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FEeferra

L

LLEESS AAPPTTAAMMEERREE

Responsab

Mm

ESIL GBM 3ème Année Projet de Biologie

CARLIER Aurélieier@esil.univ-mrs.fr

RRANDINI Emiliend@esil.univ-mrs.fr

ESIL

BIOMEDICA

SS

le de formatione S. GRANON

Les aptamères

SSOOMMMMAAIIRREE TABLE DES ILLUSTRATIONS............................................................................................ 2

INTRODUCTION.................................................................................................................... 3

RAPPELS SUR L’ADN ........................................................................................................... 4 1. QU'EST-CE QUE L'ADN ?..................................................................................................... 4

1.1. Structure Physico-chimique de l'ADN......................................................................... 4 1.2. Structures Secondaires et Tertiaires de l'ADN ........................................................... 5 1.3. Fonction Biologique de l'ADN .................................................................................... 5 1.4. Relations Structure/Fonction de l'ADN....................................................................... 5

QU’EST-CE QU’UN APTAMERE ? ..................................................................................... 6

LA METHODE SELEX .......................................................................................................... 7

1. DESCRIPTION GENERALE ..................................................................................................... 7 2. DESCRIPTION DETAILLEE..................................................................................................... 8

DIFFERENTES APPLICATIONS POSSIBLES................................................................ 10

1. APPLICATIONS THERAPEUTIQUES ...................................................................................... 10 1.1. Description ................................................................................................................ 10 1.2. Exemples d’applications ........................................................................................... 11

2. APPLICATIONS DIAGNOSTIQUES ........................................................................................ 12 2.1. Description ................................................................................................................ 12 2.2 Exemples..................................................................................................................... 13

TRAITEMENT DE LA GRIPPE ......................................................................................... 14 1. LES VIRUS DE LA GRIPPE.................................................................................................... 14

1.1 Description des virus.................................................................................................. 14 1.2 Le cycle de réplication virale :................................................................................... 15 1.3 Traitements existants.................................................................................................. 15

2. APPLICATION DES APTAMERES A LA GRIPPE ...................................................................... 16

CONCLUSION....................................................................................................................... 17

BIBLIOGRAPHIE................................................................................................................. 18

ANNEXES............................................................................................................................... 19 1. REACTION EN CHAINE PAR POLYMERASE........................................................................... 19

Résumé ............................................................................................................................. 19 1.1 PCR Qualitative ......................................................................................................... 20

1.1.1 Méthode........................................................................................................ 20 1.1.2 Inconvénients ............................................................................................... 20

1.2. PCR Quantitative ...................................................................................................... 20 1.2.1 Généralités.................................................................................................... 21 1.2.2 Les sondes nucléotiques ............................................................................... 21 1.2.3 Méthode........................................................................................................ 24 1.2.4. Exploitation des résultats ............................................................................. 27

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TTAABBLLEE DDEESS IILLLLUUSSTTRRAATTIIOONNSS FIGURE 1 - CONFORMATION DE LA DOUBLE HELICE DE L'ADN DANS SA CONFORMATION

USUELLE (ADN-B). ROUGE: LE BRIN PHOSPHODIESTER. BLEU: GUANINE. JAUNE: CYTOSINE. CETTE FIGURE EST DE ANNE LEBRUN ET RICHARD LAVERY. ............................ 4

FIGURE 2 - LES DIFFERENTES ETAPES DE LA METHODE SELEX .................................................. 7 FIGURE 3 - UN CYCLE SELEX COMPLET..................................................................................... 8 FIGURE 4 METHODE SANDWICH................................................................................................. 12 FIGURE 5 - VIRUS DE LA GRIPPE [12] A. ........................................................................................ 14 FIGURE 6 - CYCLE DE REPLICATION DE LA GRIPPE, SELON [12] B. .................................................... 15 FIGURE 7 - MELANGE REACTIONNEL EN PRESENCE DE SYBR GREEN....................................... 21 FIGURE 8 - DEBUT DE L’AMPLIFICATION AVEC COUPLAGE DE L’AMORCE ................................. 22 FIGURE 9 - PHASE D’ELONGATION ET AUGMENTATION DE LA FLUORESCENCE .......................... 22 FIGURE 10 - MELANGE REACTIONNEL DE TYPE « QUENCHING »................................................ 23 FIGURE 11 - EXCITATION DE LA FLUORESCEINE ........................................................................ 23 FIGURE 12 - EXCITATION DU DEUXIEME FLUOROCHROME PAR LA FLUORESCEINE .................... 23 FIGURE 13 - DEPLACEMENT PAR LA POLYMERASE LORS DE L’ELONGATION (ACTIVITE

EXONUCLEASE 5’) LORS D’UN « QUENCHING » DE FLUORESCENCE AVEC UNE SONDE TAQMAN........................................................................................................................... 24

FIGURE 14 - LES DIFFERENTES PHASES DE LA PCR ................................................................... 25 FIGURE 15 - ILLUSTRATION D’UNE INTERFERENCE D’AMPLIFICATION AVEC LE SYBR GREEN . 27

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Les aptamères

IINNTTRROODDUUCCTTIIOONN

Les acides nucléiques ne sont pas seulement des agents passifs de l’information génétique, ils peuvent également fonctionner en tant que partenaire hautement spécifique dans les interactions moléculaires. L’exploitation des propriétés des acides nucléiques et leurs propriétés de liaison, ont conduit à la découverte d’une nouvelle classe de molécules : les aptamères.

En 1990, leur découverte par Tuerk et Gold (7) a engendré un grand intérêt aussi bien

dans le milieu universitaire qu’industriel. Les aptamères sont rapidement devenus des outils de recherche valables. De plus, un aptamère thérapeutique à fait « son entrée » dans l’évaluation clinique seulement 8 ans après la découverte de cette technique. Tandis que les aptamères ont déjà fait leur place dans les applications thérapeutiques, ils vont devenir de plus en plus important en tant qu’outils de diagnostique in vitro.

Dans un premier temps, nous ferons un bref rappel sur l’ADN, l’aptamère étant une

molécule d’ADN. Ensuite nous définirons ce qu’est un aptamère et la méthode utilisée pour l’obtenir : la méthode SELEX. Puis, nous discuterons des applications diagnostiques et thérapeutiques. Enfin, nous donnerons des exemples concrets d’applications.

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RRAAPPPPEELLSS SSUURR LL’’AADDNN

1. Qu'est-ce que l'ADN ?

1.1. Structure Physico-chimique de l'ADN

L'ADN (acide désoxyribonucléique) est une macromolécule biologique formée par deux chaînes complémentaires qui s'emboîtent tout en s'enroulant l'une autour de l'autre pour former une double hélice droite (Fig. 1). Chaque chaîne est constituée d'un squelette formé de phosphodiesters et de sucres (le ribose) en alternance. Chaque sucre porte en plus un groupe chimique appelé "base azotée" (une "lettre") du livre génétique; ces lettres sont A (pour adénine), T (thymine), G (guanine) et C (cytosine). C'est le fait que les lettres A et T, ainsi que G et C, peuvent s'appareiller entre elles qui permet la complémentarité des deux chaînes formant la double hélice. La complémentarité A-T et G-C fait que l'on parle alors de "paires de bases".

