Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le

transfert de gène dans le Système Nerveux Central

LGN - UMR 7091sous la direction du Docteur Jacques MALLET

Lahouari AMAR

• Le transfert de gène dans le SNC• Les vecteurs lentiviraux

- caractéristiques

- avantages et méthode de production

- applications• Résultats

Développement d’un seul vecteur lentiviral pour:

1) l’expression régulée d’un facteur protéique

2) l’expression régulée de shARN• Conclusion générale et perspectives

Transfert de gène dans le SNC

Gène thérapeutique: protéine ou séquence nucléotidique (siARN)

In vivo

Ex vivo

Cellules transduites

Spécificités du système nerveux central relatives au transfert de

gène• Présence de la barrière hématoencéphalique

– Limite le passage de molécules thérapeutiques» Nécessité du transfert de gène…

• La majorité des cellules du SN sont quiescentes– Possibilité d’utilisation de vecteurs intégratifs ou épisomaux– Vecteurs non viraux peu efficaces à long terme

» préférentiellement viral…

• Diversité cellulaire– Nécessité d’expression restreinte ou élargie du facteur thérapeutique– Possibilité  de ciblage d’une structure ou noyau particulier dans le SN– Transport rétrograde ou antérograde dans les neurones

» avec un vecteur dont le tropisme est modulable.

Vecteurs lentiviraux particulièrement adaptés

Avantages des vecteurs lentiviraux

• Transduction des cellules quiescentes et en division

• Expression stable et à long terme du transgène dans le SNC

• Faible toxicité• Facilité de production à haut titre dénuée

de RCR• Pseudotypage aisé

Vecteurs lentiviraux : méthode de production

Particules virales pseudotypées avec la protéine G du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G)

VSV-G

PhCMV VSV-G pAPlasmide d’enveloppe

Plasmide transcomplémentant

PhCMV pAgag

Pro polΨ

rev

tat

Plasmide vecteur 5’LTR 3’LTRRRE cPPT Pro Transgène

U3

PPT

Ψ

WPRE

Applications des vecteurs lentiviraux

• Thérapie génique

• Production d’animaux transgéniques (modèles de maladies…)

• Etude de fonction de gènes (surexpression ou inhibition par siARN)

Nécessité d’un système régulable

• Etudes cliniques– Moduler l’expression du facteur thérapeutique– Arrêt du traitement en cas de complication

grave

• Etudes fondamentales– Contrôle temporel du transgène – Contrôle du niveau d’expression

Le système de régulation inductible par la Tetracycline

(Tet-on)

PGK rTetR rTetR

VP16

VP16rtTA

Tet

Tet

Tet+

rTetR

VP16Tet

7TetO CMVmin Transgène 7TetO CMVmin Transgène

1. Développement d’un seul vecteur lentiviral pour l’expression régulée

d’une protéine thérapeutique

Nécessité d’un vecteur unique

• Réduction de la quantité de vecteur administrée:– Réduction du risque de mutagenèse

insertionnelle– Réduction du risque d’immunogénicité lié au

vecteur

• Permettre l’expression du transgène et du transactivateur dans la même cellule

Un vecteur lentiviral unique pour l’expression régulée d’un

transgène

5’LTR 3’LTRcPPT Pcmv min Transgène

U3

PPT

Ψ

WPREInsStufferPPGKrtTA2-M2BGH polyA

- Luciférase - Tyrosine hydroxylase

Expression régulée de la luciférase in vitro

Transduction d’une culture primaire d’astrocytes

+ Dox

- Dox

Réversibilité in vitro Dose optimale in vitro

Effet de la doxycycline sur l’activité luciférase

Cinétique d’induction in vitro

Injection du vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la luciférase dans le

striatum de rat

+ Dox

- Dox

Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase

+ Dox - Dox

Evaluation in vitro

Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase

Evaluation in vivo

+ Dox - Dox Contrôle non injecté

Résumé

• Construction d’un seul vecteur lentiviral portant un système de régulation Tet-on

• Validation in vitro et in vivo

• Niveau d’induction fort

• Fuite non détectable en absence d’inducteur

• Dose d’inducteur élevée in vivo

Applications, limites et voies d’amélioration

• Application de ce vecteur Tet-on • Utilisation in vitro • Utilisation chez l’animal

» Exemple : stratégie de neuroprotection» Limites dans une stratégie de remplacement?

• Utilisation en clinique exclue

• Nombre faible de cellules exprimant le transgène in vivo après induction• Quantité de vecteur utilisée sous optimale• Défaut de retrotranscription d’un génome vecteur long• Co-expression du transactivateur et du transgène

Un vecteur versus deux vecteurs?

