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Le Système Hématopoïétique

Cours N°5 – Docteur Cécile BORGET

Cours dispensés à la faculté de médecine Pierre et Marie CURIE Site Saint Antoine 27 rue Chaligny – 75012 - Paris

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CELLULES SANGUINES ET HEMATOPOIESE

DEFINITION DE L’HEMATOPOIESE C’est l’ensemble des mécanismes qui assurent le remplacement continu et régulé des cellules sanguines : Les polynucléaires : neutrophiles, basophiles, éosinophiles. Leur durée de vie est de 24 heures et le nombre total circulant est de 5 10 10 ; La production quotidienne est donc de 5 10 10 environ. Les globules rouges : Leur durée de vie est de 120 jours et le nombre total circulant est de 20 10 12 ; La production quotidienne est donc de 2 10 11 environ Les plaquettes : Leur durée de vie est de 7 jours et le nombre total circulant est de 1 10 12 ; La production quotidienne est donc de 1 10 11 environ Ces éléments sont hyperspécialisés et n’ont plus la capacité de se multiplier. Ils doivent être remplacés en permanence. Les monocytes et lymphocytes, qui circulent aussi dans les vaisseaux sanguins, conservent la capacité de se multiplier dans le sang périphérique. Nous allons donc dans un premier temps décrire le tissu sanguin mature, puis aborder les mécanismes de son renouvellement (hématopoiese) TISSU SANGUIN Le sang est un « tissu » dit mésenchymateux formé des éléments figurés du sang et du plasma. L’ensemble est liquide, contenu dans les vaisseaux sanguins. Le volume est de 5 litres et l’hématocrite (cellules) représente 45% du volume total. Le plasma contient des protéines (albumine, globulones…) lipides glucides enzymes vitamines gaz dissous eau…. Les cellules s’étudient par frottis et coloration des cellules LES CELLULES SANGUINES ; DESCRIPTION ET RÔLE Les globules rouges 5 millions/ mm3 de sang ; ils sont rouges en raison de leur fixation aux molécules d’O2 ; ils sont déformables ; ils sont anuclées et ne peuvent se multiplier dans le sang périphérique ; ils sont en forme de lentille biconcave et leur diamètre est de 8 micromètres ; leur épaisseur de 2 micromètres ; ils transportent l’oxygène qui se fixe sur l’hémoglobine contenue dans la cellule, vers les tissus ; ils transportent également le CO2 Les globules blancs Sont au nombre de 4 à 10000/ mm3 Sont de plusieurs types selon leur spécialisation mais participent tous à la défense de l’organisme contre les agents pathogènes: les polynucléaires : agissent pour la lutte antibactérienne en passant par « diapédèse » du sang au tissu lésé, entre les cellules endothéliales grâce à l’action de cytokines. Ils

54« phagocytent » les bactéries ; leur demi vie est courte ; ils ne peuvent plus se multiplier dans le sang.

- Les polynucléaires neutrophiles représentent le plus fort contingent de globules blancs ; ils font 12 micromètres de diamètre et possèdent un noyau plurilobé ; leur demi-vie est de 24 heures car ces cellules sont incapables de renouveler les lysosomes utilisés dans la digestion des microbes et meurent après en avoir phagocyté quelques-uns.

- Les polynucléaires éosinophiles ; 10 à 14 micromètres ; noyau bilobé ; volumineuses granulations du cytoplasme ; ils détruisent les parasites ; leur activité de bactéricidie et phagocytose est faible.

