LespetitsARNrgulateurs

DanielGautheret

V.2008.0http://www.esil.univmrs.fr/~dgaut/Cours

Apportsdelagnomique

LesARNnonmessagersouARNnoncodants(ncRNA)

ARNt

ARNr

ARNsn(spliceosome)

AutresARNs 4.5S,10Sa,Spot42,DicF,MicF,OxyS,DsrA,6S(procaryotes)produitsdes

gnesXIST,H19,IPW,7H4,His1,NTT(mammifres),microARN(animauxetplantes),snoARN(partout)

ARNr18Set28S:promoteurspolI.

ARNtetARNr5S:promoteurspolIII

AutresARNnc:polI,IIouIII

2

LesARNrgulateurs

Procaryotes

Eucaryotes

3

ARNrgulateurseucaryotes

4

LinterfrenceARN

5

Commentamarche?

Dbutannes90:ARNantisens

Effetsmodestesetparfoisincohrents

6

ArticledeFire&Mello1998

Theunc22 geneencodesamyofilamentprotein.Decreaseinunc22 activityisknowntoproduceseveretwitchingmovements(convulsions).InjecteddoublestrandedRNA,butnotsinglestrandedRNA,inducedthetwitchingphenotypeintheprogeny.

Image:BertilDaneholt.http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/adv.html

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Injectionofsinglestrandedordoublestrandedmex3 RNAintothegonadofC.elegans.Theextentofbrowncolourreflectstheamountofmex3mRNApresent.mex3mRNAisabundantinthegonadsandearlyembryos.ThemRNAwaslostafterinjectionofdoublestrandedRNA,whileinjectionofantisenseRNAonlyreducedthecontentofmRNAtosomeextent.

Image:BertilDaneholt.http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/adv.html

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Observationsimportantes

LesilencingnefonctionnequavecunesquencedecetARNm

LasquencedoitprovenirdARNmature Posttranscription/cytoplasmique

LARNmciblsembletredgrad

QuelquesmolculesdADNdssuffisent Soitamplification,soitcatalyse

Leffetpeutsetransmettreentretissus,voireladescendance Transmission

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Gnralisation

Animaux(mtazoaires) Mammifres:seulementavecARNde21nt

Plantes

Tousleseucaryotessaufleslevures

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1999:lemcanisme

PrsencedepetitsARNde2025ntcontenantlesdeuxbrins:siRNA (smallinterfering)

CesARNsontproduitsparclivagedelARNds

CesontlespetitsARNquiinteragissentaveclARNm

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2000:dcouvertedelamachinerie

RISC

RISC

Dicer

dsRNA

siRNA

mRNA

Dicer:uneRNAseIII

RISC:uncomplexecomprenantdesprotinesdelafamilleArgonaute/PIWI

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Importancedeladcouverte

Protectioncontrelesvirus Silencingdeslmentsmobiles Maintientdeltatcondensdelachromatine Unnouveloutilpourrprimerspcifiquementlesgnes

Rpressiondelasynthseprotiqueetrgulationdudveloppement DessiRNAnaturels:lesmiRNAs

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1993:dcouvertedupremiermicroRNA

4stadeslarvaires:L1L4 Ambrosisoleunmutantqui ritre lestadeL1 Cemutantprsenteunedltiondugnelin4 LorsquoninsredansunanimaltransgniqueunfragmentdADNcontenant

legnelin4,onretrouvelephnotypenormal Curieusementlin4necodepaspouruneprotinemaisunARNde22n

(Laboratoire de Victor Ambros)

Coenorhabditiselegans(www.wormatlas.org) 0,1mm

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RpressionparreconnaissancedelUTR3

PlusieursfragmentsdelUTR3delin14sontcomplmentaireslin4

Enmutantlin4oulUTR,onestcapabledabolirourestaurerlarpressiondugnelin14

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LabiognsedesmiRNA:lajonctionentremiRNAetsiRNA

DeuxRnaseIIIncessaires Drosha

Dicer

Lesdeuxenzymeslaissentunbout3librede2nt

(He&Hannon,Naturereviews,2004)

16

ActiondesmiRNA

(He&Hannon,Naturereviews,2004)

17

Lesmultiplesmodesdesilencing

18

LavoiedextinctiondesARN:I(RNAsilencingpathway)

ScienceMagazine2006

RISCcomplex

Cytoplasm

19

RISCloadingcomplex

LavoiedextinctiondesARN.IILecomplexeRISCviselARNm

Silencingauniveauchromatine.Moinsbiencompris

ScienceMagazine200620

LavoiedesmicroRNA

CleavagebyDicer

RISCloadingcomplex

RISCcomplex

Nucleus

ScienceMagazine2006 21

UnmiRNApeutrprimerdescentainesdetranscrits

InjectiondemiR1(coeur+muscle)etmiR124(cerveau)dansdescelluleshumaines

SuividelexpressionparpuceADN

~200gnesrprims

LemiRNAdecerveaurprimedesgnesquinedoiventpassexprimer danslecerveauentempsnormal.

IDEMpourmiRNAdecoeur.

22

Lesgnesrprimsontunmotifcommundansleur3UTR

Squencede78nt seed essentiellepourlareconnaissancedelacible

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LesnouvellesfamillesdARNinterfrentsnaturels

piRNA PIWIassociatedRNA

Protgelegnomedestransposons

Comprend:rasiRNA(repeatassociatedRNAs)

UtilisentdiffrentesprotinesDiceretArgonaute(RISC).

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MachineriemiRNAchezleseucaryotesGrimsonetal.Nature455.2008.

