Septièmes Journées Scientifiques du Réseau Français de

Métabolomique et Fluxomique

10-12 Juin 2013

Université de Picardie Jules Verne

UFR des Sciences

Le Comité d'Organisation

Comité Local UPJV

Rebecca Dauwe, Véronique Dulin, Redouan Elboutachfaiti, Ophélie Fliniaux, Jean-Xavier Fontaine,

Eric Gontier, Nathalie Julian, Jean Claude Laberche, Michelle Lequart, François Mesnard,

Roland Molinié, Paulo Marcello, Thi Khieu Oanh Nguyen, Gabrielle Oria, Corinne Pau-Roblot,

Emmanuel Petit, Maryse Poiret, Anthony Quéro, Séverine Schiltz

Comité National INRA Bordeaux

Catherine Deborde, Muriel Gauthier, Alain Girard, Florence Lartigaut, Marie-Lou Lombard,

Dominique Rolin

Le Comité Scientifique

Comité Local

Rebecca Dauwe, Ophélie Fliniaux, Jean-Xavier Fontaine,

Eric Gontier, François Mesnard, Roland Molinié, Emmanuel Petit BIOPI UPJV - Amiens

Isabelle Gosselin, Albrecht Roscher, Catherine Sarazin,

Brigitte Thomasset GEC-CNRS, UTC-UPJV - Compiègne-Amiens

Eric Grand, José Kovensky LG-CNRS UPJV - Amiens

Paulo Marcello ICAP UPJV - Amiens

Christophe Clément SFR Condorcet et URVVC, URCA - Reims

David Gagneul, Simon Hawkins, Jean-Louis Hilbert SADV USTL - Lille

Conseil d'Administration du RFMF

Serge Akoka CEISAM, Nantes Fabien Jourdan UMR Toxalim - Toulouse

Alain Bouchereau Corsaire Biogenouest & UMR

Igepp, Le Rheu Christophe Junot DSV/iBiTec-S/SPI CEA Saclay

Frédérique Courant Laberca, Nantes Marie-Lou Lombard UMR1332 BFP - Bordeaux

Catherine Deborde

Dominique Rolin PF Métabolome Bordeaux &

UMR1332 BFP - Bordeaux Jean-Charles Martin Biomet NORT - Marseille

Eric Gontier BIOPI UPJV - Amiens Estelle Pujos-Guillot PFEM Clermont-Ferrand

2

Partenaires des Septièmes Journées Scientifiques

Institut national de la recherche

agronomique

147 rue de l'Université

F-75338 Paris Cedex 07

Site web: http://www.inra.fr/

Département Biologie et Amélioration des

Plantes

Université de Picardie Jules Verne

Chemin du Thil

F-80000 Amiens

Site web: http://www.u-picardie.fr/

SFR Condorcet - Agro-Sciences,

Environnement et Développement Durable

FR CNRS n° 3417

GIS IBiSA

Site web: http://www.ibisa.net/

Conseil Régional de Picardie

11 Mail Albert 1er

F-80026 Amiens Cedex 1

Site web: http://www.picardie.fr/

3

Amiens Métropole

BP 2720

F-80027 Amiens Cedex

Site web : http://www.amiens.fr/

Bruker BioSpin S.A.

34, rue de l'industrie - BP 10002

F-67166 Wissembourg cedex

Site web : http://www.bruker.fr

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ina

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AGILENT TECHNOLOGIES

33 rue du Dr Georges Levy

Parc/Club du moulin à vent

69693 Vénissieux

Site web : http://www.agilent.com

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D +

Sém

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Thermo Fisher Scientific

16 avenue du Québec - Silic 765

Villebon-sur-Yvette

F-91963 Courtaboeuf cedex

Site web : http://www.thermoscientific.com/

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D +

Sém

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Waters

5 rue Jacques Monod

F-78280 Guyancourt

Site web : http://www.waters.com/

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D +

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AB SCIEX

Parc Technopolis - Bâtiment Sigma

3 avenue du Canada

F-91940 Les Ulis

Site web : http://www.absciex.com/

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D +

Sém

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Advanced Chemistry Development

(ACD/Labs)

3 quai Kléber, Tour Sébastopol,

F-67000 Strasbourg

Site web: http://www.acdlabs.com/home/

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AN

D +

Sém

ina

ire

LECO France

ZAC Les Doucettes

22 avenue des Morillons

BP 70074

F-95144 Garges-Les-Gonesse cedex

Site web: http://www.lecofrance.com/

ST

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Euriso-Top

Parc des Algorithmes ,Bâtiment Homère

Route de l'Orme

F-91194 Saint Aubin

Site web: http://www.eurisotop.com/

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SIGMA PLUS

6 rue Collange

F-92300 Levallois-Perret

Site web: http://www.sigmaplus.fr

ST

AN

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5

Séminaires industriels des 7èmes JS RFMF

Séminaire Bruker - Mardi 11 juin Amphi Ehresmann 12h45-13h15

Bruker : outils et développements récents pour les applications en métabolomique

M. Assemat et Mme Jourdain, Bruker France

Séminaire WATERS - Mardi 11 juin Amphi Ehresmann 13h20-13h50

Development of a Metabolomic/Lipidomic Platform Based on a Hybrid Quadrupole Time-Of-

Flight (QTof) Ion-Mobility Mass Spectrometer.

José Portela, MS Sales Specialist, Waters Corporation, Saint-Quentin-en-Yvelines cedex

(France), jose_portela@waters.com

Metabolomics/Lipidomics represents a paradigm shift in metabolic research, away from approaches

that focus on a limited number of enzymatic reactions or single pathways, to approaches that

attempt to capture the complexity of metabolic networks. Additionally, the high-throughput nature

of metabolomics makes it ideal to perform biomarker screens for diseases or follow drug efficacy.

Mass spectrometry is highly discriminatory for a large range of pathological processes which makes

it the principal tool for metabolomics studies.

Recent technological advances in high resolution mass spectrometry and informatics, which

combine chromatogram and ion-mobilty alignment (HDMSETM), possesses clear analytical

advantages and are specifically designed to address the new challenges of very complex samples in

metabolomic/lipidomic.

This acquisition and processing strategy provides a 100% duty-cycle accurate mass analysis of all

detectable parent and product ion informations in a complex mixture. The exact mass information

obtained provides an information rich dataset with more definitive descriptors of the molecules.

We will illustrate the utility of both the hardware (Synapt G2-S HDMSTM

) and software

(TransomicsTM

) developed for metabolomics/lipidomic work-flow analysis in this talk with real

application examples.

6

Séminaire Agilent Technologies - Mardi 11 juin Amphi Parmentier 12h45-13h15

Les Solutions Agilent technologies en Métabolomique

Luc ARNAUD

Agilent metabolomics solutions are designed to address two major approaches:

Discovery Metabolomics involves acquisition of data in an untargeted mode, in which all

metabolites are detected to determine those that are significantly different between

experimental and control conditions.

Agilent has developed sophisticated tools for untargeted or "targeted" data mining, and these

metabolites are annotated and identified using Agilent's custom metabolite databases and

spectral libraries. The identified metabolites are then mapped onto biological pathways.

Quantitative Metabolomics is hypothesis driven. It may be used to confirm results from a

previous discovery based metabolomic profiling experiment or based on results from a

genomics and/or proteomics study. Typically a large number of samples is needed to

validate a few targets and has the advantage of absolute quantitation using analytical

standards.

Due to the diverse requirements of the systems studied, the chemical diversity of metabolites, and

their wide variation in abundance, metabolomics research usually requires multiple techniques –

GCMS, LCMS, CEMS, NMR.

Séminaire Thermo Scientific - Mardi 11 juin Amphi Parmentier 13h20-13h50

Nouvelle génération de spectromètres de masse ultra performants pour les analyses métabolomiques globales et ciblées.

Claire Dauly, Thermo Scientific, France

7

Séminaire ABSCIEX - Mercredi 12 juin Amphi Ehresmann 12h45-13h15

Targeted and Untargeted Metabolomics - Using TripleTOF® 5600+ System Technology

Baljit Ubhi

AB SCIEX UK Limited, Warrington, UK

baljit.ubhi@absciex.com

The metabolome is difficult to characterize; there is a wide dynamic range of concentrations of

metabolites, which are chemically and structurally diverse with various polarities and sizes.

Creating a single analytical method for all these components is challenging. With global profiling

techniques, the aim is to detect and quantify as many metabolites as possible. Once features of

interest are identified they need to be quantified. Information dependent acquisition (IDA)

provides useful MS/MS information, based on the user selected criteria to prioritize candidates for

fragmentation. Both the TripleTOF® 4600 and TripleTOF® 5600+ systems are capable of delivering

high resolution, quantitative, accurate mass data with high acquisition rates, enabling MS and

MS/MS information to be acquired in a single acquisition. Speed is crucial to the workflow,

enabling MS/MS information to be collected for as many features as possible, providing a

quant/qual workflow on one system!

Séminaire ACD/Labs - Mercredi 12 juin Amphi Parmentier 12h45-13h15

Création d’une base de données de référence RMN et MS sur la base de données expérimentales.

Yves Lorrain, ACD-Labs, France

8

Réseau Français de Métabolomique et Fluxomique 7

èmes Journées Scientifiques - 10 au 12 juin 2013

Université de Picardie Jules Verne, UFR des Sciences,

33 rue Saint Leu, Amiens

Programme

Lundi 10 juin 2013

10h00 –12h00 Atelier « Initiation au traitement de données de métabolomique obtenues par RMN»

Animateurs : Roland Molinié, Jean-Xavier Fontaine. Salle informatique.

13h00 –14h00 Accueil des participants – Buffet

14h00 – 14h10 Allocution de Bienvenue – Amphi Baudelocque

Mohammed Benlahssen, Directeur de l'UFR des Sciences, Université de Picardie Jules Verne

14h10 – 14h20 Allocution de Bienvenue.

Michel Brazier, Président de l'Université de Picardie Jules Verne

14h20 - 14h30 Introduction aux Journées.

Eric Gontier, représentant le Comité local d’organisation des 7 JS RFMF, et Dominique Rolin président du RFMF.

14h30 –15h15 Conférence Plénière invitée 1 Chairwoman : Frédérique Courant, Nantes, France

14h30 –15h15 Analyzing metabolomics data: univariate, multivariate or simplivariate?

Age Smilde, Amsterdam, Pays-Bas O1

15h20 –15h40 Session «Développements technologiques en bioinformatique / traitements statistiques» Chairman : François Mesnard, Amiens, France

15h20 –15h35 Vers une automatisation de l’analyse des données et de l’identification

de métabolites candidats biomarqueurs dans le cadre des études métabolomiques. Sylvain Chéreau, Nantes, France O2

9

15h40 Session Flash 1 (Présentations de 5 minutes (2-3 diapos) faites par les participants sur la base de leur poster.)

Chairman : François Mesnard, Amiens, France

15h40 Analyse métabolomique des composés participant à la symbiose

Frankia-Alnus. Anne-Emmanuelle Hay-de Bettignies, Villeurbanne, France. F1-P1

15h45 Complementarity of NMR and MS methods in metabolome analysis of

dairy cows’ urine. Hamid Boudra, Saint-Genès-Champanelle, France. F2-P2

15h50 Bruker : outils et développements récents pour les applications en

métabolomique Olivier Assemat et Sabine Jourdain, Bruker, France F3

15h55 –16h35 Session «Développements technologiques en bioinformatique /

traitements statistiques» 1 Chairman : François Mesnard, Amiens, France

15h55 –16h10 ERVA: a novel method of binning, allowing chemical information to be

highlighted, from 1H-NMR metabolomics data. Daniel Jacob, Villenave d'Ornon, France O3

16h15 –16h30 A toolbox using the R environment to explore NMR metabolomic data

sets. Stéphane Balayssac, Toulouse, France O4

16h35 –17h05 PAUSE - Echanges informels

17h05 –17h25 Session «Développements technologiques en bioinformatique / traitements statistiques» 2 Chairman : Fabien Jourdan, Toulouse, France

17h05 –17h20 Vers une Galaxy Métabolomique ?

Pierre Péricard, Roscoff, Estelle Pujos, Saint-Genès Champanelle, France O5

17h25 Session Flash 2 (Présentations de 5 minutes (2-3 diapos) faites par les participants sur la base de leur poster.)

Chairman : Fabien Jourdan, Toulouse, France

17h25 Evaluation des conséquences métaboliques de deux régimes

alimentaires chez la truite arc-en-ciel par une approche métabolomique. Blandine Madji Hounoum, Saint Pée-sur-Nivelle, France F4-P4

17h30 Caractérisation du réseau métabolique de la micro-algue

Chlamydomonas reinhardtii en conditions photo-autotrophe par métabolomique et analyse des flux en marquage instationnaire. Edern Cahoreau, Toulouse, France F5-P5

10

17h35 Les Solutions Agilent technologies en Métabolomique. Luc Arnaud, Les Ullis, France F6

17h40 – 18h20 Session «Développements méthodologiques en métabolomique, fluxomique, lipidomique, adductomique» Chairman : Serge Akoka, Nantes, France

17h40 – 17h55 Spatially-encoded 2D NMR strategies for fast quantitative

metabolomics. Illa Téa, Nantes, France O6

18h00 – 18h15 Caractérisation rapide du xénométabolome par spectrométrie de masse à très haute résolution combinée à un filtre de défaut de masse. Estelle Rathahao-Paris, Paris, France O7

18h20 Session Flash 3 (Présentations de 5 minutes (2-3 diapos) faites par les participants sur la base de leur poster.)

Chairman : Serge Akoka, Nantes, France

18h20 NMR-based metabolomics profiling for identification of bevacizumab

effect on U87 cells. Philippe Savarin, Paris, France F7-P7

18h25 Création d’une base de données de référence RMN et MS sur la base

de données expérimentales. Yves Lorrain, ACD-Labs, Strasbourg, France F8

18h30 – 19h10 Session «Développements méthodologiques en métabolomique,

fluxomique, lipidomique, adductomique» (2) Chairwoman : Estelle Pujos, Clermont- Ferrand, France

18h30 – 18h45 Le développement de méthode d’empreintes métabolomiques à haut

débit et à ultra haute résolution pour le phénotypage métabolique et l’identification structurale de biomarqueurs. Baiyi Xue, Paris, France O8

18h50 – 19h05 Evaluation of a metabolic profiling strategy using liquid

chromatography LTQ Orbitrap mass spectrometry for the metabolic characterization of Isatis tinctoria L. leaf extracts. Rebecca Dauwe, Amiens, France O9

19h30 Cocktail d'accueil

Cocktail d'accueil au Logis du Roy, Passage du Logis du Roy, Amiens

19h30 – 20h30 : Réunion du Conseil d’Administration du RFMF (réservée aux membres du Conseil d’Administration)

11

Mardi 11 juin 2013

8h30 Session « Applications de la métabolomique/fluxomique Environnement & Microbiologie » 1

Session parallèle A – Amphi Baudelocque

8h30 –9h50 Session « Environnement»

Chairman : Christophe Clément, Reims, France

8h30 – 8h45 Analyse métabolomique des miels par spectrométrie de masse:

caractérisation chimique et détection de polluants. Jérôme Cotton, Gif-sur-Yvette, France. O10

8h50 – 9h05 Analyse métabolomique de la symbiose entre le puceron

Acyrthosiphon pisum et la bactérie Buchnera aphidicola Marjolaine Rey, Lyon, France O11

9h10 – 9h25 Développement d’une méthode d’extraction et d’analyse du

métabolome de coraux scléractiniaires. Fahoullia Mohamadi, Perpignan, France O12

9h30 – 9h45 Application of both targeted and untargeted metabolomics approaches

to assess potential biological effects of simulated sonar signals on bottlenose dolphins. Gregory Genta-Jouve, Birmingham, Royaume-Uni O13

Session parallèle B – Amphi Parmentier

8h30 –9h50 Session « Microbiologie»

Chairwoman : Catherine Sarazin, Amiens, France

8h30 – 8h45 Rôle de la régulation post-transcriptionnelle dans le contrôle du

métabolisme carboné. Jean-Charles Portais, Toulouse, France. O14

8h50 – 9h05 Metabolomic study of the metabolites induction dynamics during

fungal co-culture. Samuel Bertrand, Lausanne, Suisse. O15

9h10 – 9h25 Towards the development of metabolomics for marine micro-

organisms compounds discovery. Yann Guitton, Nantes, France O16

9h30 – 9h45 Identification par spectrométrie de masse à haute résolution d’un nouveau métabolite chez la bactérie du sol aérobie stricte Acinetobacter baylyi ADP1. Lucille Stuani, Evry, France O17

12

9h50 Session Flash 4 - Amphi Baudelocque (Présentations de 5 minutes (2-3 diapos) faites par les participants sur la base de leur poster.)

Chairman : Christophe Clément, Reims, France

9h50 Characterization of proanthocyanidins, adaptation and development of

methodology applied to polyphenols in cranberry. David Renaud, Rennes, France F9-P9

9h55 Développement de techniques de préconcentration pour faciliter

l’identification de biomarqueurs lors d’analyses métabolomiques. Nicolas Dalle, France F10-P10

10h00 Development of a Metabolomic/Lipidomic Platform Based on a Hybrid

Quadrupole Time-Of-Flight (QTof) Ion-Mobility Mass Spectrometer. José Portela, Waters, Saint-Quentin-en-Yvelines, France F11

10h05 -10h35 PAUSE - Echanges informels 10h35 –11h15 Session « Fluxomique» Amphi Baudelocque

Chairwoman : Brigitte Thomasset, Compiègne, France

10h35 – 10h55 Understanding fatty acid synthesis in developing linseed embryos using metabolic flux analysis. Sébastien Acket, Compiègne, France O18

11h00 – 11h15 13 C-based metabolic flux analysis as a tool to unravel mechanisms

involved in oil accumulation in maize embryos. Mohamed Koubaa, Columbus, USA O19

11h20 Session Flash 5 - Amphi Baudelocque (Présentations de 5 minutes (2-3 diapos) faites par les participants sur la base de leur poster.)

Chairwoman : Brigitte Thomasset, Compiègne, France

11h20 Signal processing and data analysis for non-targeted detection of

unknown contaminants in food. Natacha Lenuzza, Gif-sur-Yvette, France F12-P12

11h25 Nouveaux outils pour l’implémentation et l’utilisation de la RMN 2D

ultrarapide. Patrick Giraudeau, Nantes, France F13-P13

11h30 Nouvelle génération de spectromètres de masse ultra performants

pour les analyses métabolomiques globales et ciblées. Claire Dauly, Thermo Scientific, France F14

13

11h35 Session « Applications de la métabolomique/fluxomique Agroressources & Santé » 1

Session parallèle A – Amphi Baudelocque

11h35 –11h55 Session « Agroressources»

Chairman : Jean Louis Hilbert, Lille, France

11h35 – 11h50 Du raisin au vin de Champagne : Impact de la pourriture grise sur le métabolome. Clara Cilindre, Reims, France O20

Session parallèle B – Amphi Parmentier

11h35 –11h55 Session « Santé»

Chairwoman : Frédérique Courant, Nantes, France

11h35 – 11h50 Extension du profilage urinaire des stéroïdes par une approche stéroïdomique pour le dépistage anti-dopage. Julien Boccard, Lausanne, Suisse. O21

12h00 –14h00 BUFFET - REPAS

12h45 –13h50 Sessions Industrielles en parallèle 1

Session parallèle A – Amphi Ehresmann Chairman Roland Molinié, Amiens, France

12h45 – 13h15 Bruker : outils et développements récents pour les applications

en métabolomique Olivier Assemat et Sabine Jourdain, Bruker, Wissembourg, France. F3

13h20 – 13h50 Development of a Metabolomic/Lipidomic Platform Based on a Hybrid Quadrupole Time-Of-Flight (QTof) Ion-Mobility Mass Spectrometer. José Portela, Waters, Saint-Quentin-en-Yvelines, France. F11

14

Session parallèle B – Amphi Parmentier Chairman Jean Xavier Fontaine, Amiens, France

12h45 – 13h15 Les Solutions Agilent technologies en Métabolomique.

Luc Arnaud, Agilent technologies, Les Ullis, France. F6

13h20 – 13h50 Nouvelle génération de spectromètres de masse ultra performants pour les analyses métabolomiques globales et ciblées. Claire Dauly, Thermo Scientific, France. F14

14h00 –14h50 Conférence Plénière invitée 2 - Amphi Baudelocque Chairman : Alain Bouchereau, Rennes, France

14h00 – 14h50 Plant Metabolomics: Challenges and Solutions 2013

Joachim Kopka, Golm, Allemagne O22

14h50 Session Flash 6 - Amphi Baudelocque (Présentations de 5 minutes (2-3 diapos) faites par les participants sur la base de leur poster.)

