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Logez Christel Delbos Lila

Le complexe de régulation de

l’homéostasie du Cholestérol

Master EGPR 7

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Sommaire

RESUME................................................................................................................................... 3

LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................... 4

I. INTRODUCTION : .............................................................................................................. 5 1) Bref historique de la découverte du système de régulation de l’homéostasie du

cholestérol : ............................................................................................................................ 6

2) Présentation des protéines impliquées dans le complexe : ................................................ 7

3) Mécanisme du complexe de régulation du Cholestérol : ................................................... 8

II. RESULTATS :..................................................................................................................... 9 1) Le 25-HC et le Cholestérol induisent tous deux la formation du complexe SCAP/Insig.. 9

2) Le 25-HC n’induit pas de changement de conformation de SCAP et l’inhibition du

clivage de SREBP est dépendante de Insig-1....................................................................... 10

3) Le 25-HC n’interagit pas directement avec SCAP : ........................................................ 11

4) Découverte d’une nouvelle protéine interagissant avec les protéines SCAP et Insig :

PGRMC1 :............................................................................................................................ 12

III. PROJET DE RECHERCHE :........................................................................................ 14 1) Présentation de PGRMC1 : .............................................................................................. 14

2) Modèle d’étude ................................................................................................................ 15

3) PGRMC1 intervient-elle dans l’inhibition du clivage de SREBP ? ................................ 15

A. Transfection stable des cellules COS7 : ...................................................................... 16

B. Extinction de PGRMC1 : ............................................................................................. 16

C. Expérience :................................................................................................................. 16

4) Le 25-HC interagit-il directement avec PGRMC1 ?........................................................ 18

A. Production du photo-25-HC radioactif : ..................................................................... 18

B. Expérience : ................................................................................................................. 18

5) Y a t-il formation d’un complexe multiprotéique PGRMC1/SCAP/Insig ? .................... 19

IV. CONCLUSIONS :............................................................................................................ 21

RÉFÉRENCES :..................................................................................................................... 23

ANNEXE ................................................................................................................................. 25

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Résumé

La concentration en cholestérol, constituant majeur des membranes lipidiques et

précurseur de nombreuses hormones stéroïdiennes doit être régulée car une trop forte

concentration en cholestérol peut conduire à la mort cellulaire ou à une athérosclérose. La

synthèse de cholestérol est autorégulée grâce à un contrôle en feedback faisant intervenir un

complexe constitué des protéines SREBP, SCAP et Insig. La fixation du cholestérol sur

SCAP induit la formation d’un complexe SREBP/SCAP/Insig retenu dans la membrane du

RE qui empêche SREBP de jouer son rôle d’activateur de la transcription des gènes impliqués

dans la synthèse du cholestérol en inhibant son clivage.

Le 25-Hydroxycholestérol peut également inhiber le clivage de SREBP en induisant la

formation du complexe SCAP/Insig mais sans interagir directement avec SCAP. Ceci suggère

qu’une protéine non identifiée activée par le 25-HC induirait la formation du complexe

SCAP/Insig pour inhiber le clivage de SREBP. Une récente étude, qui a mis en évidence que

la protéine PGRMC1 interagit directement avec SCAP et Insig, soulève l’hypothèse selon

laquelle PGRMC1 pourrait être cette protéine. Cependant, à ce jour, aucune étude n’a été

réalisée pour déterminer le rôle de PGRMC1 dans le mécanisme de régulation de

l’homéostasie du cholestérol par la voie du 25-HC. C’est pourquoi nous nous sommes

intéressées à cette protéine et avons élaboré un projet de recherche, faisant intervenir des

expériences de photo-pontage et de siRNA, dans le but de vérifier l’intervention de PGRMC1

et de comprendre son rôle potentiel dans ce mécanisme de régulation.

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Liste des abréviations

25-HC : 25-Hydroxycholestérol

HA : Hémaglutinine

HSV : Herpès Simplex Virus

INSIG : Insulin Induced Gene

PGRMC1 : Progesterone Receptor Membrane Component 1

RE : Réticulum Endoplasmique

S1P : Sérine Protéase 1

S2P : Sérine Protéase 2

SCAP : SREBP Cleavage Activating Protein

SDS : Sodium Dodecyl Sufate

PAGE : Poly Acrylamide Gel Electrophoresis

SRE : Sterol Regulatory Element

SREBP : Sterol Regulatory Element Binding Protein

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Figure1 : Voie de biosynthèse du cholestérol. Enzymes, substrats produits, inhibiteurs des enzymes. (www.answers.com/topic/cholesterol)

I. Introduction : Le cholestérol est une molécule essentielle chez les eucaryotes supérieurs. En effet il est

l’un des constituants majeurs des membranes lipidiques et a pour fonction de diminuer la

perméabilité membranaire et d’augmenter la fluidité membranaire. De plus, le cholestérol est

le précurseur métabolique des hormones stéroïdiennes comme la progestérone et dans le foie,

le cholestérol est le précurseur de l’acide glycocholique, un composant majeur de la bile. Les

oxystérols, issus du métabolisme du cholestérol, interviennent également en tant que

régulateurs de nombreuses voies métaboliques. Les besoins quotidiens en cholestérol d’un

adultes sont d’environ un gramme et demi, et le corps trouve cet approvisionnement pour un

tiers dans l’alimentation et les deux tiers restants sont synthétisés dans le foie.