- Les polynucléaires basophiles : font 10 à 14 micromètres ; leur noyau bilobé est masqué par de volumineuses granulations ; leur membrane possède des récepteurs aux igE spécifiques d’un allergène ; ainsi, lors d’un contact avec l’allergène, les Ig E se mettent en ponts et provoque la libération des granules, d’ou les manifestations allergiques les monocytes : font 15 à 20 micromètres de diamètre et leur noyau est en fer à cheval. Ils vivent 24 h dans le sang puis passent dans les tissus ou ils deviennent des macrophages qui éliminent les déchets cellulaires et microbiens laissés sur le lieu d’une infection. Ils gardent la capacité à se multiplier dans le sang les lymphocytes : Les lymphocytes sont des cellules qui, outre leur présence dans le sang, peuplent aussi les tissus lymphoïdes et les organes de même que la lymphe circulant dans les vaisseaux lymphatiques. On distingue morphologiquement des petits (comme des GR) et des grands lymphocytes (comme un GB) , et fonctionnellement des lymphocytes B des lymphocytes T des lymphocytes NK….ces distinctions se basant sur la nature de leurs récepteurs de membrane et leur rôle exact dans la réponse immunitaire ; ils se multiplient dans le sang lorsqu’il existe des signaux d’activation ; Ils sont les principaux éléments du système immunitaire, et assurent la défense contre les attaques de micro-organismes pathogènes comme les virus, bactéries, champignons et parasites. Les mécanismes de défense sont complexes : lors d’une agression par un agent pathogène se mettent en place des systèmes de défense non spécifiques (inflammation…) puis d’autres, spécifiques dédiés par les lymphocytes : les B activés par une stimulation antigénique deviennent plasmocytes sécréteurs d’immunoglobulines à activité anticorps dirigée vers l’antigène du microorganisme infectant ; les T portent des Anticorps de surface, eux aussi spécifiques de l’antigène et se lient à l’agent infestant par ce biais , puis le détruisent. Des lymphocytes auxiliaires et suppréteurs participent à ces phénomènes de défense de nature immune, humorale (lymphocytes B) ou cellulaire (lymphocytes T). Les plaquettes : T= 5 micromètres ; sans noyau Leur fonction principale est de faire cesser l'écoulement du sang par les plaies (hémostase). A cette fin, elles s'agglutinent et libèrent des facteurs favorisant la coagulation du sang : sérotonine, qui réduit le diamètre des vaisseaux lésés et ralentit le flux sanguin, fibrine qui capture les cellules et donne lieu à la coagulation. Elles forment ainsi un bouchon, le thrombus.

55 L’HEMATOPOIESE : LIEU DE PRODUCTION DES CELLULES SANGUINES La moelle osseuse est le lieu de renouvellement des cellules sanguines chez l’homme adulte ; mais les cellules sanguines, d’origine mésodermique chez le jeune embryon, sont d’abord produites par le sac vitellin (jusqu’au 16eme jour), puis dans le mésoblaste jusqu’au 22ième jour ; ensuite, la production de cellules sanguines est hépatosplénique, du 3eme au 6ième mois, et la production par l’os devient prépondérante à compter du 6ième mois, alors que la production hépatosplénique s’éteint progressivement, sauf dans certaines conditions pathologiques particulières. Après la naissance, la moelle osseuse est le site exclusif de production des cellules ; jusqu’à 5 ans, c’est dans la moelle rouge qu’elles se développent (totalité des cavités osseuses car moelle très active) puis ces sites s’involuent progressivement et la production reste confinée aux os plats et courts.

56La répartition quantitative de la production est la suivante : lignée granuleuse : 60% ; érythroide : 25% ; mégacaryocytaire : 0,5% ; lymphocytaire : 10% ; HISTOLOGIE DE LA MOELLE OSSEUSE L’hématopoïèse médullaire est localisée dans des logettes extravasculaires, situées en dehors et à proximité des vaisseaux, partiellement délimitées par les adipocytes et les travées de l’os spongieux, et irriguées par un réseau de capillaires sinusoïdes et structurées par un réseau de cellules fibroblastiques. Dans chacune de ces logettes, l’hématopoïèse est un processus dynamique avec des interactions complexes entre les cellules hématopoïétiques et les cellules du tissu conjonctif. Réseau vasculaire médullaire : La vascularisation est l’élément central de la microstructure médullaire, permettant le passage des substances stimulantes et de cellules souches, et la libération des cellules matures. Les artères nourricières de l’os donnent des ramifications puis des artérioles prolongées par des capillaires le plus souvent situés dans la corticale osseuse et qui se transforment en sinusoïdes lorsqu’ils pénètrent dans la moelle. Ainsi, une partie du sang artériel irriguant la moelle a préalablement irrigué l’os. Les sinusoïdes qui prolongent les capillaires sont d’abord contournés et présentent de multiples divisions et anastomoses.