2. Développement d’un seul vecteur lentiviral permettant

l’expression régulée de shARN

L’ARN interférence

Expression des siARN

Pol III

+1

Un promoteur d’ARN Polymérase III

Le promoteur U6 L’expression des shARN nécessite l’utilisation d’un promoteur d’ARN polymérase III

- Débute la transcription à un nucléotide défini (G)- Arrêt de la transcription par 5 thymidines

Site de démarrage de la transcription

ESD ESP TATA

-24-29-47-66-149-244

G

TTTTT

core

SNAPc TBPSTAF1 Oct1

shARN

Sans inducteur : inhibition de la synthèse des siARN

Stratégie négative : encombrement stérique inductible d’un promoteur polymérase III

Protéine

ESD ESP shARNTATA

SNAPc TBPPol III

Avec inducteur : synthèse des siARN

inducteur

Pol III

ESD ESP shARNTATA

SNAPc TBP

Pol III

Avec Doxycycline : synthèse des siARN

doxycycline

Sans Doxycycline : inhibition de la synthèse des siARN

Encombrement stérique inductible du promoteur U6 par le système tétracycline

répresseur Tet

ESD ESP shARNTATATet0

SNAPc

ESD ESP shARNTATATetO

SNAPc TBP

TBPPol III

Un promoteur U6 régulable :Stratégie négative

ESD ESP TetOTetOTetOTetO TATA TetO

ESD ESP TetOTATA

ESD ESP TetO TATA

ESD ESP TetO TATA TetO

ESD TATA

+1-24-29-47-66-149-244

ESP

ESD ESP TetOTetO TATA TetO

ESD ESP TetOTetOTetO TATA TetO

Inhibition de l ’expression de la GFP dans des cellules HEK 293T-GFP

inhibition de la GFP par un vecteur lentiviral exprimant un siGFP régulable

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

293T-GFP LVsiGFP - Dox LVsiGFP+Dox

% d

e ce

llule

s G

FP

posi

tive

s%

de

cell

ule

s G

FP

pos

itiv

es

Stratégie positive : adaptation du système Tet-on à un promoteur d’ARN polymérase III

• Utilisation d’un transactivateur de l’ARN polymerase III

• Utilisation d’un promoteur polymérase III minimal inductible par la tétracycline

Développement d’un transactivateur de promoteur polymérase III inductible par la

doxycycline

Un nouveau transactivateur rtTA-Oct2

rtTA

Domaine de liaison à l’ADN du rtTA2-M2

VP16

Domaine transactivateur VP16 du virus HSV

Domaine transactivateur

Q18III(QA) Q18III(QA) Q18III(QA) Q18III(QA)

Un nouveau promoteur

ESP Boîte TATA

Développement d’un promoteur U6 minimal inductible par la doxycycline

DSE

7 TetO

Pol III

Un promoteur d’ARN Polymérase III inductible par la doxycycline

ESP Boîte TATA

7 TetO

+1SNAPc TBP

sens boucle

antisens TTTTT

19 pb 19 pb9 pb

antisenssens5’

UUshARN

Oct-2

rtTADox

Un vecteur lentiviral pour l’expression régulée de shARN

dirigé contre la GFP

5’LTR 3’LTRcPPT

U3

PPT

Ψ

PPGK rtTA-Oct2 WPREP

U6 min shGFP

- dox

+ dox

Pas d’expression de shGFP Synthèse de la GFP

Expression de shGFP Inhibition de la GFP

Une expression de shGFP régulée

+ Dox

- Dox

Northern Blot

Transduction de cellules HEK293T-GFP avec différentes quantités de vecteur lentiviral exprimant de façon régulée un shGFP

Expression de shGFP en fonction de la concentration de

doxycycline

- Dox + Dox

Cinétique d’expression du shARN

- Dox

+ Dox+ Dox- Dox

Application du système pour la régulation d’un gène endogène :

p53 HEK293T

A549

MCF-7

Résumé

• Construction d’un système de régulation qui permet une expression contrôlée par la doxycycline de shARN

• Validation du contrôle d’un gène endogène

• Forte inductibilité

• Système réversible

• Forte concentration de doxycycline

Limites et perspectives

• Dose de doxycycline

• Validation in vivo

Expression de shARN par promoteur pol III versus promoteur pol II

Conclusion générale

• Construction d’un seul vecteur lentiviral pour l’expression régulée par le système Tet-on d’une protéine thérapeutique.

• Développement d’un système de régulation de l’expression de shARN inductible par la tétracycline et sa vectorisation.

Problème de l’immunogénicité du transactivateur pour utilisation clinique

Perspectives pour une utilisation clinique

• Se tourner vers un système de régulation d’origine humaine ou « humanisé » pour la clinique–Rapamycine–ZFP synthétique

• Régulation Physiologique

• La régulation en cas de complication–Alternatives :excision du vecteur ou suicide des cellules transduites