Maitre 1985

BIOCHIMIE, 1985, 67, 215-225

Caract6risation de r6cepteurs sp6cifiques /t l'cestradiol, induction de la vitellog6nine et de son m R N A dans le foie de truite arc-en-ciel (Salmo gairdnerii).

Jean-Louis M A I T R E , Louis M E R C I E R , Laurence D O L O et Yves V A L O T A I R E .

Laboratoire de Biologie Moldculaire, Campus de Beaulieu, UER SVE, Universitd de Rennes L 35042 Rennes Cedex. ERA C.N.R.S. no 56Z

(Refu le 5-11o1984, acceptd apr~s rdvision le 9-l-1985).

R~sum~ - - Chez toutes les espdces ovipares ~tudides h ce jour, la synthOse et l'utilisation de la vitellogdnine (Vg) est un phdnom~ne intimement lid ~ la reproduction. La synth~se de la Vg dans le foie de truite arc-en-ciel (Salrno gairdnerii) est sous la ddpendance de l'cestradiol (E2) qui agit vraisemblablement selon le schdma classique du m~canisme d'action des hormones stdroMes. AprOs liaison de l'hormone ~ un rdcepteur spdcifique, le complexe ¢estradiol-rdcepteur peut interagir avec la chromatine et moduler l'expression du gone de la Vg, ce qui se traduit par une augmentation de la synthOse de RNAm Vg et de Vg. Nous montrons ici : (1) la prdsence de rdcepteurs spdcifiques des oestrogdnes (constante de dissociation Ko = 1,5 x 10-9M pour E2) dans le cytosol du foie de truite mdle; (2) que le foie du male constitue un contr61e experimental idOal au niveau ~( zdro ~, permettant de suivre, aprOs stimulation par E2, la cindtique d'induction du mRNA Vg par hybridation avec le cDNA Vg; et (3) l'apparition de Vg dans le sdrum en utilisant une technique de dosage original (rocket immuno-dlectrophordse). Le modkle vitellogdnine du foie de truite mMe et les techniques originales mises au point seront trOs prdcieuses pour dtudier l'influence des facteurs endogOnes et exogdnes sur les diffdrentes dtapes (rdcepteurs, transcription, traduction) de la rdgulation de la synthOse de Vg.

Mots-cl~ : vitellog~nine / ~stradiol / r6cepteurs / RNAm vitellog~nine / truite..

S u m m a r y m In all egg laying vertebrates, synthesis and use of vitellogenin (Vg) are intimately bound to the.active phase of reproduction. In the liver of the rainbow trout (Salmo gairdnerii), Vg synthesis is influenced by estradiol (E2) which, we believe, acts through the classical mechanism of steroid hormone action. After binding of the hormone to a soluble specific receptor protein, the estradiol-receptor complex can interact with chromatin and modulate the expression of Vg genes, leading to increased synthesis of specific mRNA and Vg. We show here : (i) the presence of specific cestrogen receptors (dissociatiOn constant KD ~-- 1.5 x lO-gM for E2) in the cytosol of the male trout liver. (ii) The male liver, offering, an ideal experimental control of "zero" background, we followed -- in the liver of mide trouts 1 the kinetics o f induction of Vg mRNA by hybridization with Vg cDNA, after Ez stimulation; and (iii) the apparition of Vg in the serum by using an original rocket immuno-electrophoretic,technique. The male trouts Hver vitellogenin model and the original techniques we developed will be very useful to,study the influence of endogenous and exogenous factors on t.le different steps (receptors, transcription, translation) of vitellogenesis regulation.

Key-words : vitellogenin / estradiol / receptors / mRNA viteliogenin / trout.

216 Jean-Louis Maitre and coll.

Introduction

Chez les vert6br6s ovipares, les prot6ines du vitellus sont synth6tis6es dans le foie sous forme d ' une grosse mol6cule pr6curseur : la vitellog6- nine qui se scinde en phosvi t ine et lipovitelline apr6s incorpora t ion par les oocytes [1-4].

La synth~se et l 'uti l isation de la vitellog6nine sont des ph6nom~nes in t imement li6s fi la repro- duct ion. C o m m e chez les autres vert6br6s, la synth6se de vitellog6nine chez les poissons est sous le contr61e direct des oestrog6nes : cestradiol [5-10] et oestrone [11, 12]. Cependan t , fi part les t ravaux de Roach et Davis [13] sur le poisson-chat et, p lus r6cemment, ceux de Chen [14] chez la truite arc-en-ciei, il n 'existe gu~re de donn6es sur les m6canismes mol6culaires de la r6gulation de la synth6se de cette prot6ine chez les poissons.

