L‘HAPLOïDE SPONTANÉE LEE À LA POLYEMBRYONIE CHEZ LE COFFEA ARABICA L.

P. DUBLIN

Directeur de recherches ORSTOM

Laboratoire de biologie cellulaire de I’IFCC en Côte d’Ivoire

I_ ----.--.J

J.-P. PARVAIS

Ingénieur agronome, Dr en physiologie végétale

Laboratoire de biologie cellulaire de I’IFCC en Côte d’Ivoire

I NTRO D UCTl O N

L’intérêt des haploïdes dans l’amélioration et l’étude génétique des plantes utiles augmente chaque jour avec l’emploi des techniques d’andro- genèse in vitro.

Les contributions apportées par le récent Sym- posium de Guelph aux méthodes d’obtention et d’utilisation pratique de l’haploïdie auront, au cours des prochaines années, un impact important sur le développement des recherches sur l’haploïdie chez les végétaux supérieurs.

En amélioration des plantes, ce sont les végétaux arborescents, souvent entachés de barrières d’incom- patibilité, de cycles végétatifs longs, qui nécessitent le plus le recours aux haploïdes, en tant que tech- nique de raccourcissement des cycles de sélection.

Cependant, les données actuelles sur l’haploïdie des végétaux arborescents ou arbustifs sont rares ; la forme haploïde n’est connue que chez quelques espèces de végétaux ligneux pluri-annuels (Winton, Stettler, 1974).

Le CofSea arabica, qui joue un rôle important dans l’économie de plusieurs pays d’Amérique et d‘Afrique, est allotétraploïde avec 2 n = 4 x = 44 chromosomes. ,Son haploïde (n = 2 x = 22), individu porteur d‘un nombre gamétique de chro- mosomes (Kimber, Riley, 1963), est connu depuis fort longtemps (Mendes, Bacchi, 1940 ; Mendes, 1941, 1946, 1955).

Ces haploïdes de Coffea arabica n’avaient jus- qu’ici guère suscité d’intérêt, ni dans l’améliora- tion, ni dans les études cytogénétiques du genre Coffea.

L‘importance grandissante des hybrides interspé- cifiques (C. canephora x C. arabica), tant pour la lutte contre la rouille (Monaco, Carvalho, 1971) que pour l’amélioration des qualités gustatives des formes cultivables en basse altitude (Capot, 1972), ou encore pour les recherches de mutants induits mieux adaptés à un I environnement local (Chinappa, 1968), a donné un regain d‘intérêt aux recherches sur l’haploïdie chez le genre Coffea.

Les premiers essais de culture d’anthères de C. arabica ont déjà abouti à la formation de cals haploïdes [Sharp, 1973). .

Jusqu’à présent, les seuls haploïdes d‘Arabica mentionnés dans la littérature avaient été découverts à l’état spontané au hasard des semis faits en pépi- nière.

En 1972, un programme de recherches sur la méthodologie de l’obtention d‘haploïdes chez le genre Coffea a été entrepris par le Laboratoire de biologie cellulaire de l’IFCC en Côte d‘Ivoire. Ce sont les premiers résultats sur l’haploïdie spontanée, liée à la gemellité, qui sont présentés dans les pages qui suivent.

a 4 FEV. 8977 83 Caf6 Cacao Thé, vol. XX, no 2, avril-juin 1976

MATÉRIEL ET METHODES

Les semences utilisées pour ces premières re- cherches provenaient de différents cultivars récol- tés en mélange..

Les recherches d’haploïdes ont été effectuées sur . des plantules issues de graines polyembryonées.

En effet, chez le caféier, le repérage des graines polyembryonées est très facile. Les graines, préala- blement déparchées, sont mises à germer dans de la sciure de bois décomposée et maintenue humide par des arrosages périodiques.

Dans ces conditions, la sortie des radicules a lieu dans les quinze jours qui suivent le semis ; il suffit alors de trier les graines qui ont deux ou plusieurs radicules et de les semer séparément dans des petits pots en alkatène, remplis à moitié de ter- reau de forêt.

Comparativement à d’autres espèces végételes, - la polyembryonie est relativement fréquente chez

le genre coj-ea et en particulier chez les formes tétraploïdes (Dublin, 1973, tableau I). Chez le C. arabica, le taux moyen de polyembryonie appa- raît près de vingt fois plus élevé que celui d’un autre végétal arbustif comme le Theobroma cacao (Dublin, 1972).

