Les petits ARN régulateurs -...

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  • LespetitsARNrgulateurs

    DanielGautheret

    V.2008.0http://www.esil.univmrs.fr/~dgaut/Cours

    Apportsdelagnomique

  • LesARNnonmessagersouARNnoncodants(ncRNA)

    ARNt

    ARNr

    ARNsn(spliceosome)

    AutresARNs 4.5S,10Sa,Spot42,DicF,MicF,OxyS,DsrA,6S(procaryotes)produitsdes

    gnesXIST,H19,IPW,7H4,His1,NTT(mammifres),microARN(animauxetplantes),snoARN(partout)

    ARNr18Set28S:promoteurspolI.

    ARNtetARNr5S:promoteurspolIII

    AutresARNnc:polI,IIouIII

    2

  • LesARNrgulateurs

    Procaryotes

    Eucaryotes

    3

  • ARNrgulateurseucaryotes

    4

  • LinterfrenceARN

    5

  • Commentamarche?

    Dbutannes90:ARNantisens

    Effetsmodestesetparfoisincohrents

    6

  • ArticledeFire&Mello1998

    Theunc22 geneencodesamyofilamentprotein.Decreaseinunc22 activityisknowntoproduceseveretwitchingmovements(convulsions).InjecteddoublestrandedRNA,butnotsinglestrandedRNA,inducedthetwitchingphenotypeintheprogeny.

    Image:BertilDaneholt.http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/adv.html

    7

  • Injectionofsinglestrandedordoublestrandedmex3 RNAintothegonadofC.elegans.Theextentofbrowncolourreflectstheamountofmex3mRNApresent.mex3mRNAisabundantinthegonadsandearlyembryos.ThemRNAwaslostafterinjectionofdoublestrandedRNA,whileinjectionofantisenseRNAonlyreducedthecontentofmRNAtosomeextent.

    Image:BertilDaneholt.http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/adv.html

    8

  • Observationsimportantes

    LesilencingnefonctionnequavecunesquencedecetARNm

    LasquencedoitprovenirdARNmature Posttranscription/cytoplasmique

    LARNmciblsembletredgrad

    QuelquesmolculesdADNdssuffisent Soitamplification,soitcatalyse

    Leffetpeutsetransmettreentretissus,voireladescendance Transmission

    9

  • Gnralisation

    Animaux(mtazoaires) Mammifres:seulementavecARNde21nt

    Plantes

    Tousleseucaryotessaufleslevures

    10

  • 1999:lemcanisme

    PrsencedepetitsARNde2025ntcontenantlesdeuxbrins:siRNA (smallinterfering)

    CesARNsontproduitsparclivagedelARNds

    CesontlespetitsARNquiinteragissentaveclARNm

    11

  • 2000:dcouvertedelamachinerie

    RISC

    RISC

    Dicer

    dsRNA

    siRNA

    mRNA

    Dicer:uneRNAseIII

    RISC:uncomplexecomprenantdesprotinesdelafamilleArgonaute/PIWI

    12

  • Importancedeladcouverte

    Protectioncontrelesvirus Silencingdeslmentsmobiles Maintientdeltatcondensdelachromatine Unnouveloutilpourrprimerspcifiquementlesgnes

    Rpressiondelasynthseprotiqueetrgulationdudveloppement DessiRNAnaturels:lesmiRNAs

    13

  • 1993:dcouvertedupremiermicroRNA

    4stadeslarvaires:L1L4 Ambrosisoleunmutantqui ritre lestadeL1 Cemutantprsenteunedltiondugnelin4 LorsquoninsredansunanimaltransgniqueunfragmentdADNcontenant

    legnelin4,onretrouvelephnotypenormal Curieusementlin4necodepaspouruneprotinemaisunARNde22n

    (Laboratoire de Victor Ambros)