Cependant il est nécessaire pour les cellules de réguler leur concentration en cholestérol

afin de maintenir un taux physiologique n’excédant pas deux grammes de cholestérol par

millilitre de sang. En effet une trop forte concentration en cholestérol peut détruire les

fonctions des membranes cellulaires et l’accumulation de cholestérol peut conduire à la mort

cellulaire ou à une athérosclérose.

De ce fait, au cours de l’évolution les eucaryotes supérieurs ont acquis un mécanisme

qui permet de réguler cette concentration.

Ce mécanisme fait intervenir un système

de régulation en feedback qui contrôle le

niveau de cholestérol dans les membranes

cellulaires et module la transcription des

gènes codant les enzymes HMGCoA

synthase, la HMGCoA réductase,… . En

effet, ces enzymes interviennent dans la

biosynthèse du cholestérol à partir de

l’acétyl-CoA au niveau du cytosol pour la

HMG-CoA synthase et au niveau du RE

pour la HMG-CoA réductase. (figure1).

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Figure 2 : Chronologie de la découverte du complexe de régulation du cholestérol.

La compréhension de ce système de régulation s’est faite pas à pas sur près de quarante

ans, à travers les travaux de nombreuses équipes de recherche .

1) Bref historique de la découverte du système de régulation de l’homéostasie du

cholestérol :

Au cours des dernières

décennies de nombreuses études

sur le rôle, les fonctions et la

régulation du cholestérol ont

permis de mettre en évidence le

complexe de régulation du

cholestérol et d’en comprendre

le fonctionnement. En 1967, les

travaux de Chesterton (1) ont

montré que le cholestérol et ses

intermédiaires métaboliques sont

localisés dans le RE. Puis en

1988 J.B. Smith et al. (2) ont

découvert une séquence notée

SRE (Sterol Regulatory Element)

présente dans les promoteurs des gènes codant la HMG CoA synthase et la HMG CoA

réductase. Cette séquence intervient dans la régulation de la transcription de ces gènes. En

effet, si cette séquence subis des mutations on n’observe plus d’augmentation de la

transcription de ces gènes en réponse à une carence en cholestérol. Ensuite, en 1992, les

travaux de H. Stark et al. (3) ont mis en évidence l’existence d’un facteur SREBF pouvant se

fixer sur cette séquence SRE. Puis en 1993 Yokoyama C. et al.(4) ont isolé et caractérisé une

protéine qui avait la capacité de fixer cette séquence SRE, ils ont ainsi déterminé que cette

protéine possédait un domaine facteur de transcription de type Hélice-Boucle-Hélice et

induisait l’expression de la HMG-CoA synthase. Ils ont alors rebaptisé cette protéine

SREBP-1. Les travaux de Yang J. et ses collaborateurs dans Gene Development en 1994 ont

mis en évidence le clivage de la partie N-terminale de SREBP correspondant au facteur de

transcription. Ces travaux ont ensuite été complétés en 1995 par ceux de Wang X. et son

équipe (5) qui ont isolé et caractérisé la protéase responsable du clivage de SREBP-1 au

7

Figure 3: Schéma SREBP

www.erudit.org

Figure 4 : Schéma de SCAP

www.erudit.org

niveau de la boucle intraluminale. Hua X. et Al. en 1995 (6) ont ensuite démonté que ce

premier clivage était suivi d’une seconde protéolyse de SREBP. En 1996, les études de X.

Hua et al. sur des cellules CHO dont le clivage de SREBP n’était pas inhibé par une forte

concentration en stérol, ont permis de mettre en évidence l’existence d’une protéine qui

activerait le processus de clivage de SREBP. Ils ont alors nommé cette protéine SCAP

(SREBP Cleavage Activating Protein). Puis en 1997, R.B. Rawson (7) identifia la seconde

protéase S2P responsable du clivage de SREBP au niveau du premier segment

transmembranaire de SREBP. Au cour de la même année, l’équipe de Juro Sakai (8) mit en

évidence l’interaction entre SCAP et SREBP. Trois ans après, en 2000, les travaux de Yang T.

(9) ont soulevé l’hypothèse qu’une protéine du RE intervenait pour retenir SREBP dans ce

compartiment en condition de forte concentration en cholestérol. Par la suite, en 2002, la

même équipe (10) identifia cette protéine séquestrant SREBP dans le RE comme étant la

protéine Insig (une protéine résidante de la membrane du RE). En 2004, les travaux de Adams

C.M. (11) mirent en évidence une voie alternative induite par le 25-HC, permettant de réguler

le processus de clivage de SREBP.

2) Présentation des protéines impliquées dans le complexe : (12-15)

SREBP (Sterol Regulatory Element Binding Protein) est une protéine

ancrée dans la membrane du RE. L’extrémité N-terminale de SREBP est un

facteur de transcription de type hélice-boucle-hélice-leucine zipper (bHLH).

