Les techniques de préparation des Les techniques de préparation des coupes pour les coupes pour les

microscopies optique et électroniquemicroscopies optique et électronique

Histologie

Faculté de médecine Saint-AntoineNM 08/2004

Principes générauxPrincipes généraux

échantillonnage du prélèvement, fixation, deshydratation, inclusion (paraffine, résine), coupe, colorations, observation.

I- Les coupes histologiquesI- Les coupes histologiques

3 à 5 µm d’épaisseur,

quelques centimètres de largeur et longueur,

nombreuses colorations possibles,

montées entre lame et lamelle,

grandissement de 10 à 1000 fois (environ).

Techniques de fixationTechniques de fixation

Immersion dans le fixateur• la technique la plus utilisée (routine).

Perfusion intravasculaire ou intraluminale • très bonne fixation,• délicate à mettre en place,• pour la recherche.

FixationFixation

être rapide,

permettre des colorations topographiques,

permettre l’immunohistologie,

être peu ou pas toxique.

préserver les structures tissulaires et cellulaires,

éviter les artefacts (gonflements, rétractions),

Elle doit :

Il n’y a pas de fixateur idéalIl n’y a pas de fixateur idéal

Il faut le choisir en fonction de ses avantages et inconvénients.

Parmi des centaines disponibles !

le formol seul (formaldéhyde dilué) dans l’eau courante, ou tamponné

bon marché,incolore,permet la fixation de grosses pièces,permet l’immunohistologie

MAIS

allergisant,carcinogène.

Les fixateurs contenant du formol (1)

– AFA (Acide acétique Formol Alcool)

très rapide (risques de surfixation),

permet les marquages immunohistologiques.

peu pénétrant.

MAIS

idéal pour les biopsies

– Bouin (Acide acétique Formol Acide picrique)

rapide,

pénétrant,

légères rétractions tissulaires,

très belles colorations topographiques,

ne permet que difficilement l’immunohistologie, coloré : tache ! (et ne part qu’avec l’épiderme).

Les fixateurs contenant du formol (2)

MAIS

Idéal pour voir des gg. lymphatiques dans le tissu adipeux

Quel que soit le fixateur, le prélèvement doit être Quel que soit le fixateur, le prélèvement doit être échantillonné et la taille des échantillons adaptée à échantillonné et la taille des échantillons adaptée à celle de la cassette d’inclusion.celle de la cassette d’inclusion.

DeshydratationDeshydratation

L’eau tissulaire est remplacée par de la paraffine.

Mais ces milieux ne sont pas miscibles entre eux.

On procède donc par étapes en remplaçant :

l’eau par un alcool,

l’alcool par un solvant organique,

le solvant par la paraffine

Deshydration et Inclusion : l’automate Deshydration et Inclusion : l’automate les bacs contiennent

des alcools (5 bains),

des solvants organiques

(5 bains),

de la paraffine chaude (3 bains).

Remarque : machine historique ! Elle a 40 ans et fonctionne toujours !

Confection du bloc : EnrobageConfection du bloc : Enrobage

Un moule est rempli de paraffine liquideUn moule est rempli de paraffine liquide

Le prélèvement est mis en place et le bloc Le prélèvement est mis en place et le bloc mis à refroidirmis à refroidir

Démoulage, après refroidissementDémoulage, après refroidissement

Mise en place du bloc sur le microtomeMise en place du bloc sur le microtome

Confection des coupes : le rubanConfection des coupes : le ruban

Etalement sur lameEtalement sur lame

Séchage avant colorationSéchage avant coloration

Les colorations sont infinies.Les colorations sont infinies.

Ne vous fiez pas à la couleurNe vous fiez pas à la couleurpour « reconnaître » une structure !pour « reconnaître » une structure !

Observations, photographies.Observations, photographies.

Résultat surpriseRésultat surprise

Poumon de chien

Et n’oubliez pas ….Et n’oubliez pas ….De remettre vos lames dans les boîtes,De remettre vos lames dans les boîtes,

vous nous aiderezvous nous aiderez ! !

Microscopie électroniqueMicroscopie électronique

Quelques millimètres de largeur et longueur,

60 à 100 nanomètres d’épaisseur,

coupe déposée sur une grille métallique,

rares colorations possibles,

grandissement de 1000 à 100.000 fois.

Les blocsLes blocs environ 2 mm3 de

tissu,

fixation immédiate

glutaraldéhyde /

tétroxyde d’osmium,

inclusion en résine,

imprégnation par

métaux lourds

(plomb).

Coupe (dégrossissage au couteau de verre)Coupe (dégrossissage au couteau de verre)

Coupe ultra-fine (couteau diamant)Coupe ultra-fine (couteau diamant)

Les coupes sur grille métalliqueLes coupes sur grille métallique

Le Le (vénérable)(vénérable) microscope électronique de la fac’ microscope électronique de la fac’

Mise en place de la grilleMise en place de la grille

ObservationObservation

Mise au point, observationMise au point, observation

X 1 000X 400

En microscopie optique, les plus forts grandissements sont :En microscopie optique, les plus forts grandissements sont :

En microscopie électronique, le plus fort grossissement estEn microscopie électronique, le plus fort grossissement estx 100 000.x 100 000.

X 40 000

Les plus couramment utilisés sont entre x 3 500 et x 50 000