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Le pouvoir pathogène de la bactérie Bordetella bronchiseptica

Bordetella beta- protéobactérie

bronchiseptica Coccobacille gram négatif, mobile

aérobie

S et N +

tractus respiratoire

présent chez de nombreux mammifères

responsable de bronchopneumonie chez les animaux

zoonose possible

parent de B. pertussis et B. parapertussis

génome séquencé (5.3Mbase)

Bordetella ssp. facteurs de virulence (adhesines et toxine) exprimées sous le contrôle d’un système à 2 composants (BvgAS system)

nécessité d’un TTSS pour induire la cytotoxicité, la colonisation à long terme de la trachée

Le pouvoir pathogène de la bactérie Bordetella bronchiseptica

BvgAS système: BvgS: protéine membranaire histidine kinase

senseur du milieu extracellulaire

activée , phosphoryle BvgA

BvgA: facteur de transcription pour les gènes de virulence

régulation du TTSS

Système de sécrétion de type 3 :

très conservé chez les bactéries Gram-

un des mécanismes très impliqué dans la virulence

translocation des effecteurs du cytosol de la bactérie dans le cytoplasme de la cellule hôte

selon le stade de l’infection, les effecteurs peuvent variés

Représentation d’un TTSS

Protéines sécrétées via le TTSS :

4 protéines identifiées chez Bordetella.

BopB, BopD, BopN et Bsp22

BopB/D complexe de perforation de la membrane plasmique

BopN ATPase permettant la sécrétionObjetif de l’étude:

Identifier de nouveaux effecteurs de Bordetella passant via le TTSS

Recherche de protéines sécrétées via le TTSS

-Comparaison des profils protéiques des surnageants

de culture des souches wt et ΔTTSS en SDS-PAGE

10 bandes différentes entre les 2 pistes dont

BopB, BopN, BopD, Bsp 22

-Extraction du gel des 6 bandes non identifiées

-Trypsination et analyse par spectromètre de masse

pour identification des protéines

MALDI-TOF MS ou ESI-MS/MS

-génération in silico d’une banque de peptides à partir du génome

Recherche de protéines sécrétées via le TTSS

Une seule protéine a été identifié à l’issue du screening.

HP de 69 kDa renommée BopC

-Analyse des séquences peptidiques:

3 bandes sont des produits de dégradation de Bsp22 et BopD

Bande a 1 peptide résidus 33-44 de HP p69

Bande b 5 peptides

Les bandes a (150kD) et b (28kD) correspondent –elles à une seule protéine BopC?

Génération d’un mutant ΔBopC

Clonage puis délétion du gène bopC via le système Gateway™

Introduction dans un plasmide suicide conjugatif (pRK6)

Complémentation du mutant ΔBopC par le plasmide pBopC

Clonage d’une cassette promoteur fha- bopC- terminateur rrnB1

fha hémagglutinine filamenteuse de Bordetella activé par BvgA

Introduction dans un plasmide réplicatif conjugatif (pRK415)

Les bandes a (150kD) et b (28kD) correspondent –elles à une seule protéine BopC?

Comparaison des profils de sécrétion

formation de complexe multimérique

sécrétion dépendante d’un TTSS

BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?

Recherche d’un effet cytotoxique de BopC

Infection de cellules L2 de rat pendant 20 min

Coloration avec une solution de Giemsa (différenciation nucléaire et cytoplasmique)

95% des cellules infectées par les témoins +

sont détruites

Pas de cellules dégradées pour les

mutants ΔbopC et ΔTTSS


Infection de cellules HeLa

Evaluation de la cytotoxicité par mesure de la LDH

La cytotoxité de B. brochiseptica est associée à bopC.



Infection de cellules HeLa pendant 1h

Evaluation de la mortalité par coloration au bleu trypan

57% 48%


Données bibliographiques

B. brochiseptica induit une nécrose des cellules sans activation des caspases

Cependant, observation de certaines cellules infectées TUNEL +

(terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP-biotin nick end-labelling)

Coloration différentielle de la mort cellulaire:

Cellules apoptotiques coloration dense au niveau du noyau

Cellules non apoptotiques: coloration diffuse du noyau


Evaluation de la mort cellulaire

Observation des cellules HeLa infectées à 2h (ou 5h pour la stauroporine)

BopC est requis pour l’induction de la mort cellulaire, mais n’induit pas d’apoptose.


Stsp: staurosporine, inhibiteur des PK

BopC est-elle une protéine formant un pore du TTSS?