57Ils sont collectés dans les sinusoïdes droits, puis dans les sinus centraux et dans les veines émergeant de l’os. Chaque bouquet de sinusoïdes contournés se jetant dans le même segment de sinusoïde droit est le lieu privilégié des migrations cellulaires à travers la paroi du vaisseau. Le réseau vasculaire médullaire est doublé d’un réseau nerveux périvasculaire avec des fibres myélinisées et non myélinisées vasomotrices, capables de transmettre la sensation de douleur lors de l’aspiration du myélogramme. Unité structurelle médullaire : La moelle hématopoïétique peut être interprétée comme la juxtaposition d’unités élémentaires, centrées sur un groupe de sinusoïdes Stroma ou tissu de soutien médullaire : Les cellules stromales délimitant et structurant les logettes hématopoïétiques sont de plusieurs types : cellules réticulaires fibroblastiques, adipocytes, cellules endothéliales, ostéoblastes. Il s’y associe des molécules de la matrice extracellulaire (collagène, laminine, fibronectine, protéoglycanes, etc), et des cytokines ancrées sur les membranes cellulaires et la matrice extracellulaire. Les processus de multiplication et de différenciation cellulaires exigés par l’hématopoïèse nécessitent un contact étroit entre les cellules du tissu de soutien et les cellules souches hématopoïétiques. Endothélium et barrière médullosanguine : Les cellules endothéliales des capillaires sinusoïdes médullaires régulent le trafic des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques et la sortie des cellules sanguines matures. La paroi des sinusoides est traversée par les cellules souches hématopoïétiques passant du sang dans les niches d’hématopoïèse extravasculaire (homing) et par les cellules sanguines matures passant sélectivement de la moelle dans le sang (diabase) par des orifices transendothéliaux faisant communiquer les territoires extravasculaires et la lumière du vaisseau. Pour traverser les vaisseaux, les cellules qui migrent doivent ainsi présenter une déformabilité suffisante. Dans le cas des globules rouges, l’expulsion préalable du noyau trop rigide est indispensable : celle-ci se ferait en moyenne 12 heures avant la migration, cependant l’expulsion du noyau en cours de traversée du sinus est parfois possible. Les noyaux des polynucléaires, monocytes et lymphocytes sont suffisamment déformables pour permettre leur migration transendothéliale. Le cas des mégacaryocytes est particulier : la région du cytoplasme située à proximité des sinus émet des pseudopodes traversant la paroi des sinus

58Matrice extracellulaire médullaire : composants fibrillaires La matrice extracellulaire est formée par un réseau complexe de molécules synthétisées par les cellules stromales. - Les fibres de collagène de type I et de type IV - Le réseau de fibres dites de réticuline, un réseau de fibres grillagées renfermant dans ses mailles les cellules hématopoïétiques, bordant les sinus et cerclant les adipocytes. Composants non fibrillaires de la matrice extracellulaire De nombreux composants matriciels non fibrillaires ont été identifiés: glycosaminoglycanes, héparanes sulfates, etc. Ces macromolécules jouent un rôle dans les mouvements de l’eau, régulent les phénomènes de diffusion interstitielle, stabilisent les fibres de collagène, interviennent dans l’adhérence des précurseurs hématopoïétiques au tissu de soutien et peuvent se lier aux facteurs de croissance pour faciliter leur action in situ. De nombreuses autres molécules participent à la constitution des niches adhésives médullaires, intégrines en particulier. La fibronectine est un autre composant majeur de la matrice extracellulaire, procurant des sites d’adhésion pour les cellules hématopoïétiques.

