites antigéniques par le premier systèmede révélation

- Limitations liées à l encombrement stérique (cas de la détection d antigènes colocalisés au sein d un même élément cellulaire)

Sensibilité




A - Fixation

B - Inclusion

III - Traceurs









Fixation des tissus

Finalité:- Immobiliser les molécules in situ (antigènes)- Préserver l aspect (ultra)structural du tissu

Inconvénients:- Modification des antigènes pouvant changer leur affinité pour lesanticorps- Réticulation du tissu freinant ou empêchant la diffusion des réactifs

Choix du fixateur:- Selon le type d observation envisagée (m. optique ou électronique)- Selon les structures à préserver- Selon les molécules à immobiliser

Compromis

Principaux fixateurs

Déshydratants alcools, acétone, lyophilisation

Agents précipitants acide picrique, acide acétique

Agents de pontage chimique formaldéhyde, glutaraldéhyde, acroléine

Acide tannique

Tétroxyde d osmium (acide osmique)

Principaux fixateurs

Fixateurs aldéhydiques

Réagissent essentiellementavec les groupements aminésdes protéines

Tétroxyde d osmium (acide osmique)

Réagit principalement sur les doubles liaisons insaturéesdes lipides. Indispensable pour une bonne préservation desmembranes en microscopie électronique.

Utilisé en post-fixation après la fixation aldéhydique

Action des fixateurs sur les tissus

Inclusion

Résines époxy (hydrophobes) Epon, Araldite, Spurr

Résines acryliques (généralement hydrophiles) LR-White, Lowicryl, Métacrylates

Les monomères époxy forment un réseau depolymères branchés en présence de diamines

- Peuvent polymériser à basse température sous UV- Un peu instables sous le faisceau d électrons- Moins ramifiées et plus poreuses- N établissent pas de liaisons covalentes avec les constituants cellulaires- Perméables après polymérisation- Faible viscosité- Dureté un peu irrégulière (coupe plus difficile)

- Polymérisation à chaud (60°C)- Stables sous le faisceau d électrons- Préservation optimale des détails ultrastructuraux- Viscosité élevée- Imperméables après polymérisation- Bonne dureté pour la coupe




A - Fixation

B - Inclusion

III - Traceurs









Traceurs fluorescents

Fluorescéine (vert)

Rhodamine (rouge)

Texas red (rouge)

Phycoérythrine B et R (rouge)

Cyanines (vert à infrarouge)

Alexa (bleu à infrarouge)

Fluorescence

Absorption Émission

e1=h/ 1e2=h/ 2

e1 > e2

1 < 2

orbital basse(état de repos)

orbital haute(état excité)

noyau noyau

Excités par le rayonnement d une lampe à vapeurs de mercure ou d unlaser, les fluorochromes émettent une lumière de plus grande longueurd onde que la lumière d excitation

Principaux fluorochromes

Principales sources d excitation

Propriétés ondulatoires de la lumière

Autres traceurs

Enzymatiques

Peroxydase Phosphatase alcaline Glucose oxydase

Particulaires

Ferritine (10nm) Or colloïdal (1nm à 20nm)

Radioactifs

Tritium (3H) Iode (125I)

Révélation photographique(radioautograhie sur film ou sur émulsion nucléaire selon leniveau de résolution souhaité)

Révélation à l aide d un substrat et d un chromogène(peroxydase : H2O2 + 3,3 -diaminobenzidine)

Visualisation directe ou aprèsintensification à l argent(or colloïdal, selon la taille des particules)




A - Fixation

B - Inclusion

III - Traceurs









Microscope à fluorescence conventionnel

Principe de fonctionnement du microscope confocal

Caractéristiques:Caractéristiques:

source d’illumination laser ponctuelleexcitation au point focal dans l’échantillonun diaphragme de détection

illumination

échantillonlame

lamelle

Conventionnel Confocal

laser

excitation

miroirdichroïque

diaphragmed’émission

lumière réfléchiehors focus

lumièreréfléchie

objectif

plan focaléchantillon

photomultiplicateur

diaphragme de détection"pinhole"

hors focus

Principe de la microscopie Principe de la microscopie confocaleconfocale

coupe optique (2D)coupe optique (2D)

Z-Série (3D)Z-Série (3D)

Time Time series series (4D)(4D)

t0 t1 ….tX

Y

Z

Microscopie Microscopie confocale confocale à balayage laserà balayage laser

Microscope Leica TCS SP2 avec AOTF et détection spectrale

Ensemble de sources laser : argon et hélium/néon

Laser pulsé femtoseconde Coherent Mira 9000 accordable

Centre de Microscopie et ImagerieCentre de Microscopie et ImagerieStation de microscopie Station de microscopie confocaleconfocale