L’extrémité C-terminale est un domaine régulateur. Ces deux domaines sont

cytosoliques et reliés par deux segments transmembranaires et une boucle

intra-luminale.(Figure 3)

SCAP (SREBP Cleavage Activating Protein) est également une protéine

membranaire du RE. Elle est composée de huit segments

transmembranaires. L’extrémité C-terminale contient cinq répétitions des

acides aminés Tryptophane et Aspartate (WD). Les domaines WD sont

souvent impliqués dans les interactions protéines-protéines. Les extrémités

N-terminale et C-terminale sont toutes deux cytosoliques. (Figure 4)

INSIG (Insulin induced gene) est, elle aussi, une protéine membranaire du

RE. Elle est composée de cinq domaines transmembranaires. (Figure 5)

Figure 5 : Schéma de Insig-1

www.erudit.org

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3) Mécanisme du complexe de régulation du Cholestérol : (12-15)

Quand le taux de

cholestérol est faible, la protéine

SREBP se lie à l’extrémité N-

terminale de SCAP par son

domaine régulateur. SCAP

escorte alors SREBP du RE

jusqu’au Golgi par un transport

vésiculaire. Une fois dans la

membrane du Golgi, SREBP va

subir un clivage enzymatique par

deux protéases. La première S1P

clive SREBP au niveau de la

boucle intraluminale. Lorsque

SREBP est clivée en deux, la

deuxième protéase S2P peut agir.

Elle clive la partie N-terminale de SREBP au niveau du domaine transmembranaire.

L’extrémité N-terminale qui est un facteur de transcription est alors libérée et migre jusqu’au

noyau grâce aux Importines β. Ce facteur de transcription reconnaît les séquences SRE (Sterol

Regulatory Element) présentes dans les promoteurs des gènes codant pour des enzymes

impliquées dans la synthèse du cholestérol. Cette séquence est composée de 10 nucléotides

avec 1 ou 2 répétitions CAC mais la séquence consensus n’est pas clairement définie. La

fixation de l’extrémité N-terminale de SREBP sur une séquence SRE active la transcription

des gènes codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse de cholestérol.

Par contre lorsque le taux de cholestérol est élevé, celui-ci se fixe sur SCAP . Cette

fixation induit un changement de conformation de SCAP permettant à la protéine Insig de se

fixer sur SCAP. Insig va retenir le complexe SCAP/ SREBP dans la membrane du RE. Il y a

donc inhibition du transport de SREBP jusqu’au Golgi, du clivage de SREBP par les

protéases, de la libération du facteur de transcription et de l’activation des gènes impliqués

dans la biosynthèse du cholestérol.

Figure 6 : Mécanisme du complexe de régulation en feed-back du Cholestérol faisant intervenir les protéines SCAP et SREBP pour l’activation de la transcription des gènes impliqués dans la synthèse du cholestérol et Insig pour l’inhibition de la transcription de ces gènes. Copyright 2004. The University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas. Brown/ Goldstein Lab.

9

II. Résultats : Il existe d’autres inhibiteurs de la biosynthèse du cholestérol, notamment le 25-

Hydroxycholestérol. (Figure 7)

Le 25-Hydroxycholestérol est synthétisé à partir du cholestérol par l’enzyme cholestérol 25-

hydroxylase dans le RE et le Golgi. Il est le précurseur des acides biliaires. Longtemps utilisé

comme inhibiteur de la synthèse du cholestérol, ce n’est que récemment qu’il a été démontré

que c’est un inhibiteur du clivage de SREBP (16).

Une autre équipe s’est intéressé au 25-Hydroxycholestérol. Ils ont notamment cherché

à voir si le cholestérol et le 25-HC utilisent le même mécanisme pour inhiber l’activation de

SREBP. (17). Pour cela ils ont mis en place plusieurs expériences.

1) Le 25-HC et le Cholestérol induisent tous deux la formation du complexe SCAP/Insig.

Des cellules SDR-13 (cellules CHO SCAP déficientes) ont été transfectées avec Insig

et SREBP en présence ou en absence de SCAP. Elles ont été incubées avec du cholestérol ou

du 25-HC. Les extraits cellulaires sont soumis à une électrophorèse en condition native afin

de visualiser les complexes protéiques. Les protéines sont transférées sur membrane et

soumises à un immunoblot avec un anticorps anti-Myc dirigé contre Insig-Myc. (figure 8).

Figure 7: Le 25-Hydroxycholestérol est synthétisé à partir du cholestérol par l’enzyme cholestérol 25-hydroxylase et il est le précurseur des acides biliaires.

Figure 8 : Des cellules SDR-13A déficientes en SCAP sont transfectées avec 0,05µg de plasmide pCMV-Insig-1-Myc et 2µg de plasmide TK-HSV-SREBP-2 en présence ou absence de 1,25µg de plasmide pCMV-SCAP, comme c’est indiqué. Les cellules sont incubées en présence ou en absence de 25µM de cholestérol ou 2,5µM de 25-HC. Des aliquots de suspension membranaire de ces cellules, sont mélangés au bleu de Coomassie G250 (qui charge négativement les protéines sans les dénaturer) et sont soumis à un gel natif. Les protéines sont transférées sur membrane et soumises à un immunoblot avec un anticorps anti-Myc dirigé contre Insig-Myc.

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Dans les cellules CHO sauvages en présence de 25-HC et de cholestérol on observe la

présence d’un complexe SCAP/Insig. Ce complexe n’est pas observé en absence de 25-HC et

de cholestérol ou en absence de SCAP.

Ceci montre que le cholestérol et le 25-HC sont tous deux capables d’induire la formation du

complexe SCAP/Insig.

2) Le 25-HC n’induit pas de changement de conformation de SCAP et l’inhibition du

clivage de SREBP est dépendante de Insig-1.

