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L ' e n z y m e :

un nouvel outil pour la synthbse peptidique

Les sciences bio/ogiques sont de nos jours en pleine expansion grace notam- ment ~ la transposition de techniques chimiques et physiques au domaine de la biochimie. L'isolement et la caractdri- sation de mol6cules souvent ~ I'dtat de trace dans les tissus on/contribud large- men/ ~ approfondir nos connaissances des r~actions intervenant dans te syst~me vivant.

Le m6me essor a caractdrisd les d~cou- vertes de substances protdiniques et depuis une trentaine d'ann~es des pro- gr~s considdrables on/~td fails aussi bien dans les m~thodes de purification que dans certes d'analyse : ainsi la structure de plusieurs milliers de molecules poly- peptidiques naturelles a pu ~tre dtablie, cette trame prot~inique se trouve distri- bute dans tout I'organisme vivant sous forme d'hormones, d'enzymes, de pro- tdines membranaires et cellulaires, de peptides du cerveau et du systdme ner- veux sans oublier /es antibiotiques, cette distribution se retrouve aussi bien dans le monde animal que vdg6tal et intervient dans tous les processus biologiques.

Une des consequences les plus directes de ces d~couvertes a ~t~ une demande croissante pour de relies molecules et de leurs analogues et cela ~ des fins de plus en plus nombreuses : la mise en dvidence de ces substances et leur distribution dans les tissus, I'~tude de leur mode d" ac- tion et de leur mdtabolisme et dans le

cas de certaines hormones ~ des fins thdrapeutiques pour subvenir ~ la carence d'un organisme d~ficient.

Ce matdriel de ,plus en plus divers n'est devenu accessible pour ces expdrio mentations que grace ~ des m~thodes de synth~se. Ces syntheses ont pallid ia raret~ et le coCit ~ievd de /'extraction de relies molecules ~ partir de sources natu- relies. Ce dernier fait est particu/i~re- ment sensible dans le cas de peptides d" origine humaine.

Parall~lement I'accessibilitd ~ des pep- tides de synthdse a largement contribu~

/'~tude du m~canisme d'action de ces molecules : 6tudes conformationne/les et dtablissement des param~tres structuraux responsables d'une activitd biologique donn~e. En effet la synth~se de nom- breux analogues comportant dans leur chaine aminde soit des substitutions de r~sidus amines soit des s~quences tron- qu~es a permis dans plusieurs classes de peptide de d~finir les r~sidus indispen- sables ~ I'activitd biologique de la mold- cule naturelle. De m~me dans le cas de Iongues chaines poly, peptidiques ~ effet biologique simple ou multiple, la syn- thdse peptidique a souvent rendu possible la ddtermination des portions minima res- ponsables d'une activit~ ddterminde. Ce qui a autorisd darts de nombreux travaux la substitution de ces Iongues chaines par des peptides d'un acc~s plus aisd.

Ce materiel peptidique a ~t# obtenu presqu" exclusivement par vole chimique et i/ suffit de consulter les catalogues de diff~rents fabriquants pour noter le nom- bre croissant de peptides ainsi offerts commercialement. Que de progr~s depuis I'obtention de la premiere liaison amide

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par E. Fisher en 1906 et mbme de la pre- miere hormone entidrement synthdtique : I'oxytocine par Du Vigneau en 1953.

Malgrd tout, la m6thode de synth~se id~ale ou du moins accept~e par la majo- ritd des chimistes peptidistes n'est pas encore publide et nombre d'auteurs pro- posent encore des ameliorations, aussi ce n'est pas dans un but purement aca- ddmique que d'autres chercheurs se sont eHorc~s de mettre au point des m~thodes originales pour aboutir ~ ces moldcules nature/les.

Quels sont donc les d~fauts de la mdthode chimique actuel/e ? En une phrase, la vole purement chimique ne permet que trds difficilement I'acc~s de Iongues chaines polypeptidiques ayant conserv~ I'enti~re configuration st~r~o- chimique des molecules nature/les cor- respondantes.