Figure 1 - Conformation de la double hélice de l'ADN dans sa conformation usuelle (ADN-B). Rouge: le brin phosphodiester. Bleu: Guanine. Jaune: Cytosine. Cette figure est de Anne Lebrun et Richard

Lavery.

La structure primaire de l'ADN correspond donc à la séquence des paires de bases le long de la molécule. Différents mécanismes moléculaires et cellulaires sont alors spécialisés dans la lecture de cette séquence génétique et sa traduction en unités fonctionnelles, les protéines.

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1.2. Structures Secondaires et Tertiaires de l'ADN

On parle également de structures secondaires et tertiaires dans la molécule d'ADN. En effet, certaines séquences de paires de bases sont connues pour induire dans la molécule des courbures importantes. D'autres séquences permettent la formation de structures encore plus particulières, tels les cruciformes, la forme en hélice gauche de l'ADN, et ainsi de suite.

In vivo, l'ADN est organisé en structures suprahélicales ubiquitaires qui permettent un empaquetage très efficace de longues molécules d'ADN dans chaque noyau cellulaire. Ces structure correspondent à de l'ADN dit sur- ou sous-enroulé. Un cordon téléphonique enroulé sur lui-même est un bon exemple des formes que peut prendre de l'ADN sur- ou sous-enroulé. De nombreuses études visent donc à regarder de plus près les liens entre le surenroulement de l'ADN et son activité biologique.

1.3. Fonction Biologique de l'ADN

L'ADN est le repositoire de l'information génétique. Cette information est codée par la succession des bases azotées A, T, G et C. On peut imaginer que la molécule d'ADN est le livre de recettes de toute cellule vivante. C'est là que se trouvent toutes les information nécessaires à la production des protéines dont les cellules vivantes ont besoin.

Ainsi, les systèmes vivants se retrouvent avec une batterie d'enzymes dont le rôle principal est de lire et décoder l'information génétique portée par l'ADN (ARN polymérases, ribosomes et gyrases pour n'en nommer que trois). Le décodage complet suit de nombreuses étapes (déroulement de l'ADN, lecture et transcription en ARN, épissage de l'ARN, traduction du code en protéine, maturation de la protéine...) avant de donner lieu à l'assemblage correct des protéines dont la cellule peut avoir besoin.

1.4. Relations Structure/Fonction de l'ADN

L'analogie du livre est très utile pour comprendre les liens entre la structure et la fonction de l'ADN. Admettons que le livre ait une couverture pour protéger les pages, une introduction, un message écrit et une conclusion.

Pour l'ADN, la couverture correspond au squelette phosphodiester-ribose qui donne à la molécule une certaine rigidité. Le texte est repéré par la séquence des paires de bases; c'est l'information brute. Des séquences d'introduction et de conclusion permettent de diriger vers la page correcte les enzymes nécessaires au décodage de l'information génétique.

Pour lire un livre, il faut d'abord l'ouvrir. La même chose est vraie pour l'ADN; il faut dérouler légèrement la double hélice pour que les enzymes appropriées puissent aller lire le code génétique. Au fil des années, les scientifiques ont compris que la structure physique de l'ADN pouvait donc influer sur son activité biologique. Par exemple, un ADN trop enroulé est comme un livre sous scellé, dans la mesure où les enzymes n'ont pas accès à l'information portée par l'ADN. La molécule d'ADN doit avoir une structure bien particulière pour que sa fonction soit correctement remplie.

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Les aptamères

QQUU’’EESSTT--CCEE QQUU’’UUNN AAPPTTAAMMEERREE ??

Leur nom dérive du mot latin « aptus » qui signifie « correspondre » et du suffixe grec « -mer ».

Les aptamères sont des oligonucléotides (molécules d’ADN, simple ou double brin, et

ARN) qui peuvent se lier avec une grande affinité et une grande spécificité à un grand nombre de molécules cibles. Ces molécules cibles peuvent être des protéines, des peptides, des vitamines ou encore tout autre composé organique ou non organique.

Ce sont des molécules de forme tridimensionnelle (ou globulaire comme le tARN) qui transportent des informations génétiques.

Les aptamères sont de taille intermédiaire (environ 8 à 15 kDa), entre les petits peptides (environ 1 kDa) et les fragments d’anticorps simple chaîne (environ 25 kDa). Les aptamères peuvent être comparés à des anticorps, car comme ces derniers, ils vont aller se fixer sur une molécule cible. Cependant, les aptamères possèdent des avantages par rapport aux anticorps :

- Les aptamères sont identifiés par un procédé in-vitro qui ne dépend pas des animaux, des cellules, ou même des conditions in-vivo. Il en résulte que les propriétés des aptamères peuvent être modifiées à la demande.

- Les conditions de sélection peuvent être modifiées de manière à obtenir des aptamères avec des propriétés souhaitables pour le diagnostic in-vitro. Par exemple, les aptamères qui se lient avec une molécule dans un tampon non physiologique et à une température non physiologique peuvent être identifiés. De la même manière, les paramètres cinétiques, tels que le « on-rate » et « off-rate » des aptamères, peuvent être modifiés à la demande.

- Puisque les animaux ou les cellules ne sont pas impliqués dans l’identification des aptamères, les toxines ainsi que les molécules qui n’ont pas une bonne réponse immunitaire peuvent être utilisés pour générer des aptamères de grande affinité.

- Les aptamères sont produits par synthèse chimique avec une grande exactitude et reproductibilité. Ils sont purifiés sous des conditions de dénaturation à un très fort taux de pureté. Donc, une faible variation est attendue dans la production d’aptamères.

- Les molécules « transporteuses » comme la fluorescéine et la biotine peuvent être attachées à des aptamères à un endroit précis définit par l’utilisateur. Les groupes fonctionnels peuvent également être attachés pendant la synthèse chimique des aptamères.

- Les aptamères subissent une dénaturation, mais le procédé est réversible. Une fois dénaturés, les aptamères fonctionnels peuvent être régénérés facilement en quelques minutes. Ils peuvent être conservés pendant une longue durée et être transportés à température ambiante.

Ils ont été découverts en 1990 grâce au développement d’un moyen de sélection in-

vitro couplé à une technique d’amplification. On appelle cette méthode la méthode SELEX pour Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment. Nous allons donc étudier cette méthode de plus près.

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Les aptamères

LLAA MMEETTHHOODDEE SSEELLEEXX

Les méthodes de sélection de sites in vitro permettent d’isoler, de façon systématique, des ADN ou des ARN possédant une capacité à interagir fortement et préférentiellement avec une cible donnée.

1. Description générale La méthode SELEX est une méthode du domaine de la chimie combinatoire qui

permet d’extraire des ligands potentiels d’une bibliothèque d’oligonucléotides composée initialement de séquence engendrés aléatoirement. La nature des ligands obtenus résulte conjointement des affinités et des concentrations des molécules cibles. Le SELEX est une méthode itérative constituée de quatre étapes successives schématisée sur la figure 2.