Des cellules SCAP-déficientes ont été transfectées avec SCAP et SREBP en absence

ou en présence de Insig-1 puis incubées avec du cholestérol ou du 25-HC. Les fractions

nucléaires ont été analysées par immunoblot avec un Anticorps anti-SREBP. La conformation

de SCAP a été analysées par digestion à la trypsine des membranes du RE et par immunoblot

avec un anticorps anti-SCAP. En effet, lorsque SCAP est soumise à une digestion par la

Trypsine, on obtient un fragment de 37kDa alors que lorsque SCAP subit un changement de

conformation l’arginine 503, qui été masquée, est alors exposée et le clivage par la trypsine

donne un produit de 35kDa.

Comme le montre la figure 9, en absence de Insig on détecte la présence de SREBP

dans le noyau alors qu’en présence de Insig et de 25-HC ou de cholestérol on ne détecte plus

la présence de SREBP dans le noyau. Ceci montre que le 25-HC et le cholestérol inhibent le

clivage de SREBP dépendamment de la présence de Insig.

D’autre part, en présence de cholestérol on observe un fragment de SCAP à 35kDa qui

montre que le cholestérol a induit un changement de conformation de SCAP, alors qu’en

présence de 25-HC on observe un fragment de SCAP à 37kDa qui montre que le 25-HC n’a

pas induit de changement de conformation de SCAP. Ainsi, on conclue que le 25-HC n’induit

pas de changement de conformation de SCAP contrairement au cholestérol.

Figure 9 : Des cellules SDR-13A déficientes en SCAP sont transfectées avec 1,25µg de plasmide pCMV-SCAP et 2µg de plasmide TK-HSV-SREBP en présence ou absence de 0,6µg de pCMV-Insig-Myc. Les cellules sont incubées en présence ou en absence de 50µM de cholestérol ou de 25-HC. Les cellules sont lavées et on sépare les fractions membranaire et nucléaire. La fraction nucléaire est analysée par immunoblot avec un anticorps anti-HSV pour détecter l’extrémité N-terminale clivée de SREBP fusionnée à HSV. La suspension membranaire est traitée avec 2µg de trypsine (30°C 30mn) et analysée par immunoblot avec un anticorps anti-SCAP.

11

3) Le 25-HC n’interagit pas directement avec SCAP :

Des cellules SDR-13 SCAP-déficientes ont été

transfectées avec SREBP et Insig en présence ou

absence de HSV-SCAP. Elles ont été incubées avec du

cholestérol, du photo-cholestérol (Figure 10) ou du

photo-25-HC. Puis elles ont été irradiées ou non aux

UV. La fraction membranaire a été soumise à une

digestion par la Chymotrypsine puis analysée par immunoblot avec un anticorps anti-HSV.

On observe normalement un produit de digestion de 10kDa correspondant à

l’extrémité N-terminale de SCAP couplée à HSV. En présence de SCAP, l’addition de photo-

cholestérol provoque un retard de migration sur gel de ce fragment (ligne 7 figure 11). Ce

changement ne survient qu’après une irradiation aux UV et n’est pas observé avec le

cholestérol ou le 25-HC. Ceci indique que le photo-cholestérol est ponté à l’extrémité N-

terminale SCAP mais pas le photo-25-HC. On en déduit donc que le 25-HC n’interagit pas

directement avec SCAP contrairement au cholestérol.

Ces travaux ont permis de démonter que le 25-HC, comme le cholestérol inhibe le

clivage de SREBP dépendamment de Insig et induit la formation du complexe SCAP/Insig.

Cependant il n’interagit pas directement avec SCAP et n’induit de changement de

conformation de SCAP.

Cette étude a conduit à émettre l’hypothèse que le 25-HC interagirait avec une autre protéine

non identifiée dont l’activation induirait la formation du complexe SCAP/Insig pour inhiber le

clivage de SREBP.

Figure 10 : structure du photo-cholestérol avant et après activation par les UV. (31)

Figure 11 : Des cellules SDR-13A déficientes en SCAP sont transfectées ou non avec 1,25µg de plasmide TK-HSV-SCAP. Les cellules sont incubées avec du cholestérol, du photo-cholestérol ou du photo-25-HC. Elles sont irradiées ou non aux UV pendant 20mn. La suspension membranaire est incubée avec la chymotrypsine, puis analysée par immunoblot avec un anticorps anti-HSV pour détecter SCAP.

12

4) Découverte d’une nouvelle protéine interagissant avec les protéines SCAP et Insig :

PGRMC1 :

En 2005, M. Suchanek et Al.(18) ont utilisé PGRMC1 et le complexe de régulation du

cholestérol comme exemple pour démontrer l’efficacité d’une nouvelle méthode de

photopontage impliquant l’introduction d’acides aminés photo-activables dans une séquence

protéique.

Le photo-pontage est une technique qui utilise des agents photo-pontant pour former

une liaison covalente entre deux protéines qui interagissent afin de figer ces interactions sous

forme de complexe pour pouvoir les étudier. On utilise ici des photo-méthionines (Figure 12)

qui comporte un groupement diazirine greffé sur la chaîne latérale. Sous l’effet des UV, le

groupement diazirine va former un carbocation hyper-réactif qui va réagir sur les liaisons C-H

pour former une liaison covalente (Figure 13).

