M2 bmc2007 cours01

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  • 1

    M2 de Biophysique Molculaire et CellulaireCours N1 Principes de Base de la Microscopie

    Electronique en Transmission

    URL: http://www.impmc.jussieu.fr

    Nicolas BOISSET et Slavica JONIC

    Dpartement de Biologie Structurale de lIMPMC

    Institut de minralogie et de physique des milieux condenss

    CNRS UMR 7590, Universits Paris 6, Paris 7, IPGP

    140 Rue de Lourmel, 75015 Paris

    Tel. (S. JONIC): 01 44 27 72 05

    E-mail: Slavica.Jonic@impmc.jussieu.fr

    Bacteriu

    m

    Animal

    cell

    Riboso

    me

    Virus Glo

    bular

    proteinPlan

    t cell

    AtomS

    mall

    molecu

    les

    Objet

    Image

    Objectif Condenseur

    Source de rayonnement

    Microscopie lectroniqueMicroscopie lectroniqueMicroscopie optiqueMicroscopie optique

    Oeil nuOeil nu

  • 2

    1. Quelques Dates 1. Quelques Dates

    DATES NOMS EVENEMENTS

    1897 J. J. Thompson Dcouverte de l'lectron 1924 Louis deBroglie Identification de la longueur d'onde des

    lectrons en mouvement1926 H. Busch Caractrisation des effets de lentille des

    champs magntiques et lectriques sur les lectrons.

    1929 E. Ruska Thse (Ph.D) sur les lentilles magntiques 1931 Knoll & Ruska Construction du premier microscope 1934 Driest & Muller Dpassement de la rsolution de la

    microscopie optique 1938 von Borries & Ruska Premier Microscope utilisable (Siemens) -

    rsolution 10 nm 1940 RCA Microscope Commercial - rsolution 2.4 nm 1945 rsolution 1.0 nm

    A quoi A quoi a ressemble ?a ressemble ?

  • 3

    Quel type dQuel type dimage ?image ?

    Visualiser des surfaces

    Si on associe la Si on associe la cryocryo--microscopie microscopie lectroniquelectroniquesur spsur spcimen congelcimen congel--hydrathydrat

    avec lavec lanalyse danalyse dimagesimages

    60x 660x 6660x 66000x

    Bridget Carragher

    Clint Potter

    Ron Milligan

    Scripps Inst.Scripps Inst.

    San DiegoSan Diego

  • 4

    Observer des proteines en coloration ngative(De Carlo et al.)

    Rotavirus(Yeager LabScripps, San Diego)

    Observer et reconstruire des virus partir dimages

    de cryo-microscopie

  • 5

    Regarder des cristaux de protineen mode image eten mode diffraction

    Actin decorated withDictyostelium S1

    (Manstein Lab, HeidelbergImage: T. Wendt)

    Pour quoi faire ?Pour quoi faire ?

    Pour relier la structure la fonction en intgrant des informationsprovenant dautres methodes(cristallographie X, RMN)

  • 6

    2. Photon/2. Photon/lectron et dualitlectron et dualit onde particuleonde particule

    La lumire possde la fois des caractres de particules et d'ondes, ncessaire pour expliquer certains phnomnes optiques. La THEORIE ONDULATOIRE de la lumire permet d'expliquer les phnomnes de diffraction et a t dveloppe par Huygens (1629-1695) et Hooke (1638-1703). La THEORIE CORPUSCULAIRE a t propose par Newton (1642- 1727) et elle est devenue la thorie la plus commune, mme aprs la dmonstration de la diffraction par Young (1773-1829) et des franges d'interfrences par Fresnel (1788-1827).

    La THEORIE QUANTIQUE (Planck et Einstein) donne les bases pour expliquer les phnomnes d'INTERFERENCE, de DIFFRACTION et l'effet PHOTOELECTRIC (la lumire frappant certains mtaux les force mettre des lectrons). Le transfert d'nergie entre la lumire et la matire a lieu par paquets dont la quantit est proportionnelle la longueur d'onde lumineuse.

    3. 3. VVlocitlocit des des lectrons et longueurs d'ondeslectrons et longueurs d'ondes

    La relation entre la longueur d'onde () d'une particule de masse , m, se dplaant avec une vlocit,v, est donne par l'quation de DeBroglie :

    Un lectron de charge e (1.610-19 coulomb), et de masse m (9.1110- 28 g), quand il est acclr parune diffrence de potentiel de V volts, a une nergie cintique de :

    et

    h = constante de Planck (6.62410-34 joule-sec)

  • 7

    La Table (1) illustre le fait qu' haut voltage, la vitesse de l'lectron dans le vide se rapproche de celle de la lumire (c = 31010 cm/sec).