L 'obje t de ce travail a 6t6 de montrer , :~ l 'a ide de techniques que nous avons mises au point ou adapt6es (dosage de la vitellog6nine et de son R N A messager), que les diff6rentes 6tapes du m6canisme mol6culaire d 'ac t iva t ion des g6nes de la vitellog6nine : l iaison de l 'cestradiol ~t un r6cep- teur sp6cifique, induc t ion ou modif ica t ion de l 'expression des g6nes conduisan t ~ la synth~se de m R N A et de vitellog6nine, 6taient 6galement pr6sentes chez la truite arc-en-ciel.

Materiel et m~thodes

Animaux et produits chimiques

Les truites arc-en-ciel (Salmo gairdnerii) en prove- nance de la pisciculture de Gournay/Aronde (Oise) sont 61ev~es dans les bassins du Laboratoire de Physio- logie des Poissons (I.N.R.A Rennes) dans un syst~me d'eau recycl6e [15] jusqu'fi utilisation pour les exp6rien- c e s .

Les r~actifs ont 6t6 obtenus chez les fournisseurs ci-apr~s indiqu6s: 17l]-oestradiol (E2), ~estrone (E~), cestriol (E~), di6thyl~tilbestrol (DES), 5ct-dihydrotestos- t6rone (5ct-DHT), 5ct-androstane-3[3, 17[3-diol (3[3-diol), bleu de Coomassie, bromure d'6tbidium, ficoli, polyvi- nylpyrrolidone, s6rum albumin bovine (BSA), DNA de testicule de saumon (Sigma Chemical Company, Saint-Louis, U.S.A.). D6oXydbonucl6ase I, DNA po- lym6rase I, les 4 d6oxyribonucl6otides dATP, dCTP, dGTP et dTI~P (Boehringer Mannbeim, R.F.A.). D6oxy (I',2',5-3H) cytidine 5' triphosphate 50 Ci/mmo]e, m6thyl (1',2',5-~H) thymidine 5' triphosphate 109 Ci/ mmole, (6,7)H)1713-cestradiol 55Ci/mmole (Amers- ham France SA).

Preparation du cytosol

Le cytosol a 6t6 pr6par6 par homog6n6isation du foie dans 4ml de tampon I (20mMTris, 1,5 mM EDTA, l mM D'IT, 10mM Na:MoO~) pH 7,4. L'ho- mog6nat a 6t6 centrifug6 fi 3 5 0 0 0 x g ~t 0°C pendant 20minutes et ensuite fi 2 0 0 0 0 0 x g ~t 0°C pendant 90 minutes.

Purification partielle des r~cepteurs

La pr6cipitation fractionn6e des prot6ines solubles a 6t6 r6alis6e sur une fraction de cytosoi ~t des concentrations en (NH4)2SO4 (AS) de 30 % et 50 % de saturation. Une solution satur6e de (NH~)2SO~ dans le tampon I a 6t6 ajout6e goutte :~ goutte, avec agitation, ~t des fractions de cytosol. Apr~s 30 mn, la suspension a 6t6 centrifug6e ~ 3 600 x g pendant 10 minutes. Les culots AS 30 % et AS 50 % ont ensuite 6t6 dissous dans le tampon I, dans un volume d6fini par le nombre d'essais :~ traiter.

Mesure de la liaison de 3H-E2

Les constantes de dissociation ont 6t6 d6termi- n6es en ajoutant des concentrations croissantes (7,5x 10-~°M fi 5x 10-SM) de (3H)-E2 --- un exc~s (100fois) de (~H)-E2, ~ 751.d de cytosol brut ou de preparation partiellement purifi6e de r6cepteurs. Le volume final de chaque essai a 6t6 ajust6 h 250 I.tl.

La sp6cificit6 de la liaison a 6t6 d6termin6e par addition de 75 I.tl de cytosol brut h des fractions de 175 I11 de (3H)-E2 (2,88 x 10-gM) contenant des concentrations croissantes de st6roides comp6titeurs darts le tampon I.

Apr~s incubation, pendant 3 h ~ 0°C, l 'hormone radioactive li6e aux r6cepteurs a 6t6 mesur6e par addition de 25 I.tl de charbon-dextran ~ I0% (DCC) dans le tampon I, centrifugation fi 3 600 x g pendant 10 minutes fi 0°C et comptage de 150 lal de surnageant dans 10 ml d'ACS (Amersham). La liaison non sp6cifi- que a ~t6 d6termin~e par la quantit6 de (3H)-E2 li6e en pr6sence d'un exc6s de'( IH)-E2. Elle a 6t6 soustraite des autres valeurs pour obtenir la quantit6 de (3H)-E2 li6e sp6cifiquement.