Initialement, un ensemble d’acides nucléiques est engendré aléatoirement. La mise en présence de ces acides nucléiques avec une molécule cible produit des liaisons biochimiques dont l’intensité est fonction du couple considéré. Parmi les complexes constitués, on sélectionne ceux dont la liaison est suffisamment forte. Les ligands contenus dans les complexes sont ensuite identifiés puis amplifiés par Polymerase Chain Reaction (PCR) (cf. annexe). Un nouvel ensemble d’acides nucléiques est ainsi produit, sur lequel il est possible d’itérer le processus de sélection. L’expérimentateur décide de mettre fin à la succession des cycles lorsqu’il lui apparaît que les données obtenues correspondent aux critères biologiques fixés (forte affinité pour la molécule cible).

Figure 2 - Les différentes étapes de la méthode SELEX

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2. Description détaillée

La méthode SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) est une technique permettant de cribler un grand nombre de bibliothèques d’oligonucléotides par un procédé itératif de sélection in vitro suivi d’une amplification. Les bibliothèques combinatoires basées sur les bio-polymères comme les acides nucléiques (et peptides) offrent la possibilité d’une amplification itérative de leurs « membres », ce qui rend le criblage plus rapide et plus simple.

Le procédé SELEX début par une séquence aléatoire de la bibliothèque obtenue par synthèse chimique de l’ADN. Chaque membre de la bibliothèque est un oligomère linéaire d’une séquence unique. La complexité, ou la diversité moléculaire, d’une bibliothèque dépend du nombre de positions aléatoires de nucléotides. Théoriquement, une bibliothèque contenant une région aléatoire de 40 nucléotides est représentée par 1,2 * 1024 séquences individuelles (420 = 1,2 * 1024). Toutefois, en pratique, la complexité d’une bibliothèque combinatoire de base d’oligonucléotides obtenue à partir de la synthèse d’une phase solide d’ADN d’échelle 1µmol est limitée à 1014 ou 1015 séquences individuelles. La chance de trouver des molécules rares et uniques qui interagissent avec la cible est liée à la diversité de la bibliothèque utilisée. Le degré de diversité moléculaire présent dans les séquences aléatoires d’oligonucléotides des bibliothèques, remplace celui des autres bibliothèques combinatoires utilisées pour le criblage. Cela comprend les bibliothèques de peptides utilisées pour l’affichage bactériophage ainsi que les bibliothèques faites pour les petites molécules organiques.

Dans le procédé de criblage, une séquence aléatoire d’oligonucléotides est incubée avec la cible d’intérêt dans un tampon de choix à température donnée. Durant cette étape, une très petite fraction de séquences individuelles va interagir avec la cible. Ces séquences sont alors séparées du reste de la bibliothèque au moyen d’une technique de séparation physique classique. Généralement, on utilisera une séparation sur filtre de nitrocellulose pour une protéine cible retenue par la nitrocellulose. Les petites molécules cibles sont généralement immobilisées sur un support solide qui génère une matrice d’affinité, et dans ce cas, les séquences qui n’interagissent pas avec la cible sont enlevées par un simple nettoyage du support. La population de séquences liées à la cible est isolée puis amplifiée afin d’obtenir une bibliothèque enrichie pour le prochain cycle (sélection et amplification).

Figure 3 - Un cycle SELEX complet

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L’efficacité de l’enrichissement en ligands de haute affinité est régie par la rigueur de la sélection à chaque cycle. L’évolution de l’enrichissement peut être déterminée en effectuant une analyse de la population enrichie par rapport à la cible. On obtient une saturation de l’affinité après plusieurs cycles, la bibliothèque enrichie est alors clonée et séquencée pour obtenir l’information de la séquence de chaque membre. Les séquences individuelles sont ensuite caractérisées selon leur habilité à se lier à la cible. Usuellement, la majorité des séquences individuelles, plus de 90%, d’une bibliothèque enrichie sont des « gagnants », c’est à dire des aptamères qui se fixent à la cible utilisée pour la sélection.

Les aptamères produits par la méthode SELEX sont de longues séquences qui contiennent des séquences fixes (connues) qui on été rajoutées pour faciliter l’amplification. Ces aptamères comptent en général 70 à 80 nucléotides et peuvent être tronqués pour éliminer les extensions de nucléotides qui ne sont pas important pour l’interaction avec la cible ou pour le pliage à l’intérieur de la structure qui facilite la liaison avec la cible. L’identification des aptamères tronqués au domaine minimum de la liaison avec la cible requiert quelques efforts, mais elle permet d’obtenir des aptamères fonctionnels de moins de 40 nucléotides. Dans la plupart des cas, les régions fixes de séquence utilisées pour la première liaison ne sont pas nécessaires pour la fonction de l’aptamère et peuvent être éliminées. Les avancées technologiques ont déjà permis d’éliminer la nécessité de régions fixes dans les bibliothèques de séquences aléatoires utilisées pour la méthode SELEX, permettant ainsi d’obtenir des séquences plus courtes d’aptamères.

Le nombre de cycles requis pour l’identification d’aptamère dépend généralement du degré de rigueur imposé à chaque cycle aussi bien que de la nature de la cible. Pour la plupart des cibles, l’affinité d’enrichissement est obtenue en 8 à 15 cycles. En général, un chercheur peut effectuer un cycle SELEX tous les 2 jours . En comptant le clonage et le séquençage, une expérience SELEX classique prend environ 2 à 3 mois. Une fois que la séquence est identifiée, l’aptamère est produit par synthèse chimique.

La synthèse « petite-échelle » et la purification d’un aptamère ne prend pas plus de 3 jours et fournit une quantité suffisante (plusieurs nanomoles) pour la mise au point et l’optimisation d’un essai diagnostique. Ce procédé complet est plus rapide que le temps typiquement passé à générer une ligne de cellule pour produire un anticorps et le purifier.

La méthode SELEX a été automatisée pour que la recherche d’aptamères soit encore plus rapide et plus économique. La plate-forme automatisée réalise le procédé SELEX sans (ou presque) intervention humaine. Elle permet d’effectuer plusieurs cycles en parallèle, ce qui offre une rapidité de traitement supplémentaire.

Les aptamères sont connus pour leur remarquable spécificité. Ils peuvent discriminer des cibles à partir de différences structurales subtiles, comme la présence ou non de méthyle, de groupement hydroxyle ou encore la forme –L ou –D d’un énantiomère de la cible. Le haut degré de spécificité souvent vu pour les aptamères, même meilleur que celui des anticorps, est le résultat d’une demande sélective dans le procédé SELEX qui élimine les séquences qui se lient avec des cellules proches de la cellule cible. En pratique, cela est réalisé par le procédé appelé « counter-SELEX » qui élimine efficacement les ligands qui vont se lier aussi bien à la cellule cible qu’à une cellule de structure analogue. Pendant cette sélection, la population d’aptamères liés à la cible est soumise à une élution d’affinité avec des structures analogues à celle de la cible, et les séquences éluées sont rejetées.