Dans cette étude, les auteurs ont co-exprimé PGRMC1 portant un tag hemagglutinine

(HA) et Insig portant un tag Myc dans des cellules COS7. Puis ils ont cultivé ces cellules en

présence ou en absence de Photo-methionine (figure 12) afin d’introduire des groupements

photo activables (diazirine) dans ces protéines. Après irradiation aux UV, les lysats cellulaires

obtenus ont été analysés pour détecter la présence de complexes protéiques (figure 14).

Figure 13 : schéma de la réaction du groupement diazirine sous les UV.

Figure 12 : A : structure de la méthionine. B : structure de la photo-méthionine (18)

A B

13

Figure 14 : a. Des cellules COS7 (cellules de rein du singe) ont été transfectées avec un plasmide pPGRMC1-3HA et un plasmide pInsig-9Myc. Les cellules sont cultivées en présence ou en absence de Photo-methionine puis irradiées ou non aux UV, comme indiqué. Le lysat cellulaire a ensuite été soumis à une immunoprécipitation avec des anticorps anti-HA ou anti-Myc, comme indiqué. Les protéines immunoprécipitées ont alors été soumises à un SDS-PAGE et à un western blot avec des anticorps anti-Myc ou anti-HA comme indiqué pour détecter le photo-pontage. NB : La présence de Insig non ponté à gauche indique une co-immunoprécipitation non covalente. La large bande dans les puits 3 et 4 indique une fixation des anticorps secondaires sur l’anticorps primaire. b. Des cellules COS7 ont été transfectées avec des vecteurs codant les protéines taguées indiquées. Les cellules ont été soumises à un cross-link comme précédemment. Le lysat cellulaire a ensuite été soumis à une immunoprécipitation, un SDS-PAGE puis un western bot comme dans la figure a. NB : la bande de haut poids moléculaire détectée avec un anticorps dirigé contre SCAP constitue certainement un dimère de SCAP.

Dans les colonnes 1 et 3 (figure 14a) on peut voir une bande de forte intensité au

niveau du poids moléculaire attendu pour le complexe Insig-PGRMC1. Ces résultats montrent

qu’il y a une interaction directe entre ces deux protéines in vivo. Par le même procédé (figure

14b) ils ont mis en évidence une interaction directe entre PGRMC1 et SCAP (colonne 3). Par

contre on ne voit pas d’interaction de Insig ou de SCAP avec la protéine TRP1-RE (protéine

résidante du RE qui n’a pas de relation avec le complexe de régulation du cholestérol). Ceci

montre la spécificité de l’interaction de PGRMC1 avec SCAP et Insig.

Ces travaux ont permis de montrer que PGRMC1 interagit directement avec SCAP et

Insig, ce qui suggère que PGRMC1 pourrait être la protéine qui intervient dans la régulation

de la synthèse du cholestérol induite par le 25-HC.

Cependant à ce jour aucune étude n’a été réalisée pour déterminer le rôle de PGRMC1

dans le mécanisme de régulation de l’homéostasie du cholestérol par la voie du 25-HC. Notre

projet de recherche sera donc axé sur la détermination du rôle de PGRMC1 dans ce

mécanisme.

14

III. Projet de recherche : Les résultats présentés précédemment, ont permis de mettre en évidence qu’il existe

une voie alternative de régulation du cholestérol médié par le 25-HC. De récents travaux ont

montré que PGRMC1 pouvait intervenir dans cette voie de régulation car elle interagit avec

des protéines de ce complexe de régulation. Notre projet de recherche sera donc centré sur la

protéine PGRMC1 et son rôle dans la régulation du cholestérol.

1) Présentation de PGRMC1 :

PGRMC1 (Progesterone Receptor Membrane Component 1) est un récepteur

membranaire de la progestérone, de la famille des MAPR (Membrane Associated

Progesterone binding Proteins). C’est une protéine de 28 kDa, composée d’une courte

extrémité N-terminale extracellulaire, d’un seul domaine transmembranaire et un domaine

cytoplasmique. Ce dernier présente plusieurs domaines putatifs SH2 (Src homology domain)

qui reconnaissent les tyrosines phosphorylées et SH3 qui reconnaissent les ligands riches en

prolines. Ces domaines confèrent à PGRMC1 la capacité d’activer certaines voies de

signalisation. Elle possède également un domaine de fixation à la progestérone qui présente

une grande homologie avec les domaines de fixation à l’hème. (19)

PGRMC1 est surtout connue pour son rôle dans l’effet anti-apoptotique de la

progestérone. En effet, l’action anti-apoptotique de la progestérone est médiée par un

complexe de deux récepteurs membranaires : PGRMC1 et PAIRBP1.(20)

D’autre part, PGRMC1 présente 98% d’homologie avec l’antigène IZA du rat qui

semble être impliqué dans la régulation du métabolisme de la progestérone. En effet, lorsque

l’antigène IZA est surexprimé, on observe une augmentation de la 21-hydroxylation de la

progestérone (21).

A l’heure actuelle nous ne disposons pas d’information sur le rôle potentiel de

PGRMC1 dans la régulation de la synthèse de cholestérol. C’est pourquoi nous avons

envisagé plusieurs expériences, afin de comprendre le rôle de PGRMC1 dans cette voie de

régulation.

15

Nous essayerons notamment de répondre aux questions suivantes:

Le 25-HC interagit-il directement avec PGRMC1 ?