Extraction des st~roMes et chromatographie sur couche mince

Le cytosol incub6 pendant 3 h fi 0°C en pr6sence de (3H)-E2 (5 x 10-gM) a ~t6 extrait par 2 fois 5 volumes d'un m61ange cyclohexane-ac6tate d'6thyle (1/1). Apr6s centrifugation ~t 3 600 x g pendant 10 minutes, la phase organique a 6t6 6vapor6e :~ sec. L'extrait see a 6t6 repris par du m6thanol contenant les st6roides t6moins El, E2 et E3 (1 mg/ml) et d6pos6 sur plaque (20 x 20cm) de gel de silice. La s6paration des st6roides a alors 6t6 effectu6e ~ temp6rature ambiante dans le syst6me de solvants chloroforme-ac6tate d'6thyle (80/20). Apr6s rep6rage de la position des st6roides t6moins :~ 254 et 366 nm, le gel de silice a 6t6 gratt6 par fraction de

Expression du g~ne de la vitellog~nine de la truite 217

0,5 x I cm. Les st6roides ont alors 6t6 extraits de chaque fraction par 2 x 2 ml d'ac6tate d'6thyle, 6vapor6s ~ see, repris par 200 lal de m6thanol, et compt6s dans 2 ml d'ACS.

Extraction des RNA

Les foies des animaux sont pr61ev6s rapidement, congel6s dans I'azote liquide et stock6s au cong61ateur g~ - 8 0 ° C jusqu'fi utilisation. Le RNA total est extrait par la technique d'Auffray et Rougeon [16], modifi6e par Tenniswood et Simpson [17]. Le RNA poly A + a 6t6 pr~par6 par chromatographie sur oligo-dT cellulose d'apr6s la technique d'Aviv et Leder [18], a~,ec un taux de r6cup6ration de 10 g~ 30 lag de RNA poly A ÷ par mg de RNA total [19]. Les pr6parations du RNA sont analys6es par 61ectrophor~se sur plaque d'agarose 1,2 % dans des conditions d6naturantes [201 pour s'as- surer de la qualit6 des pr6parations. La concentration en RNA est d6termin6e sur une aliquote par mesure de l'absorption ~ 260 nm.

Hybridation du RNA messager vitellog#nine

Les RNA sont immobilis6s par liaison covalente sur des filtres de papier trait6s ~ l'amino-thio-ph6nol et diazot6s selon la technique d6cr[te par Seed [21]. Des aliquotes de 10 lal contenant 10 lag de RNA total ou 5

10 ng de RNA poly A ÷ sont d6pos6es sur les filtres et incub6es 12 h entre 2 feuilles de parafilm scell6es. Les hybridations sont ensuite r6alis6es dans les conditions d6crites par Wahl et aL [22] puis les filtres sont brfil6s dans un ~ autooxidizer)> Packard Tricarb mo- d61e 306, et la radioactivit6 d6termin6e par scintillation liquide au moyen d'un appareil Isocap 300 (Nuclear Chicago).

La sonde utilis6e, pr6par6e en collaboration avec M. Tenniswood, D. Bailey et J.R. "rata (National Institute for Medical Research, Mill Hill, Londres), est un plasmide pAT 153 dans lequel a 6t6 ins6r6 un fragment de 0,6 Kb correspondant ~ une s6quence du RNA messager de la vitellog6nine [23]. Cette sonde a 6t6 caract~ris6e par Northern Blot (Fig. 1), e ta 6t6 marqu6e par ~t nick translation >> en utilisant les d6oxynucl6oti- des triphosphates tdti6s. L'activit6 sp6cifique est com- prise entre 7 et 12 laCi/lag de DNA.

Dosage de la vitellog~nine

Le sang est pr61ev6 chez les animaux en exp6rience par ponction dans la veine caudale ~ l'aide d'une seringue h6parin6e. Apr6s 24 h de d6cantation, 1~ s6rum est obtenu par centrifugation gl 2 000 x g. Les 6chantil- Ions sont ensuite stock6s au cong61ateur ~ -20°C. Le taux de vitellog6nine est d6termin6 par une technique d'immuno61ectrophor6se que nous avons misg au point apr~s pr6paration d'un anticorps sp6cifique. Les films de plastique (F.M.C. Gelbond films) sont d6coup6s en carr6s de 5 cm de c6t6. L'anticorps antivitellog6nine est dilu6 au 1/400 °dans la solution d'agarose fi 1%. Apr~s

refroidissement de l'agarose, on r6alise 9 puits de 2 mm de diam6tre par succion de ragarose h raide d'une aiguille reli6e ~ une trompe gt vide. Neuf 6chantillons de 2 I11 peuvent ainsi ~tre analys6s par plaque de 5 cm de c6t6. Apr6s 61ectrophor6se (18h ~ temperature ambiante, voltage constant=2,3 volts/cm) les plaques sont lav6es pendant 24 h dans le NaCI A 0,9 % et 1 h dans l'eau distill6e. Elles sont ensuite s6ch6es sur papier Whatman 3 MM fi l'6tuve gt 40°C et color6es au bleu de Coomassie. La quantit6 de vitellog6nine est d6termin6e par mesure de la hauteur du pie d'immuno- pr6cipitation par comparaison avec des pics standards obtenus avec des quantit6s croissantes de vitellog~nine purifi6e.