Les protdines et les peptides naturels nous /e savons, sont pour la plupart des chaines plus ou moins Iongues d'acides amin6s de configuration dire (( L ~. Au cours de la synth~se dite (( chimique )) la rdalisation de la liaison amide entre /e groupement carboxylique et /a fonction amine se fait grace ~ un agent de conden- sation (gdn~ralement une carbodiimide substitude) qui active la fonction carbo- xyle et ~limine les molecules d'eau for- m~es en se transformant en urge, mais i l a dt~ observ6 (Benoiton) que cet agent entraine une isom6risation partielle des deux r6sidus amines ~ condenser, le taux de cette double isomdrisation est fonc- tion des conditions de /a r6action mais 6galement, ce qui est beaucoup plus cri- tique, de la nature des chaines /at~rales portdes par /es deux r6sidus amines en presence.

H est bien connu que les rendements de la condensation chimique d~croissent au fur et ~ mesure de i'ddification de i a

chaine peptidique, celle-ci en effet devient de plus en plus volumineuse et de moins en moins soluble dans les sol- rants employ~s ; de plus certaines fonc- tions port~es par les chaines iat6rales sont susceptibles de r6agir et demandent par I~ ~ ~tre masqudes par des groupe- ments dits <¢ protecteurs )) souvent volu- mineux, Tous ces fairs cr~ent un emp6- chement st~rique croissant autour des fonctions qui doivent r6agir entre elles. La baisse de rendement sera la directe consequence de la dilution rendue n6ces- saire du fragment et de I'emp6chement

st~rique croissant autour du groupement r6actionnel et malgrd diverses amdtiora- tions (synth~se en phase solide et sur- tout synthdse par condensation de frag- ments), ces /imitations rendent diff ici le la purification des rndlanges interm~- diaires ou finaux. De m~me le produit final dewa ~tre soumis ~ de nombreux contr61es de puret~ chimique et st6r6o- chimique. Aussi sans t'apport de nou- veaux progrds il semble encore illusoire d'envisager la synth~se de longs po/y- peptides par vole chimique.

C'est pourquoi plusieurs laboratoires cherchent ~ remplacer plus ou moins partiellement /'agent de coup/age chi- mique par un catalyseur nature/et ils ont choisi /'enzyme prot~olytique pour trois raisons principa/es :

1) L'enzyme protdolytique est large- ment utilisde comme un agent de frag- mentation de prot~ines mais I'hydrolyse ainsi cata/ysde n'est en fair qu'une rdac- tion d'dquilibre naturellement ddplacde dans le monde vivant dans le sens de I'ouverture de ia liaison peptidique par la pr~Jsence d'un important exc~s d'eau.

2) L'enzyme ne peut agir qu'en for- mant un complexe sur des rdsidus ou acides amines de configuration naturelle L, ce qui interdit route r~Jaction entre des acides amines ou des fragments se ter. minant par des r~sidus de configura- tion D.

3) L'enzyme en rant que catalyseur n'est pas sensible ~ la taille des mold. cules en prdsence et seuls les r~sidus amin6s impliquds directement dans ia r~action doivent ~tre suffisamment acces. sibles.

Dans un but plus pratique nous a/Ions aborder trois aspects de la synth~se enzy- matique :

A. Les diverses conditions proposdes pour permettre ~ cette r6action d'dqui- fibre de s'effectuer dans le sens de la formation de la liaison amide.

B. Les enzymes utills6es. C. Les diverses possibilit~s offertes

par cette technique.