La stratégie « counter-SELEX » peut être un outil valable dans l’identification d’aptamères qui se fixent à une seule et unique cible dans un mélange complexe, même sans connaître la cible, par exemple, dans la recherche d’aptamères qui se fixent sur un épitope présent à la surface de cellules cancéreuses mais pas sur les cellules saines, ou encore pour trouver des aptamères qui interagissent avec les molécules présentent dans le sérum de patient infectés par une pathologie, mais non présent dans le sérum d’individus sains.

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Les aptamères

DDIIFFFFEERREENNTTEESS AAPPPPLLIICCAATTIIOONNSS PPOOSSSSIIBBLLEESS

1. Applications thérapeutiques

1.1. Description Pour que les aptamères soient des agents thérapeutiques efficaces, ils doivent se lier

fortement aux protéines et inhiber une fonction spécifique de cette protéine. En effet, on cherche le plus souvent à obtenir un effet antagoniste de celui de la protéine. De plus, il ne faut pas que l’aptamère présente d’effet secondaire dangereux.

Les mêmes critères s‘appliqueront donc pour des anticorps thérapeutiques et pour des aptamères thérapeutiques.

On cherchera à garantir une grande spécificité de l’aptamère car on veut que celui-ci

puisse faire la distinction entre la cible visée et une protéine connue de conformation proche. Lors de la sélection de l’aptamère par la méthode SELEX, on réalise alternativement une sélection positive à la cible (on ne garde que les molécules qui s’y lient) et une sélection négative à la protéine proche (on ne garde que les molécules qui ne se sont pas liées à la protéine). Par exemple, en utilisant cette méthode, on arrive à obtenir un aptamère qui se lie 10 000 fois mieux à la théophylline qu’à la caféine alors que la seule différence entre ces deux molécules est un groupe méthyle.

La spécificité n’est pas le seul critère à prendre en compte pour utiliser les aptamères à des

fins thérapeutiques : il faut aussi prendre en compte leur stabilité. En effet, l’ARN non modifié ne peut être utilisé comme agent thérapeutique puisque le sang est riche en ribonucléases. Toutefois, une modification appropriée d’un ARN ou ADN simple brin peut produire des molécules stables dans le sang.

Les ARN-ases les plus actives dans le sang ont les mêmes spécificités que les ARN-ases pancréatiques qui coupent spécifiquement après les ribonucléotides pyrimidine. Ainsi, le changement du groupe 2’OH du ribose de la pyrimidine en 2’NH2 ou 2’F, suffit à donner une résistance à l’altération dans le sérum jusqu’à deux jours. Tous les aptamères à but thérapeutique ont donc soit un groupement 2’NH2 ou 2’F dans chaque pyrimidine. D’autres modifications sont utilisées pour les aptamères thérapeutiques. Une fois qu’une séquence « gagnante » est sélectionnée, elle est synthétisée chimiquement à l’aide du phosphoramidite approprié. En général, cette synthèse est amorcée avec un dT 3’-3’ dT cap qui rend les oligonucléotides résistants aux exonucléases 3’ et 5’ présentes dans le sang et les autres tissus. Bien que les modifications des sucres assurent une stabilité, ils ne garantissent pas une pharmacocinétique adéquate pour que les aptamères soient thérapeutiquement actifs. Les aptamères sont de poids moléculaire compris entre 8 000 et 12 000 Da, ils sont éliminés du plasma en quelques minutes, par excrétion rénale. Pour conserver les aptamères dans le sang de plusieurs heures à plusieurs jours après leur injection, il faut donc les conjuguer à de plus grandes macromolécules qui seront éliminées moins rapidement.

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1.2. Exemples d’applications

Les aptamères thérapeutiques sont utilisés dans le traitement contre le SIDA en bloquant la transcriptase reverse du HIV.

Il a été prouvé que les aptamères anti-thrombine bloquent la coagulation du sang. On

peut donc s’en servir en tant qu’anticoagulant. On a également montré que les aptamères sélectionnés pour se lier au virus du

sarcome de la poule, peuvent inhiber l’infection après avoir été pré-incubé avec le virus. Nous verrons par la suite plus en détails, l’utilisation d’aptamère pour le traitement du

virus influenza (virus de la grippe).

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2. Applications diagnostiques

2.1. Description

Les aptamères peuvent être utilisés tant en outils de diagnostic in vivo que in vitro. Leur potentiel en tant que nouvel outil diagnostique, rivalisant et complétant celui apporté par les anticorps, est en constante évolution.

Tout comme les anticorps, les aptamères ont de grandes affinités et spécificités pour des cibles. Les aptamères sont plus petits et moins complexes que les anticorps, et de ce fait, ils devraient être plus faciles à fabriquer et à modifier.

Etant donné que les aptamères sont semblables aux anticorps, il paraît évident que l’on puisse les utiliser comme outil d’évaluation diagnostique des protéines. En effet, la présence ou non de certaines protéines permet d’établir le diagnostic de certaines maladies.

La méthode « sandwich » est une des méthodes les plus utilisées à but diagnostic. Elle

consiste à prendre en sandwich l’analyte entre deux ligands : l’un est utilisé pour capturer la cible, et l’autre pour détecter le complexe aptamère-cible formé. Le détecteur est fluorescent, ou radio marqué par exemple. Dans le cas d’un diagnostic in vivo, il est préférable d’éviter les marqueurs radioactifs. On remplace alors l’aptamère « détecteur » par une enzyme dont l’activité est facilement détectable.

Figure 4 méthode sandwich

Une autre méthode, qui ne requiert pas d’immobilisation, est la détection des aptamères par cytométrie de flux. Cette technique consiste à analyser et trier des cellules ou particules biologiques en suspension dans un liquide. Ainsi, on peut séparer les aptamères liés à la cible.

Certaines applications ont besoin d’une détection rapide de l’analyte, surtout en cas

d’urgence médicale. Pour cela, des capteurs basés sur une détection moléculaire couplée à un transducteur ont étés développés. Idéalement, trois critères de base doivent être remplis : traduire l’événement de liaison sans addition d’un agent réactif supplémentaire, détecter et quantifier la cible dans un intervalle de concentration désiré avec un temps donné, et enfin, pouvoir réaliser plusieurs mesures avec le même transducteur.

La capacité des aptamères à différencier des cellules cancéreuses de cellules saines

d’un même tissu, en font des agents d’imagerie appropriés pour des procédures de diagnostic non invasives.

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2.2 Exemples Il a été prouvé que les aptamères sont des outils de diagnostique très utiles pour la

reconnaissance de cible complexes telles que les globules rouges fantômes humain, ainsi que pour distinguer des cellules différenciées de cellules mères dans le diagnostique des cellules carcinomes, ou encore pour le diagnostique du virus du SIDA.

Par ailleurs, les aptamères sont aussi utilisés pour la détection de la maladie

d’Alzheimer, ceci grâce aux aptamères amyloïdes qui sont capables de se fixer à des fibrilles amyloïdes.