Les fèves polyembryonées de C. arabica ont en majorité deux embryons ; il. n’est cependant pas rare d’en trouver avec trois ou même quatre.

En règle générale, ces polyembryons sont situés à une même extrémité de la graine. Plus rarement, un des deux embryons peut être situé au milieu de la graine.

,

I1 s’agit évidemment de polyembryonie vraie où chaque graine est constituée par une masse unique d’albumen enveloppée dans une même pellicule séminale (pellicule argentée).

Dans le cas de fausse polyembryonie, fréquent chez l’Arabica, mais rare chez les espèces diploïdes, la graine est alors constituée par plusieurs frag- ments d’albumen, accolés à l’intérieur d’une même parche, mais ayant chacun une pellicule séminale distincte. Ces cas de fausse polyembryonie résultent du développement de plusieurs ovules à l’intérieur d’une même loge (Mendes, 1944).

.

TABLEAU I

Polyembryonie chez.le genre Cofea

Nombre de Taux de Origine chromosomes polyembryonie

C. canephora var. ro- ‘ busta . . . . . . . . . . . . . . 22 5,8.10-3 C. stenophylla . . . . . . . 0,3.10-3 Robusta tétraploïde . . 44 i8,6.10-3 Arabusta tétraploïde . 44 1 6 , O . l O - 3 C. arabica . . . . . . ., . . 44 26,o. 10-3

22

Les embryons associés dans le cas de polyembryo- nie vraie sont souvent de taille et de vigueur dif- férentes. ’

Les techniques de germination; I de triage des graines polyembryonées et de récupération des plantules issues de polyembryons ont été décrites dans un précédent article (Dublin et Parvais, 1975).

I

R ÉS U LTATS

Parmi les deux mille plantules de C. arabica issues de polyembryons qui ont été ainsi examinées, dix-neuf se sont révélées -haploïdes (n = 22 ;

* fig. 2). L’haploïde de Coflea arabica (n = 2 x = 22) Les haploïdes de C. arabica découverts ici ne

s’écartent pas des types morphologiques‘ décrits par Vishveshwara (1960) chez la variété Kent, ni de ceux décrits par Carvalho (1952) chez divers cul-

Comparativement à la plantule normale (2n = 44) du même âge, la plantule dihaplcïde

\

a . tivars de cette espèce.

84

P

(n = 22) se caractérise par des tiges plus grêles à entre-nœuds courts, mais d‘un développement plus rapide. La différenciation des ramifications plagiotropes semble en effet nettement plus précoce chez l’haploïde.

Chez les jeunes plantes, les différences fonda- mentales entre les dihaploïdes (n = 22) et les tétra- ploïdes (2 n = 44), se situent principalement au niveau des caractéristiques foliaires. Chez l’ha- ’ ploïde, la feuille est très allongée, avec un rapport Longueurllargeur de 3,4, contre 2,4 pour les feuilles analogues de la plantule tétraploïde (tab. II, p, 86).

1

Fig. 4 Q

Fig.1 b

Fig. 1. - Coffea arabica. Morphologie comparée chez un dihaploïde (n = 22), fig. l a , et chez u n tétraploïde ( 2 n = 44), fig. lb.

. Fig. 2. - Coffea arabica. Métaphase de mitose chez un

dihaploïde (n = 22), fig. 2a, et chez un tétraploïde (2 n = 44), fig. 2b.

Fig. 2 b

Fric

30

I 2 0

10

Fig. 3. - Courbe de répartition des rapports L/1 des feuilles chez le dihaploïde (n = 22) et le tétraploïde (2 n = 44) de C. arabica 1

,CD

5

TABLEAU II

Coffea arabica : dimensions comparées des feuilles chez le dihaploïde (n - 22) et le tétraploïde (2 n = 44)

Longueur (en mm) ......... 101 112,08 f 2,21 Largeur (en mm) ........... 101 33,69 f 0,94 Rapport L/1.. .............. 101 3,39 f 0,94

Longueur (en mm) ......... 75 125,79 f 7,55 Largeur (en 'mm) ........... 75 52,21 f 3,84 Rapport L/l.. .............. 75 2,40 f 0,05