    Coenorhabditiselegans(www.wormatlas.org) 0,1mm

    14

  • RpressionparreconnaissancedelUTR3

    PlusieursfragmentsdelUTR3delin14sontcomplmentaireslin4

    Enmutantlin4oulUTR,onestcapabledabolirourestaurerlarpressiondugnelin14

    15

  • LabiognsedesmiRNA:lajonctionentremiRNAetsiRNA

    DeuxRnaseIIIncessaires Drosha

    Dicer

    Lesdeuxenzymeslaissentunbout3librede2nt

    (He&Hannon,Naturereviews,2004)

    16

  • ActiondesmiRNA

    (He&Hannon,Naturereviews,2004)

    17

  • Lesmultiplesmodesdesilencing

    18

  • LavoiedextinctiondesARN:I(RNAsilencingpathway)

    ScienceMagazine2006

    RISCcomplex

    Cytoplasm

    19

  • RISCloadingcomplex

    LavoiedextinctiondesARN.IILecomplexeRISCviselARNm

    Silencingauniveauchromatine.Moinsbiencompris

    ScienceMagazine200620

  • LavoiedesmicroRNA

    CleavagebyDicer

    RISCloadingcomplex

    RISCcomplex

    Nucleus

    ScienceMagazine2006 21

  • UnmiRNApeutrprimerdescentainesdetranscrits

    InjectiondemiR1(coeur+muscle)etmiR124(cerveau)dansdescelluleshumaines

    SuividelexpressionparpuceADN

    ~200gnesrprims

    LemiRNAdecerveaurprimedesgnesquinedoiventpassexprimer danslecerveauentempsnormal.

    IDEMpourmiRNAdecoeur.

    22

  • Lesgnesrprimsontunmotifcommundansleur3UTR

    Squencede78nt seed essentiellepourlareconnaissancedelacible

    23

  • LesnouvellesfamillesdARNinterfrentsnaturels

    piRNA PIWIassociatedRNA

    Protgelegnomedestransposons

    Comprend:rasiRNA(repeatassociatedRNAs)

    UtilisentdiffrentesprotinesDiceretArgonaute(RISC).

    24

  • MachineriemiRNAchezleseucaryotesGrimsonetal.Nature455.2008.

    Dicer&argonauteproteins

    25

  • ARNrgulateursbactriens

    26

  • Dbutdesannes80: ChezEscherichiacoli,depetitsARN(~100nt)peuventselierdessquencescomplmentairesetinhiberlatraduction

    Aujourdhui,environ25casconnusdARNantisensrgulateurschezE.coli

    27

  • LessRNA:laprincipalefamilledARNrgulateurschezlesbactries

    80100ntdelong

    Pasdeprocessing/clivage

    InteractionavecprotinechaperoneHfq

    AppariementauxARNm

    AffectentcapacitdetraductionoustabilitdelARNm

    28

  • LessRNAchezColisontsouventimpliqusdanslarponseauStress

    Dclencheur synthse sRNA

    Les cibles sont souvent des rgulateurs de transcription29

    PrsentateurCommentaires de prsentationSGRS: glucose-phosphate stress. Advient quad les cellules ne peuvent plus mtaboliser le Glucose-6P

  • LachaperoneHfqestncessairelactiondessRNA

    IntragitavecrgionsrichesenAUsurlesRNAetsurlacible StabiliselesRNA

    StimuleappariemententresRNAetcible

    30

  • ReconnaissancesRNA/mRNA

    Leplussouventen5 Occlusiondusitedefixationduribosome,ducodonStart,dudpartdetranscription

    DgradationparRNAseE Estelleuneconsquencedelappariement?

    Ouuneconsquencedelarrtdetraduction?

    RNAseEdgradeaussilesRNA.