Mesure de l’activité hémolytique (30min de contact)

Contrairement à BopB/D, BopC n’appartient pas

au complexe de perforation de la membrane plasmique


BopC et phosphorilation


B. brochiseptica induit des déphosphorylations dans des cellules L2 infectées.

Ce phénomène est TTSS dépendant.

Recherche d’un effet de BopC sur les protéines tyrosine phosphorylées (PY).

Observation par immunofluorescence de différents facteurs:

adhérence bactérienne ( actine et bactérie)

Etat de phosphorylation des PY


Observation des cellules HeLA

après 0, 20 min ou 1h d’infection


Au cours du développement de l’infection:

•l’adhésion et la colonisation des cellules ne sont pas modifiées

chez les mutants ΔbopC et ΔTTSS.

•l’état de phosphorylation des PY est modifié par la souche wt

mais ni par le mutant ΔbopC, ni par le mutant ΔTTSS

BopC induit une déphosphorylation des PY dans les cellules infectées.


Au cours du développement de l’infection B. brochiseptica BopC :

•requis pour l’induction de la mort cellulaire

•modifie l’état de phosphorylation des PY

Sur quel aspect BopC agit principalement?

Infection de cellules HeLa en présence d’inhibiteur de la déphosphorylation,

le sodium orthovanadate

Observation en microscopie à fluorescence

Mesure de la cytotoxicité (LDH et TUNEL)


Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica wt en présence ou non de vanadate

+

-

L’état de déphosphorylation des PY dans les cellules en présence de vanadate est relativement atténué.


Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica en présence ou non de vanadate

Observation sur 200cellules au hasard

La présence de vanadate atténue la déphosphorylation des PY induite par BopC.



Le vanadate et donc l’état de déphosphorylation des PY n’ont pas d’effet sur la cytotoxité cellulaire.

↓[PY] dans les cellules infectées par B. brochiseptica

a lieu après la mort cellulaire dépendante de BopC.

BopC et sécrétion via le TTSS


Les effecteurs TTSS dépendants sont introduits directement dans la cellule hôte depuis

le cytoplasme bactérien via le TTSS.

BopC est-elle un effecteur de type III?

Utilisation d’un système rapporteur TEM-1 β-lactamase ( Charpentier et Oswald, 2004)

Fluorescence

Resonance

Energy

Transfert


Génération des fusions TEM1

Amplification PCR des gènes bopC, bcrH2 (protéine cytoplasmique induit par BvgA)

et map (effecteur de EPEC)

Clonage dans le pCX340 (fusion traductionnelle avec TEM1)

puis PCR pour introduction dans un plasmide réplicatif conjugatif (pRK415)

via le système Gateway™,


Analyse des transformants ΔbopC et ΔbopB et ΔTTSS avec les plasmides TEM1

Protéines totales Protéines sécrétées

5%

20%

Les produits de fusion BopC-TEM1 sont correctement synthétisés et sécrétés exceptés dans la souche ΔTTSS.


BopC est transloquée via le TTSS dans la cellule hôte.

Le signal d’adressage se situe dans les 48 premiers acides aminés N-ter.

Cellules HeLa infectées+ CCF2-AM

70% FRET+

BopC et cytotoxicité dans la cellule hôte

BopC a un effet cytotoxique mais est-il direct ou résulte –t- il d’une cascade de régulation?

Clonage de BopC dans un plasmide d’expression eucaryote

Transfection des cellules COS-7, HeLa, 293T

Mesure de la cytotoxicité à 18h

L’expression de BopC directement dans la cellule permet

d’induire la mort cellulaire sans intervention d’autres

facteurs de virulence.

Discussion

BopC (Bordetella outer protein involved in cytotoxicity)

protéine de 69kDa

impliquée dans la mort cellulaire

protéines sécrétées via le TTSS : pore forming proteins (translocators) (1)

ou effecteurs (translocated protéins) (2)

effecteur de cytotoxicité qui provoque la nécrose des cellules infectées.