A ~ Une enzyme agit dans des condi- tions de pH et de temperature bien d6fi- hies sur des r6actifs solubilis6s dans le milieu rdactionnel. Aussi en appliquant les lois d'action de masse i l est possible de trouvar certains facteurs qui faro-

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riseront IB r~action dans le sens de I'ad- dillon. Dans ce but tes premi6res expd- riences ont ~td effectu~es en prdsence d'un important exc6s d'un des r~actifs mais cela ne semble pas raisonnable ~conomiquement, aussi par la suite I'dli- mination au fur et ~ mesure de sa forma- tion du produit de condensation a dt~ prdf~r~e quand cela dtait possible. Cette ~limination peut ~tre r~alis~e de plu- sieurs mani~res : par le choix du solvant de rdaction entrainant I' insolubilisation du produit form~, ou par I'util isation d'un syst~me de solvant binaire, dans ce cas la r~action enzymatique se fai l dans une des phases e t l a substance d'addition est extraite clans l'autre phase (Cremo- nesi et a'l.). Pour entrainer hors du milieu rdactionnel la molecule finale, d'autres auteurs (Komoriya et a,I.) mettent dans le milieu r~actionnel une substance insoluble ayant une affinitd pour la mold- cule finale, ces substances sont de v~ri- tables pi6ges cindtiques ou chimiques. Toutes ces mdthodes ont des applications limit~es ~ des peptides ou des prot~ines particuli6res. Par la suite un grand pro- gr6s de portde g~n~rale a ~t~ r~alis~ Iors de ruti l isation de solvants organo-aqueux qui entrainent la diminution de I'ionisa- lion du groupement carboxyle r~action- net (Homandberg et a~l.). Ces syst~mes de solvants permettent ainsi de minimi- ser I 'effet de I'hyd[olyse en retour et par I~ favorisent les rendements de la rdac- lion d" addition.

De m~me it semble maintenant bien dtabli que ces rendements sont am~lior~s si la condensation s'effectue ~ partir d'ester ou de ph~nylhydrazide au lieu de I'acide libre (Zerner et a,I.) ; I'enzyme joue le r61e d'une est~rase qui provoque le ddpart d'alcool ou de phdnylhydrazine au lieu de molecules d'eau, ce qui tend

diminuer fortement I'hydrolyse en re- tour, cette r~action se produit souvent des pH plus basiques que ceux n~ces- saires ~ la condensation d'un acide libre.

Enfin, une des derni6res techniques proposde afin d'assurer un meilleur con- tr6le de la r~action est I'util isation d'en- zyme attach~e ~ un support solMe (Konnecke e t a ) . ) , /'enzyme reste active en tant que catalyseur et peut ~tre ~limi- n~e ~ tout moment du milieu rdactionnel par simple filtration.

B m II n'est pas dans notre propos de nous engager dans une description trop

exhaustive des dfff~rentes enzymes d~j~ utilis~es en synth~se peptidique, surtout apr6s I'artic/e tr&s complet de Jakubke et Kuhl, nous nous proposons dans un but pratique de les classer en deux grou- pes : Celles ~ grande sp~cificit~ qui en rant que prot~ases ne forment un com- p/exe qu'avec certains r~sidus amines, nous citerons la trypsine pour les rdsidus basiques (arginine et lysine) e t l a chy- motrypsine n'agissant que sur les d~riv~s aromatiques (tyrosine et ph~nylalanine). Les propri~t6s de ces enzymes ont dt~ dtudi~es en ddtail par Morihara et Oka, certes e/les ne peuvent catalyser la con- densation d'un groupement amind que sur des r~sidus amines bien d~finis (basiques ou aromatiques respective- ment), en revanche eltes pr~sentent le grand avantage de permettre ces conden- sations entre des substances pratique- ment non prot~gdes au niveau de leurs fonctions lat~rales ce qui dvite la ndcessi- t~ des ddbloquages ult~rieurs. Utilisdes en tant qu'est~rases, ces enzymes en per- dant leur sp~cificitd propre permettront aussi la condensation de nombreux r6si- dus amines sous forme d'ester.

Les autres prot~ases utilisdes prdsen- tent un spectre de r~activit~ beaucoup plus large mais moins bien d~fini, elles permettent la condensation entre des r~sidus aminds de nature diverse mais demandent avant leur utilisation une ~tude pr~liminaire pour f ixer les condi- tions de r~action ; en effet les rendements d'une condensation donnde sont entre autres directement lids ~ la nature de I'enzyme utilis~e (Ohmori et a~l.). Ces enzymes sont nombreuses et appartien- nent aux fami/les des serinoprotdases comme I'~lastase, la subtilisine, la throm- bine, la thermitase e t l a carboxypepti- dase Y, ou dans celle des thioiprot~ases parmi lesquelles on compte la papaine, la cathepsine, ou les aspartalprotdases, avec la pepsine et enfin les m~talpro- tdases parmi lesquelles se trouvent la thermolysine, les prolisines A e t B, la tacynase N et la thermoase sans oublier les carboxypeptidases A et B.