59LES CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES Toutes les cellules sanguines (hématies, polynucléaires, monocytes, lymphocytes et plaquettes) sont produites à partir d'une même cellule indifférenciée dite cellule souche multipotente ou cellule souche primitive. Sous l'influence de facteurs stimulants une cellule souche multipotente va s'engager dans la différenciation d'une lignée cellulaire. Elle devient alors un progéniteur (= cellule souche différenciée ou " engagée "). Après plusieurs divisions qui aboutissent à des cellules souches engagées et à la potentialisation de différenciation de plus en plus limitée, les progéniteurs deviennent spécifiques d'une seule lignée. On aboutit alors aux précurseurs, cellules identifiables morphologiquement sur un prélèvement de moelle osseuse. Ces précurseurs se divisent et maturent. Ils correspondent à la majorité des cellules vues sur un étalement de myélogramme ou sur une biopsie ostéomédullaire (BOM). La maturation terminale aboutit aux cellules matures fonctionnelles qui passent dans le sang. L'hématopoïèse comporte donc 4 compartiments cellulaires: o Les cellules souches multipotentes o Les progéniteurs o Les précurseurs o Les cellules matures Les cellules souches primitives : Les cellules souches ont deux propriétés essentielles: la capacité d'auto-renouvellement et la capacité de différenciation o Auto renouvellement = multiplication sans différenciation permettant de maintenir intact un pool de cellules souches primitives et donc le potentiel de l'hématopoïèse. o Différenciation = possibilité, sous l'influence de facteurs de croissance, de se diviser en s'engageant de façon irréversible vers plusieurs ou une lignée. La cellule perd alors sa multipotence pour devenir une cellule souche engagée. Lors d'une hématopoïèse normale il existe un équilibre entre la production des cellules souches par division cellulaire (auto renouvellement) et la perte des cellules souches par engagement vers les lignées cellulaires (différenciation). Ces cellules: • Sont localisées dans la moelle osseuse mais certaines peuvent passer de façon temporaire dans le sang. • Ne représentent qu'un faible pourcentage des cellules médullaires (0,01 à 0,05%). • Ne sont pas identifiables morphologiquement (elles ressemblent à des petits lymphocytes). • Possèdent certains marqueurs immunologiques spécifiques: En pathologie : Les cellules souches peuvent être prélevées, concentrées puis congelées dans l'azote liquide. Lorsqu'une chimiothérapie très myélotoxique est nécessaire la reconstitution de l'hématopoïèse peut être réalisée par décongélation et réinjection de ces cellules souches au patient: c'est le principe de l'autogreffe de moelle osseuse.