Analyse in silico du gène bopC

BopC a une fonction protein-tyrosine phosphatase (PTPase) comme YopH

mais rBopC activité PTPase –

membre de la famille PTPase activité catalytique sur la cystéine 403 dans YopH

BopC n’a pas de cystéine

L’effet PTPase ne serait pas lié à BopC

Discussion

Analyse in silico du gène bopC

•Recherche de protéines homologues et ou de motifs conservés

Présent uniquement chez les souches de Bordetella (identité >95%)

•Localisation à l’extérieur du locus TTSS

idem pour d’autres effecteurs de TTSS (SopE, SigD, orf3,Nle5)

•Recherche d’îlots de pathogénie dans une région de 20kb flanquant bopC

transposase 5kb en amont de bopC B.parapertussis

transposase 2kb en amont et intégrase 1.6kb en aval de bopC B. pertussis

Rien chez B. bronchiseptica

•Régulation + de bopC par le système BvgAS

Discussion

La protéine BopC

•BopC est sécrétée sous forme de multimère ou compléxée (150-200kDa >69kDa)

observation en SDS-PAGE de tels phénomènes

pour des protéines ayant de nombreux segments TM

mais BopC possède un seul TM prédit (619-643aa)

la multimérisation de BopC serait porté par la partie Cter (449-658 aa) de BopC

BopC et TTSS

•Les TTSS peuvent sécréter des effecteurs hétérologues:

Xanthomonas TTSS reconnaît YopE;

Yersinia TTSS reconnaît Pseudomonas AvrB et AvrPto;

Bordetella TTSS reconnaît EPEC Map bien que moins stable ( absence de la chaperone CesT)

•BopC aurait un effet régulateur sur l’expression des autres protéines du TTSS

La spectrophotométrie de masse

MALDI-TOF Matrix –assisted laser desorption/ionization Time of Fly

ESI Electrospray Ionization

Phage lambda recombination in E. coli

The Gateway® System

relies on five sets of

specific and non cross-

reacting att sequences

The specificity is given

by the 7 nucleotides of

the core region

PhageattP

cos

232 bp

attBE. coli

x

21 bp

attLLysogen

attR

96 bp 157 bp

Integration(Int, IHF)

Excision(Int, IHF, Xis)

Glossary of terms used in Gateway® cloning

att site – A defined length of DNA that constitutes a recombination site. There are 4 classes of att sites called attB, attP, attL, and attR.

ccdB gene – A counterselectable gene that allows for negative selection of unwanted by-product plasmids after recombination.

Donor (pDONR) Vector – A vector with attP sites flanking a counterselectable gene that recombines with a gene of interest flanked by attB sites.

BP reaction – A recombination event between attB and attP sites catalyzed by BP Clonase™ II

Entry (pENTR) clone – A vector that contains your gene of interest flanked by attL or attR sites.

LR reaction – A recombination event between attL and attR sites catalyzed by LR Clonase™ II

Destination (DEST) Vector – An application-geared vector with attR sites flanking a counterselectable gene that will recombine with one or more entry clones.

MultiSite Gateway® Technology – A system that allows simultaneous assembly of multiple DNA fragments into a single destination vector

90-99% correct cloneson Kan plates

Building a Gateway® Entry Clone

geneattB1 attB2

+attP1 attP2

ccdB

D o norVector

K anR

+

gene

attL1 attL2

EntryC lone

K anRccdBattR1 attR2

BP Clonase™ II

Obtaining a Gateway® Expression Clone

Express ionC lone

gene

attB1 attB2

A m pR

attP1 attP2

ccdB

D o norVector

K anR

attR1 attR2

ccdB

D estinationVector

A m pR

gene

attL1 attL2

EntryC lone

K anR

90-99% correct cloneson Amp plates

+ +

LR Clonase™ II

CTGCTTTTTTGTACAAACTTG attB1 CAGCTTTCTTGTACAAAGTTG attB2 CAACTTTATTATACAAAGTTG attB3 CAACTTTTCTATACAAAGTTG attB4 CAACTTTTGTATACAAAGTTG attB5

StandardGateway®

MultiSiteGateway®

Invitrogen Proprietary & Confidential

X XX X

X

X

attB2attB5

attP2attP5

attR2attR1

attB5rattB1

attP5rattP1

attL5

attL1

attB2attB5attB1

attL2

attR5

PCR Fragments

pDONRs

Entry Clones

Destination Vectors

Expression clones

2-fragment MultiSite Gateway® Pro

BP reactions

LR reaction

Invitrogen Proprietary & Confidential

MultiSite Gateway® Three-Fragment Vector Construction Kit

CmR

X XEntry clones

Destination vector

attB3attB4 attB2attB1Expression clone

attR1attL4 attL3attR2

attR3attR4

attL2attL1

ccdB

X X X XattB1rattB4

attP1rattP4

attB2attB1

attP2attP1

attB3attB2r

attP3attP2rX X

PCR Fragments

pDONRs

BP reactions

LR reaction

Système TEM

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