D'un point de vue historique nous cite- rons plus particuli~rement la pepsine qui fur la premi6re enzyme dont /'action en tant que catalyseur transformant un md- lange de peptides en substances inso- lubles fur remarqude par Danilewski ~ la fin du si6cle dernier et de la papa~ne, enzyme utilis~e par Bergmann et Frankel-

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Conrat en 1937 pour rdaliser la premiere liaison am/de catalysde enzymatique- ment.

De m~me une des voies d'avenir de la synth&se peptidique catalys~e par des protdases nous semble ~tre pr~sentde par les travaux de W/diner et Johansen. En effet, ces auteurs utilisent la carboxypep- tidase Y pour allonger progressivement une chaine aminde non prot~gde ~ partir de son r~sidu carboxylterminal est~rifid, /Is jouent pour cela tr~s dl~gamment sur les deux propri~t~s de cette enzyme ; pH 9 /Is catalysent avec de bons rende- ments l 'addition d'un certain nombre d'acides amines sous forme am/de sur des esters amines util isant les propri~- tds est~rases de cette enzyme, puis pH 7 la m&me enzyme alors carboxypep- tidase leur permet la d~samidation du peptide form& La nouvelle fonction car- boxyle libre peut ~tre alors est~rifi~e pour ~tre condens~e par le m&me processus de nouveau ~ pH 9 sur un autre acide amin~ amid& C'est vraiment la premidre m~- thode de synth~se peptidique enzyma- tique pas ~ pas qui pourrait ~tre par la suite automatis~e.

C ~ Aprds cette presentation trds suc- cinte des enzymes jusqu'ici utilis~es nous allons prdsenter deux exemples qui i/lustreront les possibilit~s et la strat~gie de ces syntheses enzymatiques.

La premiere illustration concerne la synth~se totale de peptides assez courts comme la Met et la Leu enk~phaline pen- tapeptide isolds du cerveau. Ces syn- thdses ont n~cessit~ I'emploi successif de plusieurs enzymes pour assurer des rendements de condensation acceptables

chaque ~tape. Les travaux de Kull- mann montrent bien les difficultds ren- contrdes dans le choix de/ 'enzyme ~ uti- liser ~ chaque dtape et des conditions de rdaction afin d'dviter toute hydrolyse en retour, et c'est en util isant successive- ment la papaine et la chymotrypsine, que cet auteur parvient successivement transformer certaines fonctions carbo- xyles en ph~nylhydrazides par catalyse enzymatique, ~ condenser certains esters en utilisant /"enzyme comme estdrase et

d'autres ~tapes ~ utiliser I'enzyme en rant que prot~ase pour condenser un groupement carboxyl sur une fonction aminde iibre et malgrd cette stratdgie tr~s &laborde, I'auteur ne parvient pas ~ obte- nir la Leu enk~phaline qui, pour ~tre rda-

lisde, n6cessite une derni~re condensa- tion chimique.

Par contre les d/verses condensations catalys~es en prdsence de carboxypepti- dase Y semb/ent aboutir ~ de mei//eurs rdsu/tats et permettent par une u/time addition en presence de chymotrypsine (W/diner et Johansen) d'aboutir avec des rendements apprdciables ~ cette moldcule naturel/e.

// semble donc que la synth~se pepti- dique par vole enzymatique pure est encore probl~matique car ni les rende- ments de chaque dtape, ni les conditions op~ratoires ne sont suffisamment connus pour assurer la prdsence dans /e mdlange final de /a mo/dcule d~sir~e en quantitd suffisante. II est dvident que ces rende- ments sont aussi trds d~pendants de la puretd de /'enzyme utilis~e, toute autre presence d'enzyme dtrang~re pouvant provoquer des coupures non d~sir~es dans la chaine amin~e en dlaboration.