Chairman : Alain Bouchereau, Rennes, France

14h50 Data processing optimization through batch normalization and

orthogonal variation inspection: Application to a cohort study to define a reference urine human metabolome. Julie Foucquier, Gif-sur-Yvette, France F15-P15

14h55 Targeted and Untargeted Metabolomics - Using TripleTOF® 5600+

System Technology Henri Nicar, ABSCIEX, France F16

15h00 Session « Applications de la métabolomique/fluxomique Agroressources & Santé » 1

Session parallèle A – Amphi Baudelocque

15h00 – 16h20 Session « Agroressources»

Chairman : Eric Gontier, Amiens, France

15h00 – 15h15 Improving the understanding of the stimulating effect of Agrobacterium rhizogenes on the tropane alkaloid biosynthesis pathway in Datura innoxia Mill. using metabolite correlation networks. Kieu Oanh Nguyen, Amiens, France O23

15h20 – 15h35 Profilage métabolique du pathosystème Lactuca sativa / Bremia lactucacea après application de stimulateurs de défenses des plantes. Floriant Bellvert, Villeurbanne, France O24

15

15h40 – 15h55 Phénotypage métabolique de pommes de terre génétiquement résistantes à différents parasites majeurs. Chloé Volant, Le Rheu, France O25

16h00 – 16h15 Acclimatation du lin (Linum usitatissimum) au stress hydrique par la réorganisation du métabolome induite par l’acide β-amino butyrique (BABA). Anthony Quéro, Amiens, France O26

Session parallèle B – Amphi Parmentier

15h00 –16h40 Session « Santé»

Chairman Jean Charles Martin, Marseille, France

15h00 – 15h15 Liquid chromatography-mass spectrometry based analysis of the cerebrospinal fluid metabolome for the study of inborn errors of metabolism. Christophe Junot, Saclay, France O27

15h20 – 15h35 Untargeted metabolomics approach for the analysis of cerebrospinal fluid (CSF) in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) patients using LC-HRMS method. Hélène Blasco, Tours, France O28

15h40 – 15h55 Pharmaco-metabonomic investigation of acetaminophen toxicity on rat primary hepatocytes in microfluidic biochips. Claire Lopez, Villeurbanne, France O29

16h00 – 16h15 Characterization and localization of d18:2 sphingadienine based sulfatides in rat cerebellum using 2D offline LC-HRMS and MALDI imaging in lipidomics. Benoît Colsch, Gif-Sur-Yvette, France O30

16h20 – 16h35 Variations spectrales et IRM devant une masse cérébrale nécrotique. Jean-Marc Constans, Amiens, France O31

16h40 - 17h10 PAUSE - Echanges informels

17h10 – 18h30 Session « POSTERS » et Echanges Informels

18h30 – 19h30 Assemblée Générale du Réseau Français de Métabolomique et Fluxomique (ouverte à tous les membres du RFMF). Amphi Baudelocque

19h30 Départ en Bus vers le Pré Porus pour le dîner de gala.

16

Mercredi 12 juin 2013

8h45 Session «Etudiants Masters Nantes» Amphi Baudelocque

Chairman : Dominique Rolin, Villenave d’Ornon, France

8h45 – 8h50 Présentation du Master 2 A3M (Analyse, Molécules, Matériaux, Médicaments). Renaud Boisseau, Nantes, France EM1

8h50 – 9h00 L'apport de la métabolomique pour la toxicologie.

Jérémy Marchand, Nantes, France EM2

9h00 – 9h10 L'apport de la métabolomique pour l'étude de l'obésité.

Estelle N'Tsiba, Nantes, France EM3

9h15 –10h20 Session «Nutrition» Amphi Baudelocque Chairwoman : Estelle Pujos-Guillot, Saint-Genès Champanelle, France

9h15 – 9h30 Existe-t-il un profil métabolique associé à la sensation de faim ?

Mohamed N. Triba, Bobigny, France O32

9h35 – 9h50 Metabolomics reveals differentiated metabolic adjustments of normal

and overweight subjects submitted to overfeeding. Blandine Comte, Saint-Genès-Champanelle, France O33

9h55 – 10h10 Effet de l’exercice à la vitesse lipox sur le métabolome hépatique de

souris obèses. Laurence Le Moyec, Evry, France O34

10h15 -10h40 PAUSE - Echanges informels

10h40 –11h50 Session «Initiatives nationale & internationale en métabolomique» - Amphi Baudelocque Chairman : Dominique Rolin, Villenave d’Ornon, France

10h40 – 10h55 MetaboHUB : a National Infrastructure dedicated to metabolomics and

fluxomics. Dominique Rolin, Villenave d’Ornon, France O35

11h00 – 11h45 MetaboLights: towards a new COSMOS of metabolomics data

management. Kenneth Haug et Reza Salek, Cambridge, Royaume-Uni O36

17

11h50 – 12h00 Clôture des Journées Eric Gontier, représentant le Comité local d’organisation des 7 JS RFMF, et Dominique Rolin président du RFMF.

12h00 – 14h00 BUFFET

12h45 – 13h15 Sessions Industrielles en parallèle 2

Session parallèle A – Amphi Ehresmann

12h45 – 13h15 Targeted and Untargeted Metabolomics - Using TripleTOF® 5600+ System Technology Baljit Ubhi, ABSCIEX, UK.

Session parallèle B – Amphi Parmentier

12h45 – 13h15 Création d’une base de données de référence RMN et MS sur la base de données expérimentales. Yves Lorrain, ACD-Labs, Strasbourg, France.

14h00 – 17h00 Atelier 2«Exploitation des données acquises par Spectrométrie de Masse.» Amphi Baudelocque Frédérique Courant, Nantes ; Christophe Junot, Saclay ; Jean-Charles Martin, Marseille ; Estelle Pujos-Guillot, Saint-Genès- Champanelle, France.

14h00 – 16h00 Atelier 3«Techniques d’acquisition et de suppression de solvant en RMN 1D» Amphi Parmentier Serge Akoka, Illa Téa, Patrick Giraudeau, Nantes, France.

14h00 – 16h00 Atelier 4« How to submit data to MetaboLights» Salle Informatique Kenneth Haug et Reza Salek, Cambridge, Royaume-Uni

18

Résumés

Communications Orales

19

O1- Conférencier Invité

Analyzing metabolomics data: univariate, multivariate or simplivariate?

Age Smilde

A.K.Smilde@uva.nl

Biosystems Data Analysis

Swammerdam Institute for Life Sciences,

University of Amsterdam, the Netherlands

20

O2

Vers une automatisation de l’analyse des données et de l’identification de

métabolites candidats biomarqueurs dans le cadre des études métabolomiques.

Sylvain Chéreau1, Anne-Lise Royer

1,2, Frédérique Courant

1, Clémentine Le

Boucher1,2,3

, Sophie Jeanson2,3

, Anne Thierry2,3

, Gaud Dervilly-Pinel1, Jean-Philippe

Antignac1, Fabrice Monteau

1, Bruno Le Bizec

1.

1 LABoratoire d’Étude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA) USC INRA 1329, Oniris,

LUNAM Université, BP 50707, 44307 Nantes Cedex 3, France

2 INRA, UMR1253 Science et Technologie du Lait et de l’Œuf, F-35042 Rennes, France

3 Agrocampus Ouest, UMR1253 Science et Technologie du Lait et de l’Œuf, F-35042 Rennes, France

Par nature, une étude métabolomique génère des volumes de données très importants. En fonction

de l’ampleur de l’étude (nombre d’échantillons) et des conditions d’analyse, l’acquisition des

profils métaboliques correspondants peut s’étendre sur de longues périodes, allant parfois jusqu’à

plusieurs mois. En amont de l’étape de retraitement des données brutes, la caractérisation et la

maîtrise de la qualité analytique des profils métaboliques est alors primordiale pour éviter tout

biais dans l’exploitation ultérieure des données. Dans ce sens, plusieurs solutions sont

communément utilisées par la communauté scientifique : l’ajout d’étalons internes et/ou externes,

l’acquisition de profils sur des échantillons dits « contrôles qualité »… Outre les avantages qu’elles

procurent, ces stratégies complexifient toutefois l’information disponible et par conséquent la mise

en évidence de l’information utile peut se révéler fastidieuse. Passées ces étapes de retraitement de

l’information, l’identification structurale des candidats biomarqueurs révélés reste ensuite une

étape très laborieuse, toutefois nécessaire pour comprendre les perturbations biologiques observées.

Face à ces différentes problématiques, un outil d’évaluation de la qualité analytique des données à

été développé au LABERCA, sous forme d’une macro Excel. Cet outil permet de mieux visualiser

l’homogénéité des profils métaboliques à comparer et, le cas échéant, de corriger automatiquement

les dérives analytiques observées. De plus, en vue de fluidifier l’annotation des empreintes

métaboliques acquises, une banque de données spectrales [1], comptant à ce jour plus de 200

composés caractérisés, a été développée sa consultation intégrée à la macro Excel permet d’annoter

automatiquement le tableau de données généré suite au retraitement des données brutes par XCMS.

Les principaux avantages de cette stratégie haut-débit seront présentés et illustrés au travers

d’applications telles que la mise en évidence de marqueurs d’une administration frauduleuse de

promoteurs de croissance en élevage [2] ou l’identification de marqueurs de croissance bactérienne

au cours de l’affinage du fromage [3].

Références bibliographiques [1] F. Courant et al., Implementation of a semi-automated strategy for the annotation of metabolomic fingerprints generated by liquid

chromatography-high resolution mass spectrometry from biological samples. Analyst. 2012, 137, 4958-4967.

[2] G. Dervilly-Pinel et al., Metabolomics in food analysis: application to the control of forbidden substances. Drug. Test Analysis

2012, Suppl 1:59-69.

[3] C. Le Boucher et al., First mass spectrometry metabolic fingerprinting of bacterial metabolism in a model cheese. Food

Chemistry. Accepted.

Mots-clés : Macro Excel, banque de données, retraitement de données métabolomiques

21

O3

ERVA: a novel method of binning, allowing chemical information to be

highlighted, from 1H-NMR metabolomics data.

Daniel Jacob 1,2

, Catherine Deborde 1,2

and Annick Moing 1,2

1 INRA, UMR1332 Fruit Biology and Pathology, Centre INRA de Bordeaux, F-33140 Villenave d'Ornon, France

2 Metabolome Facility of Bordeaux Functional Genomics Center, IBVM, Centre INRA de Bordeaux, F-33140 Villenave

d'Ornon, France

The spectra processing is crucial in metabolomics approaches, especially for proton NMR

metabolomic profiling, each step might impact on the following. Among the different steps, data

reduction (binning or bucketing) strongly impacts subsequent statistical data analysis and potential

biomarker discovery. Based on a recently published work 1 , here we propose an improving method

of data reduction, called ERVA which stands for Extraction of Relevant Variables for Analysis.

This new method provides buckets i) rid of any non-significant signal, and ii) closer to the chemical

fingerprints of metabolites. Moreover, taking advantage of the concentration variability of each

compound from a complex mixture, chemical information can be highlighted by linking the buckets

into clusters based on significant correlations, thus bringing a helpful support for compound

identification. This new method is applied as a proof of concept, to a tomato 1 H-NMR dataset to

test its ability to recover the fruit extract compositions.

Référence bibliographique

[1] Daniel Jacob, Catherine Deborde, Annick Moing, (2013) An efficient spectra processing method for metabolite

identification from 1H-NMR metabolomics data, Analytical and Bioanalytical Chemistry , doi: 10.1007/s00216-

013-6852-y

Mots-clés : 1H-NMR spectroscopy, spectra processing, metabolite identification, metabolomics

22

O4

A toolbox using the R environment to explore NMR metabolomic data sets

Stéphane Balayssac 1, Sébastien Déjean

2, Julie Lalande

1, Véronique Gilard

1,

Myriam Malet-Martino 1

1 Groupe de RMN Biomédicale, Laboratoire SPCMIB (UMR CNRS 5068),

2 Institut de Mathématiques de Toulouse, UMR 5219

Université de Toulouse, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse cedex, France

Several packages or toolboxes to explore NMR metabolomic data sets exist as for example

metabonomic [1] and MUMA [2] R packages, as well as several in-house codes developed in

Matlab. However, programming knowledge is required with R and Mathlab softwares, which limit

their access for inexperienced users.

The purpose of the present work was to develop in the free R software [3] statistical and

graphical techniques to analyze NMR data. Concretely, very basic knowledge in R is required. The

user just has to source one of the R script files corresponding to the analysis he wants to perform.

Once the script sourced, data are imported from three common xls files. The first one contains the

quantitative and qualitative variables, the second one the specific attribution of the variable and the

last one the high resolution spectrum. Then the user can customize his analysis by answering to

some very simple questions asked by the program like “Do you want different colours? yes/no” or

“Insert the order to display boxplots”. Output files including numerical and graphical results are

produced and stored in one main directory with sub-directories to facilitate the localization of data.

This toolbox includes univariate, bivariate and multivariate statistical analyses. Univariate

approaches propose a set of graphical and numerical tools to provide information for each variable

of the data set. Bivariate approaches lead to various representations (STOCSY-like representation,

statistical correlation network, specific image) of the correlation matrix to explore highly correlated

metabolites. Then, multivariate methods provide a global overview of the data set either in an

unsupervised (PCA) or a supervised (PLS-DA) framework. Sparse versions of these methods,

implemented in the mixOmics package [4], enable selecting the most relevant variables to focus on.

All these tools are accompanied with interactive facilities to make easier the biological

interpretation of the results. For example, interactive facility is available for network handling

where the user can click on the network to move and re-organize the nodes.

The potential of our toolbox is illustrated by a series of graphical representation resulting

from 1 H NMR metabolomic studies (Alzheimer’s disease, melanoma, …) or chemometric analyses.

Références bibliographiques [1] J.L. Izquierdo-García, et al. BMC Bioinformatics 2009; 10: 363.

[2] E. Gaude, et al. (2012) http://cran.r-project.org/web/packages/muma/

[3] R Development Core Team. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org, 2012.

[4] K.A. Lê Cao et al. Bioinformatics, 2009; 25: 2855-2856,

Mots-clés : NMR, Statistical analysis, R software

23

O5

Vers une "Galaxy" Métabolomique ?

la plateforme Galaxy et l’univers des analyses métabolomiques

Pierre Péricard

1, Gildas Le Corguille

1, Urszula Czewinska

1, Marion Landi

2, Franck

Giacomoni 2, Christophe Duperier

2, Jean-François Martin

2, Sophie Goulitquer

1, Christophe

Caron 1, Estelle Pujos-Guillot

2

1 ABiMS, FR2424 CNRS-UPMC, Station Biologique, Place Georges Teissier, 29680, Roscoff, France

2 PFEM, UMR1019 INRA, Centre Clermont-Ferrand-Theix, 63122, Saint Genes Champanelle, France

Contact : franck.giacomoni@clermont.inra.fr

Face à l'utilisation croissante de la métabolomique par les scientifiques dans la génération

d’empreintes, les massistes, statisticiens et bio-informaticiens ont dû imaginer de nouvelles

stratégies d’analyses [1]. Des efforts importants ont été consentis par la communauté pour lever les

verrous techniques et méthodologiques rencontrés et particulièrement dans les champs de la

bioinformatique et de la chimiométrie. Ainsi, lors de la dernière décennie, la production

d’algorithmes et d’outils par les laboratoires scientifiques, les compagnies privées et les

constructeurs d’appareils s’est accélérée. Or, la majorité de ces solutions informatiques sont des

logiciels de type client lourd, ou de simples scripts à exécuter avec des fonctionnalités spécifiques et

des performances parfois limitées même si des solutions « full web », plus ergonomiques telles que

XCMS Online [2] ou MetaboAnalyst [3], sont aujourd’hui proposées. Présentée comme une

solution alternative et basée sur un mode collaboratif, nous avons développé une « boîte à outils »

(BAO) intégrant des modules de traitement et d’annotations de données métabolomiques, facile à

compléter quelle que soit l'origine (laboratoire) et la nature (langage) des scripts et des

développements. Cette BAO est accessible par une simple interface web pour les différentes

communautés : biologistes, experts massistes, statisticiens et bio-informaticiens.

Un des moteurs de « workflows » les plus utilisés en bioinformatique, la plateforme web

d’analyses Galaxy [4,5,6] ( http://galaxyproject.org/ ), a été choisi pour développer notre suite

d’applications. Cette première version « métabolomique » de Galaxy a pour objectif d’établir une

preuve de concept de ses capacités d’intégration d’outils tels que XCMS [7]. Nous avons aussi

démontré son adaptabilité à des stratégies d’analyses particulières et valider la qualité intrinsèque de

son interface utilisateur. Dans le cadre d’une collaboration entre les plateformes INRA/PFEM et

CNRS/ABiMS-METABOMER, nous avons ainsi pu construire sous Galaxy un premier

environnement extensible d’analyses. Cette chaîne modulaire inclut des composants connus comme

les fonctions d’XCMS mais aussi une suite d’outils statistiques complémentaires de type ACP,

outils de clustering [8] et de normalisation de données [9]. Chaque composant peut être utilisé de

manière indépendante ou comme faisant partie intégrante d’un « workflow » complet et

préconfiguré. La parallélisation des traitements a aussi été implémentée avec le portage des

fonctions calculatoires sur serveur de calculs. Cette implémentation met également à disposition un

grand nombre des paramètres proposés par le package d’analyses R. Des experts peuvent ainsi

configurer des chaînes de traitement en utilisant les options avancées et les partager à l’ensemble

des utilisateurs de la plateforme pour une utilisation en routine.

La plateforme Galaxy propose nativement une méthodologie d’intégration d’outils issus de

sources multiples et dispose d’un gestionnaire de workflows intuitif, de fonctionnalités avancées

telles que des historiques assurant la traçabilité et la capacité à reproduire des analyses. Enfin,

Galaxy propose un environnement pour le partage des données, des résultats, des outils via le

« toolshed » ou des workflows d’analyses. Cet environnement web unifié facilite la réalisation de

traitements in silico par des non bio-informaticiens.

24

Avec la mise en place de telles infrastructures, notre projet s'inscrit dans un contexte

d’adaptation de nos méthodes de traitement et de changement d’échelle des capacités de traitement

des laboratoires. La dynamique de cette collaboration nous a permis de dépasser notre objectif

initial, à savoir la validation de la plateforme Galaxy. Nous envisageons ainsi notamment de

développer les aspects « annotation » avec des composants d’interrogation de banques de données.

Nos premiers résultats nous ont également permis d’obtenir des financements pour les deux

prochaines années auprès des conseils régionaux d’Auvergne et de Bretagne. Enfin, cette

collaboration s’intègre totalement aux Infrastructures de Recherche financées dans le contexte des

Investissements d’Avenir. Elle contribue notamment à développer de fortes synergies entre

METABOHUB et EMBRC-France, visant à développer des composants interopérables et de haut-

niveau pour la métabolique à haut-débit. Ces développements s’intègrent également dans une

perspective de structuration nationale de la bio-informatique, en liens étroits avec l’Institut Français

de Bio-informatique.

Références bibliographiques :

[1] W. Dunn, Current trends and future requirements for the mass spectrometric investigation of microbial, mammalian and plant

metabolomes. Physical Biology, 5:011001, 2008.

[2] R. Tautenhahn, G.J. Patti, D. Rinehart and G. Siuzdak, XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted

Metabolomic Data. Analytical Chemistry, 84(11):5035-5039, 2012.

[3] J. Xia, N. Psychogios, N. Young and D.S. Wishart, MetaboAnalyst: a web server for metabolomic data analysis and

interpretation. Nucleic Acids Res, 37(Web Server issue):W652-60, 2009.

[4] J. Goecks, A. Nekrutenko, J. Taylor and The Galaxy Team, Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible,

reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol, 11(8):R86, 2010.

[5] D. Blankenberg, G. Von Kuster, N. Coraor, G. Ananda, R. Lazarus, M. Mangan, A. Nekrutenko and J. Taylor, Galaxy: a web-

based genome analysis tool for experimentalists. Current Protocols in Molecular Biology, 89:19.10.1-19.10.21, 2010.

[6] B. Giardine, C. Riemer, R.C. Hardison, R. Burhans, L. Elnitski, P. Shah, Y. Zhang, D. Blankenberg, I. Albert, J. Taylor, W.

Miller, W.J. Kent and A. Nekrutenko, Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Research,

15(10):1451-5, 2005.

[7] C.A. Smith, E.J. Want, G.C. Tong, R. Abagyan, and G. Siuzdak, XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite

profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry, 78(3):779-787, 2006.

[8] A.J. Saldanha, Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics, 20(17):3246-3248, 2004.

[9] F.M. Van Der Kloet, I. Bobeldijk, E.R. Verheij, R.H. Jellema, Analytical error reduction using single point calibration for

accurate and precise metabolomic phenotyping. J Proteome Res, 8(11):5132-41, 2009.

Mots-clés : metabolomics, workflows, galaxy, xcms

25

O6

Spatially-encoded 2D NMR strategies for fast quantitative metabolomics.

Illa Tea, Adrien Le Guennec, Estelle Martineau,

Meerakhan Pathan, Benoît Charrier, Serge Akoka, Patrick Giraudeau

Université de Nantes, CNRS, CEISAM UMR 6230, Nantes, France

Two-dimensional Nuclear Magnetic Resonance (2D NMR) forms a powerful tool for the targeted

analysis of metabolic samples, thanks to its capacity to simultaneously identify and quantify major

metabolites in biological samples. However, its use for quantitative purposes is far from being

trivial, not only because of the associated experiment time, but also due to its subsequent high

sensitivity to hardware instabilities. The latter highly affect the analytical performance of 2D

experiments (repeatability, linearity), thus affecting the accuracy and precision of quantitative

analysis. Recent papers described the development and optimization of 2D NMR experiments for

quantitative analysis of metabolic samples.1 Reducing the experiment duration appears as

indispensable to reach a high quantitative performance. In this context, we recently focused our

attention on the development of fast quantitative 2D NMR approaches applied to the measurement

of major metabolites in breast cancer cell line extracts, allowing the discrimination between

different cancer cell lines.2

On the other hand, the NMR community has developed a number of approaches departing from the

classical parametric incrementation scheme of 2D NMR, in order to drastically reduce the duration

of 2D NMR experiments. In particular, the last 10 years have witnessed large efforts geared at

developing the so-called “ultrafast 2D NMR” methodology, capable of providing a complete 2D

correlation in a single scan, i.e. in a fraction of a second.3 Based on this approach, we developed a

quantitative “multi-scan single shot” (M3S) strategy, 4

capable of measuring absolute metabolite

concentrations in complex mixtures with a high precision in a reasonable time. The analytical

performance of this methodology was compared to the one of conventional 2D NMR. 2D COSY

spectra were obtained in 10 minutes on model metabolic mixtures, with a precision in the 1-4%

range (versus 5-18% for the conventional approach). 5 This much higher precision is due to the

excellent immunity of the M3S approach towards hardware instabilities. The M3S approach also

shows a better linearity than its conventional counterpart. It ensures that accurate quantitative

results can be obtained provided that a calibration procedure is carried out. The M3S COSY

approach was then applied to measure the absolute metabolite concentration in three breast cancer

cell line extracts, relying on a standard addition protocol. M3S COSY spectra of such extracts were

recorded in 20 minutes and gave access to the absolute concentration of 14 major metabolites,

showing significant differences between cell lines. 5 The concentrations measured are coherent with

the biological processes in cancer cells and are in good adequacy with metabolic studies performed

in our group by Isotopic Ratio Mass Spectrometry (IRMS). 6

Références bibliographiques 1. Chylla, R.A.; Hu, K.; Ellinger, J.J.; Markley, J.L. Anal. Chem. 2011, 83, 4871-4880.