    1.977! 5.930 0.0012 1,000,000

    0.6251.8750.0039100,000

    0.4421.326 0.005550,000

    0.1980.5930.012310,000

    v/c v (1010

    cm/sec) (nm)V

    En fait, l'quation devient incorrecte quand la vlocit de l'lectron s'approche de la vitesse de la lumire,et une correction relativiste doit tre apporte pour la valeur de la masse:

    La relation entre la longueur d'onde et la tension d'acclration V est donne de manire exacte par:

    La Table (2) est obtenue lorsqu'on tient compte de la correction relativiste :

    0.9412.8230.000861,000,000

    0.5481.6440.00370100,000

    0.4141.2420.0053650,000

    0.1950.5850.0122310,000

    v/cv (1010

    cm/sec) (nm)V

  • 8

    lampe filament

    lentillecondenseur

    spcimen

    lentilleobjectif

    lentilleprojecteur

    image intermdiaire

    cranimage

    microscope optique microscope lectronique

    1) Systme d'illumination: Produit les radiations et les dirige sur le spcimen. Il est constitu d'une SOURCE qui met les radiations, d'une lentille CONDENSEUR qui focalise le faisceau incident, per-mettant de faire varier l'intensit de l'illumination sur le spcimen.

    4. Similarit4. Similarits entre microscope Optique et M.E.T.s entre microscope Optique et M.E.T.

    2) L'tage du spcimen: situ entre les systmes d'illumination et d'imagerie.

    3) Systme d'imagerie: Combinaison de lentilles qui produisent une image finale magnifie du spcimen. Il contient (1) une Lentille OBJECTIF qui focalise le faisceau aprs qu'il soit pass au travers du spcimen, et qui forme une image intermdiaires du spcimen, et (2) de lentille(s) PROJECTEURs qui grossissent une portion de l'image intermdiaire pour former l'image finale.

    4) Systme d'enregistrement: Qui convertit les radiations en une image permanente sur support photographique (ngatifs) ou numrique (camras).

    lampe filament

    lentillecondenseur

    spcimen

    lentilleobjectif

    lentilleprojecteur

    image intermdiaire

    cranimage

    microscope optique microscope lectronique

    1) Les Lentilles optiques sont gnralement faites de verre et ont une distance focale fixe, alors que les lentilles magntiques sont constitues d'lectro-aimants, dont la distance focale est variable en changeant l'intensit du courant qui traverse les bobines de cuivre.

    5. Diff5. Diffrences entre microscope Optique et M.E.T.rences entre microscope Optique et M.E.T.

    2) En microscopie optique, le grossissement est modul en changeant les lentilles objectif montes sur un disque rotatif au dessus de l'chantillon. Il peut aussi tre modifi si les lentilles oculaires sont changes. Sur un MET le grossissement (distance focale) de la lentille objectif reste constant, et c'est en modifiant la distance focale des lentilles projecteurs qu'on fait varier le grossissement.

    DONC! Les performances d'un TEM dpendent principalement de la qualit de sa lentille objectif.

  • 9

    3) Le Microscope Optique a une faible profondeur de champ, ainsi on peut focaliser et voir diffrents niveaux d'un mme chantillon (application directe la microscopie confocale). La (relative) grande profondeur de champ du M.E.T. permet de visualiser entirement un chantillon (mince < 100 nm).

    lampe filament

    lentillecondenseur

    spcimen

    lentilleobjectif

    lentilleprojecteur

    image intermdiaire

    cranimage

    microscope optique microscope lectronique

    5. Diff5. Diffrences (Suite)rences (Suite)

    4) Sur un Microscope Optique la source est gnralement situe en bas, alors que sur le M.E.T. la source est en haut de l'instrument.

    5) Le M.E.T. fonctionne trs haut vide pour permettre le passage lectrons, donc les spcimens biologiques sont souvent dshydrats (pas dobservation in vivo).

    6) Le faisceau d'lectron du MET dtruit rapidement les chantillons biologiques.

  • 10

    6. D6. Dfinitions:finitions:

    RESOLUTION: Possibilit de distinguer des points rapprochs comme des objets distincts.

    LIMITE DE RESOLUTION: Dans des conditions expDans des conditions exprimentales rimentales donndonneses, cest la plus petite distance sparant deux points reconnus comme des objets distincts.

    POUVOIR DE RESOLUTION: La meilleure rmeilleure rsolution atteignablesolution atteignablepour un instrument particulier et dans les conditions ddans les conditions dobservation observation optimum.optimum.

    7) Distinction entre r7) Distinction entre rsolution et pouvoir de rsolution et pouvoir de rsolution :solution :

    Le pouvoir de rsolution est une proprit de linstrument, et cest une valeur absolue et thorique.

    La rsolution sera toujours gale ou infrieure au pouvoir de rsolution, et cest une valeur qui va dpendre des conditions exprimentales dobservation.

    Par exemple, en M.E.T. et spcialement avec des chantillons biologiques (fragiles aux lectrons), la rsolution que lon obtient peut tre considrablement infrieure au pouvoir de rsolution de linstrument.

    Le pouvoir de rsolution de lil humain est de lordre de 0.07 mm (70 microns), ce qui correspond un objet de 3cm vu 100 mtres (ici encore dans des conditions optimum de contrastedans des conditions optimum de contraste). Cette limitation de lil humain est due la taille des cellules capteurs dans la rtine.

  • 11

    8. Interf8. Interfrence/diffraction/cohrence/diffraction/cohrencerence

    Un systme optique idal produit une image exacte de lobjet ochaque point de lobjet est reproduit correctement. Le phnomne de diffraction rend malheureusement le phnomne impossible.

    Des franges dinterfrences entre la lumire diffracte par la fente et londe dorigine, au bo