Par contre il nous semble que c'est dans /e domaine de la semi synth~se que la catalyse enzymatique offre les mei/leures possibilit~s. En effet, i l e s t certain que toute liaison am/de rompue enzymatiquement dans une chaine ami- n~e m~me /ongue peut ~tre reform~e par /a m6me enzyme. Seules les conditions de rdaction devront ~tre 6tudides pour obtenir les meil/eurs rdsu/tats.

De nombreux exemples illustrent cette voie enzymatique d'acc~s aux analogues de prot~ines, et nous ne nous bornerons qu'~ d~crire ce/ui de I'insu/ine humaine obtenue ~ partir des d~rivds bovin ou porcin.

L'insuline porcine est couple en pr6- sence de trypsine sp~cifiquement au ni- veau de I'arginine de la chaine B, le d~riv~ d~soctapeptide obtenu est ensuite condens~ avec i'octapeptide synth6tique possddant la sdquence humaine en prd- sence de la m~me enzyme comme cata- lyseur. Apr~s la liberation de certaines fonctions latdrales n~cessairement blo- qu~es, 49 % d'insuline humaine pure sont obtenus. I! est certain que /'addition par voie enzymatique se fait avec de meil- leurs rendements qu'une pure addition chimique et dvite toute possibilitd de rac~misation (Inouye).

D'une mani&re plus simple encore et surtout plus ~conomique, it est possible d'~viter la synthdse (chimique) de I'oc- tapeptide ; en effet par digestion de I'in- suline de porc en prdsence de carboxy-

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peptidase A i l est possible d'obtenir avec de bons rendements la des-alanine insu- line qui est ensuite additionnde ~ la thr~onine m~thylester en presence de trypsine. Apr~s les ddprotections de cer- tains rdsidus (notamment I" arginine) I'in- suline humaine pure est obtenue avec

des rendements sup~rieurs ~ 50 %.

D'autres semi synthdses ont ~td obte- nues avec des rendements tr~s appre- ciables m~me sur des moldcules de taille respectable. A partir de r inhibi teur de la kallikr~ine (Kunitz), de la somatostatine humaine, de la ribonucl~ase Se t du cyto- chrome C, des analogues ont dtd obtenus par vole enzymatique et ce ne sont que quelques exemples ob la vole chimique reste encore tr~s probl6matique.

En conclusion nous pensons avoir mon- tr~ que la synth~se peptidique par cata- lyse enzymatique est une mdthode nou- ve//e en p/eine expansion et, bien qu'elle pr~sente encore certains d~fauts de ]eu- hesse par son manque d'universalit6 cela est le fair de notre manque de connais- sance des enzymes prot~o/ytiques sus- ceptibles d'engendrer une liaison amide entre n'importe quel rdsidu amind. Elle se pr~sente ~ I'heure actuelle comme un outi/ tr&s pr~cieux mais trop souvent ignor~ comme compldment de la syn- th~se chimique, car elle permet I'dlimi- nation des molecules ayant des r~sidus terminaux de configuration non naturel/e, et rendues par I~ non rdactives vis-a-vis des protdases (Bergmann et Behrens). La vole enzymatique d'autre part est une mdthodologie souvent indispensable pour la synth~se de Iongues chaines amindes, car elle permet la crdation de liaisons amides entre les fragments synthdtiques et naturels avec des rendements accep- tables ; elle offre par l~-m6me de nou- velles possibilitds dens le domaine de la semi-synth~se. Et il est certain que I'ob- tention d'analogues nature/s ou artificiels de prot~ines ouvre un nouveau champ d'investigation dans les relations struc- ture-activitds de ces Iongues chaines ami- n~es, dtudes qui n'avaient connu jus- qu'alors un grand essor que dens le domaine des peptides.

D. RAU:I~IS,

Ma~re de ,recherches CNRS, LA 163, C.H.U. Sat,nt Atomize, 27 rue Cha.l, igny, 75012 Paris.