Les aptamères ont également été utilisés afin de déchiffrer les sites d’interactions d’un

auto anticorps avec sa cible ADN naturelle dans les lupus érythémateux chronique (maladie de Cazenave). Cela pourrait servir à une plate-forme de biocapteurs pour le diagnostique de maladies auto-immunes.

En tant qu’agent d’imagerie, les aptamères vont permettre de diagnostiquer le cancer

de la prostate. Ces aptamères pourront ensuite être modifiés, pour en faire des aptamères thérapeutiques.

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Les aptamères

TTRRAAIITTEEMMEENNTT DDEE LLAA GGRRIIPPPPEE 1. Les virus de la grippe

La grippe est une maladie due aux virus de la famille des Orthomyxoviridae qui ont pour nom scientifique Myoxivirus influenzae. Il en existe de trois types : A, B et C.

Ce sont des virus sphériques de 80 à 120 nm de diamètre. Sur un plan clinique, on ne peut distinguer les virus de type A et B. Le virus C quant à

lui provoque des symptômes proche de ceux d’un simple rhume et se limitent à une expression sporadique.

Le type A mute avec une grande facilité et on distingue trois sous-types : H1N1, H2N2, H3N2 ainsi que des variants tels que le H3N2.

1.1 Description des virus Les virus de la grippe sont des rétrovirus, à ARN de polarité négative. Ceux de type A et

B possèdent 8 segments d’ARN tandis que ceux de type C n’en possèdent que 7. Ces segments se trouvent dans une nucléocapside de forme hélicoïdale, composée de nucléoprotéines, et présente au centre du virus.

La surface des virus est hérissée de spicules. Les virus A et B en comportent deux types : l’hémagglutinine et la neuraminidase. Ce sont en fait des antigènes de surface qui empêchent le virus d’être infecté par une même source virale. Le virus de type C n’a qu’une sorte de spicule qui regroupe les fonctions assurées par les hémagglutinines et la neuraminidase.

Figure 5 - Virus de la grippe [12] a.

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Les aptamères

1.2 Le cycle de réplication virale : Il comporte six phases (voir schéma ci-dessous) :

∗ L’attachement : la particule virale se fixe sur une cellule épithéliale respiratoire grâce à son récepteur, l’hémagglutinine.

∗ L’endocytose : fusion entre la membrane de la cellule hôte et la bicouche lipidique virale puis libération des nucléocapsides dans le cytoplasme cellulaire.

∗ La réplication virale : les ARN de polarité négative sont répliqués de façon à produire d’autres virus. D’autres sont convertis en ARN de polarité positive.

∗ La synthèse protéique : le virus détourne le métabolisme cellulaire pour synthétiser ses propres protéines.

∗ Le bourgeonnement : les virions néoformés se forment par bourgeonnement à la surface de la membrane cellulaire.

∗ Libération des virions néoformés et dissémination dans l’épithélium respiratoire.

Figure 6 - Cycle de réplication de la grippe, selon [12] b.

1.3 Traitements existants Il n’existe actuellement pas de thérapeutique efficace pour traiter les infections dues au

virus de la grippe. Le vaccin reste la meilleure arme pour lutter contre l’infection grippale.

Il existe néanmoins des traitements curatifs qui diminuent les effets de la grippe : ce sont les antiviraux. Ils se fixent sur une partie d’un composant du virus qui échappe à toute modification. Ils agissent en bloquant la neuraminidase, enzyme essentielle à la libération du virus. Celui-ci reste donc prisonnier des cellules hôtes, ce qui limite l’infection. Ils réduisent les symptômes de la maladie ainsi que sa durée de 36 à 60 heures.

On peut également utiliser des antibiotiques pour traiter les complications de la grippe mais ils sont impuissants contre le virus.

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Les aptamères

2. Application des aptamères à la grippe

Nous allons ici décrire l’étude faite par Sung Ho Jeon et ses collaborateurs, publiée en septembre 2004. Cette étude s’avère être l’une des plus récentes à ce sujet.

L’équipe s’est portée sur l’étude des aptamères dans le but de bloquer la liaison virus-cellule hôte.

Comme nous l’avons dit précédemment, l’attachement du virus à la cellule hôte se

fait par l’hémagglutinine. L’approche des scientifiques a été de trouver un aptamère qui se lierait directement à cette hémagglutinine, empêchant ainsi la liaison de ce récepteur avec la cellule hôte.

Lors de précédentes études, ils ont démontré que c’est un peptide, nommé HA91-261,

qui induisait à la fois les réponses immunes humorale et cellulaire. En utilisant la méthode SELEX avec ce peptide HA91-261 comme modèle, ils ont pu

synthétiser une librairie de nucléotides, contenant un segment de trente nucléotides aléatoires entouré de segments primaires communs en 3’ et 5’. Cette librairie a ensuite été hybridée avec le HA91-261, puis il y a eu purification et amplification par la méthode PCR.

Ils ne gardent alors que les deux oligonucléotides qui présentent le plus d’affinité : ils seront appelés A21 et A22. Cependant, bien que les deux présentent une grande affinité pour le HA91-261, le A22 en présente une supérieure pour le virus lui-même.

Il en leur reste plus qu’à analyser les séquences de ces oligonucléotides et de synthétiser les aptamères correspondants.

In vitro, l’aptamère A22 démontre une inhibition de l’hemagglutination (agglutination

des virus sur les cellules hôtes). Ils ont pu démontrer que ceci est bien dû à une liaison de l’A22 sur le virus et non sur les cellules hôtes. De plus, ce peptide peut exercer un effet protecteur jusque 30 minutes après exposition des cellules au virus.

In vivo, l’efficacité de l’A22 a été évaluée sur quatre groupes de souris infectées : un

groupe témoin, infecté mais non traité et trois groupes infectés avec administration de l’aptamère un jour avant l’infection, le jour même et deux jours après (dénotés respectivement –1, 0 et +2).

Du point de vue poids, les souris témoins ont perdu 20% de leur masse corporelle au moment du pic de l’infection tandis que les trois autres groupes n’ont eu que des pertes de poids non significatives.

En menant une expérience parallèle, les animaux sont sacrifiés six jours après le début de l’expérimentation et un titrage du virus dans les poumons est effectué ainsi qu’un examen histologique. L’étude montre que le A22 réduit les zones enflammées d’une façon significative, au plus tôt l’aptamère étant administré, au mieux sont les résultats.

Les résultats obtenus sont donc encourageants pour la suite surtout qu’en cas de

mutations du virus de la grippe, celles-ci ne concernent pas ou peu l’hémagglutinine.

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Les aptamères

CCOONNCCLLUUSSIIOONN

La principale barrière à l’utilisation d’aptamères à des fins thérapeutiques était leur instabilité dans l’organisme. Des solutions ont été apportées, ce qui leur a donné un avenir prometteur.