2. Martineau, E.; Tea, I., Akoka; S.; Giraudeau, P. NMR Biomed. 2012, 25, 985-992.

3. Frydman, L.; Scherf, T.; Lupulescu, A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 99, 15858-15862.

4. Pathan, M.; Akoka, S.; Tea, I.; Charrier, B.; Giraudeau, P. Analyst 2011, 136, 3157-3163.

5. Le Guennec, A.; Tea, I.; Antheaume, I. ; Martineau, E.; Charrier, B.; Pathan, M.; Akoka, S.; Giraudeau, P. Anal. Chem. 2012, in

press, doi: 10.1021/ac3033504

6. Tea, I.; Martineau, E.; Giraudeau, P.; Akoka, S.; Barillé-Nion, S. Patent WO 2012/123886, 2012

7. http://www.sciences.univ-nantes.fr

26

O7

Caractérisation rapide du xénométabolome par spectrométrie de masse à

très haute résolution combinée à un filtre de défaut de masse

Estelle Rathahao-Paris

1 , Alain Paris

2

1 INRA, AgroParisTech, UMR 1145 Ingénierie Procédés Aliments, 75231 Paris, France

2 INRA- AgroParisTech, Unité Met@risk, 75231 Paris Cedex 05, France

L’approche métabolomique comprend également la caractérisation possible du xénométabolome

puisque des métabolites des xénobiotiques sont également détectés dans l’organisme à un moment

donné sous forme d’empreintes spécifiques. Compte tenu de la possibilité de présence d’un grand

nombre d’ions correspondant aux xénométabolites et de la présence d’ions d’interférence présents

dans la matrice biologique, il est nécessaire de disposer d’un outil performant permettant la

détection rapide et simultanée des métabolites de différents xénobiotiques pour la caractérisation

rapide du xénométabolome et ainsi la mise en évidence, dans des surveillances épidémiologiques,

de l’état d’exposition réel des populations au risque chimique, notamment l’exposition combinée de

plusieurs xénobiotiques tels que les pesticides, les résidus de médicaments ou les polluants de

l’environnement.

La spectrométrie de masse à très haute résolution combinée à un outil de traitement de données

fondé sur le calcul des défauts de masse permettrait d’extraire des ions d’intérêt, même ceux de

faible abondance [1,2]. Ce type d’approche a été appliqué à l’étude du métabolisme de la

vinclozoline, un fongicide fréquemment utilisé en agriculture et reconnue comme étant un

perturbateur endocrinien ayant des propriétés androgéniques.

Dans ce travail, l’analyse directe de l’urine de rat traité avec la vinclozoline a été réalisée en mode

d’introduction directe combinée à la spectrométrie de masse à très haute résolution (LTQ-Orbitrap).

L’application d’un filtre de défaut de masse a permis de réduire un nombre considérables de

variables, facilitant ainsi la détection et l’identification des métabolites de la vinclozoline ayant

conservé le motif dichlorophényl possédant un massif isotopique caractéristique de la présence de

deux atomes de chlore. La composition élémentaire de chaque métabolite a pu être obtenue à partir

de la mesure précise du rapport m/z des ions caractéristiques. Les expériences de spectrométrie de

masse en tandem ont été également réalisées sur les ions présentant une distribution de massifs

isotopiques diagnostiques de la présence de deux atomes de chlore. La mesure précise des rapports

m/z des ions fragments a permis de fournir la composition élémentaire de chaque ion fragment et

des informations structurales non ambiguës.

Les résultats obtenus sur cette étude semblent très prometteurs en termes d’analyse des

xénométabolites à haut débit.

Références bibliographiques : 1. Zhang, H. Zhang, D. and Ray. K. (2003). A software filter to remove interference ions from drug metabolites in

accurate mass liquid chromatography/mass spectrometric analyses. Journal of Mass Spectrometry 38, 1110-1112.

2. Zhang, H., Zhang, D., Ray, K., and Zhu, M. (2009). Mass defect filter technique and its applications to drug

metabolite identification by high-resolution mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry 44, 999–1016.

Mots-clés : xénométabolome, spectrométrie de masse à très haute résolution, filtre de défaut de

masse

27

O8

Le développement de méthode d’empreintes métabolomiques à haut débit et

à ultra haute résolution pour le phénotypage métabolique et l’identification

structurale de biomarqueurs

B. Xue

1 ; S. Alves

2 ; J-C. Tabet

2 ; R. Cole

2 ; A. Paris

3 ; C. Junot

4 ; E. Paris

1

1 INRA, AgroParisTech, Équipe IAQA, UMR 1145 Ingénierie Procédés Aliments, 75231 Paris

Cedex 05 2

UPMC, Laboratoire CSOB, Institut Parisien Chimie Moléculaire, 75252 Paris Cedex 05 3

INRA, AgroParisTech, Mét@risk , 75231 Paris Cedex 05 4

CEA, LEMM, 91191 Gif sur Yvette Cedex

Les études menées en métabolomique utilisent généralement la spectrométrie de masse couplée à un

système de séparation chromatographique [1,2]. La production des données à haut débit avec ce

type d’approche est donc difficile puisque seulement 50 à 100 échantillons peuvent être analysés au

maximum par jour, selon les conditions chromatographiques utilisées. Pour pouvoir réaliser le

phénotypage métabolique sur une cohorte de taille importante et à des coûts raisonnables, il est

nécessaire de disposer d’une méthodologie robuste permettant de produire à haut débit des

empreintes métabolomiques pleinement informatives et exploitables au plan statistique.

L’introduction directe des échantillons, sans avoir recours à une séparation chromatographique

préalable, semble être une bonne alternative.

Dans ce travail, la nouvelle méthodologie développée consiste à remplacer la chromatographie

liquide (LC) par une introduction directe (DI) en mode injection en flux continu (FIA, flow

injection analysis) pour coupler à un spectromètre de masse (MS) FT-ICR (Fourier Transform-Ion

Cyclotron Resonance). Cet instrument possède des performances remarquables sans commune

mesure avec celle des autres types de spectromètre de masse. Ainsi, grâce à son pouvoir résolutif

ultra élevé (résolution en masse > 100 000 FWHM), il permet la séparation des ions isobares et en

conséquence la détection simultanée d’un grand nombre de composés à partir de l’analyse de

mélanges complexes.

Dans cet exposé, seront présentés les résultats préliminaires obtenus sur des échantillons urinaires.

Des composés standards de référence, de poids moléculaires couvrant la gamme de rapports m/z des

spectres de masse étudiés, ont été utilisés afin de déterminer les meilleures conditions d’analyses et

évaluer les performances de la détection dans des matrices complexes telles que l’urine.

L’introduction des composés de référence dans ces biofluides a permis de mettre en évidence, pour

des échantillons faiblement dilués, l’existence des effets de matrice. Un facteur de dilution a pu être

déterminé pour limiter ces effets de matrice et avoir la meilleure réponse en terme de signal de

détection. Une bonne linéarité a pu être observée dans la gamme de concentrations choisies. Les

premiers résultats obtenus ont permis d’évaluer le nombre de métabolites urinaires détectés en

mode introduction directe couplé à l’instrument FT-ICR en comparaison avec les résultats obtenus

sur les mêmes échantillons par couplage UPLC-LTQ-Orbitrap.

Références bibliographiques : 1. Bedair, M., Sumner L.W. Current and emerging mass-spectrometry technologies for metabolomics, Trends in

Analytical Chemistry 2008 , 27, 238-250.

2. Roux, A., Lison, D., Junot, C., Heilier J.-F. Applications of liquid chromatography coupled to mass

spectrometry-based metabolomics in clinical chemistry and toxicology: A review. Clinical Biochemistry 2011 ,

44, 119–135.

Mots-clés : phénotypage métabolique, haut débit, spectrométrie de masse à très haute résolution

28

O9

Evaluation of a metabolic profiling strategy using liquid chromatography

LTQ Orbitrap mass spectrometry for the metabolic characterization of Isatis

tinctoria L. leaf extracts

Kieu Oanh Nguyen 1 , Kris Morreel

2 , Paulo Marcello

3 , Eric Gontier

1 , Rebecca Dauwe

1

1 Université de Picardie Jules Verne, BIOPI, UFR des Sciences, Ilot des poulies, 33 rue Saint Leu,

80039 Amiens cedex, France 2 VIB - Department of Plant Systems Biology, Ghent University - Technologiepark 927, 9052 Ghent,

Belgium 3

Université de Picardie Jules Verne, ICAP- Plateforme d'Ingénierie Cellulaire et Analyse des

Protéines, 1-3, rue des Louvels, 80037 Amiens cedex, France

Efficient compound annotation is a problem that remains not satisfactorily solved in

untargeted LC-MS-based metabolomics research. Here we present a strategy for metabolite

profiling of plant extracts using an LC-LTQ-Orbitrap MS. As a model plant, we used Isatis

tinctoria L., an ancient indigo dye and a medicinal plant of which the leaf extracts have been

intensively investigated from a pharmacological viewpoint. Complex mass spectra of leaf extracts

consist of molecular ions as well as fragments and adducts. We reduced the data complexity by

selecting the [M-H]- ions from the dataset in an automated way. The highly accurate Orbitrap MS

masses were used to determine the number of sulfur ions and to derive a ranked list of chemical

sum formulae. Furthermore, exact mass differences between different [M-H]- ions in combination

with a correlation analysis and an analysis of the relative retention times could reveal networks of

biochemically closely related compounds in the complex dataset. Based on the MS2 spectra

obtained in parallel via the linear ion trap, selections of [M-H]- ions that showed characteristic

fragments and/or neutral losses in their MS2 spectrum, were made in an automated way. The

structures of selected ions were finally proposed based on MSn experiments obtained in the linear

ion trap. Using this strategy, we performed a broad metabolic characterization of the polar

constituents of fresh leaves of I. tinctoria individuals, in parallel with the metabolic characterization

of the pharmacologically active lipophilic extracts from comparable leaves of the same individuals

after a drying process. The proposed method is able to provide reductions in data complexity and

identification of biochemically related metabolites. We finally used the obtained metabolite profiles

to establish a predictive relationship between the metabolic composition of the fresh I. tinctoria

leaves and the production of pharmacologically active compounds during the drying process.

Mots-clés : high resolution mass spectrometry, structural annotation

29

O10

Analyse métabolomique des miels par spectrométrie de masse:

caractérisation chimique et détection de polluants.

Cotton Jérôme, Sabarly Victor, Oursel Stéphanie, Marie Mylène, Broudin Simon, Leroux

Fanny, Desoubzdanne Denis, Corman Bruno, Junot Christophe.

Traditionnellement, la spectrométrie de masse à analyseurs de type triple quadripôlaire

fonctionnant en mode MRM est utilisée pour la détermination et le dosage de contaminants

chimiques dans les matrices alimentaires 1,2

. Dans cette étude, une approche métabolomique 3 par

couplage de la chromatographie liquide avec la spectrométrie de masse à ultra haute résolution (LC-

ESI-FTMS) a été développée pour la recherche de contaminants chimiques potentiels (56

pesticides et 35 antibiotiques) dans le miel. La valeur ajoutée de ce travail réside dans l’acquisition

d’une seule empreinte chimique pour (1) la détermination de polluants dans le miel avec une bonne

spécificité (masse exacte, temps de rétention et massif isotopique) et (2) l’utilisation de l’ensemble

des signaux générés durant l’analyse pour réaliser un profilage métabolique à l’aide de méthodes

statistiques. Pour cela, une extraction liquide-liquide en cinq étapes a tout d’abord été réalisée pour

extraire le maximum de métabolites possibles à partir du miel. Les résultats montrent que 74 miels

sur 76 sont pollués par une molécule au moins et que trois pesticides sont retrouvés dans la majorité

d’entre eux (carbendazim, amitraz et chlorfenvinphos). Enfin, des analyses statistiques ont été

réalisées (ACP et modèle prédictif) et ont permis de discriminer les miels selon leurs origines

florales.

Cette étude démontre que les analyses métabolomiques globales et sans a priori permettent

d'obtenir dans le cadre d'une seule acquisition des données pertinentes dans des domaines aussi

variés que la recherche de polluants, la recherche d'adultérations et la chimie des substances

naturelles.

Références bibliographiques : 1. Bohm D.A ; Stachel C.S ; Gowik P. Validation of a multi-residue method for the determination of several

antibiotic groups in honey by LC-MS/MS. Anal Bioanal Chem, 403 (2012) 2943–2953.

2. Herrmanna A ; Roséna J ; Janssonb D ; Hellenäs K.E. Evaluation of a generic multi-analyte method for

detection of 100 representative compounds correlated to emergency events in 19 food types by ultrahigh-

pressure liquid chromatography–tandem mass spectrometry. J Chrom A, 1235 (2012) 115–124.

3. Werner E ; Croixmarie V ; Umbdenstock T ; Ezan E ; Chaminade P ; Tabet J.C ; Junot C. Mass

Spectrometry-Based Metabolomics: Accelerating the Characterization of Discriminating Signals by

Combining Statistical Correlations and Ultrahigh Resolution. Anal Chem, 80 (2008) 4918–4932.

Mots-clés : miel, LC/MS, spectrométrie de masse à haute résolution, métabolomique, statistiques,

environnement, polluants

30

O11

Analyse métabolomique de la symbiose entre le puceron Acyrthosiphon pisum et

la bactérie Buchnera aphidicola

Marjolaine Rey 1 , Floriant Bellvert

2 , Gabrielle Duport

1 , Patrice Baa-Puyoulet

1 , Federica

Calevro 1 , Stefano Colella

1 , Hubert Charles

1 , Gilles Comte

2 , Gérard Febvay

1

1 UMR203BF2I Biologie Fonctionnelle Insectes et Interactions, INRA,INSA Lyon, Université De Lyon,20 avenueAlbert

Einstein,F‐69621 Villeurbanne cedex

2 UMR5557 Ecologie Microbienne, Centre d’Etudes des Substances Naturelles, CNRS, Université Lyon 1, Université

de Lyon, 43 Boulevard du 11 novembre 1918,F‐69622 Villeurbanne cedex

En colonisant de nombreuses légumineuses d’intérêt agronomique (pois, fève, lentille,

luzerne), le puceron du pois Acyrthosiphon pisum est un ravageur notable des cultures en régions

tempérées. Les dégâts qu’il occasionne sont liés d’une part à la ponction de sève phloémienne qui

affaiblit la plante, et d’autre part à sa capacité à transmettre de très nombreux virus végétaux

phytopathogènes.

La sève phloémienne dont se nourrissent les pucerons est un milieu riche en sucres et en

certains acides aminés transporteurs d’azote, et particulièrement carencé en vitamines et acides

aminés essentiels (non synthétisables par les animaux). L’adaptation du puceron à cette source

alimentaire déséquilibrée et variable repose sur l’établissement d’une symbiose obligatoire avec une

bactérie intracellulaire : Buchnera aphidicola . En effet, les études physiologiques conduites dans

les années antérieures ont démontré le rôle nutritionnel de B. aphidicola dans la fourniture au

puceron des acides aminés essentiels déficients dans la sève phloémienne des plantes (Liadouze et

al. , 1995 ; 1996). Dans ce travail, nous étudions l’impact de la présence de la bactérie sur le

métabolisme global du puceron.

Dans cette perspective, nous avons comparé le métabolome de pucerons symbiotiques

témoins, élevés 8 jours sur plants de fève (Vicia fabae), à celui de pucerons aposymbiotiques. Dans

ces derniers, la bactérie a été éliminée par un traitement antibiotique de 2 jours sur milieu artificiel,

avant de transférer les pucerons sur plantes, où ils seront élevés pendant 6 jours. Des pucerons

contrôles ont été élevés 2 jours sur milieu artificiel sans antibiotique, puis transférés sur plantes

pendant 6 jours.

Pour analyser le métabolome de la manière la plus exhaustive, chaque échantillon a été extrait

successivement avec 4 solvants de polarité croissante (hexane, acétate d’éthyle, méthanol et eau)

conduisant à une extraction totale de 37 % à 51% de la masse de matière sèche de puceron. Sur des

combinaisons de ces extraits, deux approches distinctes ont été conduites : (i) une approche ciblée

de type profilage métabolique de plusieurs classes de métabolites : (acides aminés par

HPLC/fluorimétrie, et sucres, acides organiques, acides gras par GC/MS) ; (ii) une approche non

ciblée de type empreinte métabolique par UHPLC/DAD/QTOF. Ces deux types d’approche nous

permettent ainsi d’appréhender aussi bien le métabolisme primaire que le métabolisme secondaire

du puceron.

L’ensemble des données provenant des différentes techniques chromatographiques ont été

normalisées puis compilées au sein d’une même matrice.

L’analyse en composantes principales de cette matrice (328 composés caractérisés) sépare les

pucerons symbiotiques (témoins et contrôles) des pucerons aposymbiotiques (axe 1 / 28%), et

montre aussi l’impact des 2 jours de culture sur milieu artificiel des pucerons symbiotiques (axe 3 /

14%). Cette analyse descriptive met ainsi en évidence des composés discriminants entre les trois

conditions biologiques.

31

L’analyse statistique (ANOVA) montre que plus de 40% des métabolites détectés ou

identifiés sont significativement discriminants entre les différentes conditions biologiques, dont

19% sont des métabolites primaires et 23% des secondaires.

Cette analyse métabolomique globale révèle l’impact important de la bactérie sur le

métabolisme du puceron, tant sur les composés liés directement à la croissance et la reproduction

(métabolisme primaire) que sur les composés du métabolisme secondaire. Cette influence se

caractérise, selon les composés analysés, par une accumulation ou une déficience significative dans

les pucerons aposymbiotiques par rapport aux symbiotiques.

Références bibliographiques Liadouze I, Febvay G, Guillaud J, Bonnot G. 1995. Effect of diet on the free amino acid pools of symbiotic and

aposymbiotic pea aphids, Acyrthosiphon pisum. J. Insect Physiol. 41 : 33-40.

Liadouze I, Febvay G, Guillaud J, Bonnot G. 1996. Metabolic fate of energetic amino acids in the aposymbiotic pea

aphid Acyrthosiphon pisum (Harris) (Homoptera: Aphididae). Symbiosis 21: 115-127.

Mots-clés : Métabolomique, Acyrthosiphon pisum, symbiose

32

O12

Développement d’une méthode d’extraction et d’analyse du métabolome de

coraux scléractiniaires.

Fahoullia Mohamadi, Isabelle Bonard, Cédric Bertrand et Bernard Banaigs

Laboratoire de Chimie des Biomolécules et de l'Environnement - EA 4215

Centre de Phytopharmacie, 52 av. Paul Alduy

66860 Perpignan Cedex

Le blanchissement des coraux fait suite à un dérèglement symbiotique causé par des perturbations

environnementales. Il se produit alors une rupture de la symbiose corallienne [symbiodinium-polype]. Le

métabolome est la dernière étape des voies métaboliques, ainsi tous les dérèglements environnementaux

susceptibles d’entrainer des modifications physiologiques des coraux, sont observables à ce niveau. Le

métabolome est par conséquent caractéristique d’un état physiologique. Afin de mieux appréhender le

phénomène de blanchissement, une approche globale de l’étude du métabolome de l’holobionte a été

entreprise. Elle consiste à réaliser des empreintes métaboliques en caractérisant un maximum de

métabolites afin d’identifier les diverses voies métaboliques perturbées suite au blanchissement des coraux.

Pour ce faire, une méthode d’extraction bi-phasique du métabolome corallien a été développée, et des

empreintes chimiques des extraits polaires et apolaires sont réalisées sur trois systèmes : en RMN, en HPLC-

MS-DAD et en GC-MS. La méthodologie mise au point permet le suivi d’une large gamme de métabolites

polaires et apolaires.

- L’extraction est réalisée par un mélange de solvants composés d’eau, de méthanol et de dichlorométhane

(H 2 0/MeOH/DCM). Un partage liquide-liquide permet de séparer les molécules polaires des molécules

apolaires et moyennement polaires/apolaire. Ces deux extraits sont analysés respectivement sur une colonne

polaire (Hilic), et sur une colonne apolaire (C6-phenyl) en HPLC-MS-DAD.

- Une fraction de l’extrait apolaire est transméthylée puis dérivatisée avant une analyse en GCMS sur une

colonne moyennement polaire (SPB-50) permettant le partage simultané des acides gras et des stérols.

-Parallèlement, des empreintes chimiques des phases polaires et apolaires sont réalisées en RMN du proton,

dans du D 2 O et dans du CdCl 3 respectivement.