Dosage de l'oestradiol

I1 a 6t6 r6alis6 par Radio Immuno Assay (R.I.A.) au Laboratoire de Physiologie des Poissons [24].

Resultats

Ddtermhlation des caractdristiques du rdcepteur soluble du 17fl-oestradiol

L' incuba t ion de (6,7-3H)-E2 _ un exc~s (100 fois) de (~H)-E2 et de cytosol , ~t 0°C, permet de mont re r une liaison sp6cifique du 17[3-oestradiol dans le cytosol de foie de truite. Cette liaison est maximale d~s 30 minutes et reste stable pendant au moins 2 4 h (L. D o l o et L. Mercier, r~sultats non publi6s).

La mesure des param~tres de liaison du 1713mestradiol darts le cytosol a et6 effectu6e apr6s 3 h d ' incuba t ion h 0°C. Dans ces condit ions, on n 'observe pas de t ransformat ion du (6,7-3H)-E2 (Fig. 2).

La repr6sentat ion de Sca tchard de la liaison du 1713-cestradiol dans le cytosol n 'es t pas toujours lin6aire, sugg6ran t la pr6sence d ' a u moins 2 types de sites de liaison. Par contre, apr6s pr6cipi ta t ion par (NH4)2SO4, on retrouve dans la fraction AS 30 % un composan t un ique de haute affinit6 KD---- 1,52x 10-aM. La pr6cipi tat ion fractionn6e des prot6ines du cytosol par (NH4)2SO4 permet de s6parer les sites de haute affinit6 (fraction AS 30 %) des sites de faible affinit6 (fraction AS 50 %) et permet une purif icat ion partielle des r6cepteurs de l 'cestradiol. Le nombre de sites de liaison dans la fract ion AS 30 % ( n = 1,69 x 10-~3moles/mg de prot6ines) est en effet s u p 6 d e u r ~ celui mesur6 dans le cytosol total (n = 5,81 x l 0 - ~4 moles / rag de prot6ines) (Fig. 3).

La Figure 4 mont re la sp~cificit~ 6troite de la liaison du 1713-eestradiol. Parmi les st6ro'fdes

218 Jean-Louis Maitre and coil

1 2 m

. !

, i

i

~_Vg m RNA

28S

¢..18 S

FzG. 1. - - Northern Blot des RNA.totaux : 101tg~ de RNA total de foies de tndtes m~les tdmoins (1) et stimulds ~ l'eestradiol (2) ont dt~ transforms sur papier activ~ gt raminothioph~nol nprds ddnaturation et ~lectrophor~se sur gel d'agarose 1,2 %.

Le papier a 6t6 ensuite hybrid~ dans les conditions d~crites avecla sonde vitellog6nine marqu6e au 32p, puis autoradiographi~e (24 h d'exposition ~ --80°C; film Kodak X Ray Film DEF5). La position des RNA 28S et 18S r~v~l~e au bromure d'fithydium parall~lement sur le gel est indiqu,~e par les fl~ches.

Expression du gdne de la vitellogdnine de la truite

I I

0 5 10 15

FIG. 2. - - S~paration par chromatographie sur gel de silice, dans le systkme chlorofonne-ac~tate d'dthyle (80/20), des stdrot'des extraits apr~s incubation du O'tosol pendant 3 h £t O'C, en presence de (6,7-JII~E: (5 x ]O-~M).

La position des stEroides t~moins est indiquEe par un trait plein situ6 sous raxe des abscisses (E~=~estriol, E2=cestradiol, E, = eest rone).

F

o,~o

o.o~

219

r = 0 .980 Kd: 1,41 x l O ' g M

n= 5,EI2 x l O - ° ~ m o l e / m g

r = 0,918

K d = 1 , 5 2 x IO-~IM n=1 ,69 x l O - t ~ m o l e / m g

FIG. 3. -- Representation selon Scatchard de la liaison ......~ spdcifique de (JH}-Ez dans le cytosoL

Des fractions aliquotes de cytosol brut ( - . e - ) (12421ag protEines/essai) ou de preparations partiellement purifiEes de rEcepteur cytosolique - - ap r~s precipitation fractionnEe par (NH~),SO4-- fraction AS 30% ( - o - ) (287 lag prot~ines/ essai) et AS 50% (zx) (525 ttg protEines/essai) ont 6t6 incu- bees pendant" 3 h :~ 0°C, en presence de concentrations croissantes (7,5 x lO-'°M A 5 x lO-SM) de (~H)-E2 --- un exc~s (100 lois) de ( 'H)-Ez. L'hormone radioactive liEe a Et6 dEterminEe

O 1 *¢ 3 • IO'~OM

l i ee Spl~cifique

apr~s 61imination de l 'hormone libre par le DCC. Dans tous les cas, l 'hormone spEcifiquement li~e a 6tE d~termin~e par soustraction de i 'hormone liEe non spEcifique :~ l 'hormone liEe totale (r reprEsente le coefficient de correlation ~valu6 pour chacune des droites tracEes, et n repr~sente le nombre de sites de liaison par mg de protEines).