    31

  • Ryhb etlasynthsedeprotinesliantlefer

    Rpresseur:Fur(Ferricuptakeregulator).ReconnatlepromoteurdeRyhb. Enprsencedefer:FURactiv.RprimeRyhb

    Ferlimitant:FURinactif.SynthsedeRyhb

    RyhbselieaveclesmRNAde5opronsdeprotinesliantlefer

    ConduitunerapidedgradationdesmRNA

    >Diminutiondesbesoinscellulairesenfer>redirectiondesressourcesenferversprotinesessentielles

    32

  • CaractrisationdeRyhb(2002)

    Genomewidesearch(bioinformatique)

    26sRNApotentiels

    ComplementaritssRNA:mRNA PlusieursmRNAutilisantlefer

    Vrif:NiveaudesdhinversementproportionnelRhyb

    CaractrisationaumoyendesouchesRhyb;fur;avecousansfer(ironchelator+)

    EricandGottesman(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99,46204625

    sdhCDAB:opronsuccinatedehydrogenaseC,D,A,B

    33

  • ActionconcertedeHfqetRnaseE

    Moritaetal.Genes&Dev.2005 34

  • RgulationpositivedeRpoSparDsrA/RprA

    RpoSestunfacteurSigmaalternatiftrsimportantpourlexpressiondenombreuxgnesenconditionsdestress.

    Etatnormal:teint.Largion5estrepliesurellemme.

    Ciblesitue~70ntenamontdudbutdetraduction

    DsrAsefixesurlacibleetlibrelesitedentreduribosome(RBS)

    LemodedactiondeRprAestencoreincertain

    RgulationpositiveparARN:jamaisvuchezleseucaryotes

    35

  • InhibitiondeRpoSparOxyS

    Encasdestressoxydatiffort,labactrie teint RpoS InductiondurgulonOxyRcomprenantunautresRNA:OxyS

    OxySinhibelatraductiondeRpoS,probablementpartitrationdelHfqdisponible

    36

  • Conclusion:unevaritdemcanismes

    (possible!)

    37

  • Eucaryotesetprocaryotes:quelquessimilitudes

    S.Gottesman 38

  • LesrgulationsparlesARNencis

    ARNprsentsurlARNmluimme

    Des capteurs (sensors)demtabolites

    Uncasclassique,lattnuationparletryptophane:

    39

  • Lesriboswitches

    Danslargion5desgnes

    Deuxconformations

    SelientdirectementauxmtabolitesouparlintermdiairedeprotinesoudARN

    Blocagetranscriptionoutraduction

    40

  • Blocagetraduction

    Blocagetranscription

    SAM=Sadenosylmethionine.Undesligandsreconnusparlesriboswitches

    41

  • Reconnaissancedirecteduligandparleriboswitch

    CoenzymeB12 TPP(drivdeThiamine)

    FMN(flavinmononucleotide)

    SAM(Sadenosylmethionine)

    Lysine

    Guanine

    Adenine

    GlcN6P(glucosamine6phosphate)

    Glycine

    42

  • ExempledesriboswitchescapteursdeTPP

    Aptamre:structuredARNcapabledereconnatreunligand

    Aprsfixationduligand:changementdeconformation

    (Icideuxmcanismesdiffrentsselonespces)

    Winkler&Breaker.Ann.Rev.Microb.2005 43

  • 44

  • RecherchedenouveauxARNnc

    45

  • Lestranscritsdanslesgnomesbactrien

    95%transcrit(~90%codant)

    codingintergenic

    95%dugnomeseretrouveunmomentdonnsousformedARN

    46

  • LesGnomesvertbrs: 90%transcritaussi!

    IntergenicDNA

    Transposableelements

    Introns,UTRs

    SatelliteDNA

    Codingregions:1.5%tRNA,rRNA

    90%dugnomesetrouveraitunmomentdonnsousformedARN(cfAffymetrixresultsin Encodeproject) 47

  • Quelssontlestranscritsnoncodantsfonctionnels?

    Uneaiguilledansunebottedefoin!

    48

  • 2.1Approchesexprimentales

    49

  • Cloning Rnomics*

    ExtraireARNtotal

    IsolerpetitsRNAs

    Marquageetreversetranscription

    Clonage&Sequenage

    200ncRNAchezlasouris

    160ncRNAchezC.elegans

    100ncRNAchezdiffrentesbactries

    *Huttenhoferetal.,2001 50

  • Limitations

    Sensibilit:ncRNArares,exprims