Cette approche métabolomique couvre ainsi une large gamme de métabolites. Son développement s’est

appuyé sur des métabolites cibles caractéristiques et spécifiques des coraux scléractiniaires. Les efforts ont

été concentrés sur les métabolites dits secondaires (molécules spécifiques d’une espèce ayant des rôles

écologiques important, et par conséquent susceptibles de varier en fonction des conditions

environnementales) ainsi que sur les lipides, plus précisément les stérols caractéristiques des clades des

zooxanthelles, et les acides gras aussi spécifiques d’une espèce. Les métabolites susceptibles de varier lors

du phénomène de blanchissement des coraux ont également été ciblés, tels que les mycosporines like

aminoacids (MAAs), des petites molécules polaires photoprotectices synthétisées par les zooxanthelles.

Les méthodes d’extractions et d’analyses ont été optimisées et validées sur deux espèces de coraux

scléractiniaires Pocillopora damicornis et Stylophora pistillata, nos modèles d’études. La méthodologie

développée permet ainsi l’analyse en série de nombreux échantillons, elle est fiable, reproductible et

sensible.

Références bibliographiques : Baker A.C. Estuarine, Coastal and Shelf Science, 2008, Vol 80 : 435-471.

Hughes T. Science, 2003, Vol 301 : 929-933.

Braid.A.H. et al, Trends in Ecology and Evolution, 2008, Vol 24 :16-20.

Wu H. et al, Analytical Biochemistry, 2008, Vol 372 : 204-212.

Mots-clés : métabolomique, corail, blanchissement, empreintes chimiques, biomarqueurs, stress

33

O13

Application of both targeted and untargeted metabolomics approaches to assess

potential biological effects of simulated sonar signals on bottlenose dolphins.

Grégory Genta-Jouve 1, Dorian S. Houser

2, Angela E. Taylor

3, Wiebke Artl

3,

Mark R. Viant 1

1 Environmental Metabolomics Research Laboratory, School od Biosciences, University of Birmingham, Birmingham, UK

2 National Marine Mammal Foundation, San Diego, CA, USA

3 Centre for Endocrinology, Diabetes and Metabolism, School of Clinical and Experimental Medicine Institute of Biomedical

Research, Rm225, University of Birmingham, UK

.

The effects of underwater noise associated with naval activities have retained the attention of the

scientific community throughout the last decade. Multiple studies have reported the impact of such

sounds on marine mammals. In a search for a deeper mechanistic understanding of the effects of

underwater noise on marine mammals, and to explore potential biomarkers of the stress response,

we have employed a metabolomics approach to characterise the stress response of bottlenose

dolphins induced by simulated sonar signals.

Two approaches were used. A targeted approach focused on a single class of metabolites often

reported to be good indicators of stress in mammals. An untargeted approach investigated new

biomarkers of stress in dolphin serum. During the first part of the study, we developed a highly

sensitive UHPLC-QQQ method to quantify six steroids of interest (i.e. cortisone, cortisol,

corticosterone, 11-deoxycortisol, testosterone and progesterone). Each compound was identified

using both retention time and multiple reactions monitoring (MRM). The untargeted approach was

run on a UHPLC system coupled to a FT-ICR mass spectrometer in order to acquire very high

resolution mass spectra.

While the targeted approach did not yield significant results, the untargeted approach led to more

interesting findings. PLS-DA analysis of the different class of samples pre, test and post (i.e. before

the sound exposure, immediately following the sound exposure, and one week after the sound

exposure) yielded a robust model to discriminate dolphin samples before and after exposure to the

simulated sonar signal. Univariate statistical analyses of the data suggested that several tens of

compounds were involved in the stress response.

Identification of these biomarkers will improve our ability to identify and understand biologically

significant effects of sound exposure on marine organisms and especially marine mammals. This

should improve the effectiveness and efficiency of efforts to minimize the risks of anthropogenic

noise.

Mots-clés : bottlenose dolphins - simulated sonar signals - metabolomics - LC-FT-ICR

34

O14

Role de la régulation post-transcriptionnelle dans le contrôle du métabolisme

carboné

Olga Revelles 1,2,3,$

, Pierre Millard 1,2,3,$

, Jean-Philippe Nougayrède 4,5,6,7

, Ulrich Dobrindt 8 ,

Eric Oswald 4,5,6,7

, Fabien Létisse 1,2,3

, Jean-Charles Portais 1,2,3

.

$Premiers auteurs à contributions égales.

1 Université de Toulouse; INSA, UPS, INP, LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077 Toulouse,

2 INRA, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse,

3 CNRS, UMR5504, F-31400 Toulouse, France ;

4 INRA USC1360, 5 Inserm U1043,

6 CNRS UMR5282,

7 Université de Toulouse, UPS, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan (CPTP), F-31400 Toulouse, France,

8 Institute for Hygiene, University of Münster, 48149 Münster, Germany.

Le métabolisme est l’objet d’une intense régulation dont les composantes métaboliques et

transcriptionnelles sont largement étudiées. En revanche, le rôle de la régulation post-

transcriptionnelle dans le contrôle du métabolisme carboné a été très peu caractérisé. La

connaissance de ces mécanismes est pourtant essentielle pour relier l’expression du génome au

comportement métabolique final. Dans ce travail, nous avons analysé le rôle du principal système

de régulation post-transcriptionnelle chez la bactérie Escherichia coli, le système Csr (pour Carbon

Storage Regulator), dans la nutrition carbonée et le contrôle du métabolisme central de la bactérie.

Pour cela nous avons analysé les capacités de croissance de mutants affectés pour les différents

composants du système Csr (deux protéines CsrA 51 et CsrD, et deux petits ARN non codants

CsrB and CsrC) pour des sources de carbone représentatives de la principale niche écologique d’E.

coli (intestin). Puis nous avons analysé en détail l’impact de ces mutations sur le métabolome et le

fluxome de la bactérie. Nos résultats montrent que la protéine CsrA, qui est le constituant clé du

système Csr, est un déterminant important de l’’utilisation de ces sources de carbone

physiologiques. L’analyse fonctionnelle du métabolisme des mutants sur glucose et gluconate met

en évidence une réorganisation importante du métabolisme carboné central, indiquant un rôle

significatif du système Csr dans le contrôle du métabolisme carboné et énergétique (ATP et rédox).

De plus, la nature et l’importance de ces réorganisations dépendent de la source de carbone.

L’ensemble de ces résultats suggère un rôle significatif du système Csr dans l’adaptation

métabolique aux conditions de vie que rencontre E. coli dans l’intestin.

Mots-clés : métabolisme carboné, métabolome, fluxome, régulation post-transcriptionnelle

35

O15

Metabolomic study of the metabolites induction dynamics during fungal co-

culture

Samuel Bertrand 1, Antonio Azzollini

1, Olivier Schumpp

2, Nadine Bohni

1, Michel Monod

3,

Katia Gindro 2, Jean-Luc Wolfender

1.

1 School of Pharmaceutical Sciences, EPGL, University of Geneva, University of Lausanne, quai Ernest-

Ansermet 30, CH-1211 Geneva, Switzerland; 2 Mycology group, Agroscope Changins ACW, Route de Duillier, CH-1260 Nyon, Switzerland;

3 Departement of Dermatology and Venereology, Laboratory of Mycology, CHUV, CH-1011 Lausanne,

Switzerland

In their environments (such as soil, rhizospheres, plants, mucosal membranes and guts), fungi

are part of a microbial community where they constantly are in interaction. These interactions

activate silent genes that are not normally active under classical growth condition in laboratories.

These genes are particularly related to metabolite production such as pheromones, defence

molecules and metabolites of symbiotic associations [1]. This induction phenomenon was recently

illustrated to be a general consequence of fungal co-culture with a large panel of fungal interaction

tested [2, 3]. To explore in details the resulting fungal metabolome modifications, the design of the

experiment need to be devised to meet high analytical and biological reproducibility.

In order to tackle this issue a high throughput UHPLC-TOF-MS based metabolomic approach

has been developed for the screening of miniaturized 12-wellplates solid fungal co-cultures,

mimicking standard petri dishes growth conditions. The strategy provided reproducibility in

accordance to metabolomic standards [4]. It highlighted the induction of many metabolites. And the

time series used enabled to assess typical metabolites induction dynamic patterns during the

interaction between Aspergillus clavatus and Fusarium sp.

Acknowledgements: This work was supported by Swiss National Science Foundation Sinergia

Grant CRSII3_127187 (to J.-L. W., K. G. and M. M.)

Références bibliographiques : [1] K. Scherlach, C. Hertweck, Org. Biomol. Chem., 7 (2009) 1753-1760.

[2] S. Bertrand, O. Schumpp, N. Bohni, A. Bujard, A. Azzollini, M. Monod, K. Gindro, J.-L. Wolfender, J.

Chromatogr., A, (2013) DOI: 10.1016/j.chroma.2013.1001.1098.

[3] G. Glauser, K. Gindro, J. Fringeli, J.-P. De Joffrey, S. Rudaz, J.-L. Wolfender, J. Agric. Food Chem., 57

(2009) 1127-1134.

[4] E.J. Want, I.D. Wilson, H. Gika, G. Theodoridis, R.S. Plumb, J. Shockcor, E. Holmes, J.K. Nicholson,

Nat. Protoc., 5 (2010) 1005-1018.

Mots-clés : Aspergillus clavatus, Fungal Interactions, Fusarium, Solid Media Co-Culture, UHPLC-

TOF-MS Metabolomics

36

O16

Towards the development of metabolomics for marine micro-organisms

compounds discovery.

Yann Guitton

1,3 , Elodie Blanchet

1,2 , Marieke Vansteelandt

1 , Catherine Roullier

1,

Marie Geiger 1,3

, Ronan Le Bot 2 , Yves François Pouchus

1 and Olivier Grovel

1

1 Faculty of Pharmacy, University of Nantes, F-44035 Nantes, France;

2 ATLANTHERA, 1 rue Gaston Veil,

F - 44000 Nantes, France;

3 IFREMER, F-44311, Nantes, France

The significance of natural resources in the discovery of new bioactive compounds is still of

interest. The increasing research on microorganisms, especially from marine environments has

provided numerous structurally different secondary metabolites and original scaffolds, with relevant

activities for drug discovery. Metabolomics tools provide an efficient way of describing and

selecting interesting species but also help to target potential new drugs. In the course of our ongoing

research on bioactive fungal metabolites, a new species of the Penicillium genus was investigated,

as it led to the isolation of ligerin, a chlorinated sesquiterpene which exhibited a specific

antiproliferative activity against osteosarcoma cell lines and in vivo antitumor activity. Four marine-

derived strains of this species were then studied in order to describe their metabolome. While they

belong to the same new species, they exhibit clear morphotypic differences linked with the

biological activities of their culture extracts. Thorough investigations of their metabolic fingerprints

have been conducted by LC-HRMS/MS and the comparison of theses fingerprints was done

automatically using a combination of the well-known R packages XCMS & CAMERA and in-

house R scripts. The application of metabolomics to marine microorganisms studies needed the

development of an in-house workflow which enhances classical XCMS outputs. It allowed us to

point out new biomarkers differentiating two sub-types inside the investigated species and also to

identify some natural structural analogs of ligerin using an LC-MS/MS-based strategy: a

fragmentation modelization was established by thoroughly studying the fragmentation patterns of

both ligerin and purified or synthetized derivatives such as fumagillin, fumagillol and TNP470. The

use of this model allowed the detection and structural identification of several minor compounds

related to ligerin. This study shows the interest of LC-HRMS/MS analyses of the metabolome of

marine-derived fungi for the rapid identification and then the targeted purification of original

bioactive secondary metabolites in a chemical series.

Mots-clés : Metabolomic, Marine micro-organisms, natural products, secondary metabolites,LC-

HRMS/MS, R tools.

37

O17

Identification par spectrométrie de masse à haute résolution d’un nouveau

métabolite chez la bactérie du sol aérobie stricte Acinetobacter baylyi ADP1.

Lucille Stuani 123

, Christophe Lechaplais 123

, Ekaterina Darii 123

, Marcel Salanoubat 123

,

Alain Perret 123

1 CEA, DSV, IG, Genoscope, 2 rue Gaston Crémieux, Evry F-91057, France,

2 CNRS-UMR 8030, Evry F-91057, France

3 UEVE, Université d’Evry, Evry F-91057, France

Nous essayons de compléter l’inventaire des activités métaboliques chez la bactérie du sol

Acinetobacter baylyi ADP1 par différentes approches (génomique comparative, phénotypage de

croissance à haut débit, RNAseq…). Nous souhaitons notamment découvrir de nouvelles activités

enzymatiques par des approches métabolomiques.

Nous avons suivi l’adaptation du métabolisme de la bactérie à l’utilisation d’une source de

carbone alternative par spectrométrie de masse à haute résolution (LC LTQ/Orbitrap). L’étude

comparée des métabolomes de cellules se développant sur succinate (source de carbone de

référence) ou sur quinate (source alternative) a permis de mettre en évidence les différents

intermédiaires de cette voie catabolique bien caractérisée (au niveau génétique et biochimique).

Des études similaires effectuées sur des souches de Pseudomonas ont montré que les

principales variations de la composition en métabolites des cellules concernent surtout les

intermédiaires de dégradation des sources de carbone utilisées [1-2]. Cependant, chez ADP1, nous

n’avons pas observé de tel ‘core metabolome’ : dans notre étude, environ 40% des métabolites

détectés chez ADP1 présentent des abondances significativement différentes selon la source de

carbone. De plus, certains métabolites, non identifiés, sont présents uniquement sur quinate.

Nous nous sommes particulièrement intéressés à l’un de ces ions donnant un signal intense

dans les deux modes d’ionisation. L’interrogation des bases de données à partir de sa masse précise

n’a pas permis de proposer d’identité en accord avec la fragmentation observée.

Les fragmentations successives avec détection à haute résolution dans l’Orbitrap nous

permettent de penser que ce composé est très probablement une tyrosine modifiée contenant une

méthylamine en position beta. A notre connaissance, ce métabolite n’a encore jamais été décrit. La

démarche expérimentale conduisant à l’élucidation de cette structure et les mécanismes envisagés

seront abordés.

Ce travail confirme que la spectrométrie de masse à haute résolution peut être un outil de

choix pour l’élucidation de structure de nouveaux métabolites.

Références bibliographiques : [1] van der Werf MJ. et al. Mol. BioSyst., 2008, 4, 315

[2] Frimmersdorf E. et al. Environ. Microbiol., 2010,12, 1734

Mots-clés : métabolomique microbienne, LC-MS, élucidation structurale

38

O18

Understanding fatty acid synthesis in developing linseed embryos using

metabolic flux analysis

.

Sébastien ACKET 1, Mohamed KOUBAA

2, Albrecht ROSCHER

3, Brigitte THOMASSET

1

1 Université de Technologie de Compiègne, BP 20529, 60205 Compiègne Cedex, France

2 Department of Molecular Genetics, The Ohio State University, 1060 Carmack Rd, 053 Rightmire Hall,

43210 Columbus, OH, USA 3 Université de Picardie Jules Verne, 33 rue Saint Leu, 80039 Amiens Cedex, France

In oilseeds, lipids can be accumulated to relatively high levels, up to 50% of dry weight.

However, the mechanisms controlling oil storage are widely unknown and only few pathways were

revealed (e.g. in Brassica napus embryos [1]). This work specifically addresses major knowledge

gaps in biological mechanisms controlling oil accumulation in linseed ( Linum usitatissimum L.)

embryos. In order to understand fatty acid synthesis and oil accumulation in linseed embryos, 13

C

Metabolic Flux Analysis (13

C-MFA) was used as a tool to calculate carbon fluxes. Developing

linseed embryos aged 15 days after pollination were dissected under aseptic conditions and

incubated for 7 days in a medium containing [U- 13

C]glucose. After incubation, biomass and free

metabolites (free amino acids and organic acids) were extracted and the 13

C labeling was quantified

using GC-MS. The model of central metabolic pathways for developing linseed embryos was built

according to literature, and 13C-FLUX software [2] was used for quantifying the flux values. Our

results show first that, similarly to Brassica napus embryos [1], precursors for fatty acid synthesis

in linseed embryos are mainly generated from the plastid and the major precursors supporting fatty

acid synthesis are glucose 6-phosphate imported from the cytosol and pyruvate. Second, the malic

enzyme is not involved in the generation of plastidial acetyl-CoA unlike its contribution in cytosolic

acetyl-CoA in developing Brassica napus embryos [1]. Third, plastid envelope transporters between

the cytosol and the plastid rapidly exchange hexose phosphates and triose phosphates. All of these

results represent a key point in understanding fatty acid synthesis and oil accumulation in oilseed

plants.

Références bibliographiques : [1] J. Schwender, J.B. Ohlrogge, Y. Shachar-Hill, A flux model of glycolysis and the oxidative

pentosephosphate pathway in developing Brassica napus embryos, J. Biol. Chem. 278 (2003) 29442–

29453.

[2] W. Wiechert, 13C metabolic flux analysis, Metab. Eng. 3 (2001) 195–206.

Mots-clés : Metabolic Flux Analysis, developing flax embryos, lipids, fatty acids

39

O19

13

C-based metabolic flux analysis as a tool to unravel mechanisms involved in oil

accumulation in maize embryos

Mohamed Koubaa, Jean-Christophe Cocuron, Rebecca Kimmelfield, Ana Paula Alonso

The Ohio State University, Department of Molecular Genetics, Columbus, OH 43210, USA

To meet the growing demands of plant bioproducts for food, industrial applications and

biofuels, it is imperative to improve crop production. The aim of this study is to unravel the

mechanisms involved in biomass accumulation in maize ( Zea mays L.) embryos and gain insight

into the identification of possible targets for genetic modifications. It has been shown, by using the

powerful tool for metabolic engineering; 13

C-Metabolic Flux Analysis (13

C-MFA), that the

plastidic NADP-dependant malic enzyme is supplying 1/3 of the carbon and reductant for fatty acid

synthesis, in developing maize embryos accumulating 34% triacylglycerol (TAG; w/w) [1].

However, no study has been conducted to unravel the mechanisms of oil accumulation in high oil

storage maize lines. The present study consists of the development and comparison of carbon flux

maps between moderate oil (34% TAG, w/w) [1] and high oil (48% TAG, w/w) storage lines using 13

C-MFA. Our results, obtained for the high oil storage line, not only point out and confirm the key

role for plastidic NADP-dependant malic enzyme in supplying carbon and reductant for fatty acid

synthesis in developing maize embryos, but also demonstrate that the flux through this enzyme is

limited by its quantity. Those results are accompanied by enzyme activities performed in developed

maize embryos as well as a metabolomic comparison between the two studied lines demonstrating a

strong synergy between kinetic, metabolomic and fluxomic data.

Référence bibliographique : [1] A.P. Alonso, V.L. Dale, Y. Shachar-Hill, Understanding fatty acid synthesis in developing maize

embryos using metabolic flux analysis, Metab. Eng. 12 (2010) 488–497.

Mots-clés : Zea mays, Metabolic Flux Analysis, Metabolomics, Maize embryo, Fatty acid

synthesis, NADP-dependent malic enzyme

40

O20

Du raisin au vin de Champagne : Impact de la pourriture grise sur le

métabolome.

Young-Shick Hong 1, Jean-Marc Nuzillard

2, Agathe Martinez

2, Gérard Liger-Belair

1,3,

Philippe Jeandet 1, Norbert Hertkorn

4, Philippe Schmitt-Kopplin

4, Clara Cilindre

1,3

1 Laboratoire d’Oenologie et Chimie Appliquée, URVVC UPRES EA 4707, Université de Reims Champagne Ardenne,

BP 1039, 51687 Reims Cedex 2, France. 2 Institut de Chimie Moléculaire de Reims, Université de Reims Champagne-Ardenne, UMR CNRS 7312, Université de

Reims Champagne Ardenne, BP 1039, 51687 Reims Cedex 2, France 3 Equipe Effervescence Champagne et Applications, GSMA UMR CNRS 7331, Université de Reims Champagne

Ardenne, BP 1039, 51687 Reims Cedex 2, France. 4 Helmholtz-Zentrum Muenchen-German Research Center for Environmental Health, Institute for Ecological

Chemistry, Neuherberg, Allemagne.

En Champagne, l’un des principaux facteurs pouvant nuire à la qualité du raisin et du vin est la présence de

pourriture grise, conséquence de l’infection des raisins par le champignon Botrytis cinerea. En effet, les

conditions climatiques de cette région septentrionale sont souvent favorables au développement de B.

cinerea sur les baies, malgré l’application de traitements phytosanitaires. Cette contamination fongique a

pour effet de réduire le rendement de la récolte et a des répercussions négatives sur la qualité du vin. Elle

provoque notamment une forte altération des propriétés moussantes et du contenu en protéines des vins de

Champagne (Cilindre et al., 2007 et 2008). Afin de mieux comprendre la relation entre le degré d’infection

des raisins et la qualité des vins de Champagne, nous avons mené une recherche approfondie par RMN, sur

l’influence de l’infection des raisins par B. cinerea sur le profil métabolique du raisin et du vin. En effet, une

approche métabolomique par RMN permet notamment une meilleure compréhension globale sur la

physiologie de la vigne (Ali et al., 2009 et 2011) et sur les processus fermentaires du vin (Son et al., 2009).

Des échantillons de raisins, moûts et vins présentant différents degrés de pourriture grise ont été préparés.

L’ensemble des données obtenues ont ensuite été analysées par une étude statistique multivariée afin

d’évaluer l’influence de l’infection par B. cinerea sur le profil métabolique global.

Les résultats obtenus sur les raisins sains et botrytisés révèlent que deux voies métaboliques, l’une associée

aux mécanismes de défense de la plante et l’autre liée à la croissance du champignon sont simultanément

impliquées et provoquent des perturbations métaboliques dans les grappes de raisins botrytisées (Hong et al.,

2012).