- Nombre Caractères observk n X CT cv Extrêmes de chromosomes

70,O - 150,O n = 2 x = 2 2 11,38 10,l . 21,O- 48,O n = 2 x = 22 4,84 14,3

0,41 12,o 2,5 - 4,3 n = 2 x = 2 2

33,36 26,5 52,O - 186,O 2 n = 4 x = 4 4 13,55 25,9 26,O- 80,O 2 n = 4 x = 44 0,22 9,lO 1,9- 2,9 2 n = 4 x = 44

" TABLEA J III

' Cuffea arabica : caractères stomatiques chez le dihaploïde (n = 22) et le tétraploïde (2 n = 44)

- Caractères observés n X CT . cv Extrêmes , Nombre de chromosomes

Densité stomatique, nb au mmz . 60 323,18 f 11,47 4,26 13,2 229 -434 n = 2 x = 2 2 Nombre de chloroplastes parcel- lule de garde.. ............... 70 4,91 f 0,20 0,86 17,5 3 - 9 n = 2 x = 2 2

Longueur en 1-1 de la cellule de garde ....................... 30 19,95 f 0,67 1,77 8 3 16,8 - 24,3 n = 2 x = 2 2

Densité stomatique, nb au mmz . 60 134,42 f 9,95 3,85 28,6 51 -204 2 n = 4 x = 44 Nombre de chloroplastes parcel-

2 n = 4 x = 4 4 lule de garde.. 40 8,41 f 0,35 1,16 13,7 Longueur en 1.1 de la cellule de ....................... 23,35 - 30,82 2 n = 4 x = 44 garde 30 27,78 =k 0,60 1,67 6,02

6 - 12 ............... I

86

1

i

Ce rapport Longueur/largeur est assez spécifique pour servir de critère lors d'un tri des plantules présumées haploïdes (fig. 1 et 3). Cette manifesta- tion de l'allongement des feuilles est très précoce puisqu'elle est visible dès l'apparition de la première paire de feuilles qui suit le stade (( papillon )) (étalement des feuilles cotylédonaires).

Les feuilles des plantules dihaploïdes (n = 22), dont les domaties sont aussi visibles que chez les formes à 44 chromosomes, ont quelquefois ten- dance à être de coloration vert pâle.

Ainsi, un triage relativement efficace, basé sur le seul caractère (( feuilles . allongées et étroites D peut être pratiqué sur des plantules âgées de quatre à cinq mois.

Le caractère (( densité stomàtique )) varie chez une même espèce de Coffea en fonction du niveau de ploïdie (Franco, 1939).

Chez le caféier, l'examen des caractères stoma- tiques (densité, dimension des cellules de garde) est facile à réaliser. I1 suffit de détacher un lambeau d'épiderme de la face inférieure de la feuille et de l'observer entre lame et lamelle, dans une goutte de solution de nitrate d'argent à 1 % ; les chloro- .

plastes prennent alors une coloration brune et sont aisément dénombrables.

Les observations (groupées dans le tableau III et schématisées dans les figures 4 et 5) ont été effectuées sur les stomates proches de la nervure principale de feuilles prélevées sur des plantules dihaploïdes (n = 22) et tétraploïdes (211 = 44) de douze mois, cultivées sous ombrières.

On ,constate que les densités stomatiques, les dimensions des cellules de garde ainsi que le nombre de chloroplastes sont significativement différents entre les dihaploïdes (11 = 22) et les tétraploïdes (2n = 44), les conditions d'éclairement et de culture étant les mêmes par ailleurs.

La surface moyenne des feuilles du dihaploïde (n = 22) est sensiblement la moitié de celle des feuilles du tétraploïde (2 n = 44).

Contrairement aux haploïdes de certaines autres espèces comme le Theobroma cacao dont la crois- sance est fortement ralentie, l'haploïde de C. ara- bica présente, du moins pendant ses premières phases de végétation, un développement normal, comparable à celui d'un caféier quelconque, mais de format plus réduit.

Fig. 4. - Courbe de répartition des chloroplastes dans les cellules de garde chez le dihaploïde (n = 22) et le tétraploïde (2 n = 44) de C. arabica

F d c

AO

30

20

ce

87

i' I l

Fig. 5. - Courbe de répartition des densités stomatiques chez le dihaploïde (n = 22) et le tétraploïde (2n = 44) de C. arabica

Fréquence

30

2 5

2 0

I 15

10

O i

stomatas

DISCUSS ON

A l’exception des travaux de mutagenèse et de diploïdisation effectués 9 en Inde sur haploïdes d’Arabica, ces plantes n’ont jusqu’ici pas fait l’ob- jet de recherches systématiques en vue de leur éven- tuelle utilisation pratique.

