Les échantillons… Cellules témoin Cellules avec drogue Extraction dARN ARN ADNc ~Cy3 Reverse...
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Transcript of Les échantillons… Cellules témoin Cellules avec drogue Extraction dARN ARN ADNc ~Cy3 Reverse...
Les échantillons…Cellules témoin
Cellulesavec drogue
Extraction d’ARN
ARN
ADNc ~Cy3
Reverse Transcription
(10µg ARN total)en présence de
fluorophores
HybridationOvernight
Cy3 Cy5
ARN
ADNc ~Cy5
Revêtement de la lame
Dépôt ADNs
amplifiés par PCR
La lame…
Principe des puces à ADN
Lecture de la lame
(Packard ScanArray Express)
• Quantification des données : QuantArray
• Uniformisation des données : script Perl
• Validation des données : macro Excel
• Travail sur les données : programmes SAM et XL STAT
Introduction
1 Quantification des puces (QuantArray)
Pour ouvrir les images, sélectionner le Cy3 puis le Cy5 DANS CET ORDRE
2 Quantification des puces (QuantArray)
Ch 1 = Cy5Ch 2 = Cy3
Number Array Row Array ColumnRow Column X Location Y Location ch1 Intensity ch1 Background1 1 1 1 1 1670.00 4430.00 707.853638 39.7894742 1 1 1 2 1840.00 4440.00 927.975586 56.5438613 1 1 1 3 2040.00 4440.00 323.170746 46.5614054 1 1 1 4 2240.00 4430.00 1729.634155 244.2807015 1 1 1 5 2380.00 4410.00 723.609741 138.3859716 1 1 1 6 2570.00 4420.00 410.439026 68.6491247 1 1 1 7 2790.00 4440.00 704.097534 88.5789498 1 1 1 8 2950.00 4420.00 1005.268311 100.543861
…
- intensités Ch 1 et 2 (Cy5 et Cy3)
- bruit de fond Ch 1 et 2 (Cy5 et Cy3)
fichier texte (séparateur tabulation)
3 Quantification des puces (QuantArray)
Caractéristiques: •dépôts en quadruplet
•contrôles déposés
Biopuce actuelle
Rapports des contrôles (Cy3 : Cy5 de la lame non swapée)
-FaNaC (1:1)-DmDNaC (1:5)-DgNaC (5:1)-Gamma tub (1:2)-RNase NE (2:1)-MDH (0:0)
Contrôles exogènes
1 Uniformisation des données (Perl)
Intensité « normalisée » de chaque spot :
In= intensité «spé» du spot – médiane MDH
Condition témoin = Cy3n lame 1 * Cy5n lame 2 Condition exp. = Cy5n lame 1 * Cy3n lame 2
2 Uniformisation des données (Perl)
Lame 1
Cellules témoin
Cellulesavec drogue
Cy3 Cy5
Lame 2 (swap) Cy5 Cy3
3 Uniformisation des données (Perl)
Pour le Script Perl :
- quantifs de QuantArray sous forme texte séparateur tabulation (lame2134.txt)
- liste des lames sous forme texte séparateur tabulation (liste2134.txt)
4 Uniformisation des données (Perl)Exécuter cmd
Copier les données dans la base(quantifs QuantArray et listes)
5 Uniformisation des données (Perl)
Exécuter telnet 195.220.189.168
Lancer le script Perl pour normaliser nos données
6 Uniformisation des données (Perl)
Exécuter cmd
Copier les données normalisées dans l’ordinateur
7 Uniformisation des données (Perl)
Position spot
Sortie d’un fichier à ouvrir sous Excel (lame2134_lame2135)
Cy51 Cy3s
Cy51n * Cy3sn
Cy31 Cy5s
Cy31n * Cy5snMédiane MDH
Condition 2Condition 1
1 Validation des données (Macro1)
Superposition des fréquences des conditions témoin (1) et expérimentale (2).
0
50
100
150
200
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Intensité
Nombre de spots
2 Validation des données (Macro1)
Répartition des rapports (Cond1/Cond2) centrée sur 1
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Log2 (Cond1/Cond2)
Intensité ( Cond12+Cond22)
3 Validation des données (Macro2)
Comparaison des intensités des contrôles (rapports définis)
0
2000
4000
6000
8000
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
DmDNaC 5/1Gamma tub 2/1FaNaC 1/1RNase 1/2DgNaC 1/5MDH 0/0
Intensité condition 1
Intensité condition 2
4 Validation des données (Macro2)
Correspondance des rapports théoriques / expérimentaux des contrôles
0,1
1
10
0,1 1 10
Y= 0.98 x + 0.1
Rapport expérimental
Rapport théorique
5 Validation des données (Macro)
1 Cliquer sur le 1er validation des données (macro1)
2 Copier la liste des gènes (liste genes pour macro.xls)de la colonne AT à BA
3 Cliquer sur le 2ème validation des contrôles (macro2)
Attention aux points et aux virgules !
exemple
Résultats
• Détermination des gènes dont la transcription est significativement modulée (programme SAM).http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/
• Classer les gènes et les expériences (programme XL STAT)http://www.xlstat.com/xlstatf52.exe
SAM
• One Class : trouver les gènes significatifs
• Two Class : 2 jeux de données (groupe ctrl et groupe traité, avec échantillons de différents patients dans chaque groupe).
SYMBOL SYMBOL 1 1 12.19 2.19 0.2383622628058430.206372606382267-0.186959936186481A A -0.4376829963381440.234441207625339-0.522896296579974ABCA4 ABCA4 -0.180560442204223-0.115723278611996-0.729645676063225ACADS ACADS 0.274364783040370.5252628392649770.206609211639057ACADVL ACADVL -0.1425094975487810.460205683057023-0.603599545529632ACAT2 ACAT2 0.09531331653979220.417243762599122-1.14239139870343ACPP ACPP -0.92433121666211-0.414994631261118-0.455141989344998AD24 AD24 -0.7788557895285330.7203246681532150.113603931179709ADAM19 ADAM19 0.3730013285358150.2499880006417010.791362857735738ADE2H1 ADE2H1 -0.1085516544960540.597869080012129-1.16885791103057ADPRH ADPRH 0.3831264536630780.5326412502634090.149448820064857ADPRT ADPRT 0.2258491765524020.504300993540526-0.79577055410116ADPRTL2 ADPRTL2 -0.2277186539047270.186853127848335-0.44492797108076AES AES 0.1529879743975670.329108434075169-0.145008853258335ALCAM ALCAM -0.4995838825090110.465124065938321-0.337408948047844ALDH3A2 ALDH3A2 -1.21644350125535-0.116076655255816-0.888038721621243
-Pas de blancs (NA)
-Rapports (cond 1/cond 2) en log 2
-Sans virgule
exemple
XL STAT
• Projection des données dans un sous espace de dimension réduite (Analyse en composante principale ou ACP).
• Organisation des données (classification ascendante hiérarchique ou CAH).
• Classification des données (K means).
-Pas de blancs (remplacés par la moyenne de toutes les expériences)-Données en log 2
exemple
XL STAT
classification ascendante hiérarchique ou CAH
XL STAT
classification ascendante hiérarchique ou CAH
XL STAT
K means (nuées dynamiques)
Permet de classer les gènes ou les expériences dans un nombre de classes défini