Sur les vins élaborés à partir de raisins sains et botrytis, les métabolites les plus discriminants montrent

clairement que l’infection par B. cinerea conduit à un ralentissement de la fermentation alcoolique. En effet,

ces composés sont des produits de la fermentation. D’autre part, des teneurs élevées de plusieurs

oligosaccharides dans les vins botrytisés indiquent également une activité fermentaire des levures plus faible

(Hong et al., 2011).

Nos résultats mettent en évidence par une approche métabolomique globale l’incidence (au niveau

métabolique) d’une infection par B. cinerea sur les raisins et vins de Champagne.

Références bibliographiques : Cilindre C. et al. J.Proteome Res., 2008 , 7, 1199-1208.

Cilindre C. et al. Food Chem., 2007 , 103, 139-149.

Ali K. et al. J. Agric. Food Chem., 2009 , 57, 9599-9606.

Ali K. et al. Food Chem., 2011 , 124, 1760-1769.

Son H.S. et al. Anal. Chem., 2009 , 81, 1137-1145.

Hong Y.S et al. J. Agric. Food Chem. 2011 , 59, 7237-7245.

Hong Y.S et al. J. Exp. Bot., 2012 , 63, 5773-5785.

Mots-clés : Champagne, Botrytis cinerea, raisin, vin, métabolome, RMN

41

O21

Extension du profilage urinaire des stéroïdes par une approche stéroïdomique

pour le dépistage anti-dopage

J. Boccard 1, F. Badoud

2, S.S Ouertani

3,4, M. Hanafi

3,4, G. Mazerolles

5, N. Baume

2,

S. Rudaz 1, M. Saugy

2

1 School of Pharmaceutical Sciences, University of Geneva, University of Lausanne, Geneva, Switzerland

2 Swiss Laboratory for Doping Analyses, University Center of Legal Medicine, Lausanne, Switzerland

3 ONIRIS, Unité de Sensométrie et de Chimiométrie, Nantes, France

4 Université Nantes Angers Le Mans, France

5 INRA-UMR, 1083 SPO, INRA, Montpellier, France

Le profil stéroïdien est utilisé dans le cadre de la lutte anti-dopage pour déceler la prise

exogène de testostérone, ses précurseurs et ses métabolites, destinés à améliorer les performances

des athlètes. Cette approche qui repose sur le suivi de stéroïdes endogènes est toutefois limitée par

l’utilisation d’un nombre restreint de biomarqueurs. Un profil élargi pourrait donc permettre

d’améliorer la fenêtre de détection et d’augmenter la sensibilité des tests anti-dopage. Une méthode

analytique associant la chromatographie liquide à ultra haute pression (UHPLC) et la spectrométrie

de masse à temps de vol (TOF-MS) a été développée pour l’analyse des stéroïdes endogènes dans

l’urine. Cette méthode est appliquée aux échantillons issus d’une étude clinique visant à détecter les

modifications métaboliques engendrées par la prise orale de pilules de testostérone. Des

prélèvements d’urine sont effectués pour chacun des volontaires à différents temps après la prise.

L’ensemble de données obtenu présente donc une structure à trois entrées (volontaires x stéroïdes x

temps), dont il est nécessaire de tenir compte lors des traitements statistiques. L’analyse de données

proposée permet la construction de modèles décrivant la cinétique des modifications métaboliques

observées chez les volontaires et l’évaluation d’un profil élargi par rapport au profil stéroïdien

traditionnel pour le dépistage.

Les résultats obtenus illustrent l’apport des méthodes de modélisation multivoie pour

l’analyse de données issues d’études cliniques (structure à trois entrées) et l’évaluation d’une

fenêtre de détection. Cette approche stéroïdomique a permis la mise en évidence de nouveaux

biomarqueurs stéroïdiens associés à la prise orale de testostérone qui constituent des éléments

pertinents dans le cadre de la lutte anti-dopage et de l’établissement du passeport biologique de

l’athlète.

Références bibliographiques : [1] Baume N. et al. Effect of multiple oral doses of androgenic anabolic steroids on endurance performance

and serum indices of physical stress in healthy male subjects. Eur.J.Appl.Physiol. 98, 329-340, 2006.

[2] Andersson, C. A. et al. The N-way Toolbox for MATLAB. Chemometr.Intell.Lab. 52, 1-4, 2000.

[3] Boccard J. et al. A steroidomic approach for biomarkers discovery in doping control. Forensic Sci. Int.

213, 85–94, 2011.

Mots-clés : UHPLC-QTOF-MS, lutte anti-dopage, stéroïdomique, modélisation multivoie, biomarqueurs

42

O22 - Conférencier Invité

Plant Metabolomics: Challenges and Solutions 2013

Joachim Kopka

Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology (MPIMP), Applied Metabolome Analysis;

Department Prof. Dr. L. Willmitzer, Am Mühlenberg 1, Potsdam-Golm, 14476, Germany;

Phone + 49 (0) 331-567-8262; Kopka@mpimp-golm.mpg.de

The “Challenges and Solutions” 2013 talk will give a personal view on the development of plant

metabolomics from 1998 until today.

The current challenges of plant metabolomics and metabolic phenotyping will be discussed with

specific reference to the metabolomic challenges that were expressed in 2003-2006.

The talk will try to highlight instances where metabolomic challenges meet with solutions.

43

O23

Improving the understanding of the stimulating effect of Agrobacterium

rhizogenes on the tropane alkaloid biosynthesis pathway in Datura innoxia Mill.

using metabolite correlation networks

Kieu Oanh Nguyen 1 , Arnaud Lanoue

2 , Eric Gontier

1 , Rebecca Dauwe

1

1 Université de Picardie Jules Verne, BIOPI, UFR des Sciences, Ilot des poulies, 33 rue Saint Leu, 80039

Amiens cedex, France 2 Université François-Rabelais Tours, Plant Biotechnology and Biomolecules, Faculté des Sciences

Pharmaceutiques, 31 Avenue Monge, 37200 Tours, France

Scopolamine and hyoscyamine are two medically important tropane alkaloids that are synthesized

in the roots of Datura innoxia Mill.. Although the biosynthesis pathway has amply been studied

using isotopic markers, major questions persist up to today, such as concerning the role of hygrine

as a precursor. On the other hand, it is well known that transformation of D. innoxia with

Agrobacterium rhizogenes induces a strong increase in the production of scopolamine and

hyoscyamine. It remains unknown, however, if just the mere fact of an increase in the amount of

young root cells is at the origin of this increased production, or if specific biosynthetic steps are

stimulated.

Here, we quantified a large number of precursors and derivatives of scopolamine and hyoscyamine

in the roots of a large number of transformed and untransformed Datura innoxia individuals. These

metabolites were quantified and structurally identified using a combination of GC-MS and UPLC-

MS. Correlation networks of the metabolites strongly suggested certain architectural aspects of the

hyoscyamine-scopolamine biosynthesis pathways and identified rate limiting steps. Biosynthetic

steps that were specifically up-regulated in the A. rhizogenes transformed individuals were clearly

revealed. Our results suggest thus that metabolite correlation networks form a promising tool for the

unraveling of different biosynthetic pathways.

Mots-clés : Metabolite, Datura innoxia Mill., Agrobacterium rhizogenes, biosynthesis

44

O24

PROFILAGE METABOLIQUE DU PATHOSYSTEME LACTUCA SATIVA

/BREMIA LACTUCEA APRES APPLICATION DE STIMULATEURS DE

DEFENSES DES PLANTES

1 Floriant Bellvert,

1 Jihane Hamzaoui,

1 Fabien Repiquet,

1 Guillaume Meiffren,

2 Jérôme

Guerrand, 3 Brigitte Maisonneuve,

4 Marie-Lisa Brachet,

1 Gilles Comte.

1 CESN, UMR 5557, CNRS Université Claude Bernard Lyon1, Villeurbanne F-69622 France

2 Vegenov, Penn Ar Prat, 29250 Saint Pol de Léon France

3 INRA, UR1052, Domaine Saint Maurice, CS 60094, 84143 Montfavet Cedex, France 4 CTIFL, Centre de Balandran, 751 Chemin de Balandran 30127 Bellegarde France

La réduction de l’utilisation des pesticides est une composante essentielle de pratiques agricoles

durables et doit être en conformité avec la compétitivité de notre agriculture. Parmi les alternatives

de protection des cultures, les Stimulateurs de Défenses des Plantes (SDP) mettant en jeu les

défenses naturelles des plantes représentent un champ d’investigation important (Fahri Y., 2011).

Dans ce contexte le projet DefiLeg a pour objectif de développer des SDP d’origine naturelle pour

les cultures légumière en s’appuyant notamment sur des approches de types métabolomiques pour

le suivi de l’activation des défenses des plantes afin de mieux appréhender le fonctionnement des

SDP.

Cette étude a pour objectif de caractériser qualitativement et quantitativement le contenu en

métabolites secondaires qui jouent un rôle important dans les mécanismes de défenses des plantes

(Dixon et al., 2002), du pathosystème Lactuca sativa cv sensai / Bremia lactucea en présence de

SDP. Pour cela, nous avons réalisé le profilage métabolique des extraits méthanoliques de feuilles

de laitue par UHPLC/DAD/QTOF.

La première phase expérimentale a été réalisée en condition in vitro avec 9 SDP et 5 temps de

prélèvements encadrant l’inoculation du pathogène. 180 composés présentant une signature

spectrale UV et MS ont été analysés dans les extraits methanoliques. La famille chimique la plus

représentée est celle des phénylpropanoïdes dont un grand nombre d’acides cinnamiques conjugués

comme l’acide cafeoylmalique ou l’acide chicorique. Aucune modification sur le contenu en

métabolites n’est observée lors de la seule application des SDP. Par contre, 4 jours après inoculation

du pathogène, un profil métabolique différentiel est observé entre la condition témoin et certains

SDP. Ces modifications sont corrélées à l’efficacité des SDP sur l’état phytosanitaire de la laitue.

Nous avons ensuite suivi le profil métabolique des feuilles de laitue traitées avec les 2 SDP

sélectionnés pour leur efficacité en condition in vitro dans (i) des expérimentations en plein champs

sur deux stations expérimentales et sur deux années (2011 et 2012) et (ii) une expérimentation de

criblage des ressources génétiques de la laitue.

Références bibliographiques : Fahri Yigit. Acibenzolar-S-methyl induces lettuce resistance against Xanthomonas campestris pv. vitians (2011).

African Journal of Biotechnology. 10(47) : 9606-9612.

Dixon R. et al. The phenylpropanoid pathway and plant defence—a genomics perspective (2002). Molecular Plant

Pathology 3 : 371-39.

Mots-clés : Profilage métabolique, Metabolisme secondaire, Eliciteurs,

45

O25

Phénotypage métabolique de pommes de terre génétiquement résistantes à

différents parasites majeurs

Chloé Volant 1,2

, Nathalie Marnet 3, Jean-Eric Chauvin

4, Aymeric Goyer

1,5

1 INRA, UMR 1349 IGEPP, F-35653 Le Rheu, France

2 Université d’Orléans, F-45067 Orléans, France

3 INRA, UR117, F-35653 Le Rheu, France

4 INRA, UMR 1349 IGEPP, F-29260 Ploudaniel, France

5 Oregon State University, Department of Botany and Plant Pathology, Hermiston, OR 97838

La pomme de terre est la 3ème

production alimentaire mondiale. Il existe sur cette culture plus

de 60 pathosystèmes qui peuvent avoir une incidence économique, actuellement la priorité de la

recherche va à la mise en place de moyens de lutte adaptés pour limiter le recours aux produits

phytosanitaires. Dans le contexte du plan Ecophyto 2018, la lutte génétique connait un regain

d’intérêt, en particulier pour ce qui est des parasites majeurs (Phytophthora infestans, Globodera

pallida, Pectobacterium sp., Potato Virus Y). Les gènes et QTL de résistance identifiés par notre

équipe chez des espèces sauvages apparentées à la pomme de terre ont été transférés par

croisements sexués récurrents dans l’espèce cultivée. Il est important de déterminer si la résistance

est corrélée à la présence de composés biochimiques dans les tubercules qui pourraient avoir un

impact (positif ou négatif) sur la qualité, la valeur nutritionnelle, les effets santé et/ou la sécurité

alimentaire du produit consommé. Dans ce but, nous avons entrepris le phénotypage métabolique de

47 variétés de pommes de terre. Le choix de ces variétés est basé sur les niveaux de résistance aux

quatre parasites mentionnés ci-dessus. Dans un premier temps, nous travaillons sur la mise au point

de deux méthodes de dosage par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse

(MSn) et à un détecteur UV multi-longueurs d’ondes (UPLC-PDA, UPLC-PDA-MS) : une méthode

pour l’analyse et la quantification à la fois de différents composés phénoliques et des

glycoalcaloïdes majeurs de la pomme de terre; et une autre méthode pour l’analyse de plusieurs

vitamines hydrosolubles du groupe B. Ces méthodes ainsi que celles déjà mises en place sur la

plate-forme de métabolomique P2M2 sont ensuite utilisées dans la caractérisation des profils

métaboliques des variétés de pommes de terre, soit sur des tubercules, soit sur des produits

transformés. Les métabolites ciblés sont les suivants : composés phénoliques et glycoalcaloïdes,

acides aminés, sucres réducteurs, vitamines hydrosolubles (C, B1, B2, B3, B5, B6 et B9) et

acrylamide (pour les produits transformés). Ces familles de composés ont été choisies pour leur

importance dans des mécanismes de résistance aux maladies et/ou dans la qualité nutritionnelle. Des

analyses statistiques seront ensuite effectuées de façon à tenter de mettre en évidence des

corrélations significatives entre le niveau de résistance du matériel, son origine génétique et sa

teneur en certains composés.

Mots-clés : Solanum, phénotypage, métabolomique, marqueurs biochimiques

46

O26

Acclimatation du lin (Linum usitatissimum) au stress hydrique par la

réorganisation du métabolome induite par l’acide β-amino butyrique (BABA).

Anthony Quéro

1 , Ophélie Fliniaux

1 , Redouan Elboutachfaiti

1 , Xavier Guillot

2 , Corinne

Pau-Roblot 1 , François Mesnard

1 et Josiane Courtois

1 .

1 Laboratoire de BIOlogie des Plantes & Innovations UPJV, IUT / GB, Avenue des Facultés, Le Bailly, 80025 Amiens

Cedex, France. Email : queroanthony@yahoo.fr 2 Laboulet Semences, 1 rue Carnot, 80270 Airaines, France

Le lin (Linum usitatissimum) est traditionnellement cultivé dans les régions humides et tempérées (telle

que la Picardie) pour la qualité de ses fibres ou de ses graines riches en composés valorisables par leurs

activités pharmacologiques (acide α-linolénique, lignanes) [1]. Le lin est une culture respectueuse de

l’environnement qui nécessite peu de produits phytosanitaires et qui est peu exigeante en apport d’azote ou

de potasse. Malgré ces avantages, la production de cette plante est tombée en désuétude en France. Alors

qu’en 1850, le lin était cultivé sur plus d’un million d’hectares, aujourd’hui la surface allouée à la production

de cette linacée est limitée à quelques milliers d’hectares. Le lin est considéré comme pas assez rentable, trop

dure à récolter et trop peu productive (www.cetiom.fr).

Pour réhabiliter cette culture traditionnelle et dans un souci d’élargir la biodiversité en adéquation avec

la politique environnementale actuelle, un effort doit être fourni pour améliorer la compétitivité de cette

espèce. Cet effort doit s’effectuer par un gain au niveau de la productivité de cette culture en limitant

notamment les pertes de rendement attribuées au manque de disponibilité en eau dans le milieu extérieur.

Dans cette démarche d’amélioration de la tolérance au stress hydrique chez le lin oléagineux, les travaux

de cette étude ont fait intervenir un traitement par l’acide β-amino butyrique (BABA). Le BABA est un acide

aminé non protéinogène très peu représenté dans la nature dont l’efficacité à induire une amélioration de la

tolérance au stress hydrique a déjà été démontrée chez Arabidopsis thaliana [2], le pommier (Malus pumila)

[3] et le blé (Triticum aestivum) [4].

Les travaux conduits sur le lin oléagineux ont mis en évidence que les plantes préalablement traitées par

le BABA possèdent une teneur en eau plus importante en situation de stress hydrique que les plantes non

traitées. Cette amélioration de la tolérance s’accompagne par une légère diminution du potentiel osmotique

(PO) des feuilles. Cette déviation du PO n’est pas due à une accumulation nette de solutés mais est attribuée

à une modification du statut hydrique. Les résultats ont également souligné une forte réorganisation du

métabolome qui se traduit par une accumulation de solutés organiques et une diminution de la teneur en

solutés minéraux. La comparaison de la réponse métabolomique obtenue en condition de choc osmotique ou

après un traitement BABA a aussi permis d’établir qu’un chevauchement important existe entre ces deux

réponses.

L’ensemble de ces résultats montre que le BABA induit un stress hydrique léger chez le lin et suggère

que le BABA conduit à une acclimatation de la plante qui se traduit par une réorganisation du métabolome et

par une diminution du potentiel osmotique. Ces travaux offrent un regard nouveau sur les raisons

explicatives de l’amélioration de la tolérance au stress hydrique induite par le BABA chez les végétaux.

Références bibliographiques : [1] Touré A et Xueming X, CRFSFS, 2010, vol.9, pp. 261-269

[2] Jakab et al. , Plant Physiol, 2005, vol.139, pp. 267-274

[3] Macarisin et al., Plant Cell Environ, 2009, vol.32, pp. 1612-1631

[4] Du et al., J Exp Bot, 2012, vol. 63, pp. 4849-4860

Mots-clés : Linum usitatissimum, stress hydrique, BABA, metabolome, GC-MS

47

O27

Liquid chromatography-mass spectrometry based analysis of the cerebrospinal

fluid metabolome for the study of inborn errors of metabolism.

Amador M 1 , Lamari F

1,5 , Colsch B

2 , Mochel F

1,3 , Seguin F

4 , Sedel F

1 , Junot C

2

1 Neurometabolic Unit, Pitié-Salpêtrière Hospital, AP-HP & University Pierre and Marie Curie,

Paris, France. 2 CEA/DSV/iBiTec-S/SPI, Bâtiment 136, CEA/Saclay, 91191 Gif-sur-Yvette cedex,

France. 3 INSERM UMR S975, Brain and Spine Institute and Department of Genetics.

4 INSERM

U1082, University of Poitiers, Hôpital La Milêtrie, Poitiers, France. 5 Department of Metabolic

Biochemistry- Pitié-Salpêtrière Hospital, AP-HP

Introduction Many complex neurological disorders remain of unknown etiology despite extensive biochemical

and genetic work-up. These “unexplained encephalopathies” may be caused by inborn errors of

metabolism (IEM). Diagnosis of IEMs can usually be accomplished by the biochemical analysis of

biofluids (blood and urine in most cases) to highlight the consequences of an enzymatic or a

transport protein defect. However, biochemical analyses available at clinical chemistry laboratories

are restricted to well-known metabolites, and many metabolic pathways remain unexplored. By

enabling the concomitant detection of a wide range of metabolites in biological fluids in a single

analysis, metabolomics appears to be a relevant tool for the diagnosis of IEMs[1-3]. Regarding

disorders with predominant nervous system dysfunction, the cerebrospinal fluid (CSF) is the body

fluid more likely to be altered because of its proximity with neuronal and glial cells. In the present

pilot study, we aimed at evaluating liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS)-

based CSF metabolomics for the study and characterization of IEMs involving the nervous system.

Material and methods Patients. For this study, 79 CSF samples were selected from a biobank collected from adult patients

seen in the neurometabolic unit of the Pitié-Salpêtrière Hospital. CSF sample collection was

realized after written informed consent, in accordance with french ethical rules. Selected CSF

samples were classified into 4 categories: (i) 7 Negative controls without progressive neurological

disease, (ii) 12 patients with well-defined neurometabolic disorders, (iii) 60 patients having

unexplained encephalopathies, and (iv) 15 patients with various neurodegenerative diseases.

LC/MS based metabolomics. Hundred µl of CSF samples were deproteinized in microcentrifuge

tubes by adding 300 µl of methanol. Samples were vortexed and centrifugated. Supernatants were

evaporated to dryness under nitrogen and resuspended in 100 µl of water containing 0.1% of formic

acid. Five µl of a solution of internal standards were added to all samples. In addition, a quality

control CSF sample was injected every 10 samples in order to evaluate the analytical error at the

level of each metabolite. Samples were analyzed by ultra performance liquid chromatography

coupled to an ESI-LTQ-Orbitrap operated in positive and negative modes. Data processing and

treatment were performed as previously described [4].

Results The developed LC/MS and processing methods led to the identification of 104 metabolites in the

CSF. Statistical analyses indicated that physiological factors such as gender and age have no impact

on CSF metabotypes in the context of our study. CSF analysis revealed a specific abnormal

fingerprint in 4 out of 12 patients with confirmed metabolic diseases, emphasizing that the

48

possibility to measure metabolites not previously analyzed may be of help to depict underlying

pathophysiological mechanisms. For the others 8 patients, LC/MS analysis of the CSF was normal.

This can be explained by incomplete coverage of the whole metabolome. Furthermore, 22 of the 60

patients with unexplained encephalopathies presented at least one or more metabolites in an

abnormally high concentration. Among these 22 patients, our LC/MS study enabled the grouping of

3 patients, given the high number of common abnormalities detected in their fingerprints.

Interestingly, two of these patients have already been grouped from a previous NMR study in which

a significant elevation of free sialic acid was detected exclusively in their CSF [5].

In conclusion, The CSF profile of abnormal metabolites might provide new insights into the

pathogenic mechanisms of known diseases. In patients with unexplained encephalopathies, the

precise delineation of individual biochemical phenotypes makes LC/MS based metabolomics of

CSF a promising complementary tool to high throughput genetic approaches.