A - Fixation

B - Inclusion

III - Traceurs









Lapin

Souris

Chèvre

Anticorps primaires d espèces différentesAnticorps secondaires de même espèce

Doubles marquages immunocytochimiques

Lapin Souris

Lapin(sérum non immun)

Chèvre

Lapin

Anticorps primaires d espèces différentesAnticorps secondaires d espèces différentes

Doubles marquages immunocytochimiques

Spectres d émission des fluorochromeset cross-talk

400 450 500 550 600 650 700 750 800

Longueur d’onde (nm)

0

20

40

60

80

100 Alexa-488 Alexa-546 Alexa-633

Cross-talk

Cross-talk : sélection du signal émisCross-talk : sélection du signal émis

400 450 500 550 600 650 700 750 800Longueur d’onde (nm)

0

20

40

60

80

100 Alexa-488 Alexa-546 Alexa-633

Filtres bande-passe

ZT02

CO

ZT18

CO

DM

VL

GFAP/VIP

Plasticité gliale dans le NSCPlasticité gliale dans le NSC

0,64 µm

Analysesemi-quantitative

Série Z

Innervation Innervation glutamatergique glutamatergique des neurones à VIPdes neurones à VIP du NSCdu NSC

Superposition

*

ZT02 ZT180.0

0.5

1.0

1.5

2.0

0

30

60

90

120

150

180

1 11 21 31 41 51

distance (px)

gra

y l

ev

els

BassoonVIPvGlut1-2

Innervation Innervation glutamatergique glutamatergique des neurones à VIPdes neurones à VIP du NSC:du NSC:Analyse Analyse semi-quantitativesemi-quantitative

Guillaumond et al., J. Neurochem., 2007

VIP

P-ERK1/2

GRP

P-ERK1/2-

GRP

GRP/VIP

P-ERK1/2-

VIP/GRP

Expression neuronale de P-ERK1/2 dans le NSCExpression neuronale de P-ERK1/2 dans le NSC

Nuit

1 - VIP

3 - GRP

5 - GRP/VIP

2 - P-ERK1/2

6 - P-ERK1/2-

VIP/GRP

4 - P-ERK1/2-

GRP

VIP VIP/GRPGRP

AVP non identifiés

21%

15%64%

26%

20%

54%

Jour

ZT18

Distribution spatiale et temporelle de P-ERK1/2 dans le NSCDistribution spatiale et temporelle de P-ERK1/2 dans le NSC

Guillaumond et al., J. Neurochem., 2007

TP : Expression et colocalisation neuronale de marqueurs rythmiques:Triple marquage P-ERK1/2/VIP/GRP dans le NSC chez le rat

Protocole de marquage

Fixation par perfusion intra-cardiaque de paraformaldéhyde 4% Echantillonnage de l hypothalamus antérieur contenant le NSC sur coupes frontales de 50 µm (vibratome)

Jour 1: Rinçages dans un tampon Tris pH 7,5 (3X10 min) Préincubation dans du sérum normal de chèvre (NGS) 30% + Triton X-100 0,2% (15min) Anti-P-ERK1/2 (monoclonal souris) 1/200 dans Tris + NGS 1% (4°C, sous agitation)

Jour 2 : Rinçages Tris + NGS 1% (3X10 min) Chèvre anti-IgG de souris conjugué à Alexa-568 (1/200, 2h) Rinçages Tris + NGS 1% (3X10 min) Anti-VIP (polyclonal lapin) 1/1000 + Anti-GRP (polyclonal cobaye) 1/1000 dans Tris + NGS 1% (4°C, sous agitation)

Jour 3 : Rinçages Tris + NGS 1% (3X10 min) Chèvre anti-IgG de lapin conjugué à FITC (1/200) +

Chèvre anti-IgG de cobaye conjugué à Alexa-647 (1/200) (2h) Rinçages Tris (3X10min) Montages des coupes sur lames gélatinées dans un tampon phosphate glycériné

Conservation des coupes à -20°C




A - Fixation

B - Inclusion

III - Traceurs









Microscopie électroniqueen transmission

Centre de Microscopie et ImagerieCentre de Microscopie et ImagerieStation de microscopie électroniqueStation de microscopie électronique

Microscope électronique à transmission Philips CM 10

Centre de Microscopie et ImagerieCentre de Microscopie et ImagerieStation Station dd ultramicrotomieultramicrotomie

Ultramicrotome Reichert Ultracut S

Module d’ultracryotomie FCS




A - Fixation

B - Inclusion

III - Traceurs









Techniques de marquage en neurobiologieappliquées à la microscopie électronique

RADIOAUTOGRAPHIE

Principe:Détection d un signal radioactif émispar le tissu à l aide d une émulsion« nucléaire » liquide


Applications:

Renouvellement des constituantscellulaires

Etude du transport axonal

Traçage de voies nerveuses

RADIOAUTOGRAPHIE

Visualisation des sites de capture des monamines(terminaisons catécholaminergiques et sérotoninergiques)

Organe vasculaire de la lame terminale Noyau suprachiasmatique

Radioautographie après capture de (3H)-monoamines(microscopie optique)

(3H)5-HT

(3H)5-HT

(3H)DA

Radioautographie après capture de (3H)-sérotonine(microscopie électronique)

organe vasculaire de la lame terminale Noyau arqué


IMMUNOCYTOCHIMIE

Principe:Détection d une substanced intérêt après application d unanticorps spécifique et révélationdes complexes antigènes-anticorps à l aide d un marqueur.