Dicer&argonauteproteins

25

ARNrgulateursbactriens

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Dbutdesannes80: ChezEscherichiacoli,depetitsARN(~100nt)peuventselierdessquencescomplmentairesetinhiberlatraduction

Aujourdhui,environ25casconnusdARNantisensrgulateurschezE.coli

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LessRNA:laprincipalefamilledARNrgulateurschezlesbactries

80100ntdelong

Pasdeprocessing/clivage

InteractionavecprotinechaperoneHfq

AppariementauxARNm

AffectentcapacitdetraductionoustabilitdelARNm

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LessRNAchezColisontsouventimpliqusdanslarponseauStress

Dclencheur synthse sRNA

Les cibles sont souvent des rgulateurs de transcription29

PrsentateurCommentaires de prsentationSGRS: glucose-phosphate stress. Advient quad les cellules ne peuvent plus mtaboliser le Glucose-6P

LachaperoneHfqestncessairelactiondessRNA

IntragitavecrgionsrichesenAUsurlesRNAetsurlacible StabiliselesRNA

StimuleappariemententresRNAetcible

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ReconnaissancesRNA/mRNA

Leplussouventen5 Occlusiondusitedefixationduribosome,ducodonStart,dudpartdetranscription

DgradationparRNAseE Estelleuneconsquencedelappariement?

Ouuneconsquencedelarrtdetraduction?

RNAseEdgradeaussilesRNA.

31

Ryhb etlasynthsedeprotinesliantlefer

Rpresseur:Fur(Ferricuptakeregulator).ReconnatlepromoteurdeRyhb. Enprsencedefer:FURactiv.RprimeRyhb

Ferlimitant:FURinactif.SynthsedeRyhb

RyhbselieaveclesmRNAde5opronsdeprotinesliantlefer

ConduitunerapidedgradationdesmRNA

>Diminutiondesbesoinscellulairesenfer>redirectiondesressourcesenferversprotinesessentielles

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CaractrisationdeRyhb(2002)

Genomewidesearch(bioinformatique)

26sRNApotentiels

ComplementaritssRNA:mRNA PlusieursmRNAutilisantlefer

Vrif:NiveaudesdhinversementproportionnelRhyb

CaractrisationaumoyendesouchesRhyb;fur;avecousansfer(ironchelator+)

EricandGottesman(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99,46204625

sdhCDAB:opronsuccinatedehydrogenaseC,D,A,B

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ActionconcertedeHfqetRnaseE

Moritaetal.Genes&Dev.2005 34

RgulationpositivedeRpoSparDsrA/RprA

RpoSestunfacteurSigmaalternatiftrsimportantpourlexpressiondenombreuxgnesenconditionsdestress.

Etatnormal:teint.Largion5estrepliesurellemme.

Ciblesitue~70ntenamontdudbutdetraduction

DsrAsefixesurlacibleetlibrelesitedentreduribosome(RBS)

LemodedactiondeRprAestencoreincertain

RgulationpositiveparARN:jamaisvuchezleseucaryotes

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InhibitiondeRpoSparOxyS

Encasdestressoxydatiffort,labactrie teint RpoS InductiondurgulonOxyRcomprenantunautresRNA:OxyS

OxySinhibelatraductiondeRpoS,probablementpartitrationdelHfqdisponible

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Conclusion:unevaritdemcanismes

(possible!)

37

Eucaryotesetprocaryotes:quelquessimilitudes

S.Gottesman 38

LesrgulationsparlesARNencis

ARNprsentsurlARNmluimme

Des capteurs (sensors)demtabolites

Uncasclassique,lattnuationparletryptophane:

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Lesriboswitches

Danslargion5desgnes

Deuxconformations

SelientdirectementauxmtabolitesouparlintermdiairedeprotinesoudARN

Blocagetranscriptionoutraduction

40

Blocagetraduction

Blocagetranscription

SAM=Sadenosylmethionine.Undesligandsreconnusparlesriboswitches

41

Reconnaissancedirecteduligandparleriboswitch

CoenzymeB12 TPP(drivdeThiamine)

FMN(flavinmononucleotide)

SAM(Sadenosylmethionine)

Lysine

Guanine

Adenine

GlcN6P(glucosamine6phosphate)

Glycine

42

ExempledesriboswitchescapteursdeTPP

Aptamre:structuredARNcapabledereconnatreunligand

Aprsfixationduligand:changementdeconformation

(Icideuxmcanismesdiffrentsselonespces)

Winkler&Breaker.Ann.Rev.Microb.2005 43

44

RecherchedenouveauxARNnc

45

Lestranscritsdanslesgnomesbactrien

95%transcrit(~90%codant)

codingintergenic

95%dugnomeseretrouveunmomentdonnsousformedARN

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LesGnomesvertbrs: 90%transcritaussi!

IntergenicDNA

Transposableelements

Introns,UTRs

SatelliteDNA

Codingregions:1.5%tRNA,rRNA

90%dugnomesetrouveraitunmomentdonnsousformedARN(cfAffymetrixresultsin Encodeproject) 47

Quelssontlestranscritsnoncodantsfonctionnels?

Uneaiguilledansunebottedefoin!

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2.1Approchesexprimentales

49

Cloning Rnomics*

ExtraireARNtotal

IsolerpetitsRNAs

Marquageetreversetranscription

Clonage&Sequenage

200ncRNAchezlasouris

160ncRNAchezC.elegans

100ncRNAchezdiffrentesbactries

*Huttenhoferetal.,2001 50

Limitations

Sensibilit:ncRNArares,exprims