Les échantillons… Cellules témoin Cellules avec drogue Extraction dARN ARN ADNc ~Cy3 Reverse...

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Les échantillons… Cellules témoin Cellules avec drogue Extraction d’ARN ARN ADNc ~Cy3 Reverse Transcription (10µg ARN total) en présence de fluorophores Hybridation Overnight Cy3 Cy5 ARN ADNc ~Cy5 Revêtement de la lame Dépôt ADNs amplifiés par PCR La lame… Principe des puces à ADN Lecture de la lame (Packard ScanArray Express)

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Les échantillons…Cellules témoin

Cellulesavec drogue

Extraction d’ARN

ARN

ADNc ~Cy3

Reverse Transcription

(10µg ARN total)en présence de

fluorophores

HybridationOvernight

Cy3 Cy5

ARN

ADNc ~Cy5

Revêtement de la lame

Dépôt ADNs

amplifiés par PCR

La lame…

Principe des puces à ADN

Lecture de la lame

(Packard ScanArray Express)

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• Quantification des données : QuantArray

• Uniformisation des données : script Perl

• Validation des données : macro Excel

• Travail sur les données : programmes SAM et XL STAT

Introduction

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1 Quantification des puces (QuantArray)

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Pour ouvrir les images, sélectionner le Cy3 puis le Cy5 DANS CET ORDRE

2 Quantification des puces (QuantArray)

Ch 1 = Cy5Ch 2 = Cy3

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Number Array Row Array ColumnRow Column X Location Y Location ch1 Intensity ch1 Background1 1 1 1 1 1670.00 4430.00 707.853638 39.7894742 1 1 1 2 1840.00 4440.00 927.975586 56.5438613 1 1 1 3 2040.00 4440.00 323.170746 46.5614054 1 1 1 4 2240.00 4430.00 1729.634155 244.2807015 1 1 1 5 2380.00 4410.00 723.609741 138.3859716 1 1 1 6 2570.00 4420.00 410.439026 68.6491247 1 1 1 7 2790.00 4440.00 704.097534 88.5789498 1 1 1 8 2950.00 4420.00 1005.268311 100.543861

- intensités Ch 1 et 2 (Cy5 et Cy3)

- bruit de fond Ch 1 et 2 (Cy5 et Cy3)

fichier texte (séparateur tabulation)

3 Quantification des puces (QuantArray)

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Caractéristiques: •dépôts en quadruplet

•contrôles déposés

Biopuce actuelle

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Rapports des contrôles (Cy3 : Cy5 de la lame non swapée)

-FaNaC (1:1)-DmDNaC (1:5)-DgNaC (5:1)-Gamma tub (1:2)-RNase NE (2:1)-MDH (0:0)

Contrôles exogènes

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1 Uniformisation des données (Perl)

Intensité « normalisée » de chaque spot :

In= intensité «spé» du spot – médiane MDH

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Condition témoin = Cy3n lame 1 * Cy5n lame 2 Condition exp. = Cy5n lame 1 * Cy3n lame 2

2 Uniformisation des données (Perl)

Lame 1

Cellules témoin

Cellulesavec drogue

Cy3 Cy5

Lame 2 (swap) Cy5 Cy3

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3 Uniformisation des données (Perl)

Pour le Script Perl :

- quantifs de QuantArray sous forme texte séparateur tabulation (lame2134.txt)

- liste des lames sous forme texte séparateur tabulation (liste2134.txt)

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4 Uniformisation des données (Perl)Exécuter cmd

Copier les données dans la base(quantifs QuantArray et listes)

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5 Uniformisation des données (Perl)

Exécuter telnet 195.220.189.168

Lancer le script Perl pour normaliser nos données

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6 Uniformisation des données (Perl)

Exécuter cmd

Copier les données normalisées dans l’ordinateur

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7 Uniformisation des données (Perl)

Position spot

Sortie d’un fichier à ouvrir sous Excel (lame2134_lame2135)

Cy51 Cy3s

Cy51n * Cy3sn

Cy31 Cy5s

Cy31n * Cy5snMédiane MDH

Condition 2Condition 1

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1 Validation des données (Macro1)

Superposition des fréquences des conditions témoin (1) et expérimentale (2).

0

50

100

150

200

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Intensité

Nombre de spots

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2 Validation des données (Macro1)

Répartition des rapports (Cond1/Cond2) centrée sur 1

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Log2 (Cond1/Cond2)

Intensité ( Cond12+Cond22)

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3 Validation des données (Macro2)

Comparaison des intensités des contrôles (rapports définis)

0

2000

4000

6000

8000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

DmDNaC 5/1Gamma tub 2/1FaNaC 1/1RNase 1/2DgNaC 1/5MDH 0/0

Intensité condition 1

Intensité condition 2

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4 Validation des données (Macro2)

Correspondance des rapports théoriques / expérimentaux des contrôles

0,1

1

10

0,1 1 10

Y= 0.98 x + 0.1

Rapport expérimental

Rapport théorique

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5 Validation des données (Macro)

1 Cliquer sur le 1er validation des données (macro1)

2 Copier la liste des gènes (liste genes pour macro.xls)de la colonne AT à BA

3 Cliquer sur le 2ème validation des contrôles (macro2)

Attention aux points et aux virgules !

exemple

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Résultats

• Détermination des gènes dont la transcription est significativement modulée (programme SAM).http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/

• Classer les gènes et les expériences (programme XL STAT)http://www.xlstat.com/xlstatf52.exe

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SAM

• One Class : trouver les gènes significatifs

• Two Class : 2 jeux de données (groupe ctrl et groupe traité, avec échantillons de différents patients dans chaque groupe).

SYMBOL SYMBOL 1 1 12.19 2.19 0.2383622628058430.206372606382267-0.186959936186481A A -0.4376829963381440.234441207625339-0.522896296579974ABCA4 ABCA4 -0.180560442204223-0.115723278611996-0.729645676063225ACADS ACADS 0.274364783040370.5252628392649770.206609211639057ACADVL ACADVL -0.1425094975487810.460205683057023-0.603599545529632ACAT2 ACAT2 0.09531331653979220.417243762599122-1.14239139870343ACPP ACPP -0.92433121666211-0.414994631261118-0.455141989344998AD24 AD24 -0.7788557895285330.7203246681532150.113603931179709ADAM19 ADAM19 0.3730013285358150.2499880006417010.791362857735738ADE2H1 ADE2H1 -0.1085516544960540.597869080012129-1.16885791103057ADPRH ADPRH 0.3831264536630780.5326412502634090.149448820064857ADPRT ADPRT 0.2258491765524020.504300993540526-0.79577055410116ADPRTL2 ADPRTL2 -0.2277186539047270.186853127848335-0.44492797108076AES AES 0.1529879743975670.329108434075169-0.145008853258335ALCAM ALCAM -0.4995838825090110.465124065938321-0.337408948047844ALDH3A2 ALDH3A2 -1.21644350125535-0.116076655255816-0.888038721621243

-Pas de blancs (NA)

-Rapports (cond 1/cond 2) en log 2

-Sans virgule

exemple

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XL STAT

• Projection des données dans un sous espace de dimension réduite (Analyse en composante principale ou ACP).

• Organisation des données (classification ascendante hiérarchique ou CAH).

• Classification des données (K means).

-Pas de blancs (remplacés par la moyenne de toutes les expériences)-Données en log 2

exemple

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XL STAT

classification ascendante hiérarchique ou CAH

XL STAT

classification ascendante hiérarchique ou CAH

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XL STAT

K means (nuées dynamiques)

Permet de classer les gènes ou les expériences dans un nombre de classes défini