Depuis les trois dernières décennies, les anticorps ont étés des agents de choix pour le

développement de méthodes diagnostiques. De ce fait, les plates-formes diagnostiques qui sont utilisées aujourd’hui ont évolué pour mieux s’adapter aux anticorps. La découverte des aptamères dont l’affinité et la spécificité sont équivalentes aux anticorps, a permis une évolution des méthodes de diagnostiques.

Cependant, les aptamères n’offrent pas de solutions à tous les besoins de

reconnaissance moléculaire. Dans la plupart des cas, le recourt aux aptamères a lieu lorsque les anticorps n’offrent pas de résultats satisfaisants. Ce qui signifie que les anticorps sont, et resteront, utilisés.

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Les aptamères

BBIIBBLLIIOOGGRRAAPPHHIIEE

• Réaction en Chaîne par Polymérase http://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A9action_en_cha%C3%AEne_par_polym%C3%A9rase http://biophysiquembpepcr.site.voila.fr/

• « Aptamers as analytical reagents » Stacey L. Clark, Vincent T. Remcho - Electrophoresis 2002, 23, 1335-1340 • « Aptamers : An emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics » Sumedha D. Jayasena - Clinical Chemistry 1999, 45:9, 1628-1650 • « Escort aptamers : a delivery service for diagnosis and therapy » Brian J. Hicke, Andrew W. Stephens - The journal of clinical investigations 2000, 923-928 • « Aptamers : novel tools for specific interventions studies »

Jürgen Floege, Tammo Ostendorf, Nebojsa Janjié - Nephrol Dial Transplant 1999, 1354-1357

• « Les aptamères : des ligands et des catalyseurs oligonucléotidiques obtenus par sélection in vitro » JJ. Toulmé, R. Giegé - médecine/sciences 1998 ; 14 : 155-66

• « Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment : RNA Ligands to Bacteriophage T4 DNA Polymerase » Craik Tuerk, Larry Gold - Science 1990 ; 249 : 505-510

• « Traitement statistique des résultats de SELEX » D. Eveillard, Y. Guermeur - JOBIM 2002, 277-283

• « Oligonucleotide Aptamers for in vitro diagnostics » Sumedha D. Jayasena - Clinical chemistry, 45 No. 9 1999 1628-1650

• « Aptamers as therapeutic and diagnostic reagents : problems and prospects » Scott E.Osborne and Al. - Current opinion in chemical biology 1997, 1 : 5-9

• « A DNA aptamer prevents influenza infection by blocking the receptor binding region of the viral haemagglutinin » Sung Ho Jeon and Al. - JBC papers, Sept 2004

• Virus de la grippe a.http://lyc-monet.scola.ac-paris.fr/lycdiscip/svt/microorganismes/fr/virusgrippe.htm b.http://edumed.unige.ch/apprentissage/module1/introduction/apprentissage/virologyBasic/multipli.html

• « Nucleic acid aptamers as tools and drugs : recent developments » Martina Rimmele - ChemBioChem 2003, 4, 963-971

• « Nucleic acid aptamers in cancer medicine » Laura Cerchia and Al. - FEBS Letters 528 2002, 12-16

• Thèse : « La protéine MC1 d’archaeabactérie : reconnaissance de séquences particulières. »

Guillaume DE VUYST – Avril 2004

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AANNNNEEXXEESS 1. Réaction en chaîne par polymérase

La Réaction en Chaîne par Polymérase (ou en anglais, la Polymerase Chain Reaction, PCR), est une méthode de biologie moléculaire mise au point en 1985 par Karry Mullis, qui obtenu le prix Nobel en 1993. Cette méthode permet de dupliquer un fragment d'ADN, et par répétition du processus, d'atteindre des milliards de copies : 2 N au bout de N cycles. C'est une technique d'étude de la génétique.

Résumé

La technique de la PCR ( Polymerase Chain Réaction) est un procédé d’amplification exponentielle in vitro d’une séquence définie d’acide désoxyribonucléique (ADN) à partir d’une quantité minime de matériel génétique grâce à la Taq-polymérase. Cette méthode permet de multiplier en peu de temps la séquence désirée (près d’un million de copies en quelques heures).

La PCR est considérée comme une révolution majeure en biologie moléculaire, notamment depuis que l’on a pu isoler la Taq-polymérase, résistante à des températures très élevées. Cette méthode peut être qualitative ou quantitative, donc plus précise. Dans ce dernier cas, toutes les étapes, analysées en temps réel par ordinateur, sont réalisées dans une plaque multi-puits ou dans un capillaire, placé dans un thermocycleur dont la température varie. Cet appareil permet une automatisation de la technique.

Chaque cycle est constitué de 3 étapes s’effectuant à des températures différentes :

• Dénaturation : tous les brins sont dissociés par la chaleur (environ 95 ° C) • Hybridation des amorces sur un fragment d’ADN (entre 50 et 60°C) • Extension : synthèse des brins à partir des amorces d’hybridation (environ 72°C)

La séquence cible est doublée à chaque cycle, d’après un taux d’amplification théorique de 2n.

Pour quantifier la réaction de PCR, il existe deux méthodes, basée sur la fluorescence :

• SYBR Green I, une molécule qui émet de la fluorescence en s’intercalant entre les bases durant la phase d’extension. • Les sondes d’hybridation oligonucléotidiques fluorescentes de type « Quenching », avec le FRET (transfert de fluorescence) et la méthode TaqMan.

Les applications de la PCR sont nombreuses, aussi bien dans la recherche fondamentale qu’en médecine, en routine, ou dans d’autres domaines comme la criminologie et l’industrie agro-alimentaire à propos des OGM.

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Les aptamères

1.1 PCR Qualitative

1.1.1 Méthode

Dans le cas de la PCR qualitative (dite classique), le matériel génétique extrait est contenu dans un petit tube placé dans un thermocycleur programmable. Cet appareil effectue des cycles de températures, c'est-à-dire un passage à des températures différentes pendant des temps définis (un cycle dure quelques minutes).

Pour la PCR qualitative le milieu réactionnel doit contenir : • Le matériel génétique contenant la séquence à amplifier (il peut s’agir de l’ADN

génomique d’un patient pour lequel on cherche à réaliser le diagnostic moléculaire d’une maladie génétique, d’ADN plasmidique contenant une séquence d’intérêt ...).

• les deux amorces olignonucléotidiques monobrins, chacune complémentaire d’une des extrémités du fragment à amplifier.

• des désoxynucléotides libres (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) qui sont incorporables pour former le brin d’ADN néosynthétisé.

• l’enzyme permettant la synthèse d’un néobrin à partir des amorces ; il s’agit d’une ADN polymérase thermostable (par exemple la Taq DNA polymérase).

• du MgCl2 et une solution donnant au milieu réactionnel un PH et une concentration saline optimale pour le fonctionnement de l’enzyme.

Le tube contenant le milieu réactionnel est placé dans le thermocycleur. Il fonctionne sur le principe d’une plaque chauffante programmable (en temps et en température) qui permet des montées et descentes en température extrêmement rapides. Il délivre à chaque instant au milieu réactionnel une température donnée permettant la réalisation de l’une des trois étapes du cycle de PCR : dénaturation, hybridation ou extension. Ensuite, la révélation se fait par électrophorèse sur gel, avec l’utilisation de bromure d'éthydium (BET).