Les marqueurs

Enzymatiques

Peroxydase révélée par:

Diaminobenzidine Dihydrochlorure de benzidine Tétraméthyl benzidine

Radioactifs

Tritium (3H) Iode (125I)

Particulaires

Ferritine (10nm) Or colloïdal (1nm à 20nm)

Techniques de marquage immunocytochimique

Révélation des complexes antigènes-anticorps: Techniques directes Techniques indirectes

Application des anticorps: Avant inclusion (pre-embedding) Après inclusion (post-embedding) Combinaison des deux approches (marquages multiples)

Méthode Peroxydase-Anti-Peroxydase (PAP)

3

2

1

ETAPES

1

2

3

Méthode Avidine-Biotine-Peroxydase (ABC)

Anticorps primaire

Complexe ABC

Anticorps secondaire biotinylé

Anticorps primaire

Descarries et al., J. Comp. Neurol., 375, 167-186, 1996

Innervation dopaminergique du neostriatum

Immunomarquage tyrosine hydroxylase(peroxydase, coupes sériées)

Eminence médiane : Terminaisons dopaminergiques tubéro-infundibulaires

Immunomarquage (Tyrosine Hydroxylase) Radiomarquage après capture de (3H)-dopamine

Epv : Espace périvasculaire* Terminaisons non marquées

T : pied tanycytaireFlêches : fenestrations de l endothélium vasculaire

Epv




A - Fixation

B - Inclusion

III - Traceurs









Marquages combinés

Radioautographie (monoamines) / immunocytochimie

Noyau suprachiasmatique : interactions sérotonine (3H-5-HT) / GABA (anti-GAD)

Marquages combinés

Immunocytochimie associant différents marqueursen pré et/ou post-enrobage

--------------------------------------------------------------------------

Le choix de l approche doit tenir compte:

de l origine des anticorps primaires disponibles (espèces différentes ou même espèce)

de la sensibilité et/ou de la résolution recherchée(s)

des limitations respectives des méthodes qui seront associées

Double marquage en pré-enrobageImmunocytochimie (peroxydase)+ radioimmunocytochimie (125I)

Noyau paraventriculaire : colocalisation tyrosine hydroxylase/NPY

Double marquage en pré-enrobagePeroxydase / or 1nm intensifié à l argent

1µm

Noyau suprachiasmatique : innervation sérotoninergique des neurones à vasopressine

Double marquage en pré-enrobagePeroxydase révélée à l aide de chromogènes distincts

Benzidine dihydrochloride3,3 -diaminobenzidine

Anti-A(espèce a)

Anti-B(espèce b)

Anti-IgG espèce a Anti-IgG espèce b

(espèce c) (espèce c)

PAP(espèce a)

PAP(espèce a)

PAP(espèce b)

Double immunoperoxydase + radioautographie

+

capture(3H)5-HT

VIP GABA

5-HT

Triple marquage

Benzidine dihydrochloride3,3 -diaminobenzidine

Anti-A(espèce a)

Anti-B(espèce b)

Anti-IgG espèce a Anti-IgG espèce b

(espèce c) (espèce c)

PAP(espèce a)

PAP(espèce a)

PAP(espèce b)

Double marquage en post-enrobage(or colloïdal 5nm vs 15nm)

Anticorps primaires d espèces différentes

Anticorps primaires de même espèce

Double marquage en post-enrobage(or colloïdal 5nm vs 15nm)

Face A

Face A

Face B

Face B

Face A

Face B

Bertini and Kiss, Neuroscience, 42, 237-244, 1991

Co-localisation CRF/AVP dans l éminence médiane

Contrôle

Surrénalectomie

A, B : parvocellulairesC : magnocellulaires

D : parvocellulairesE : magnocellulaires

Double marquage immunocytochimique à l or colloïdal

5 nm : CRF 15 nm : AVP

Double marquage en pré/ post-enrobage(peroxydase/or colloïdal 15nm)

Innervation sérotoninergique et GABA-ergique des neurones du noyau rouge

Marquages immunohistochimiques IMMUNOCYTOCHIMIE...

Documents

Transcript of Marquages immunohistochimiques IMMUNOCYTOCHIMIE...