Références bibliographiques : [1] B.A.Binzak, R.A.Wevers, S.H.Moolenaar, Y.M.Lee, W.L.Hwu, J.Poggi-Bach, U.F.Engelke, H.M.Hoard,

J.G.Vockley and J.Vockley, Am J Hum. Genet., 68 (2001) 839.

[2] M.Oostendorp, U.F.Engelke, M.A.Willemsen and R.A.Wevers, Clin. Chem, 52 (2006) 1395.

[3] S.H.Moolenaar, G.Gohlich-Ratmann, U.F.Engelke, M.Spraul, E.Humpfer, P.Dvortsak, T.Voit, G.F.Hoffmann,

C.Brautigam, A.B.van Kuilenburg, G.A.van, P.Vreken and R.A.Wevers, Magn Reson. Med, 46 (2001) 1014.

[4] D.Darghouth, B.Koehl, G.Madalinski, J.F.Heilier, P.Bovee, Y.Xu, M.F.Olivier, P.Bartolucci, M.Benkerrou,

S.Pissard, Y.Colin, F.Galacteros, G.Bosman, C.Junot and P.H.Romeo, Blood, 117 (2011) e57-e66.

[5] F.Mochel, F.Sedel, A.Vanderver, U.F.Engelke, J.Barritault, B.Z.Yang, B.Kulkarni, D.R.Adams, F.Clot,

J.H.Ding, C.R.Kaneski, F.W.Verheijen, B.W.Smits, F.Seguin, A.Brice, M.T.Vanier, M.Huizing, R.Schiffmann, A.Durr

and R.A.Wevers, Brain, 132 (2009) 801.

Mots-clés : Chromatographie liquide, spectrométrie de masse, haute résolution, liquide céphalorachidien,

biomarqueurs, erreurs innées du métabolisme

49

O28

Untargeted metabolomics approach for the analysis of cerebrospinal fluid (CSF)

in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) patients using LC-HRMS method

Hélène Blasco 1,2,3

, Philippe Corcia1,2,7

, Pierre-François Pradat5, Cinzia Bocca

2,4, Charlotte

Veyrat-Durebex1,2,3

, Sylvie Mavel1,2

, Lydie Nadal-Desbarats1,2,3,4

, Caroline Moreau6, David

Devos6, Christian R Andres

1,2,3, Patrick Emond

1,2,3,4

1- Inserm U930, CNRS 2448, Tours, France

2- Université François-Rabelais, Tours, France

3-CHRU de Tours, Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, Tours, France

4- PPF, Université François-Rabelais, Tours, France

5-APHP, Fédération des Maladies du Système Nerveux, Centre Référent Maladie Rare SLA, Hôpital de la Pitié-

Salpêtrière, Paris, France

6-CHRU de Lille, Service de Neurologie, Lille, France

7- Centre SLA, Service de Neurologie, CHRU Tours, France

Background

Diagnosis of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) remains currently clinical owing to

identification of few biological markers. This mainly explains the delay of 9-12 months between

first symptoms and diagnosis (1). Metabolomics is a promising approach providing metabolic

profile of biological fluids. This method has been rarely used to explore neurological diseases (2,3,4

).

Among the high-throughput analytical platforms used in metabolomics, liquid chromatography

coupled to high-resolution mass spectrometry (LC-HRMS) appears the most powerful to obtain a

high sensitivity and mass accuracy (5). However it has never been used to perform metabolomics on

cerebrospinal fluid (CSF) in ALS.

Objectives

To devise a reliable methodology to compare CSF of ALS and non ALS patients using untargeted

metabolomics by LC-HRMS in order to (i) ascertain a metabolic signature of ALS patients and (ii)

identify metabolites for a potential use as diagnostic biomarkers or for pathogenesis understanding.

Methods

CSF samples were collected from ALS patients at the time of diagnosis and from controls. We

developed a method to analyze CSF components by UPLC coupled with a Q-Exactive Mass

Spectrometer using an electrospray ionization. We performed multivariate data analysis (OPLS-

DA) using R 2 and Q

2 values as representative of the model quality. We focused on discriminating

metabolites involved in our models and relevant compounds previously identified by other

metabolomics studies using univariate statistical analysis.

Results

66 CSF samples from ALS patients and 128 from patients with other neurological diseases were

analyzed. CSF metabolome analysis by LC-HRMS of ALS patients could predict a correct status in

more than 80% of cases. Among the features highlighted in these OPLS-DA models, 5 were found

highly differently expressed between both groups (p<0.004). These relevant compounds are

characterized by MS 2 and are currently under identification.

Conclusions: We developed a robust procedure to analyse a large cohort of CSF samples using LC-

HRMS method. Accordingly, a specific metabolic CSF profile has been highlighted in ALS

patients, suggesting the great interest to use these emerging technologies in diagnosis.

50

Références bibliographiques : 1- Rocchetti, I.; Taruscio, D.; Pierannunzio, D., Modeling delay to diagnosis for Amiotrophic lateral sclerosis: under

reporting and incidence estimates. BMC Neurol 2012, 12, (1), 160.

2-Quinones, M. P.; Kaddurah-Daouk, R., Metabolomics tools for identifying biomarkers for neuropsychiatric diseases.

Neurobiol Dis 2009, 35, (2), 165-76.

3-Blasco, H.; Corcia, P.; Moreau, C.; Veau, S.; Fournier, C.; Vourc'h, P.; Emond, P.; Gordon, P.; Pradat, P. F.; Praline,

J.; Devos, D.; Nadal-Desbarats, L.; Andres, C. R., 1H-NMR-based metabolomic profiling of CSF in early

amyotrophic lateral sclerosis. PLoS One 2010, 5, (10), e13223.

4-Wuolikainen, A.; Moritz, T.; Marklund, S. L.; Antti, H.; Andersen, P. M., Disease-related changes in the

cerebrospinal fluid metabolome in amyotrophic lateral sclerosis detected by GC/TOFMS. PLoS One 2011, 6, (4),

e17947.

5-Wang, X.; Sun, H.; Zhang, A.; Wang, P.; Han, Y., Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass

spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. J Sep Sci 2011, 34, (24), 3451-9.

Mots-clés : amyotrophic lateral sclerosis, cerebrospinal fluid, biomarkers, LC-HRMS, metabolomics

51

O29

Pharmaco-metabonomic investigation of acetaminophen toxicity on rat primary

hepatocytes in microfluidic biochips.

.

Claire Lopez 1 , Mathilde Bayet-Robert

1 , Marc-Emmanuel Dumas

2 , Jean-Matthieu Prot

3 ,

Alexandre Péry 4 , Céline Brochot

4 , Eric Leclerc

3 , and Bénédicte Elena-Herrmann

1

1 Université de Lyon, Centre de RMN à Très Hauts Champs, CNRS/ENS Lyon/ UCB Lyon 1, 5 rue de la

Doua, 69100 Villeurbanne, France. 2 Biomolecular Medicine, Department of Surgery and Cancer, Faculty of Medicine, Imperial College

London, Sir Alexander Fleming Building, London SW7 2AZ, United Kingdom. 3 Université de Technologie de Compiègne (UTC), Laboratoire de biomécanique et bioingénierie, CNRS

UMR 7338, BP 20529, rue Personne de Roberval, 60205 Compiègne Cedex, France. 4 Institut National de l’Environnement Industriel et des Risques (INERIS), Parc Technologique Alata, BP2,

60550 Verneuil en Halatte, France.

Microfluidic bioartificial organs enable the spatial and temporal control of cell growth and

biochemistry as well as the combination of organ-specific metabolic functions in endogenous and

xenobiotic metabolism 1. These properties are particularly relevant to testing the metabolic dose-

response and building extrapolation models in both pharmaceutical and environmental toxicity

screening. Thus, various microfluidic bioartificial organs have been proposed to reproduce human

organs.

Here we present a microfluidic bioartificial organ system combined with 1 H NMR-based

metabolomic study to characterize an analgesic drug (N acetyl-para-aminophenol or APAP)

toxicity. The objective of this systematic approach, based on innovative in vitro and in vivo

methodologies to predict toxicity of substances, is to characterize culture media for biochip

systems. This work is the continuity of a previous investigation carried out previously on hepatoma

cell line 2 . APAP is a model molecule to validate in vitro biochips systems in toxicology

approaches. We analyze using 1 H high-field NMR (800 MHz) the metabolomic profiles of rat

primary hepatocytes cultivated inside microfluidic systems (perfused dynamic system) with or

without acetaminophen. Differences between controls and samples exposed to APAP were observed

using supervised analysis. Acetaminophen met abolites such as its glucuronide conjuguate are

identified on the corresponding metabolic fingerprint, as well as a range of amino-acids. A better

differentiation between control and APAP is shown for long perfusion times (>24h). Results

obtained on rat primary hepatocytes are also compared with in vivo study on rat biofluids.

Références bibliographiques : 1. Baudoin R, Griscom L, Monge M, Legallais C, Leclerc, E. Biotechnol. Prog. 23, 1245 (2007).

2. Prot JM, Andrei Bunescu A, Elena-Herrmann B, Aninat C, Snouber LC, Griscom L, Razan F,

Bois FY, Legallais C, Brochot C, Corlu A, Dumas ME, Leclerc E, Toxicology and Applied

Pharmacology 259, 270 (2012).

Mots-clés : metabonomic, biochips, acetaminophen, toxicity, primary hepatocytes

52

O30

Characterization and localization of d18:2 sphingadienine based sulfatides in rat

cerebellum using 2D offline LC-HRMS and MALDI imaging in lipidomics.

Samia Boudah 1 ; Benoit Colsch

1 ; Christophe Junot

1 ; Amina S. Woods

2 .

1. Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments-SPI-IbiTec-S-CEA- France.

2. Structural Biology Unit, Cellular Neurobiology Section, NIDA IRP, NIH, Baltimore, MD, USA

Introduction: Sulfatides are a subclass of sphingolipids involved in several biological processes such as signal

transduction and cell recognition. In mammalian brain, sulfatides are present in cerebellar and

cerebral white matter areas. They are implicated in several neurological diseases such as

metachromatic leukodystrophy, or Alzheimer’s disease. Sphingosine (d18:1) represents the most

abundant sphingoïd base, as compared to sphingadienine (d18:2). Due to the high structural

diversity of sulfatide species, high resolution mass spectrometry is a powerful tool to detect low

abundance species. In this study, we have developed a 2D offline method based on a pre-separation

of sulfatide species before LC-HRMS analysis to characterize numerous sulfatide species. MALDI

imaging was used in parallel to localize these species in rat cerebellum.

Methods: For the imaging, a MALDI-LTQ mass spectrometer was used, while LC-HRMS was conducted on

an ESI-Orbitrap mass spectrometer. Brain tissue was obtained from male Sprague-Dawley rats and

was cut into thin sections (18 mm thickness) using a cryostat. Brain sections were collected onto a

MALDI sample target and the matrix of saturated 2, 6-dihydroxyacetphenone / 125 mM ammonium

sulfate and 0.5% HFBA were sprayed on the tissue section with an airbrush. Brain lipid extracts

were obtained using a Folch modified partition from adjacent rat tissue sections (± 2-3mg). The

lower phase containing sulfatide species underwent further separation using LCNH2 columns. The

resulting fractions were dried and dissolved in methanol prior to LC-HRMS or shotgun analysis.

Preliminary data: In this study, a lipidomic analysis of cerebellum tissue section extracts was conducted. The sulfatide

fraction were isolated from LC-NH2 column and analyzed by direct infusion and LC/HRMS then

compared to the total lipid extract (TLE). More than 30 sulfatide isoforms were identified according

to their exact mass, retention time and MS n

experiments. We demonstrated structural differences

not only on the fatty acid chain according to their length, presence of double bounds and

hydroxylations, but also on the sphingoïd base moiety. We have identified and characterized

different sphingoïd bases in rat cerebellum including sphingosine (d18:1) and sphingadienine

(d18:2). Direct infusion of LC-NH2 sulfatide fraction was more effective compared to TLE’s as

sulfatide species identification was not hampered by the presence of other isobaric species and ion

suppression. As an example, during shotgun experiments of TLE, the presence of the 13C isotope of

glycerophosphatidylinositol (GPI 38a:4) ( m/z 886.5527) makes the characterization of sulfatide (Su

d18:2/C24:1) ( m/z 886.6078) species difficult. Moreover, reverse phase chromatography coupled

with a high resolution instrument (RPLC-HRMS) brought an additional separation dimension in

support of the high mass accuracy. Using RPLC-HRMS methodology, low level sulfatide species

containing sphingadienine and sphinganine which are often undetected and/or uncharacterized by

MS n experiments were clearly separated and identified. Finally, MALDI imaging of all these

species was performed in rat cerebellum and show specific localization according to the nature of

53

the sphingoïd bases and the presence of hydroxylations in fatty acid chains. In addition, sulfatides

containing sphingadienine were mapped for the first time in mammalian brain and compared to the

major sulfatide species containing sphingosine. If the biosynthesis mechanisms of ceramides

containing sphingadienine remain unclear, the presence of this low level sphingoïd base already

shown to be present in ceramide, galactosylceramide and sulfatide species will lead to future

research on their cellular functions.

Mots-clés : Lipidomics, structural characterization, brain, imaging mass spectrometry, 2D offline

LC-MS

54

O31

Variations spectrales et IRM devant une masse cérébrale nécrotique

B Loiseau1, S Collet

1, JS Guillamo

1, F Kauffmann

1, C Sarrazin

2, F Mesnard

2, S Bouchoux

2, R

Benchimol2, S Valable

1, H. Vasseur

2, M Gaffez

2, M Kamsu

1, C Levy

1, E Emery

1, A Fichten

2,

M Lefranc2, J Peltier

2, A Coutte

2, R Verdon

1, E Lechapt-Zalcman

1, M Bauvois

2,

P Courtheoux1, H Deramond

2, D Legars

2, JM Constans

1,2

(1) CAEN - FRANCE, (2) AMIENS (CHU et BioFLOWIMAGE) - FRANCE

Objectifs Déterminer si les paramètres IRM et Spectroscopie par Résonance Magnétique (SRM) de 40

patients avec une masse cérébrale nécrotique (avec rehaussement périphérique après injection de

produit de contraste (gadolinium)) et non encore traitée permettent de discriminer les abcès, des

métastases et des tumeurs cérébrales gliales de haut grade glioblastomes (GBM).

Matériels et méthodes 40 patients tous biopsiés : 12 avec abcès, 11 avec métastases et 15 avec GBM furent étudiés avec

des séquences d’imagerie IRM (Sagittal T1, axial T2, FLAIR, T2*, diffusion, perfusion et 3D T1

après gadolinium) et de la SRM : 1H, simple volume PRESS (multiple TE à 1.5T et 3T (GEMS)).

Pour quelques cas le liquide de nécrose, le matériel biopsique ou le liquide cérébrospinal (LCS) a

été ou sera analysé in vitro par RMN in vitro, HRMAS ou CPMAS. Traitements des données

spectrales (par SRM): logiciels SA/GE (du constructeur GE), JMRUI et SCI-MRS-Lab (développé

au LMNO et CHU de Caen) calculant amplitudes, aires, ratios (Cho/Cr, CH2/Cr (de phospholipides

de nécrose) et NAA/Cr) et concentrations de métabolites. Analyse statistique des données

spectroscopiques et des données de diffusion et de perfusion et d’IRM standard par analyse en

composante principale et analyse discriminante.

Résultats Le coefficient apparent de diffusion (ADC) et les profils spectroscopiques aident à différencier dans

tous les cas les abcès des autres tumeurs nécrotiques. Les ratios Cho/Cr et CH2/Cr aident à

différencier les métastases des GBM : seuls 2 GBM sont mal classés.

Conclusion L’IRM, la diffusion, la SRM et la perfusion permettent très souvent (38/40) une classification non-

invasive des masses cérébrales nécrotiques.

Références bibliographiques : Patel TR, McHugh BJ, Bi WL, Minja FJ, Knisely JP, Chiang VL. Am J Neuroradiol. 32:1885-1892.

Chang SC, Lai PH, Chen WL, Weng HH, Ho JT, Wang JS, Chang CY, Pan HB, Yang CF, 2002. Clinical Imaging 26,

227–236.

Dorenbeck U, Butz B, Schlaier J, Bretschneider T, Schuierer G, Feuerbach S, 2003. Journal of Neuroimaging 13, 330–

338

Pal D, Bhattacharyya A, Husain M, Prasad KN, Pandey CM, Gupta RK. AJNR Am J Neuroradiol. 2010 31:360-6.

Arvinda HR, Kesavadas C, Sarma PS, Thomas B, Radhakrishnan VV, Gupta AK, Kapilamoorthy TR, Nair S, 2009. J

Neurooncol 94, 87–96.

Catalaa I, Henry R, Dillon WP, Graves EE, McKnight TR, Lu Y, Vigneron DB, Nelson SJ. 2006.NMR in Biomedicine

19, 463–475.

Bulik M, Jancalek R, Vanicek J, Skoch A, Mechl M, 2013. Clinical Neurology and Neurosurgery 115, 146–153.

Chaichana KL, Kosztowski T, Niranjan A, Olivi A, Weingart JD, Laterra J, Brem H, Quinones-Hinojosa A, 2010. J.

Neurosurg. 113, 286–292.

55

de Certaines JD, Le Moyec L, Seguin F, Eliat A, Constans JM. Current Organic Chemistry 2007 11:529-46

Fliniaux O et al. J Biomol NMR (2011, 51 : 457-465)

Dou W, Dong A, Chi P, Li S, Constans JM. IEEE Engineering in Medicine & Biology Society 2011 May:1-4

Constans JM, Collet S, Guillamo JS, Hossu G, Lacombe S, Gauduel Y, Houée Levin C, Dou W, Ruan S, Barré L,

Rioult F, Derlon JM, Lechapt-Zalcmann E, Valable S, Chapon F, Courtheoux P, Fong V, Kauffmann F. Journal of

Physics : Conference Series (JPCS) 2011;26:1-17

Mots-clés : IRM, diffusion, SRM, perfusion, masses cérébrales nécrotiques

56

O32

Existe-t’-il un profil métabolique associé à la sensation de faim ?

Mohamed N Triba1, Laurence Le Moyec

1, Elodie Etienne

1, Claire Gaudichon

2, Nadezda

Khodorova2, Daniel Tomé

2, Alain Paris

3.

1: METEVBO : UMR 7244-Université Paris 13-Sorbonne Paris-Cité et U902 Université d’Evry Val d’Essonne.

2:UMR 914, AgroParisTech.

3:U1012 Mét@risk, INRA, AgroParisTech.

A ce jour il n’existe pas de marqueur fiable de la satiété, qu’il soit métabolique ou hormonal. Pourtant, un tel

marqueur serait un outil primordial pour les nutritionnistes. Il permettrait d’optimiser les régimes

alimentaires en contrôlant la sensation de faim. Le but de notre étude est de déterminer 1) s’il existe un profil

métabolomique dépendant du délai qui existe entre la dernière prise alimentaire et le moment où la sensation

de faim est ressentie et 2) si ce profil est fonction de la composition qualitative du dernier repas.

Matériel et Méthodes

Nous avons analysé les plasmas de 7 sujets volontaires participant à une étude d’intervention nutritionnelle

Pour chaque sujet, l’étude durait 2 jours. Durant ces deux jours, ils consommaient soit un encas à base d’œuf,

soit un encas à base de fromage blanc. L’attribution du type d’encas consommé le premier jour était

déterminée par tirage au sort. Les deux encas étaient de même valeur énergétique et de même composition en

termes de macronutriments. Des prélèvements sanguins ont été effectués au moment de l’administration de

l’encas (P0) puis régulièrement (toutes les 20 à 30 min) jusqu’à la demande d’un repas (DR). Pour

l’ensemble des sujets le nombre de prélèvements entre P0 et DR variait de 3 à 8. Les prélèvements analysés

par RMN pour tous les sujets étaient les prélèvements P0 et DR ainsi que les seuls prélèvements

intermédiaires effectués 40 minutes après P0 et une heure avant DR. Avant l’analyse RMN, chaque

prélèvement (100 µl) a été dilué par 400 µl de PBS/D2O puis soumis à une expérience à 500 MHz de type

CPMG avec suppression du signal de H2O. L’analyse statistique multivariée (PCA et OPLS) a été effectuée à

l’aide d’un script écrit en langage Matlab.

Résultats.

Un premier modèle OPLS prenant en compte les deux types d’encas a été construit pour discriminer les

prélèvements P0 et DR. Les acides aminés branchés sont les métabolites les plus discriminants de ce premier

modèle. Un autre modèle prenant en compte uniquement les encas à base d’œuf met en évidence des

variations des lipides tandis qu’en prenant en compte uniquement les encas à base de fromage blanc l’OPLS

réalisée entre P0 et DR indique des variations des teneurs en acides aminés mais pas celles en lipides.

A chaque prélèvement, nous avons associé un indice I=T/T DR compris entre 0 (pour P0) et 1 (pour DR) et

exprimant de manière relative le moment du prélèvement (T) par rapport à la durée de la satiété (T DR ). La

projection des prélèvements intermédiaires sur le modèle OPLS discriminant P0 et DR indique une très forte

corrélation entre l’indice I et la variable prédictive du modèle.

L’utilisation des méthodes exploitant l’appariement des échantillons issus d’un même individu accroît de

façon significative les performances des différents modèles.

Conclusions.

Cette étude démontre la possibilité de déterminer par RMN un métabotype caractérisant la sensation de faim

et que ce dernier peut être spécifique du type d’encas. En fonction du temps relatif de la satiété (indice I), le

métabotype évolue d’un état métabolique correspondant à P0 vers un état correspondant à DR. Ce

métabotype pourrait être un outil potentiellement prédictif de l’état d’évolution de la satiété.