Les études cytologiques effectuées par les auteurs brésiliens sur les premiers haploïdes connus d‘Ara- bica ont révélé une très forte stérilité chez ceux-ci.

Cette stérilité est la conséquence d’une faillite de la mégasporogenèse consécutive à une méiose qui conduit à une majorité de monovalents et à une répartition désordonnée des chromosomes lors des anaphases.

Les quelques descendances obtenues à la suite d‘auto-fécondation, ou de pollinisation de ces haploïdes avec du pollen issu d’Arabica normaux tétraploïdes, avaient toutes 43-44 ou 45 chromo- somes (Carvalho, 1952). I

Si un tel résultat était conijrmé, cela signifierait que ces dihaploïdes se comporteraient comme certains monoploïdes (Kimber et Riley, 1963) et

88

b

15 pQr champ ‘ O , (Ø=SZO,UU)

ET CONCLUS

que leurs seuls gamètes viables résulteraient de noyaux de substitution à 22 chromosomes.

Dans de telles conditions, l’intérêt de ces diha- ploïdes d’Arabica pour la recherche de combinai- sons (C. arabica x C. canephora) à 22 chromo- somes, serait fortement réduit, sinon nul.

Quoi qu’il en soit, pour tous les pays dont les conditions écologiques sont favorables à la culture de l’Arabica, ces haploïdes gardent tout leur intérêt pratique pour l’obtention d’homozygotes complets, en vue d’une meilleure exploration des phénomènes d’hétérosis que l’on suppose exister chez l’Arabica au niveau de certaines variétés (Carvalho et Monaco, 1968, 1971).

L‘haploïdie spontanée, liée ou non à la gemellité, constitue chez l’Arabica une voie intéressante d’ob- tention d‘haploïdes en quantité suffisante pour des études cytogénétiques ainsi que pour les tests pré- liminaires de leur. utilisation dans un programme d’hybridation avec les espèces allogames diploïdes à vingt-deux chromosomes.

'\

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Reçu pour publication, juillet 1975.

DUBLIN (P.), PARVAIS (J.-P.). - L'haploïdie spon- tanée liée à la polyembryonie chez le Coffea arabica L. Café Cacao Thé (Paris), vol. XX, no 2, avr.-juin 1976, p. 83-90, fig., tabl., réf.

L'emploi des haploïdes peut être une aide très effi- cace pour le raccourcissement des cycles de sélection des végétaux arborescents tels que le caféier Coffea arabica dont l'haploïde (n = 2 x = 22) est connu depuis longtemps.

Les auteurs présentent .ici les premiers résultats sur l'haploïdie spontanée, liée à la gemellité, étude effec- tuée sur des plantules issues de graines polyembryo-

Parmi les deux mille plantules issues de polyembryons qui ont été examinées, dix-neuf se sont révélées haploïdes.

Ces plantules haploïdes sont caractérisées par des tiges plus grêles à entre-nœuds courts, par une différen- ciation des ramifications plagiotropes précoce et par un rapport Longueur/largeur de la feuille très supérieur à celui des tétraploïdes ; ce dernier caractère peut servir de critère pour trier des plantules présumées haploïdes. Les feuilles, de coloration vert pâle, présentent des densités stomatiques, des dimensions des cellules de garde et un nombre de chloroplastes très différents de ceux des tétraploïdes (2 n = 44).

Dans les pays dont les conditions écologiques sont favorables à la culture du C. arabica, ces haploïdes ont un intérêt pratique pour l'obtention d'homozygotes complets.

l nées.

,

/

DUBLIN (P.), PARVAIS (J.-P.I. -The spontaneous , haploidy linked to the polyembryony in Coffea ara- bica L. Café Cacao Thé (Paris), vol. XX, no 2, am-.- juin 1976, p. 83-90, fig., tabl., réf.

The use of haploids can be a very efficient help in the shortening of breeding cycles of arborescent plants such as the Coffea arabica coffee tree, the haploidy of which (n = 2 x = 22) has been known for a long time.

The authors show in this paper the first results regar- ding spontaneous haploidy, connected to gemellity, which comprises a study carried out on seedlings origi- nating from polyembryonic seeds.