O.I

._o-

u

ol ¢- o ol

°~

10C

60

~ o

10 -~ 10 .8 !'0 -7 i0 -6 I"0 -5

[ ] st~ro'fdes (M) FIG. 4. - - Competition de (IH)-Ez ( - • - ) , DES ( - o - ) , 5(z-DHT ( - [] - ) , 3~-diol ( - • - ) , progesterone ( - • - ) , dexamdthasone

( - tx - ) sur la liaison de (JH)-Ez dans le cytoso?: Des fractions de cytosol ont ~t~ incub~es en presence de 1.60 x'IO-9M de (3H)-E= et de concentrations croissantes des diff~rents

stEro'/des comp~titeurs, pendant 3 h h O°C. L'hormone radioactive liEe a ~t~ mesur6e apr~s traitement des fractions par le DCC. La liaison non sp~cifique a fit6 ~valu~e dans les mEmes conditions, en presence d 'un exc~s (800 fois) de ('H)-E2. La quantitE de (3H)-E2 spEcifiquement li~e.en prfisence des diffErents stEroides est repr~sentEe en % du contrEle sans compEtiteur.


utilis6s, seuls les mstrog6nes ((~H)-E2 et DES) sont des comp6titeurs efficaces de (aH)-E2. L'af- finit6 relative du DES est toutefois plus faible (3

7 fois) que celle de E2. La 5c(-DHT est un comp6titeur faible, tandis que le 31~-diol, la progest6rone et le dexam6thasone ne sont pas comp6titeurs.

le RNA poly A ÷ des animaux stimul6s contenait environ 10% de mRNA vitellog6nine [19]. La quantit6 de mRNA Vg d6celable par la technique d'hybridation sur filtre serait donc de l'ordre de 1 ng, ce qui correspond ~t la sensibilit6 d6termin6e pr6c6demment par Searle etaL [25] pour le mRNA vitellog6nine de X6nope.

Induction du RNA messager de la vitellogdnhle

Un groupe de 15 truites males de 200 g environ a 6t6 divis6 en 2 lots : le premier lot a requ par voie intrap6riton6ale une solution saline d'oestradiol-t7~ A raison de 0,5 mg/kg de poids, le second recevant uniquement le solvant. Le m~me protocole a 6t6 r6p6t6 tous les 2 jours pendant 5 jours et les animaux ont 6t6 sacrifi6s le septi6me jour (protocole I). Les injections r6p6t6es permettent d'obtenir un pourcentage important de RNA messager sp6cifique.

La Figure 5 repr6sente les r6sultats de l'hybridation des RNA poly A + extraits des foies de 2 lots d'animaux et montre que uniquement les RNA poly A + purifi6s ~ partir du groupe d'animaux stimul6s sont capables de s'hybrider pro- portionneilement ~t la quantit6 de RNA d6pos6e sur les filtres. Des estimations semi-quantitatives apr6s 61ectrophor~se sur agarose 1,2 % ou hybridation en phase liquide nous avaient montr6 que

(3_

2000,

1000

. / p o t g A" E,

x / . o o / ~ o_ pol,j A + IZ

10 20 30 t,O 50 ng poIy A +

FiG. 5. - - Hybridation des RNA poly A ÷ de truites males stitnuldes gl l'aestradiol et contr6le (Proto¢ole l).

Des quantitfs croissantes de RNA poly A* 6nt 6t6 d~pos6es (10 ~t 50 rig) sur des carr6s de papier Whatman 5~,0 ac, tiv~s l'amino-thio-ph6nol et diazot6s. AprEs hybridation avec une sonde marqu6e au tritium, les disqtw~s sont brfalEs dans up ~ auto-oxidizer, (Packard Tricarb module 306) et la radioacti- vit6 d&ermin6e par scintillation liquide dans un compteur Isocap 300 (Nuclear Chicago). ( - • - ) KNA poly A+ d'animaux stimul,~s. ( - t ~ - ) RNA polkA* d'animaux t6moins.

Cindtique d'induction du RNA messager de la vitellogdnine

15 truites males de 200 g environ re~:oivent une seule dose d'cestradiol-1713 (Protocole II) dans les mfimes conditions que pr6c6demment. Les animaux sont ensuite sacrifi6s en fonction du temps. 10 lag de RNA total de chaque 6chantiilon sont d6pos6s sur les fiitres et soumis ~ hybridation avec la sonde sp6cifique.