Mots-clés : Métabolomique, RMN, Nutrition

57

O33

Metabolomics reveals differentiated metabolic adjustments of normal and

overweight Subjects submitted to overfeeding.

B. Comte 1,2

, B. Morio 1,2

, JF. Martin 1,2,3

, A. Paris 4 , C. Junot

5 , Bernard Lyan

1,2,3 , Yves

Boirie 1,2

H. Vidal 6,7

, M. Laville 6,7

, E. Pujos-Guillot 1,2,3

, J.L. Sébédio 1,2

.

(1)-INRA, UMR 1019, UNH, CRNH Auvergne, F-63000 Clermont-Ferrand, France; (2)-Clermont Université,

Université d'Auvergne, Unité de Nutrition Humaine, BP 10448, F-63000 Clermont-Ferrand, France; (3)-INRA, UMR

1019, Plateforme d’Exploration du Métabolisme, UNH, F-63000 Clermont-Ferrand, France; (4)- INRA Met@risk,

AgroParisTech, F-75231 Paris cedex 05; (5)- CEA-LEMM, F-91191 Gif sur Yvette cedex; (6)- Institut National de la

Santé et de la Recherche Médicale Unit 1060, CarMeN Laboratory and Centre Européen Nutrition Santé, Lyon 1

University, F-69600 Oullins, France; (7)-Centre de Recherche en Nutrition Humaine (CRNH) Rhône-Alpes, Centre

Hospitalier Lyon-Sud, F-69310 Pierre Bénite, France.

Shifts in dietary pattern, food composition and processing as well as a modification in physical activity

are linked to nutritional transitions have led to an energy imbalance with an increasing prevalence of

overweight and obesity. Obesity is associated with increased risk of metabolic syndrome which is a complex

disease involving dysregulation of several metabolic pathways. The purpose of the present work was to

compare metabolic trajectories followed by free living non-obese overweight and lean subjects during a

moderate weight gain induced by a lipid-enriched supplementation of the diet. Metabolomics allowed us

determining early changes in metabolic signatures with indicators of metabolic alterations.

Thirty eight male adult subjects, 19 normal weight (BMI: 20-24.9 kg.m 2 ; NW) and 19 overweight

(BMI: 25-29.9 kg.m 2 ; OW) were recruited and submitted for 56 days to an overfeeding protocol consisting

in adding an excess of 3,300 kJ/d to their usual diet. Conventional anthropometric and metabolic parameters

were measured over time. Plasma and urine samples were collected at different time points for an untargeted

metabolomic approach. Deproteinized plasma and diluted urine samples were analyzed using UPLC-QToF-

Micro mass spectrometer. Univariate (ANOVA) and multivariate (OSC-PLS) models were used to explore

the kinetic differences between OW and NW subjects. Metabolite identifications were performed using

public databases and complementary analyses on a LTQ Orbitrap Velos high resolution mass spectrometer.

For most of the anthropometric, biochemical, metabolic parameters and for some plasma metabolomic

data, the phenotypes were discriminated at any time of the kinetic. On the whole, plasma metabolite

signatures evolve similarly in NW and OW subjects. In comparison with the NW, lower abundances of

plasma highly unsaturated lysophospholipids (LPs) were observed in OW while increased levels of saturated

LPs occurred with the intervention in both groups. Urinary metabolomic profiles clearly evidenced different

metabolic trajectories between groups, generally characterized in OW by an increase over time of short- and

medium-chain acylcarnitines and bile acids. Changes in metabolic signatures occurred at different time

points for the NW and OW volunteers. Therefore, the comprehensive metabolic profiling provided by

metabolomics revealed a differential response to the nutritional intervention in urine metabolomes of NW

and OW, indicating dissimilar metabolic flexibility. Changes with weight status of plasma and urine

metabolites, mostly related to modifications in fatty acid β-oxidation and metabolism, and inflammation

indicate a greater metabolic flexibility in NW subjects.

In conclusion, this study demonstrates that untargeted metabolomics allows detecting subtle metabolic

changes in linked to differences in metabolic flexibility that were not evidenced by a classical approach.

Mots-clés : metabolic trajectory, metabolomics, overweight, human nutritional intervention

58

O34

Effet de l’exercice à la vitesse lipox sur le métabolome hépatique de souris

obèses.

Laurence Le Moyec, Florian Messier, Mohamed Triba, Laurence Mille-Hamard, Véronique

Billat.

METEVBO : INSERM U902, Université d’Evry Val d’Essonne, UMR 7244, Université Paris 13-Sorbonne

Paris Cité.

L’un des moyens de lutter contre l’obésité est la pratique d’une activité physique à condition

d’être correctement dosée. Pour optimiser l’efficacité pour diminuer la masse graisseuse, il a été

proposé une activité physique d’intensité modérée correspondant à l’utilisation maximale des

lipides comme source d’énergie : lipox. Sur des souris obèses, nous avons recherché les effets

hépatiques d’un entrainement à leur vitesse lipox.

Les souris utilisées sont des souris ob/ob, n’exprimant pas la leptine, qui développent un

syndrome métabolique comparées à des souris « lean ». Pour chaque type de souris, les

performances ont été mesurées (vitesse critique et vitesse lipox) et la moitié de chaque groupe a été

soumis a un entrainement de 5 semaines à raison de 5 jours par semaines. Après cette période

d’entrainement, les souris sont sacrifiées et un échantillon de foie et d’urine ont été congelés.

Les foies ont été analysés par HR-MAS, à 500 MHz par une séquence CPMG et les urines en

sonde liquide avec une séquence noesy-1D. Les analyses statistiques multivariées ont été réalisées

par un script écrit sous Matlab.La comparaison des données obtenues sur les souris lean et obèses

non entrainées confirment le syndrome métabolique tant au niveau hépatique (stéatose) qu’au

niveau urinaire (diabète).

Les effets de l’exercice à Vlipox sont mis en évidence par le calcul d’un modèle OPLS pour les

souris obèses contrôles et entrainées. Pour les souris lean, un tel modèle ne peut pas être calculé.

Cette meilleure efficacité sur les souris obèses est confirmée par les variations de masse corporelle.

Chez les souris obèses, les effets hépatiques sont principalement des effets sur le métabolisme des

glucides avec une accumulation de glycogène chez les souris entrainées.

Ainsi cet entrainement à vitesse modérée s’est avéré efficace pour moduler les voies

métaboliques hépatiques de ces souris obèses en améliorant le stockage des glucides plutôt qu’en

diminuant l’accumulation des lipides.

Mots-clés : foie obésité RMN

59

O35

MetaboHUB : a National Infrastructure dedicated to metabolomics and

fluxomics

Rolin D, Agasse A, Bertrand-Michel J, Cole R, Colsch B, Colombié S, Deborde C, Debrauwer

L, Ferrara M, Fouillen L, Jacob D, Jourdan F, Jousse C, Junot C, Moing A, Portais JC,

Pujos-Guillot E, Thévenot E.

MetaboHUB, Bordeaux, Clermont-Ferrand, Paris-Saclay, Toulouse, France

In view of the critical role that metabolomics is already playing in the development of the knowledge-

based bio-economy, there is an urgent need to promote the development of this discipline in France in a

coordinated manner and with substantial resources. The MetaboHUB project aims at creating a national

infrastructure that will place France among the European leaders for advanced research services in

metabolomics and fluxomics. This infrastructure is an integration of four IBiSA platforms in the fields of

nutrition and health, agriculture, environment and biotechnologies. It will provide analytical and

computational expertise, tools and services to academic research teams and industrial partners.

In this lecture, the MetaboHUB Infrastructure will be presented as a National Platform which addresses

major life science trends and challenges listed in the French National Strategy for Research and Innovation

priorities. MetaboHUB focuses on developing tools which are not available yet, but are crucial to obtain

biologically relevant answers. MetaboHUB outputs will provide custom solutions for (i) relevant biomarkers

discovery and validation for personalized nutrition and medicine, and diagnosis of diseases with major socio-

economic impact such as obesity, cancer, cardiovascular, neurological pathologies and infectious diseases

(ii) the identification of stress indicators and biomarkers for plant and animal breeding programs and

agricultural practices, and (iii) the development of new tools to optimize microbial metabolic engineering

and create new synthesis pathway with industrial applications and (iv) dedicated bioinformatics and

biostatistics software modules for data processing, analysis annotation, and integration with other ‘omics’

technologies, biological networks reconstruction and disease modelling within a systems biology framework.

The first 4 years will focus on harmonizing, implementing and up-grading the four existing platforms

with common metabolomics and fluxomics tools (Bordeaux, Paris and surroundings, Toulouse and

Clermont-Ferrand). The following years will be dedicated to the rise in activity of the infrastructure that will

provide full services to biotech companies and national research projects (e.g. for the analysis of large patient

cohorts). The five main scientific and technological objectives are (i) to provide high-throughput,

quantitative technologies for biochemical phenotyping of large sets of samples (human epidemiological

cohorts, large sets of transgenic or non-genetically modified plants) with state of the art analytical

technologies and computational algorithms, and dedicated bioinformatics workflows, (ii) to identify

metabolites in human biofluids, and plant, microorganisms and animal cell extracts, through the

implementation and maintenance of centralized and open spectral repositories for metabolome annotations,

(iii) to develop large-scale flux profiling and sub-cellular fluxomics through integration of analytical data

from multiple analytical devices, and (iv) to provide access to high-impact services to the national scientific

community and industrial actors and, (v) to attract a new generation of scientists and users through the

promotion of metabolomics in education and the organization of training courses.

Tools and expertise will be made available to the metabolomics community through a dedicated

website, trainings, and partnerships within large set projects.

Mots-clés : Investissement d'Avenir, Infrastructure Nationale, Metabolomique, Fluxomique,

Bioinformatique

60

O36 - Conférenciers Invités

MetaboLights: towards a new COSMOS of metabolomics data management.

Kenneth Haug et Reza Salek

EMBL - European Bioinformatics Institute. Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, CB10 1SD, UK

61

Communications Flashs

F1-P1

Analyse métabolomique des composés participant à la symbiose Frankia-Alnus

Anne-Emmanuelle Hay 1, Antoine Buonomo

1, Laetitia Cotin

2, Thi Van Anh Huynh

1, Maria

Fernandez 2

et Aude Herrera-Belaroussi 2

1 CESN, Ecologie Microbienne, UMR 5557, ISPB, 43, Bvd du 11 novembre 1918, 69622 Villeurbanne Cedex

2 Ecologie Microbienne, UMR 5557, 43, Bvd du 11 novembre 1918, 69622 Villeurbanne Cedex

L’association entre Alnus spp et l’actinobactérie Frankia s’inscrit dans le cadre des symbioses

actinorhiziennes. Au cours de cette interaction plante-bactérie, Frankia induit chez sa plante-hôte la

formation d’un nouvel organe au niveau racinaire, le nodule, au sein duquel ont lieu des échanges

trophiques entre les deux partenaires. La bactérie fournit à l’hôte de l’azote réduit, grâce à sa

capacité à fixer l’azote atmosphérique, et bénéficie en retour des composés carbonés issus de la

photosynthèse de la plante. Les actinobactéries sont notamment connues pour leur résistance en

conditions environnementales défavorables (sécheresse, toxicité due à des métaux lourds,

antibiotiques…), souvent en lien avec leur capacité à sporuler. Toutes les souches de Frankia sont

capables de sporuler en culture pure. En revanche, seules certaines souches, dites Sp +, conservent

cette capacité en symbiose, à l’intérieur même des cellules végétales dans le nodule (sporulation in-

planta) [1,2]. Des différences génétiques sont déjà observées entre les souches Sp+ et les souches

Sp-.

Notre objectif est ici de mettre en évidence d’éventuelles molécules-signatures associées à la

présence ou à l'absence de spores du symbiote dans le nodule. Pour cette étude, à partir de 48

échantillons biologiques, nous avons réalisé une analyse exploratoire globale des métabolites

synthétisés dans les nodules ou les racines d' Alnus Glutinosa , prélevés sur des sites Sp+ ou Sp-

(N+ : extrait nodulaire d’un arbre Sp+, N- : extrait nodulaire d’un arbre Sp-, R+ : extrait racinaire

d’un arbre Sp+, R- : extrait racinaire d’un arbre Sp-). Les extraits polaires (MeOH/Eau) ont été

analysés par UHPLC/UV-DAD/ESI-QTOF afin de comparer les empreintes en métabolites

secondaires. Le contenu en sucres et acides organiques a également été analysé pour ces extraits,

par GC/MS-QQQ après dérivatisation. Les premiers résultats d'ACP obtenus montrent bien qu'il

existe des métabolites secondaires discriminants entre les extraits N+ et N-. Cette différence est

moins spécifique dans le cas des extraits racinaires. Ce qui peut s’expliquer par le fait que la

composition est modifiée au sein même de la symbiose.

Afin d'observer une éventuelle différence en fonction de l'hôte, nous avons réalisé le même travail

sur Alnus viridis. Les résultats sont en cours de traitement.

Références bibliographiques : 1- VandenBosch K, Torrey JG (1985) Development of endophytic Frankia sporangia in field- and

laboratory-grown nodules of Comptonia peregrina and Myrica gale. Amer. J. Bot. 72:99-108.

2- Van Dijk C (1978) Spore formation and endophyte diversity in root nodules of Alnus glutinosa

(L.) Vill. New Phytol. 81:601-615.

Mots-clés : Alnus, Frankia, symbiose, UHPLC, GC, sucres, métabolites secondaires

62

F2-P2

Complementarity of NMR and MS methods in metabolome analysis of dairy

cows’ urine

H. Boudraa, C. Thibaudeau

a, M. Traikia

c, JF. Martin

b, C. Bonnet

a, M. Lagree

c, C. Jousse

c,

E. Pujos-Guillotb & DP. Morgavi

a

a INRA, UMRH1213 Herbivores, F-63122 Saint-Genès-Champanelle, France

b INRA, UMR 1019, Plateforme d’Exploration du Métabolisme, Nutrition Humaine, F-63122 Saint Genès Champanelle,

France c ICCF, UMR 6296, Plateforme d'Exploration du Métabolisme, Université Blaise Pascal, 24 avenue des Landais, F-

63171 Aubière, France.

Metabolites produced by organisms have diverse chemical structures and properties. Due to this

complexity efforts to survey the entire metabolome rely on the implementation of multiplatform

approaches. In our study, a hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with mass

spectrometry and 1 H NMR spectroscopy (LC-MS/NMR) methods were developed to

simultaneously measure metabolic profiles in dairy cows’ urine. Urine samples were collected from

dairy cows fed two different levels of N with starch or fibre as the main energy source in a 4×4

Latin square design. The objective of this study was to develop and refine non-invasive markers of

rumen N efficiency.

For both NMR and MS data, PLS-DA models showed a clear separation of the four diets. Nine

urinary differential metabolites with a high VIP (variable important plot) were identified and

confirmed by 2D NMR. For LC-MS, several discriminant ions were observed and are currently

analysed for identification. However, only three metabolites found by NMR, i.e. hippuric acid,

phenylacetylglycine and allatoin were also found as markers using the MS method.

These results show that these two analytical techniques are complementary and when used

simultaneously offer a better coverage of the metabolome.

Mots-clés : LC-MS, NMR, nitrogen digestion, dairy cow, urine

63

F3

Bruker : outils et développements récents pour les applications en

métabolomique

Olivier Assemat et Sabine Jourdain

Bruker, 34 rue de l'Industrie, BP 10002, 67166 Wissembourg

olivier.assemat@bruker.fr, sabine.jourdain@bruker.com

64

F4-P4

Evaluation des conséquences métaboliques de deux régimes alimentaires chez la

truite arc-en-ciel par une approche métabolomique.

Blandine Madji Hounoum 1,2

, Catherine Deborde 2,3

, Mickaël Maucourt 2,4

, Annick Moing 2,3

,

Laurence Larroquet 1, Geneviève Corraze

1, Françoise Médale

1, Benoît Fauconneau

1

1 INRA, UR1067 NuMéA Nutrition, Métabolisme et Aquaculture, Pôle d’Hydrobiologie INRA, F- 64310 Saint Pée-sur-

Nivelle, France 2 Plateforme Métabolome Bordeaux du Centre de Génomique Fonctionnelle, IBVM, Centre INRA de Bordeaux, F-

33140 Villenave d'Ornon, France 3 INRA, UMR1332 Biologie du Fruit et Pathologie, Centre INRA de Bordeaux, F-33140 Villenave d'Ornon, France

4 Univ. Bordeaux, UMR1332 Biologie du Fruit et Pathologie, Centre INRA de Bordeaux, F-33140 Villenave d'Ornon,

France

L'aquaculture se développe pour répondre à l’augmentation de la demande en produits aquatiques

liées aux évolutions des pratiques alimentaires humaines. Cet essor de l'élevage aquacole engendre

une forte demande en huile et farine de poisson, produits à partir de la pêche et sources

traditionnelles de protéines et de lipides des aliments pour poissons. Or les volumes d'huile et farine

de poissons sont stables depuis plus de 20 ans pour protéger les ressources naturelles marines. Le

développement durable de l’aquaculture n’est concevable qu’en recherchant d’autres matières

premières protéiques et lipidiques que celles d’origine halieutique tout en étant compatibles avec les

besoins des poissons et la qualité des produits. De nombreux travaux menés dans le cadre de

plusieurs programmes européens ont permis d'augmenter la substitution des matières premières

d’origine marine par des matières premières d’origine végétale chez de nombreuses espèces de

poisson. Cette évolution doit impérativement se poursuivre pour affranchir l'aquaculture des

produits de la pêche. Les effets à long terme de la substitution totale sur les différentes fonctions

physiologiques et à certains stades critiques du développement restent à préciser. L'approche

métabolomique parait pertinente pour caractériser les changements globaux induits par

l'alimentation cependant elle n'a été que très rarement utilisée chez les poissons.

L’objectif de cette première étude, réalisée sur le modèle truite arc-en-ciel, vise (i) à caractériser des

aliments expérimentaux (matières premières d’origine marine vs d’origine végétale) par

spectrométrie de RMN du proton (RMN- 1 H) et (ii) à approfondir la connaissance des effets de ces

aliments sur le métabolisme du poisson par une approche métabolomique par RMN- 1 H sur fluide

biologique (plasma) et sur tissus (foie et muscle). Les résultats préliminaires de l’analyse du plasma

de truites nourries avec un régime à base de matières premières d’origine marine ou d’origine

végétale mettent en évidence des spécificités métaboliques selon la nature de l’aliment. Ils

démontrent qu’une approche métabolomique par RMN peut fournir des informations sur les

modifications induites par les matières premières alternatives et contribuer au développement de

nouvelles stratégies d'alimentation en aquaculture.

Remerciements: Les auteurs remercient vivement l’importante contribution de l’équipe technique

de l’unité NuMéA.

Financement : Projet européen ARRAINA Advanced Research Initiatives for Nutrition &

Aquaculture (FP7-KBBE-2011-5 N° 288925).

Mots-clés : Nutrition, Truite, Plasma, Métabolomique, RMN

65

F5-P5

Caractérisation du réseau métabolique de la micro-algue Chlamydomonas

reinhardtii en conditions photo-autotrophe par métabolomique et analyse des

flux en marquage instationnaire

Edern Cahoreau 1,2,3

, Arnaud Martzolff 4, Serguei Sokol

1,2,3, Guillaume Cogne

4, Lindsay

Peyriga 1,2,3

, Stéphane Massou 1,2,3

, Jean-Charles Portais 1,2,3

1 Université de Toulouse; INSA, UPS, INP, LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077 Toulouse, 2INRA,

UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse, 3 CNRS, UMR5504, F-

31400 Toulouse, France ; 4 LUNAM Université, Université de Nantes, CNRS, GEPEA, UMR 6144, Bât.

CRTT, 37 bd de l’Université, BP 406, F-44602 Saint-Nazaire Cedex, France

La capacité des micro-algues à convertir la lumière et le CO 2 en réserves énergétiques en font des

cibles potentielles pour la production de biocarburants. Cependant leur exploitation se heurte à des

verrous biologiques qui limitent le rendement de la conversion de l’énergie lumineuse et le stockage

énergétique. Pour exploiter les capacités métaboliques de ces organismes, une meilleure

compréhension de la photosynthèse et plus largement du métabolisme photoautotrophe est

nécessaire. Dans le cadre du projet ANR ALGOMICS (programme Bioénergies), nous avons étudié

le métabolisme de la microalgue modèle C. reinhardtii, en conditions photoautrophes par des

approches de métabolomique et de fluxomique 13

C. Cela a nécessité le développement d’une

approche de fluxomique en marquage instationnaire adaptée à l’analyse d’un métabolisme dans

lequel le CO 2 constitue la seule entrée de carbone. Cela a conduit à la mise en place d’une stratégie

analytique complète (échantillonnage, séparation des métabolites, méthodes d’analyse isotopique

par RMN et spectrométrie de masse). La mesure des flux intracellulaires dans ces conditions a

également nécessité le développement d’outils mathématiques modélisant la cinétique de

propagation du marquage et permettant ainsi de calculer les flux et les concentrations de

métabolites. Ce travail a permis en premier d’identifier la topologie fonctionnelle du réseau

métabolique actif en conditions photoautotrophes, montrant en particulier une compartimentation

complexe et une coordination du métabolisme chloroplastique et cytosolique pour couvrir

l’ensemble des besoins anaboliques et cataboliques des micro-algues. Nos résultats montrent

également un rôle principalement anabolique du métabolisme mitochondrial. La mise en place de

cette approche de fluxomique par marquage instationnaire nous a enfin permis d’établir la première

carte de flux réalisée d’un organisme eucaryote en condition photoautotrophe.