60Les progéniteurs : La première différenciation d'une cellule souche multipotente après sa mise en cycle se fait vers la lignée lymphoïde ou vers la lignée myéloïde. La cellule souche lymphoïde possède la potentialité de différenciation vers les deux types de lymphocytes (T et B). La cellule souche myéloïde est appelée CFU-GEMM. Chaque nom de progéniteur est définie par l'association du préfixe CFU ("Colony Forming Unit") suivi de(s) lettre(s) qui caractérisent les lignées dont elle garde le potentiel de différenciation (GEMM = Granuleuse, Erythrocytaire, Macrophage et Mégacaryocytaire). Cette cellule va poursuivre son programme de différenciation et donner naissance à des progéniteurs encore plus engagés: Les progéniteurs perdent progressivement leur capacité d'auto renouvellement au fur et à mesure de leur avancement dans la différenciation. Ils restent peu nombreux et non identifiables morphologiquement. Ils acquièrent les marqueurs immunologiques CD 33 et HLA-DR en plus du CD 34 déjà présent au stade de cellule souche multipotente. Ces déterminants antigéniques peuvent être reconnus par des anticorps monoclonaux. Les précurseurs : Les précurseurs hématopoïétiques sont les premières cellules morphologiquement identifiables de chaque lignée. Ce ne sont plus des cellules souches car elles ont perdus toute capacité d'auto renouvellement. Le compartiment des précurseurs a pour buts la multiplication et la maturation cellulaire. Les précurseurs les plus immatures sont les myéloblastes (--> polynucléaires), les proérythroblastes (--> hématies), les mégacaryoblastes (--> plaquettes), les lymphoblastes (--> lymphocytes) et les monoblastes (--> monocytes). Ils sont localisés dans la moelle osseuse et explorés par les techniques de ponction-aspiration (myélogramme) et de biopsie (BOM = biopsie ostéomédullaire) de la moelle. o La maturation: Divers stades cytologiques sont observés dans chaque lignée pour aboutir aux cellules terminales fonctionnelles. Les modifications morphologiques communes et générales liées à la maturation sont: - la diminution de la taille cellulaire, - la diminution du rapport nucléo-cytoplasmique, - la disparition des nucléoles, - la condensation de la chromatine. La maturation de chaque lignée induit également des modifications spécifiques: - du noyau (par ex: polylobulation dans la lignée granuleuse), - du cytoplasme (par ex: granulations spécifiques de la lignée granuleuse), - de la membrane (apparition de protéines membranaires spécifiques reconnaissables par anticorps monoclonaux).

61o La multiplication: L'efficacité et le rendement de l'hématopoïèse seraient très faibles si à chaque précurseur ne correspondait qu'un seul élément mature. Aussi, parallèlement à la maturation, chaque stade cytologique correspond à une division cellulaire. Selon les lignées il se produit ainsi entre 3 et 5 mitoses de sorte qu'un précurseur peut donner naissance à 32 cellules filles. Dans les précurseurs mégacaryocytaires la situation est très particulière: il n'y pas de division cellulaire mais une endomitose à l'intérieur des mégacaryocytes, la cellule doublant chaque fois son ADN. Les plaquettes sont des fragments de cytoplasme du mégacaryocyte qui seront libérées au moment de la mort de ce précurseur. Les cellules matures : L'ensemble de l'hématopoïèse a lieu dans la moelle osseuse. Seules les cellules terminales, matures et fonctionnelles, vont passer dans le sang : polynucléaires neutrophiles, éosinophiles et basophiles, hématies, plaquettes, lymphocytes et monocytes. Pour la plupart de ces cellules le sang ne représente qu'un lieu de passage et de transport entre leur lieu de production (la moelle) et le lieu de leurs fonctions (les tissus). Les lymphocytes et les monocytes seront de plus capables de nouvelles différenciations après leur séjour sanguin.