Y a t-il formation d’un complexe multiprotéique PGRMC1/SCAP/Insig ?

PGRMC1 intervient-elle dans l’inhibition du clivage de SREBP ?

2) Modèle d’étude

Pour les différentes expériences que mettrons en place nous utiliserons des cellules

COS7, qui sont des cellules rénales de singe, car ce sont les cellules qui ont été utilisées dans

les études présentées précédemment.

Ces cellules seront transfectées avec des plasmides contenant les gènes codant pour les

protéines taguées dont nous aurons besoin. Nous avons choisi de faire des transcriptions

transitoires car la plupart de nos expériences se font sur de courtes durées et ne nécessitent pas

de transfections stables. Pour cela nous utiliserons les vecteurs qui ont été utilisées dans les

études citées précédemment (17, 18). Les constructions A,B,C,D (figure 15) ont été clonées

dans des vecteurs pcDNA3.1Hygro(+) (carte du vecteur en annexe). Les cellules COS7 seront

transfectés avec ces vecteurs par la Lipofectamine 2000 d’Invitrogen.

3) PGRMC1 intervient-elle dans l’inhibition du clivage de SREBP ?

On suppose qu’en présence de 25-HC et de PGRMC1, le complexe de régulation du

cholestérol inhibe le clivage de SREBP, pour inhiber l’expression des gènes impliqués dans la

synthèse de cholestérol. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons élaboré une stratégie

basée sur l’extinction de PGRMC1 par siRNA et la recherche de la forme clivée de SREBP

Figure 15 : schéma des constructions plasmidiques qui seront transfectées de façon transitoire dans les cellules COS7. Les plasmides A, B, C seront demandés à l’équipe de M. Suchanek (18) et le plasmide D sera demandé à l’équipe de C. Adams (17).

PGRMC1 HA X3

SCAP Flag

Insig Myc X9

SREBPHSV

A

D

C

B

16

dans le noyau par western blot. Un gène rapporteur sous le contrôle de SRE nous permettra

également de voir s’il y a inhibition de l’activation de la transcription ( figure 22).

A. Transfection stable des cellules COS7 :

Nous réaliserons une transfection stable des cellules COS7 avec le gène codant pour

la Luciférase sous le contrôle de la séquence SRE répétées six fois. Ces cellules nous

permettrons de tester l’activation de la transcription du gène rapporteur de la Luciférase sous

le contrôle de la séquence SRE. Nous avons choisi de faire une transfection stable car cela

nous permettra d’obtenir une lignée cellulaire stable qui pourra être utilisée dans des études

ultérieures. La construction présentée dans la figure 21 sera clonée dans le vecteur

pcDNA3.1Hygro(+). Ces vecteurs seront linéarisés afin d’augmenter l’efficacité de la

transfection. De plus, le plasmide linéarisé ne pourra pas se répliquer donc la pression de

sélection nous permettra de sélectionner uniquement les cellules qui auront intégré le vecteur

dans leur génome. Ces vecteurs seront alors transfectés par la Lipofectamine 2000

d’Invitrogen. La sélection par l’Hygromycine nous permettra à long terme de sélectionner les

cellules ayant intégré le plasmide par recombinaison hétérologue.

B. Extinction de PGRMC1 :

Tout d’abord PGRMC1 sera produite dans E.Coli puis sera purifiée afin de faire

synthétiser des anticorps dirigés contre cette protéine par la société P.A.R.I.S. En parallèle,

nous ferons synthétiser les siRNA dirigés contre les ARNs messagers de PGRMC1 par

INVITROGEN.

Ensuite nous transfecterons les cellules exprimant la luciférase sous le contrôle des

séquences SRE, avec le plasmide codant HSV-SREBP et avec les siRNAs. On devra alors

vérifier qu’on n’a plus l’expression de PGRMC1 grâce à un western blot avec les anticorps

dirigés contre PGRMC1.

C. Expérience :

LucSRE X6

Figure 21 : schéma de la construction plasmidique avec laquelle nous transfecterons de façon stable les cellules COS7

17

On pourra alors cultiver ces cellules en présence ou non de 25-HC pendant six heures

à l’issue desquelles on réalisera un fractionnement cellulaire. Puis on analysera la fraction

nucléaire pour détecter la présence ou non de la partie N-terminal de SRBEP par

l’intermédiaire d’un western blot avec l’anticorps dirigé contre HSV. En parallèle, le test avec

la luciférase sur un autre échantillon nous permettra d’observer ou non l’inhibition de la

transcription des gènes sous le contrôle des séquences SRE.

Si on ne détecte pas la forme clivée de SREBP sur le western blot dans la fraction

nucléaire issue de la culture en présence de 25-HC, cela signifiera que le clivage de SREBP a

été inhibé en absence de PGRMC1. Dans ce cas là, PGRMC1 ne serait pas la protéine qui

inhibe le processus de clivage de SREBP induit par le 25-HC.

De la même façon, si le test avec la luciférase est négatif en présence de 25-HC, cela

signifiera que PGRMC1 n’est pas la protéine qui inhibe le processus de clivage de SREBP

induit par le 25-HC.

Cellules COS7 transfectées avec le plasmide SREBP-HSV

siRNA dirigés contre PGRMC1 transfectés dans les cellules Contrôle: cellules transfectées avec siRNA non spécifique

Transfection d’un plasmide contenant le gène rapporteur Luciférase sous le contrôle de la séquence activatrice SRE (X6)

Cellules cultivées en présence de 25-HC ou non

Fractionnement cellulaire pour séparer le noyau et le cytoplasme Western blot avec anticorps anti-HSV pour voir si on a la forme clivée de SREBP dans le noyau.