Among the two thousand seedlings originating from the polyembryos examined, nineteen turned out to be haploids.

The haploid seedlings are characterized by thinner stems with shorter internodes, by a precocious differen- tiation of -the plagiotropic branchings and by a length/ width ratio of the leaf much greater than that of tetra- ploids ; the latter character can serve as a criterion to sort out seedlings assumed to be haploids. The leaves, with a pale green color, have stomatic densities, sizes of the guard cells and a number of chloroplasts very much different from those of tetraploids (2 n = 44).

In the countries in which the ecological conditions are favourable to the cultivation of C. ar.abica,these haploids have a practical interest as far as obtaining complete homozygotes is concerned.

,

89 ,

DUBLIN (P.), PARVAIS (J.-P.). - Die spontane mit der Polyembryonie verbundene Haploidie bei Coffea arabica L. Cafk Cacao Thé Paris), vol. =:no 2, avr.- juin 1976, p. 83-90, fig., tabl., réf.

Die Verwendung von Haploiden kann eine sehr wirk- same Hilfe für die Verkürzung der Selektionszyklen von Baumpflanzen wie die des Kaffeebaums Coffea arabica, dessen Haploid (n = 2 x = 22) seit langem bekannt ist, darstellen.

Die Autoren legen in vorliegendem Bericht die ersten Ergebnisse über die spontane Haploidie dar, die mit der Paarigkeit verbunden ist, eine Untersuchung die bei aus polyembryonierten Samenkörnern entsprossenen Setzlingen vorgenommen wurde.

Von den zwei tausend aus Polyembryonen hervor- gegangenen Setzlingen, die untersucht wurden, erwiesen sich neunzehn als Haploiden.

Diese haploiden Setzlinge zeichnen sich durch diin- nere Stengel mit kurzen knoten weiten, durch eine frühzeitige Differenzierung der plagiotropen Verzwei- gungen und durch ein Verhältnis Länge : Breite des Blattes, das demjenigen der Tetraploiden sehr iiberle- gen ist, aus ; dieses letztere Merkmal! kann als Kenn- zeichen für die Auslese der als Haploide vermuteten Setzlinge dienen. Die blassgrünen Blätter weisen stoma- tische Dichten, Grössen der Schutzzellen und eine Anzahl Chloroplaste auf, die sehr verschieden von denen der Tetraploiden sind (2 n = 44).

In den Ländern mit für die Kultur des C. arabica günstigen ökologischen Bedingungen bieten diese Haploiden ein praktisches Interesse für die Erlangung von vollstandigen Homozygoten.

. .

' I

DUBLIN (P.), PARVAIS (J.-P.). - La haploidía espontánea relacionada con la poliembrionía del Co$& aua6ica L. Café Cacao Thé (Paris), vol. XX, no 2, avr.-juin 1976, p. 83-90, fig., tabl., réf.

EI empleo de los haploides puede constituir una ayuda sumamente eficaz para el acortamiento de los ciclos de selección de los vegetales arborescentes, como así ocurre con el cafeto Coffea arabica, cuyo haploide (n = 2 x = 22) es ya conocido desde hace largo tiempo.

Los autores presentan en este artículo los resultados preliminares relativos a la haploidía espontánea, rela- cionada con la gemelidad, estudio efectuado con plán- tulas procedentes de semillas poliembrionadas.

Entre las dos mil plántulas procedentes de poliem- briones que han sido sometidas a examen, diecinueve de las mismas han manifestado ser haploides.

Estas plántulas haploides se caracterizan por tallos más delgados, con entrenudos cortos, por una diferen- ciación precoz de las ramificaciones plagiotropas y por una relación longitud/anchura de la hoja marca- damente superior a la de los tetraploides. Este último carácter puede servir de criterio para clasificar las plán- tulas presumidas haploides. Las hojas, de tono verde pálido, presentan densidades estomáticas, dimensiones características de las células de guarda y un número de cloroplastos muy diferentes de aquellos de los tetra- ploides (2 n = 44).

En los países en que se dan condiciones ecol6gicas favorables para el cultivo del Coffea arabica, estos ha- ploides presentan un interés práctico para la obtención de homoci,gotos completos.

I

'

Imprime en Fqance. - ImD. JOUVE. 17. me du Louvre. 75001 Paris . o

I