62REGULATION DE L ‘HEMATOPOÏESE Les cellules souches de la moelle constituent la base indispensable à une hématopoïèse efficace. Trois éléments jouent également un rôle important pour obtenir une hématopoïèse correcte et régulée: le microenvironnement médullaire, certaines vitamines et oligoéléments, les facteurs de croissance. Le microenvironnement médullaire participe à l'organisation générale de la moelle. Il donne aux cellules souches les conditions anatomiques et intercellulaires satisfaisantes pour assurer l'hématopoïèse. Le stroma médullaire est formé de différent types de cellules: fibroblastes, cellules endothéliales, macrophages, cellules épithéliales et adipocytes. Ces cellules du stroma sont organisées au sein des logettes hématopoïétiques. Elles sécrètent des matrices extracellulaires et des facteurs de croissance. Les matrices extracellulaires permettent l'adhésion des cellules souches en particulier grâce au collagène. Des vitamines et oligoéléments sont indispensables à l'hématopoïèse: Certains agissent sur l'ensemble des lignées cellulaires. C'est le cas de la vitamine B12 et de l'acide folique qui sont nécessaires à la synthèse de l'ADN et donc à la division cellulaire. Ces vitamines sont dites antimégaloblastiques. Leur déficit entraînera des anomalies de formation dans toutes les lignées. D'autres sont nécessaires à la fabrication de protéines spécifiques de lignées. C'est le cas du fer, indispensable à l'érythropoïèse pour la synthèse de l'hémoglobine. Les facteurs de croissance : L'étude des cellules souches par culture de moelle in vitro a montré la nécessité de "facteurs de croissance hématopoïétiques" pour la survie, la différenciation, la multiplication et la maturation des cellules de l'hématopoïèse. Le premier facteur connu a été l'érythropoïétine (EPO). Depuis quelques années de nombreux autres facteurs ont été découverts, clonés et synthétisés. Leur rôle exact dans l'hématopoïèse est de mieux en mieux défini. Ils permettent de grands espoirs dans le traitement des maladies de l'hématopoïèse et certains sont déjà utilisés en thérapeutique. Les facteurs de croissance hématopoïétiques sont des glycoprotéines agissant comme des "hormones hématopoïétiques". Cependant, à l'exception de l'EPO, elles sont synthétisées par un grand nombre de cellules présentes dans divers organes: cellules endothéliales, fibroblastes, monocytes / macrophages, lymphocytes. Elles ont aussi le nom de cytokines et pour celles synthétisées par les lymphocytes, de lymphokines et interleukines (IL). Ces cytokines reconnaissent leurs cellules cibles par l'intermédiaire de récepteurs membranaires spécifiques. On distingue schématiquement 3 types de facteurs de croissance selon leur lieu d'action au cours de l'hématopoïèse: o Les facteurs de promotion: - Ce sont principalement l’ IL 6 et le SCF (Stem Cell Factor), le Flt3-ligand, le LIF (Leukemia Inhibitoring Factor). - Ils augmentent le nombre de cellules souches en cycle cellulaire, - Ils sensibilisent les cellules souches multipotentes à l'action des autres facteurs de croissance. o Les facteurs multipotents: - Ce sont principalement l' IL 3 et le GM-CSF (CSF = Colony Stimulating Factor). - Ils agissent sur les cellules souches les plus immatures après sensibilisation par les facteurs de promotion et ils permettent la survie et la différenciation des cellules souches. o Les facteurs restreints: - Ils agissent sur les cellules souches engagées et favorisent la multiplication cellulaire et la maturation des précurseurs. - Ce sont principalement : le G-CSF (lignée granuleuse neutrophile),

63le M-CSF (lignée monocytaire), l'IL 5 (lignée granuleuse éosinophile), l'IL 4 (lignée granuleuse basophile), l'IL 6 (lignée mégacaryocytaire), l'EPO (lignée érythroïde) la TPO (thrombopoïétine, mégacaryocytaire) Régulation négative : Il existe aussi de facteurs inhibant la multiplication des cellules normales et leucémiques : interferons TGF TNF… INTRODUCTION A LA CLINIQUE : EXPLORATION DE L’HEMATOPOIËSE Le myélogramme Un myélogramme consiste en la confection d'un étalement de suc médullaire sur lame de verre, puis à sa coloration. Les cellules médullaires ainsi fixées et colorées sont observées au microscope. Le but de ce prélèvement est l'étude cytologique quantitative et qualitative des frottis médullaires réalisés après ponction aspiration de moelle osseuse par ponction sternale. L'indication de cet examen de diagnostic hématologique, se pose toujours au vue des résultats d'un hémogramme préalable anormal, d'une suspicion d'hémopathie maligne ou pour faire le diagnostic de certaines parasitoses (leishmanioses viscérales). La biopsie osteomédullaire Prélèvement sous anesthésie locale d’un fragment d’os à la crête iliaque. Ce fragment d'os médullaire (carotte) est généralement inclus dans de la paraffine grâce à des techniques histologiques (immersion dans du formol, décalcification à l'acide, déshydratation puis inclusion dans la paraffine) puis découpé en fines lamelles (déparaffinées) qui seront colorées puis fixées sur une lame puis envoyé au laboratoire d'anatomopathologie dans du liquide de Bouin.