La Figure 6 montre que l'induction du RNA messager vitellog6nine se produit apr6s un temps de latence de 5 h et que le taux de RNA est maximum 48 h apr6s la stimulation. Cette quan- tit6 reste alors constante pendant 5 ~ 6jours. 15 jours apr~s rinjection, le taux de messager a d6jh tr~s nettement diminu6 : il ne reste plus que 10 % de la quantit6 maximum induite.

Ddtermination quantitative de la vitellogdnine

La Figure 7 repr6sente une courbe standard de quantification de la vitellog6nine par immuno6-

or. 2000/ / i S 10

10 50 100 1~0/I 1~ '16 heures J

JOUrS

FIG. 6. - - Cin6tique d'apparition du RNA messager de la vitellog~nhze aprEs stimulation ~ I'a'stradiol-17fl.

Un lot de 15 truites males de 200 g environ a ~t6 stimul6 par injection intrap6riton6ale d'une solution d'oestradiol-171~ raison de 0,5 mg/kg de poids (Protocole II). Les animaux ont (5t6 sacrifi6s fi des temps variables. 10 p.g de RNA total ont 6t6 d6pos('s sur les fihres et la radioactivit(~ correspondant l'hybridation d&ermin6e comme pr6c6demment. L'encadr6 correspond aux temps brefs de stimulation.

Expression du gdne de la vitellogdnine de la truite 221

i~o 3~ ng Vg

F I G . 7 . - - Gamme d~talomlage de la vitellog~nine. Des quantit~s croissantes de vitellog6nine de 34 ~ 408 ng ont ~t6 d6pos6es darts les puits du gel d'agarose ~t 0,1% contenant

i 'anticorps antivitellog6nine dilu6 au 1/400'. La migration s'effectue sous 2,3 mvolts/cm pendant 18 h. Apr~s s6chage et coloration des plaques, les pics d'immuno-pr6cipitation sont mesur~s et la hauteur en mm est report6e en fonction de la quantit6 de Vg exprim6e en ng.

lectrophor6se. Des quantit6s croissantes de vitel- log6nine purifi6e (30 h 400 ng) sont d6pos6es dans les puits et soumises :~ r61ectrophor6se en pr6- sence d'anticorps. La photographie prise apr~s coloration des pics d' immunopr6cipitation montre que la hauteur des pics (exprim6e en mm) est directement proportionnelle ~ la quantit6 de vitellog6nine d6pos6e. La limite inf6rieure du dosage dans le s6rum de truite est de 10 pg/ml.

Cindtique d'induction de la vitellogdnine

La stimulation a 6t6 effectu6e sur des animaux d 'un poids voisin de 1 kg dans le but de faire des pr61+vements de sang assez fr6quemment (truite A 1,2 kg - - truite B 0,8 kg). Le 1713-¢estradiol a 6t6 dissous dans le beurre de cacao ~ 40°C et inject6 par voie intrap6riton6ale de faqon h produire un implant apr6s solidification du beurre de cacao (truite A : 3 mg d'eestradiol pour I ml de beurre de cacao - - truite B • 0,05 mg'pour 1 mr de beurre de cacao). La concentration du s6rum en eestradiol a 6t6 mesur6e par Radio Imrriuno Assay- (R.I.A.) [24]. La Figure 8A montre que l 'apparition d'E2 dans le s6rum est rapide chez4a truite A et que sa concentration est du m6me ordre de grandeur que celle retrouv6e chez les femelles en vitellog6n~se (> h 10 ng/ml) [24]. On observe une

diminution r6guli~re du taux d'eestradiol pendant une p6riode de 25 jours. Chez la truite B (Fig. 8B) la concentration en cestradiol retrouv6e dans le s6rum est tr6s faible. La seule mesure positive a 6t6 r6alis6e au lendemain de l'injection. La concentration en E2 6tait alors de I ng/ml. Cette concentration est inf6rieure h celle de truite femelle en pr6vitellog6n~se [24]. Les cin6tiques d'apparit ion de la vitellog6nine chez les 2 animaux sont quantitativement tr6s diff6rentes. Chez la truite A (Fig. 8A) la vitellog6nine est d6tectable dans le s6rum apr6s 24 h de stimulation et la concentration augmehte r6guli~rement pour at- teindre un plateau au 15ejour. La vitellog6nine repr6sente alors plus de la moiti6 des prot6ines totales. On peut 6galement observer que ce plateau est stable au moins jusqu 'au 25e jour, bien que la concentration en eestradiol dans le s6rum soit consid6rablement r6duite. Chez la truite B (Fig. 8B) la concentration en vitellog6nine du s6rum est tr6s basse, le maximum 6tant environ 500fois plus faible que chez la truiteA. La technique d'immuno-6lectrophor6se utilis6e nous permet n6anmoins de suivre la cin6tique d'apparition de la vitellog6nine avec precision et montre que des concentrations d'cestradiol de l 'ordre du ng/ml de s6rum sont suffisantes pour induire la synth6se de la prot6ine.