REFERENCES.

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17. Bergmann, M., and Behrens, O.K. (1938). J. Biol. Chem., 17.4, 7.

Le Jury du Prix de th~se Benjamin De/essert s'est r~uni le 10 novembre 1982.

Le prix 1982 a dtd attribud ex-aequo

Mademoiselle Brigitte Saunier

pour sa th~se de Doctorat as-Sciences pharmaceutiques :

Purification partiel/e et ~tude de g/u- cosidases impliqu~es dens le rr~tabo- lisrne des glycoprotdines de Saocharo- myces cerevi~iae.

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et :

Mademoiselle Annick Faurion pour sa th~se de Doctoral ~s-ScJences Nature/les :

Etude des m~canismes de la chimio- r&ception du go~t sucrd.

P rix Benja,mi.n Del~essert 1983 :

La Fondation Benjamin Delessert r&compensera cette annde une th~se de Doctoral 1982-1983 (Doctorat as- Sciences, Doctorat lng6nieur, Doctorat 3 ~ cycle), ayant trait aux prob/&mes con- cernant :

La biochimie des glucides. - - Leur m~tabolisme normal et patholo-

gique. Leur valeur technoiogique.

Les ouvrages devront parvenir ~ la Fondation avant le 15 mai 1983.

Le montant du prix attribud sera de 10.000 F.

Ce prix sera attribu# par un jury exclu- sivement scientffique, compos6 de quatre spdcialistes.

Pour tous rense}gnements comp~menta}res, s'adresser h la : Fondation Benjamin Delessert. 30, rue de Lubeck, 75t 16 Paris - T6L 553.87.56.

Tab le r o n d e t e c h n o l o g i q u e sur la pur i f i ca t ion de f a c t e u r s

de c ro issance d e ce l lu les e u c a r y o t e s

11 Ma,rs 1983

Organisateurs : D. Ba,rri~a~JIt Y. Cou,r~is

INSER;M U. 118, CNRS iERA 842, Ur~ve~si~ Pa,ri~s XII

sous [es auspices ' la Sooi6~6 d e Chim.i~ B. io |ogi~ue

Li,~u : dans les locaux de I'INSERM U. 118, 29, rue Wilhem, 75016 Paris

Les facteurs de croissance constituent une nouvelle classe de protdines, iso/6es d partir d'organes de tissus ou de cel-

lu/es en culture qui sent capables de sti- muler plus ou moins s~lectivement la pro- lif6ration de cellules diverses ou de mo- duler ieur diff~renciation. 7r~s peu sont iso/~s et bien caract~ris6s. Ces facteurs sont actifs ~ des doses tr~s faibfes. Or, /es dernidres drapes de ]eur purification sont extr~mement diffici/es.

Les chercheurs impliquds dans des purifications de moldc~les de ce type (EGF, FGF, EDGF, PDGF, SGF, OGF, (...) GF ainsi que de/eurs inhibiteurs) et qui seraient int6ress6s 6 exposer leurs r6sultats et discuter des aspects technolo- giques lids ~ ces prob/dmes sont invites

prdsenter un poster et ~ envoyer un rdsumd avec leur demande de participa- tion, avant /e 1 °" mars.

La participation comprenant ie d~jeu- net est fixde ~ :

120 F pour/es membres de ]a Soci~- t~ de Chimie Bio/ogique, 160 F pour /es autres participants.

Le nombre de participants est limit~.

Pour tous renseignements, contacter Fun ou l'autre des organisateurs.

Programme.

Le matin sera consacrd ~ la prdsenta- tJon des posters et I'apr~s-midi ~ diff6- rents aspects technologiques :

Tests d" activitd - quantification. Etapes de purification (chromatogra- phies classiques, HPLC, chromatogra- phies d" affinit6, chromatof ocalisa- tion, ~lectrophor~se prdparative, iso- ~lectrofocalisation... ). Conservation. Prdparation d'anticorps poly et mono- clonaux. C/onage. D&termination de ia structure pri- maire.

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