1.1.2 Inconvénients

La PCR qualitative ne permet pas de quantifier le taux de matériel génétique néoformé. De plus, elle ne se réalise qu’une fois la synthèse terminée, et peut être très limitée, par exemple dans le cas des délétions hétérozygotes de tailles importantes. Nous y reviendrons.

1.2. PCR Quantitative Malgré l’existence théorique d’une relation quantitative entre le nombre de molécules

cibles utilisées au départ et la quantité de matériel obtenu après un nombre de cycle d’amplification donné, il a été fort longtemps difficile de réaliser de véritables PCR quantitatives. En effet, une très grande variabilité des résultats rendait difficile la détermination de la quantité de matériel initial connaissant celle obtenue après amplification.

C’est le développement des techniques de détection en temps réel, c’est à dire la possibilité de suivre directement la quantité d’amplicons présents dans le milieu réactionnel, qui a permis de résoudre toutes les difficultés rencontrées auparavant.

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Les aptamères

1.2.1 Généralités Aussi appelée PCR en temps réel, la PCR quantitative est une technique de réplication

ciblée in vitro. Il s'agit de la première méthode de quantification précise, reproductible et standardisable. Les automates commercialisés réalisent l'amplification exponentielle, la détection de la fluorescence et l'analyse des résultats dans un laps de temps extrêmement court. Il n'y a plus de test des produits de PCR sur gel. Seule la préparation des échantillons incombe à l'utilisateur, ce qui a considérablement augmenté la productivité.

Toute la réaction se réalise dans un tube (ou dans un capillaire) qui n'est jamais ouvert, éliminant ainsi tout risque de contamination post-PCR. Ceci explique que les applications de la PCR en temps réel soient extrêmement nombreuses.

Tous les appareils développés pour assurer la PCR quantitative en temps réel utilisent une détection par fluorescence du produit d’amplification. Deux types de produits sont classiquement utilisés :

• le SYBR Green I, non spécifique, • les sondes fluorescentes spécifiques du fragment étudié.

1.2.2 Les sondes nucléotiques

a. SYBR Green I

La SYBR Green est une molécule chimique qui émet une fluorescence quand elle s’intercale entre les bases de l'ADN double brin. Elle permet ainsi de mesurer la quantité de matériel amplifié. La fluorescence augmente quand le SYBR Green I se fixe à l’ADN double brin.

En solution, le SYBR Green I n'est pas fluorescent lorsqu'il est sous sa forme libre, alors qu'il est très fluorescent lorsqu'il est lié à l'ADN. Il est très stable : au bout de 30 cycles d'amplification, seulement 6% de son activité est perdue. Le microspectrofluorimètre couplé à l'appareil permet de lire cette fluorescence.

Au début de l'amplification, le mélange réactionnel contient de l'ADN dénaturé, les amorces et le fluorophore non lié.

Figure 7 - Mélange réactionnel en présence de SYBR Green

Après le couplage des amorces, le fluorochrome se lie au double brin. La liaison à l'ADN se traduit par une augmentation de la fluorescence.

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Les aptamères

Figure 8 - Début de l’amplification avec couplage de l’amorce

Pendant l'étape d'élongation, le nombre de molécules de fluorophore lié à l'ADN synthétisé augmente, ce qui se traduit par une augmentation de la fluorescence. La fluorescence est mesurée à la fin de l'étape d'élongation de chaque cycle.

Figure 9 - Phase d’élongation et augmentation de la fluorescence

Ce type de détection est très versatile puisque le même produit peut être utilisé pour détecter un produit d’amplification quel qu’il soit mais présente l’inconvénient de détecter toute forme d’ADN double brin. Ce phénomène implique des contraintes élevées dans le choix des amorces d’amplification : elles doivent être spécifiques, afin d’éviter l’obtention de produits d’amplification parasites. Mais il faut qu’elles soient incapables d’interagir pour former des structures en épingle à cheveux ou des dimères.

b. Les sondes d’hybridation oligonucléotidiques fluorescentes : le FRET (transfert de fluorescence) et le TaqMan

Ces sondes sont spécifiques du fragment d'ADN étudié. La fluorescence est dégagée à chaque cycle de PCR. Cette émission de lumière se produit lors de la polymérisation ou au moment de l'hybridation.

Cette méthode utilise une fluorescente correspondant à un oligonucléotide portant un fluorochrome rapporteur en 5’ et un « quencheur » de fluorescence en 3’. Quand la sonde est intacte, la proximité entre les deux colorants permet d’éteindre quasiment la fluorescence émise par le fluorochrome du fait d’un transfert énergétique (FRET) vers le quencheur. La sonde est choisie de façon à s’hybrider sur un des brins d’ADN en aval du site d’attachement de l’une des amorces. Durant l’élongation du brin d’ADN à partir de cette amorce, l’activité 5’ nucléase de la Taq-polymérase permet la dégradation de la sonde ce qui assure la poursuite de la réaction de polymérisation empêchant ainsi d’autres molécules de la sonde de s’hybrider. La dégradation de la sonde libère le rapporteur dont la fluorescence n’est alors plus inhibée par le quencheur. Durant les cycles de PCR d’autres molécules de sonde sont clivées libérant le rapporteur et augmentant ainsi le signal de fluorescence dont l’intensité est proportionnelle à la quantité de matériel amplifié.

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La sonde d'ancrage est marquée en 3' avec de la fluorescéine (concentration 0,2 µM). La sonde d'hybridation en 5' avec du LC Red 640 (ou du LC Red 705). Il est nécessaire de la phosphoryler en 3' pour bloquer l'extension (concentration 0,4 µM).

Les sondes doivent avoir 25 à 30 nucléotides et leurs températures de fusion Tm doivent être proches.

Figure 10 - Mélange réactionnel de type « quenching »

La fluorescéine est excitée et émet une lumière verte à 530 nm.

Figure 11 - Excitation de la fluorescéine

Lorsque les 2 oligonucléotides s'hybrident sur l'ADN, les 2 marqueurs fluorescents se trouvent très proches l'un de l'autre : la fluorescence émise par la fluoréscéine va exciter le 2e marqueur qui va alors émettre une fluorescence rouge à 640 nm, Ce transfert d'énergie est directement relié à la distance séparant les 2 marqueurs. Cette fluorescence rouge qui sera mesurée à la fin de l'étape d'élongation de chaque cycle.

Figure 12 - Excitation du deuxième fluorochrome par la fluoréscéine

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Les aptamères

Figure 13 - Déplacement par la polymérase lors de l’élongation (activité exonucléase 5’) lors d’un «

Quenching » de fluorescence avec une sonde TaqMan

L’avantage de cette technique est sa spécificité, seule une hybridation spécifique entre sonde et cible peut générer un signal de fluorescence.