222 Jean-Louis Maitre and coiL

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FIG. 8. - - Cin~tiques d'apparition de la ritellog~nine dans le ~drztnl de tndte mdzle aprds administration de 17fl-~rstradioL

Le taux de v i t e l log6n ine dans le s6,tum a 6t6 d6 te rmin6 pa r immuno-~ lec t rophor~se en u t i l i s an t de la v i t e l log6n ine pur i f i6e c o m m e 6talon (voi r Fig. 6). Dif f6rentes d i lu t ions de s6rum on t 6t6 uti l is6es. - - o - - eestradiol. - o - v i te l log6nine .

7A : S t imu la t i on avec u n i m p l a n t d 'eestradiol de 3 ~ n g / m t . fi, ux j ou r s de s t i m u l a t i o n indiqu6s , les d i lu t ions su ivan tes du s6 rum on t 6t6 effectu6es pour le dosage : 0, !, 2 (1 /4) - - 3 (1 /10) - - 4 (1 /20) - - 6 ( i / 5 0 ) - - 8, 10 (1 /100) - - 13 .h 24 ( ! /200) .

7B • S t imula t ion avec u n i m p l a n t d 'cestradiol de 0,05 m g / m l . T o u s l e s s6rums on t ~t6 d i lu6s au 1/2 avan t dosage.

Expression du gdne de la vitellogdnine de la truite 223

Discussion

Nos r6sultats apportent la preuve de la pr6- sence de r6cepteurs de l'cestradiol dans le foie de truite mille dans des conditions (incubation du cytosol fi 0°C) off rhormone n'est pas m6taboli- s6e.

Des sites de liaison de haute affinit6 (KD ~ 1,5 × 10-9M) ont 6t6 mis en 6vidence dans le cytosol brut et dans des pr6parations de r6- cepteurs partiellement purifi6s par pr6cipitation par (NH4)2SO4 ~ 30 % de saturation. Une h6t6ro- g6n6it6 des sites de liaison a parfois 6t6 not6e dans le cytosol brut. Les repr6sentations de Scatchard se r6solvent alors en 2 droites, indi- quant la pr6sence d'au moins 2 types de sites de liaison. La signification de ce deuxi6me type de site n'est pas facile b. d6finir. I1 pourrait s'agir d 'une prot6ine << unusuelle >~ liant les st6ro~'des sexuels, comme celle d6crite par Dickson etal. [26] dans le foie de rat mille, voire de prot6ine plasmatique. I1 ne faut pas perdre de vue que le foie est le site de synth6se de prot6ines plasmatiques et que le taux de synth6se est susceptible de varier en fonction de l'&at physiologique de ranimal. Les pr6parations de cytosol utilis6es ne provenant pas d'animaux dans le m6me 6tat physiologique (fige diff6rent, animaux spermiant ou non), on peut penser qu'il y a lh une expli- cation h la variation du taux de ce second composant. Quand le cytosol ne contient qu'un seul composant de haute affinit6, la constante de dissociation mesur6e est identique ~ celle mesur6e dans la fraction AS 30 % (KD ~ 1,5 x 10-9M).

La sp6cificit6 de la liaison hormonale est tr6s 6troite puisque seuls les cestrog6nes E2, DES, E~ et E3 (r6sultats non repr6sent6s) sont comp6titifs. Contrairement fi ce qui a 6t6 observ6 dans d'autres syst~mes : foie de mammif6re [27, 28], hypo- physe ant6fieure de mammif~re [29,30], foie de poisson [31, 32], l'affinit6 relative du DES est ici en moyenne 3 ~ 7 fois plus faible que celle de E2. Le DES est un compos6 de synth6se qui ne se lie pas ou avee une faible affinit6 h la t< sex hormone binding globulin >> (SHBG) [33]. On pourrait done s'interroger sur la signification de raffinit6 plus faible du DES pour les sites de liaison de E2 dans le cytosol de foie de truite. Ces sites de liaison de haute affinit6 sont-ils caract6ristiques des r6cep- teurs sp6cifiques ou seraient-ils dus fi une contamination par la SHBG ? Cette derni~re nypoth6se parait cependant peu vraisemblable. En effet, la SHBG a 6galement 6t6 d6crite chez la raie, Raja radiata [34,35], chez la roussette Scyliorhinus

canicula [36], chez raiguillat commun, Squalus acanthius [37]. Ces auteurs la d6crivent comme une prot6ine liant les st6ro'fdes h I8 (androg~nes),

19 (cestrog6nes), 21 (corticost6roYdes et progest6- rone) atomes de carbone avec une haute affinit6. Chez la truite, Salmo gairdnerii, Fostier et Breton [38] ont aussi d6cdt la pr6sence de prot6ines plasmatiques liant les st6roides sexuels et les corticost6ro'ides.