Test avec la Luciférase pour voir s’il y a activation de la transcription des gènes sous le contrôle de SRE.

Figure 22 : schéma du plan de l’expérience pour mettre en évidence l’intervention de PGRMC1 dans l’inhibition du clivage de SREBP.

18

4) Le 25-HC interagit-il directement avec PGRMC1 ?

Les travaux de M. Suchanek et al. suggèrent que PGRMC1 pourrait être la protéine

qui intervient dans la régulation de la synthèse du cholestérol induite par le 25-HC. On

voudrait donc déterminer s’il existe une interaction directe entre le 25-HC et PGRMC1. Pour

cela, nous utiliserons du 25-HC photo activable et radioactif pour qu’il soit photo-ponté à

PGRMC1 s’il interagit avec elle. Après purification du complexe par co-immunoprécipitation

la radioactivité nous permettra de voir si le 25-HC interagit avec PGRMC1.

A. Production du photo-25-HC radioactif :

En 2000, l’équipe de C. Thiele (22) a produit du

cholestérol photo-activable et radioactif (figure 16).

Le photo-cholestérol a été obtenu par conversion du 6-

keto-5a-cholestan-3b-ol en 6-azi-5a-cholestan-3b-ol.

Puis il a été rendu radioactif par oxydation avec de

l’acide chromique et réduction avec du [3H]NaBH4.

Nous demanderons donc à l’équipe de CM. Adams s’ils peuvent nous fournir du photo-25-HC

et nous le rendrons radioactif en utilisant la méthode de l’équipe de Thiele (Figure 17).

B. Expérience :

L’expérience réalisée (figure 18) pour savoir si le 25-HC interagit directement avec

PGRMC1 consiste à transfecter les cellules COS7 avec le plasmide contenant le gène codant

pour la protéine PGRMC1 fusionnée au tag HSV. Ces cellules seront cultivées en présence de

photo-25-HC radioactif. Elles seront ensuite irradiées aux UV afin d’induire le photo-pontage

puis lysées. Nous réaliserons alors une co-immunoprécipitation avec l’anticorps anti-HSV sur

le lysat cellulaire afin de purifier PGRMC1. Les protéines ainsi purifiées seront soumises à un

Figure 16 : schéma du cholestérol photo-activable et radioactif.

OH

Photo-25-HC

OH

[3H]Photo-25-HC

1) H2CrO4

2) [3H]NaBH4

Figure 17 : schéma de la réaction permettant de transformer le photo-25-HC en photo-25-HC radioactif.

19

SDS-PAGE, puis transférées sur une membrane de nitrocellulose. Cette membrane sera

autoradiographiée afin de visualiser la radioactivité. En effet, si on voit de la radioactivité sur

la bande correspondant au poids moléculaire de PGRMC1 cela signifiera que le photo-25-HC

radioactif est photo-ponté à PGRMC1 et donc qu’il y a une interaction directe entre

PGRMC1 et le 25-HC.

5) Y a t-il formation d’un complexe multiprotéique PGRMC1/SCAP/Insig ?

Les études de M. Suchanek et al.(18), ont mis en évidence une interaction directe entre

Insig1 et PGRMC1 et entre PGRMC1 et SCAP.

Cependant, ils ne sont pas parvenu à démontrer la formation d’un complexe multiprotéique

composé de ces trois protéines. Nous avons donc imaginé une série d’expériences qui nous

permettrait de mettre en évidence l’existence d’un tel complexe (Figure 19).

La stratégie consiste à incorporer des acides aminés photo-activables dans la séquence

primaire des trois protéines afin fixer le complexe par un photo-pontage après une exposition

Cellules COS7 transfectées avec PGRMC1-

culture en présence de photo-25-HC-radioactif

Photo-pontage par irradiation aux UV pendant 20 min

SDS-PAGE, Transfert sur membrane, autoradiographie

2. + Ac anti-HSV

3. + billes couplées à la protéine A

4. centrifugation 5. lavage 6. Western blot 1. Lysat cellulaire

Lyse cellulaire et co-immunoprécipitation avec Ac anti-HSV

Figure 18 : schéma du protocole de l’expérience de photo-pontage avec le photo-25-HC.

20

aux UV. Puis, suite à une purification par co-immunoprécipitation, un western blot nous

permettra d’identifier chaque partenaire du complexe multiprotéique isolé.

Dans un premier temps, on transfectera les cellules avec les constructions présentées

dans la figure 15, permettant d’exprimer les protéines PGRMC1, SCAP et Insig taguées. Puis

on incubera ces cellules dans un milieu contenant des photométhionines (demandées à

l’équipe de Adams C.M.) et du 25-HC. On induira ensuite le photo-pontage en irradiant les

cellules aux UV. Après une lyse cellulaire (Figure 20), on effectuera d’abord trois co-

immunoprécipitations séparément avec les anticorps dirigés contre chacun des tags utilisés.