1.2.3 Méthode

Pour réaliser une RT-PCR (time PCR) en tube (par opposition à la RT-PCR in situ), il faut commencer par extraire les ARN et les recopier in vitro en ADNc simple brin. La synthèse du second brin d'ADNc ainsi que la PCR sont effectués dans un deuxième temps par la Taq-polymérase (ou par une autre ADN polymérase thermorésistante). Avant la réaction, tous les composants de la PCR sont introduits dans le même tube :

• Le matériel génétique à amplifier, qui est la séquence cible, • les oligonucléotides (ou amorces), spécifiques du segment d'ADN voulu, • l'ADN polymérase (ici la Taq-polymérase), • le mélange des quatre désoxyribonucléotides constitutifs de l'ADN, • le fluorochrome (SYBR Green I ou une sondes oligonucléotidiques fluorescentes).

Tous sont ajoutés en large excès par rapport à l'ADN. Le choix des amorces d’environ 20 bases, spécifiques de l ADN cible, doit tenir compte de plusieurs paramètres en même

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Les aptamères

temps. Des règles basées sur ces paramètres permettent de définir le couple d'amorces le mieux adapté, mais ce n'est pas toujours simple

Les ADN polymérases sont des enzymes qui synthétisent l'ADN de l'extrémité 5-prime vers l'extrémité 3-prime. Celles utilisées en PCR sont extraites de bactéries vivant naturellement à des températures élevées comme les sources hydrothermales du fond des océans. Ces polymérases ne sont pas dénaturées par la chaleur. La plus utilisée est la Taq-polymérase.

Chaque cycle de PCR est constitué de trois phases à trois températures différentes : la dénaturation, l'hybridation (ou annelage) et l'élongation (ou extension des amorces).

Figure 14 - Les différentes phases de la PCR

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Les aptamères

Premier cycle :

Lors de la dénaturation, le tube est à 95°C, température régnant dans le thermocycleur. A cette température, les liaisons faibles qui assuraient la cohésion de la double hélice d'ARN sont rompues pour donner deux simples brins d’ARN.

L'hybridation des amorces sur l'ADN simple brin repose sur le principe de l'appariement des bases complémentaires. Le choix de la température d'hybridation résulte d'un compromis entre plusieurs paramètres. Elle est calculée en fonction de la longueur et de la séquence des amorces. Elle est inférieure à la température de dénaturation. Si l'on chauffe à nouveau, les hybrides ADN-amorces qui viennent de se former sont dénaturés.

Pour passer à l'étape d'élongation (ou extension des amorces), il faut chauffer jusqu'à 72°C. Comme leur nom l'indique, les amorces hybridées à l'ADN servent de point de départ à la polymérisation du brin d'ADN complémentaire de l'ADN matrice. La polymérisation se fait par ajout successif des désoxyribonucléotides (présents dans le mélange en large excès) sous l'influence de l'ADN polymérase. Chaque base ajoutée est complémentaire de la base correspondante du brin matrice. Mais la polymérisation ne s'arrête pas lorsque la copie est de la longueur souhaitée. La copie de l'ADN initial génère donc des copies plus longues que voulues.

Au cours du premier cycle, les brins initiaux sont donc recopiés, chacun servant de matrice pour l'autre. Le nombre de brins obtenus à la fin du premier cycle est le double du nombre de brins initialement présents. Chaque brin servira à son tour de matrice pendant le second cycle.

Deuxième cycle :

Les étapes s'effectuent de la même manière que précédemment. Toutefois, les brins nouvellement synthétisés sont limités à leur extrémité 5-prime par l'amorce. Au contraire leur extrémité 3-prime est éventuellement plus longue puisque la Taq-polymérase poursuit généralement au delà de la longueur souhaitée. L'extension des amorces à partir de l'ADN initialement présent dans le tube produit donc des brins d'ADN d'une longueur indéterminée, souvent appelés « brins longs ». Comme l'accumulation des brins dans le tube se fait de façon linéaire, leur quantité finale est directement proportionnelle au nombre de cycles réalisés.

On note aussi l'apparition des brins de longueur souhaitée (ADN court). Les brins polymérisés sur le modèle des brins synthétisés au cycle précédent sont bornés à leurs deux extrémités et leur longueur est égale à la distance entre les amorces sur le brin d'ADN réalisé.

A partir du second cycle, et dans les cycles suivants, l'ADN nouvellement synthétisé sert lui aussi de matrice.

La quantité d'ADN à la fin du second cycle est multipliée par quatre. L'ADN initial est toujours présent mais il est devenu minoritaire par rapport à l'ADN synthétisé.

Troisième cycle :

A la fin du troisième cycle la quantité d'ADN a encore doublé. Elle est huit fois supérieure à la quantité d'ADN initiale et majoritairement de taille définie.

Quatrième cycle :

Les brins longs continuent leur accumulation de façon linéaire car ils ne sont générés qu'à partir de l'extension des amorces sur l'ADN initial. Or la quantité d'ADN initial est fixée au départ et n'évolue pas. Par contre, les brins courts apparus à la fin du troisième cycle

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Les aptamères

s'accumulent de façon exponentielle car chaque brin nouvellement formé sert de matrice lors du cycle suivant. L'ADN court sera très largement majoritaire à la fin de la PCR.

Cinquième cycle et cycles suivants :

A chaque fois, la quantité d'ADN double dans le tube. Donc de façon théorique, en partant de deux brins d'ADN initiaux on obtient 4 segments d'ADN à la fin du premier cycle, 8 à la fin du second, 16 à la fin du troisième et jusqu'à 2 à la puissance n après n cycles ... soit plus d'un million de copies en une vingtaine de cycles !

Très rapidement, le pourcentage d'ADN court, qui suit une progression exponentielle, tend vers 99,99 %. L'ADN long, qui n'augmente que de façon linéaire, devient très rapidement négligeable.

1.2.4. Exploitation des résultats

Comme nous l’avons vu précédemment, il existe des risques d’interférences avec le SYBR Green I :

Figure 15 - Illustration d’une interférence d’amplification avec le SYBR Green

Pour visualiser une éventuelle interférence, après le dernier cycle de PCR, la température est rapidement élevée à 95°C pour dénaturer l'ADN double brin, puis elle est abaissée la température de couplage ce qui provoque la reformation d'ADN double brin. La température est ensuite élevée lentement à 95°C. La fluorescence est lue en continu pendant cette remontée :

• le SYBR Green I est fluorescent tant qu'il est lié à l'ADN double brin, • quand la température augmente, l'ADN double brin se dissocie, ce qui entraîne la libération du SYBR Green dans le milieu et une diminution progressive de la fluorescence, • lorsque 50 % de l'ADN double brin sont dissociés, la fluorescence chute brutalement : c’est la température que correspond la température de fusion du produit synthétisé :

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La température de fusion est obtenue en traçant la dérivée première négative de la fluorescence en fonction de la température : elle correspond au maximum de la courbe.

Si on obtient plusieurs pics pour un même cycle, on peut affirmer qu’il s’est produit une réaction parasite.

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