La sp6cificit6 6troite des sites de liaison pour les seuls cestrog6nes (comp6tition tr6s faible avec la 5ct-DHT, aucune comp6tition avee le 31]-diol, la progest6rone et la dexam6thasone) semble devoir 6carter l'id6e que ces sites seraient dus fi une contamination par des prot6ines plasmatiques dont la sp6cificit6 est au contraire tr6s large.

En utilisant des pr6parations d'h6patoeytes fraichement isol6s par perfusion du foie b. la collag6nase, nous avons pu montrer que les caract6ristiques des r6cepteurs de E2 6taient identiques h celles du foie ( K v - 1,5x 10-9M) (r6sultats non publi6s). Nous tentons maintenant de d6montrer que les caract6ristiques des r6cep- teurs sont aussi conserv6es dans des h6patocytes isol6s maintenus en culture primaire et que dans ces conditions o6 le taux d'E2 est bien contr616, il existe une corr61ation 6troite entre le nombre de sites de liaison occup6s, le taux du RNA messager de la vitellog6nine et le taux de vitellog6nine synth6tis6e.

La pr6sence de RNA messager sp6cifique de la vitellog6nine n'a pu ~tre mise en 6vidence chez la truite mille qu'apr6s stimulation ~ l'cestradiol. Chez les animaux t6moins, m~me en augmentant les quantit6s du RNA poly A ÷ de 5 ~ 50 ng, nous n'avons jamais pu obtenir d'hybridation mol6cu- laire avec la sonde sp6cifique. Ce r6sultat conso- lide les observations pr6c6dentes [19, 14]. La truite arc-en-ciel peut done 6galement constituer un excellent mod61e pour l'6tude de la r6gulation de l'expression des g6nes sous contr61e hormonal. En effet, l'oestradiol active un g6ne normalement silencieux chez le mille, ce qui est assez inhabituel dans la plupart des mod61es 6tudi6s actuellement. Nous montrons 6galement que la cin6tique d'induction, comme chez d'autres esp~ces : X6nope, poulet [39, 40], ne d6marre qu'apr/~s un temps de latence de 4 ~ 5 h (encadr6 Fig. 6). Ce temps de latence, plus ou moins long suivant les esp6ces, pourrait 6tre dO h la synthi~se de r6cepteurs sp6cifiques qui persisteraient h un niveau 61ev6, m~me apr6s disparition de l'cestradiol inject6 [41, 42].

En ce qui concerne les cin6tiques d'apparition


de la vitellog6nine, les implants d'cestradiol utili- s6s d61ivrent dans le s6rum des taux d 'hormone comparables/ l ceux retrouv~s chez la femelle au cours du cycle normal. On peut ainsi montrer que des concentrations d'cestradiol aussi faibles que 1 ng/ml de s6rum sont capables d'induire la synth~se de vitellog6nine chez le mille, et on peut se demander si, chez la femelle, la synth6se de vitellog6nine ne commence pas plus t6t qu 'on ne le pense au cours du cycle annuel.

Ces exp6riences pr61iminaires avaient surtout pour but de preparer l 'arsenal technologique n~cessaire ~ l'6tude de rexpression g~n~tique de Ia vitellog6nine chez la truite arc-en-ciel. Nous envisageons maintenant d 'aborder des probl~mes plus physiologiques. In vivo l '6tude compar6e des cin6tiques de vitellog6n6se (r6cepteurs, RNA messager, vitellog6nine), chez les 3 souches de Salmo gairdnerii qui pondent / l des dates diff6ren- tes, devrait nous permettre de savoir si le d~- clenchement du ph6nom6ne est synchrone avec modulation ult6rieure de la vitesse de synth6se de vitellog6nine ou s i c e s d6clenchements sont d6- cal6s dans le temps et les vitesses de synth6se identiques.

Au cours du cycle normal, le d~clenchement de la vitellog6n~se est li~ ~ I'616vation du taux d'cestradiol du s6rum [11, 12, 24]. Parall~lement, il apparait des taux d'eestrone importants. Le r61e de cette hormone dans la vitellog6n6se a 6t6 mis en 6vidence par Van Bohemen [11, 12]. Nous esp6rons obtenir des renseignements plus pr6cis sur son mode d'action en d6terminant son impact dans les diff6rentes 6tapes de la r6gulation.

Enfin, ~ l 'aide d 'un syst6me d'h6patocytes isol6s que nous avons mis au point (r6sultats non publi6s), nous esp6rons pouvoir tester in vitro un certain nombre de facteurs endog~nes (hormones) et exog~nes (antibiotiques, herbicides, pesticides), pouvant avoir une influence sur la production de vitellog6nine.

Remerciement

Ndus remercions le Dt. Fostier (Laboratoire de Physio- logie des Poissons, LN.R.A. Rennes)-pour les dosages d'cestradiol,

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