Une digestion à la papaïne nous permettra de couper la partie Fc de l’anticorps. Une

centrifugation culottera les billes couplées aux protéines A complexées à la partie Fc des

Transfection des cellules COS7 avec PGRMC1 SCAP Insig1 et culture des cellules dans un milieu + photo-méthionines à 1,7mM + 25-HC 25µM

Photo-pontage irradiation aux UV 20min à 20°C. Puis lyse cellulaire

Coupure enzymatique à la papaïne au niveau de la fraction Fc des anticorps

Co-immunoprécipitation avec chacun des 3 Anticorps

Figure 19 : schéma du plan de l’expérience pour mettre en évidence le complexe multiprotéique PGRMC1/SCAP/Insig

bille

Papaïne

A

Western blotCo-IP

1 2 3 M Co-IP

1 2 3 M Co-IP

1 2 3 M

21

anticorps. Les surnagents, contenant les complexes d’intérêt liés aux parties Fab des anticorps,

seront soumis à un SDS-PAGE (5%-15%). Après transfert sur membrane, les complexes

seront détectés par trois immunoblots avec les trois anticorps dirigés contre chacun des tags

utilisés. Le complexe PGRMC1/SCAP/Insig est attendu à une taille de 207kDa. Ceci nous

permettra de mettre en évidence la présence du complexe PGRMC1/SCAP/Insig.

IV. Conclusions :

Le cholestérol est un constituant majeur des membranes lipidiques des cellules

eucaryotes et le précurseur de nombreuses hormones stéroïdiennes. Cependant, il est

nécessaire pour les cellules de réguler leur concentration en cholestérol à un taux

physiologique car une trop forte concentration en cholestérol peut conduire à la mort

cellulaire ou à une athérosclérose. La synthèse de cholestérol est régulée grâce à un contrôle

en feedback par le cholestérol. Ce complexe de régulation fait intervenir les protéines SREBP,

SCAP et Insig.

Cependant les oxystérols, comme le 25-Hydroxycholestérol peuvent également réguler

l’homéostasie du cholestérol. La voie du 25-HC a été étudiée et en partie décrite par l’équipe

de C. Adams. Ils ont mis en évidence que le 25-HC régule la synthèse de cholestérol par

l’inhibition du clivage de SREBP en induisant la formation du complexe SCAP/Insig.

Cependant le 25-HC n’interagit pas directement avec SCAP et n’induit de changement de

conformation de SCAP. Cette étude a conduit à émettre l’hypothèse que le 25-HC interagirait

Lyse cellulaire

Co-IP avec l’Ac anti-Myc

Co-IP avec l’Ac anti-Flag

Co-IP avec l’Ac anti-HA

Digestion enzymatique à la papaïne, SDS-PAGE, transfert sur membrane

Détection avec Ac anti-Flag

Détection avec Ac anti-HA

Détection avecAc anti-Myc

Figure 20 : Récapitulatif des expériences de co-immunoprécipitation et western blot.

Détection avec Ac anti-Flag

Détection avec Ac anti-HA

Détection avecAc anti-Myc

Détection avec Ac anti-Flag

Détection avec Ac anti-HA

Détection avecAc anti-Myc

22

avec une autre protéine non identifiée dont l’activation induirait la formation du complexe

SCAP/Insig pour inhiber le clivage de SREBP.

Une autre étude a mis en évidence que la protéine PGRMC1 interagit directement avec

SCAP et Insig, suggérant que PGRMC1 pourrait être la protéine qui intervient dans la

régulation de la synthèse du cholestérol induite par le 25-HC. Cependant, à ce jour, aucune

étude n’a été réalisée pour déterminer le rôle de PGRMC1 dans le mécanisme de régulation de

l’homéostasie du cholestérol par la voie du 25-HC. C’est pourquoi nous nous sommes

intéressées à cette protéine et avons élaboré un projet de recherche dans le but de comprendre

le rôle potentiel de PGRMC1 dans ce mécanisme.

L’expérience consistant à éteindre le gène codant pour PGRMC1 par siRNA

confirmera ou non l’implication de PGRMC1 dans la régulation du cholestérol par le 25-HC.

L’expérience du photo-pontage avec le 25-HC photo-activable et radioactif nous permettra de

déterminer si le 25-HC interagit directement avec PGRMC1. La dernière expérience de photo-

pontage avec l’incorporation d’acides aminés photo-activables dans les protéines SCAP,

PGRMC1 et Insig, nous permettra de montrer si un complexe tri-protéique

PGRMC1/Insig/SCAP se forme dans la cellule en présence de 25-HC.La mise en place de ces

expériences nécessitera une coopération avec les équipes ayant déjà travaillé sur ce

complexe.

A l’heure actuelle les traitements pour lutter contre l’hypercholestérolémie comme les

statines, les résines ou les fibrates, nécessitent une prise conjuguée et provoquent de

nombreux effets secondaires. Ces contraintes aboutissent souvent à l’arrêt prématuré du

traitement. De plus, l’hypercholestérolémie est bien souvent indépendante de l’hygiène de vie

mais plutôt liée à des anomalies génétiques au niveau des constituants du métabolisme du

cholestérol. C’est pourquoi il est important de bien connaître toutes les voies de régulations du

cholestérol afin de développer des traitements mieux adaptés.

Les nouvelles informations, apportées par ce projet de recherche sur la régulation de la

synthèse de cholestérol induite par le 25-HC, permettront de mieux comprendre cette voie de

régulation et conduiront peut-être à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

23

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Annexe

Carte du vecteur pcDNA3.1Hygro