Mots-clés : Analyse de Flux, marquage 13C, photoautotrophie, microalgues

66

F6

Les Solutions Agilent technologies en Métabolomique

Luc Arnaud

Agilent Technologies France, Parc Technopolis ZA Courtaboeuf, 3 av du Canada, 91978 Les Ullis

cedex, France

luc_arnaud@agilent.com

Agilent metabolomics solutions are designed to address two major approaches:

Discovery Metabolomics involves acquisition of data in an untargeted mode, in which all

metabolites are detected to determine those that are significantly different between

experimental and control conditions.

Agilent has developed sophisticated tools for untargeted or "targeted" data mining, and these

metabolites are annotated and identified using Agilent's custom metabolite databases and spectral

libraries. The identified metabolites are then mapped onto biological pathways.

Quantitative Metabolomics is hypothesis driven. It may be used to confirm results from a

previous discovery based metabolomic profiling experiment or based on results from a

genomics and/or proteomics study. Typically a large number of samples is needed to

validate a few targets and has the advantage of absolute quantitation using analytical

standards.

Due to the diverse requirements of the systems studied, the chemical diversity of metabolites, and

their wide variation in abundance, metabolomics research usually requires multiple techniques –

GCMS, LCMS, CEMS, NMR.

67

F7-P7

NMR-based metabolomics profiling for identification of bevacizumab effect on

U87 cells

Tanja Mesti 1, Philippe Savarin

2, Mohamed N. Triba

2, Janja Ocvirk

3, Claire Banissi

1,

Antoine F Carpentier 4

University Paris 5, Laboratoire de recherche biochirurgicale. Hopital Européen Georges

Pompidou, Paris, France 1,

Université Paris 13, Sorbonne Paris Cité, CSPBAT, UMR 7244, CNRS, Bobigny, France 2 ,

Institute of Oncology Ljubljana, Slovenia 3 ,

Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Avicenne, Bobigny, France, 4

Background: Bevacizumab (Bev) is a monoclonal antibody targeting VEGF, which induces a high

rate of radiological response in malignant gliomas. However, concerns exist about increased tumor

cell invasiveness induced by Bev, possibly related to reduced blood supply and hypoxia. A direct

effect of Bev on tumor cells can also be advocated because glioma cells both secrete VEGF and

express low level of VEGF receptors, suggesting an autocrine loop.

We thus investigated the direct impact of Bev on U87 glioma cells metabolism recording 1D proton

spectra by High Resolution Magic Angle Spinning Spectroscopy (HR-MAS), to determine whether

Bev induces metabolic modifications that could make the cells either more invasive or resistant to

further treatments.

Material and methods: U87 cells were seeded into 25 cm 2 -Petri dishes in 5mL of culture medium

supplemented or not with a clinically relevant concentration of Bev (0,1 mg/ml). Cell proliferation

was assessed with the MTT cell proliferation assay (Sigma Aldrich, France). VEGFR expression

was checked with FACS flow cytometry (BD™ LSR II flow cytometer).VEGF secretion into the

medium was assessed with an ELISA kit for human VEGF (R&D Systems Abingdon, UK). For

HR-MAS experiments, after a 24-hour incubation, the cells were washed twice, scraped into PBS

with D 2 O and kept frozen at -80°C until analysis in a Bruker 500 MHz spectrometer. Finally,

OPLS analysis was run to determine metabolites that discriminate the different conditions.

Results: U87 cells secreted VEGF into the media (median conc. of 30 ng/ml), that can be

neutralized with Bev concentrations above 1µg/ml. U87 cells express low level of VEGFR2, but no

detectable VEGFR1. Proliferation of U87 cells was not affected by Bev. Using NMR spectra,

biomarkers which discriminate controls from Bev-treated cells were determined. The strongest

correlation obtained in the OPLS analysis concerned one metabolite located in the sugar region,

whose concentration was increased in Bev-treated samples. After assignment, this metabolite was

identified as trehalose which is actually an excipient contained in Bev. A second OPLS-model was

obtained after suppression of the sugar region, showing additional increases in choline and

glutamate in Bev-treated cells.

Mots-clés : NMR Cells VEGF

68

F8

Création d’une base de données de référence RMN et MS sur la base de données

expérimentales.

Yves Lorrain

ACD/Labs

yves.lorrain@acdlabs.com

69

F9-P9

Characterization of proanthocyanidins, adaptation and development of

methodology applied to polyphenols in cranberry.

David RENAUD1, Sylvain GUYOT

1, Philippe SANONER

2 et Hélène SOTIN

1

1 INRA, UR117 Recherches Cidricoles et Biotransformation Des Fruits Et Légumes, F-35653 Le Rheu

2 DIANA FOOD, Research & Development - Health & Nutrition Manager, F-35011 Rennes

Polyphenols are well known secondary metabolites. They are largely responsible for organoleptic

qualities, such as color, bitterness and astringency. In addition, polyphenols may have positive nutritional

effects. Polyphenols are also known for their health benefits. Indeed, the role of polyphenols as natural

antioxidants has drawn increasing interest in the prevention and treatment of cancer, inflammatory diseases,

cardiovascular and urinary tract infections [1].

In recent years, studies have been done on many matrices (apples, pomace, peel, dates, grapes, ciders,

wines, etc.) [1,2]. Cranberry (Vaccinium macrocarpon) remains unexplored; although it is increasingly

present in the European diet, mainly in the form of juice, dried fruit, jam and ingredients.

The aim of this work is to develop a method for the analysis of proanthocyanidins in cranberry and its

derivatives.

Polyphenols profiling was performed by high performance liquid chromatography (HPLC) in tandem

with mass spectrometry ion trap (MS) and UV detector. Extraction in water/methanol/formic acid (49/49/1

v/v/v) enabled the identification of proanthocyanidins in cranberry, including procyanidins A type. The four

products of acid-catalysis in presence of excess phloroglucinol (m/z 289; 413; 575 and 699) provided an

estimate of the total amount of proanthocyanidins, composition and degree of polymerization (mDP) and the

nature of the constituent units [3].

Quantification is a problem because the ions of m/z 289 and m/z 699, corresponding to epicatechin and

phloroglucinol adduct of procyanidin A2, gives an overlap with UV anthocyanins. Two hypotheses are then

explored:

1. Selective extraction to remove anthocyanins.

2. Quantification by mass spectrometry by comparison with standards.

The development of this method goes through different stages:

- Sample preparation:

o Extraction

o Purification

- Optimization of analytical parameters:

o LC (gradient, etc ...)

o MS (ionization mode, etc ...)

o UV light (wavelength, etc ...)

- Analysis by LC-UV-MS

- Complete Method Validation

- Implementation on an industrial scale

Références bibliographiques : - [1] H.HAMMOUDA et al. Ital. J. Food Sci., vol 23-2011: 404-414

- [2] A.RRODRIGUEZ-MATEOS et al. J. Agric.Food Chem 60-2012: 5772-5778

- [3] J.KENNEDY et al. J. Agric.Food Chem 49-2001: 1740-1746

Mots-clés : Polyphenols, LC-MS

70

F10-P10

Développement de techniques de préconcentration pour faciliter l’identification

de biomarqueurs lors d’analyses métabolomiques

Nicolas Dalle, Bernard Lyan, Estelle Pujos-Guillot

INRA, UMR 1019, Plateforme d’Exploration du Métabolisme, UNH, F-63000 Clermont-Ferrand, France

Parmi les nombreuses problématiques liées aux analyses métabolomiques, l’une d’entre elles

concerne la présence, dans les échantillons, de nombreux métabolites dont la concentration est très

faible. Cela entraîne des difficultés dans leur identification par spectrométrie de masse (MS) ou

RMN puisqu’il est nécessaire d’avoir une quantité suffisante de composé pour envisager des études

structurales. Pour remédier à cette problématique, la préconcentration des métabolites est une

solution efficace, avec l’existence de différentes techniques pour la préparation des échantillons.

Quatre d’entre elles sont régulièrement citées dans la littérature, ce sont la Solid Phase Extraction

(SPE) [1], la Supported Liquid Extraction (SLE) [

2], la Solid Phase MicroExtraction (SPME) [

3,4] et

la Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) [5,6

]. Ces méthodes sont toutes basées sur les phénomènes

d’adsorption (SPE et SPME) ou d’absorption (SBSE et SLE) des métabolites sur des matrices, qui

vont interagir selon les polarités ou les charges de ces molécules.

Cependant pour la plupart de ces techniques, la matrice adsorbante ou absorbante proposée est le

plus souvent spécifique d’une famille de métabolites, alors qu’il est plus intéressant, dans le cadre

d’une approche métabolomique globale, de ne pas faire de sélection lors de l’étape de

préconcentration pour obtenir un grand nombre de molécules avec des polarités et des charges très

différentes. L’objectif sera donc de trouver des matrices pouvant extraire et concentrer des

métabolites de propriétés physico-chimiques variées. Pour optimiser l’efficacité de la concentration

des métabolites d’intérêts par ces méthodes, l’utilisation de la collecte de fractions pourra permettre

de séparer les métabolites selon leurs temps de rétention et ainsi les regrouper selon leurs polarités.

Les différentes techniques ont été testées avec des matrices adsorbantes et absorbantes diverses

sur des solutions de standards comprenant des acides aminés, des acides gras et organiques, des

phospholipides, des hormones, des carnitines, des amines, des nucléosides, des peptides et d’autres

molécules à différentes concentrations et dont la gamme de log P varie de -3,52 à 7,23. Ces

techniques ont ensuite été expérimentées sur des échantillons biologiques complexes, comme du

plasma et/ou de l’urine, pour valider leur efficacité. Les analyses des échantillons ont été réalisées à

l’aide d’une chaîne uHPLC Dionex Ultimate3000 couplée au spectromètre de masse haute

résolution LTQ-Orbitrap Velos (Thermoscientific).

L’efficacité de chaque technique est déterminée par comparaison des intensités des signaux

détectés en masse avant et après les extractions réalisées. Les différentes techniques sont en cours

de validation.

Références bibliographiques : [1] Álvarez Sánchez et al. Journal of Chromatography A, 1207, 46-54 (2008).

[2] Gong et al. Talanta, 91, 77-82 (2012).

[3] Bojko et al. Analytica Chimica Acta, 750, 132-151 (2012).

[4] Vuckovic D, Pawliszyn J. Anal. Chem., 83, 1944-1954 (2011).

[5] Baltussen et al. J. Microcolumn Separations, 11(10), 737-747 (1999).

[6] Xu et al. Journal of Chromatography A, 1278, 8-15 (2013).

71

F11

Development of a Metabolomic/Lipidomic Platform Based on a Hybrid

Quadrupole Time-Of-Flight (QTof) Ion-Mobility Mass Spectrometer.

José Portela

Waters Corporation, Saint-Quentin-en-Yvelines cedex, France

jose_portela@waters.com

Metabolomics/Lipidomics represents a paradigm shift in metabolic research, away from

approaches that focus on a limited number of enzymatic reactions or single pathways, to approaches

that attempt to capture the complexity of metabolic networks. Additionally, the high-throughput

nature of metabolomics makes it ideal to perform biomarker screens for diseases or follow drug

efficacy. Mass spectrometry is highly discriminatory for a large range of pathological processes

which makes it the principal tool for metabolomics studies.

Recent technological advances in high resolution mass spectrometry and informatics, which

combine chromatogram and ion-mobilty alignment (HDMSETM), possesses clear analytical

advantages and are specifically designed to address the new challenges of very complex samples in

metabolomic/lipidomic.

This acquisition and processing strategy provides a 100% duty-cycle accurate mass analysis of

all detectable parent and product ion informations in a complex mixture. The exact mass

information obtained provides an information rich dataset with more definitive descriptors of the

molecules.

We will illustrate the utility of both the hardware (Synapt G2-S HDMSTM

) and software

(TransomicsTM

) developed for metabolomics/lipidomic work-flow analysis in this talk with real

application examples.

72

F12-P12

Signal processing and data analysis for non-targeted detection of unknown

contaminants in food

Natacha Lenuzza1, Julie Foucquier

1, Jérome Cotton

2, Victor Sabarly

2, Christophe Junot

3,

Bruno Corman2, Etienne Thévenot

1

1 CEA, LIST, Laboratory of Tools for Data Analysis, Gif-sur-Yvette, France

2 Profilomic, CEA-Saclay, Gif-sur-Yvette, France

3 CEA, DSV, iBiTecS, Pharmacology and Immunoanalysis Unit, Gif-sur-Yvette, France

In the food industry, contaminations of raw materials propagate exponentially to all end-products, sometimes

with devastating health and economic consequences. The AgriFood GPS consortium

(http://agrifoodgps.sharepoint.com) aims to develop innovative services to detect chemical and

microbiological contamination and fraud based on untargeted metabolomic approaches. The AgriFood GPS

project is partly financed by OSEO, a French public sector institution that provides support for innovation.

Current targeted screening of chemical contaminants (pesticides, drug residuals, and adulterations) relies on

MS/MS methods that are specific to single molecules. Development of non-targeted metabolomics by liquid-

chromatography coupled to high resolution mass spectrometry (LC-MS) could provide a means of

simultaneously identifying all molecules of interest, and even detect the presence of unknown, potentially

hazardous molecules [1]. However signal processing and data analysis of LC-MS data to detect unknown,

trace contaminants remain a challenging task that is poorly addressed.

Despite its strengths, classical pre-processing of data using the XCMS package for R software [2] is not

optimal for food contaminant detection: parameters required to maximize the number of detected compounds

and to detect trace contaminants lead to high dimensional peaklists (~ tens of thousands of variables) with

many false positives and non-robust intensities among replicates. In this study, we propose an optimized

filter approach to remove such noisy variables that could mask the identification of putative contaminant

signals from the peak list.

We used a metabolomics dataset containing 156 wines samples (52 wines from different regions, 3 replicates

per wines) in which contaminants were previously identified by targeted screening. We performed a robust

thresholding of the XCMS peaktable ( i.e. selection of the variables whose intensities in all the replicates are

superior to a threshold determined by cross-validation using the known contaminants). The quality of the

positive variables was then evaluated using chromatogram-based criteria (maximum, entropy [3], CODA

[4]), leading to a sensitivity of 89% and a specificity of 95% for the detection of 16 known contaminants.

Further work will consist in generalizing our approach by using a dedicated dataset (water spiked with a pool

of contaminants in various concentrations, with several technical replicates) in order: 1) to optimize the

number of replicates for robust thresholding, 2) to precisely evaluate the number of false warnings, and 3) to

assess complementary peak quality metrics.

Références bibliographiques : [1] García-Reyes et al. (2007). Comprehensive screening of target, non-target and unknown pesticides in food by LC-

TOF-MS. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 26:828-841.

[2] Smith et al. (2006). XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak

Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry, 78:779-787.

[3] Krishnan et al (2012). Instrument and process independent binning and baseline correction methods for liquid

chromatography-high resolution-mass spectrometry deconvolution, Analytical Chimica Acta, 740:12-19.

[4] Windig et al (1996). A noise and background reduction method for component detection in liquid

chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry, 68:3602-3603.

Mots-clés : Food; Liquid chromatography; Mass spectrometry; Non-target analysis; Unknown analysis; Data

processing

73

F13-P13

Nouveaux outils pour l’implémentation et l’utilisation de la RMN 2D

ultrarapide

Patrick Giraudeau, Benoît Charrier, Meerakhan Pathan, Illa Tea, Serge Akoka

Université de Nantes, CNRS, CEISAM UMR 6230, Nantes, France

La RMN 2D ultrarapide a littéralement révolutionné la spectroscopie bidimensionnelle en

permettant l’obtention de spectres 2D en une fraction de seconde. 1 Au cours des dernières années,

nous avons fortement amélioré les performances analytiques de cette méthodologie. 2 Cela nous a

permis de l’appliquer à un grand nombre de problématiques, allant de l’étude de réactions rapides 3

au couplage HPLC-RMN. 4 Nous avons récemment démontré l’intérêt d’approches 2D et 3D basées

sur la RMN ultrarapide pour l’analyse quantitative, dans le domaine de la métabolomique 5 et de la

fluxomique. 6

En dépit de ses performances remarquables, la RMN ultrarapide reste sous-utilisée : à ce jour,

moins d’une dizaine d’équipes ont fait mention de son utilisation. Cela est principalement dû aux

paramètres et séquences d’impulsions spécifiques qui gouvernent les acquisitions correspondantes,

rendant difficile leur implémentation et leur utilisation en routine. Afin de rendre la RMN

ultrarapide accessible aux non-spécialistes, nous avons développé une interface web offrant tous les

outils nécessaires à sa mise en œuvre. 7 Elle comprend un protocole d’implémentation, ainsi qu’une

interface conviviale permettant de traduire les paramètres conventionnels (largeurs spectrales,

offsets) en paramètres ultrarapides spécifiques (gradients, impulsions sélectives).

Références bibliographiques :

[1] Frydman, L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99 : 15858-15862.

[2] Giraudeau, P., Akoka, S., J. Magn. Reson., 2010, 205 : 171-176.

[3] Queiroz, L.H.K. et al. Magn. Reson. Chem, 2012, 50 : 496-501

[4] Queiroz, L.H.K. et al. Analyst, 2012, 137 : 2357-2361

[5] Le Guennec, A. et al. , Anal. Chem., 2012, 84 : 10831-10837.

[6] Giraudeau, P. et al. , Anal. Chem., 2011, 83 : 3112-3119.

[7] Pathan, M. et al. , Magn. Reson. Chem, 2013, 51 : 168-175

Mots-clés : RMN, développements méthodologiques, RMN 2D ultrarapide

74

F14

Nouvelle génération de spectromètres de masse ultra performants pour les

analyses métabolomiques globales et ciblées.

Claire Dauly

Thermo Fisher Scientific, 16 Avenue du Québec - SILIC 765

91963 COURTABOEUF CEDEX

Claire.dauly@thermofisher.com

75

F15-P15

Data processing optimization through batch normalization and orthogonal

variation inspection: Application to a cohort study to define a reference urine

human metabolome

Julie Foucquier1*

, Aurélie Roux2*

, Natacha Lenuzza1, Ying Xu

2,

Christohe Junot2, Etienne Thévenot

1

1 CEA, LIST, Laboratory of Tools for Data Analysis, Gif-sur-Yvette, France.

2 CEA, DSV, iBiTecS, Pharmacology and Immunoanalysis Unit, Gif-sur-Yvette, France

*Equally contributed to this work

In metabolomic studies involving large cohorts of patient samples by liquid chromatography

coupled to high resolution mass spectrometry (LC-HRMS), various systematic biases (sample

preparation, acquisition conditions, instrumental drift) often hamper the discovery of true

biomarkers. Several normalization methods relying on regression with pooled quality control (QC)

samples have been proposed recently (Dunn et al., 2011). In addition, new modeling approaches

such as orthogonal projection to latent structures (O-PLS) offer the opportunity to separately study

the systematic variation and the contribution to the factor of interest (Pinto et al., 2012).

Here we combine both strategies to analyze urine samples from a 227 healthy volunteer cohort

(Roux et al., 2012) in order to define a human reference metabolome. By using nonlinear regression

with periodic QC samples followed by O-PLS modeling of age, gender and body mass index (BMI)

responses, we were able to 1) correct intensity drift over injection order, 2) detect outliers, 3)

integrate three different batches, and 4) identify a set of metabolites associated with the covariates:

these metabolites will be useful as a control in biomarker studies to avoid confounding effects of

age, gender, and BMI.

All algorithms have been implemented within an in-house R package so that they can be readily

integrated within existing workflows. All numerical and graphical results obtained with the PCA,

PLS and OPLS methods included in the package have been cross-validated with the SIMCA-P

software (Version 11).

Références bibliographiques : Dunn et al. (2011). Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas

chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols, 6 :1060-

1083.

Pinto et al. (2012). Advantages of orthogonal inspection in chemometrics. Journal of Chemometrics, 26:

231-235.

Roux et al. (2012). Annotation of the Human Adult Urinary Metabolome and Metabolite Identification

Using Ultra High Performance Liquid Chromatography Coupled to a Linear Quadrupole Ion Trap-

Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry, 84: 6429-6437.

Mots-clés : normalization, OPLS-DA, data processing, chemometrics

76

F16

Targeted and Untargeted Metabolomics - Using TripleTOF® 5600

+ System

Technology

Henri Nicar

AB SCIEX, 3 avenue du Canada, Parc Technopolis – Bâtiment Sigma, 91940 LES ULIS France

henri-michel.nicar@absciex.com

The metabolome is difficult to characterize; there is a wide dynamic range of concentrations of

metabolites, which are chemically and structurally diverse with various polarities and sizes.

Creating a single analytical method for all these components is challenging. With global profiling

techniques, the aim is to detect and quantify as many metabolites as possible. Once features of

interest are identified they need to be quantified. Information dependent acquisition (IDA) provides

useful MS/MS information, based on the user selected criteria to prioritize candidates for

fragmentation. Both the TripleTOF® 4600 and TripleTOF® 5600+ systems are capable of

delivering high resolution, quantitative, accurate mass data with high acquisition rates, enabling MS

and MS/MS information to be acquired in a single acquisition. Speed is crucial to the workflow,

enabling MS/MS information to be collected for as many features as possible, providing a

quant/qual workflow on one system!

77

Communications Posters

P17

Analysis of the interactions between seedcoat and embryo metabolites using

NMR metabolomics in flaxseed (Linum usitatissimum)

Miart F., Pageau K., A. Ramsay, Fontaine JX., Bouton S., Fournet F., Van Wuytswinkel O.,

Thomasset Bb

& Mesnard F.

aEA3900 BIOPI Biologie des Plantes et Innovation, UFR des Sciences, 33 rue Saint Leu, F-80039 Amiens

France bCNRS UMR6022 Génie Enzymatique et Cellulaire, Université de Technologie de Compiègne, BP 20529, F-

60205 Compiègne Cedex France

Interest for flaxseed (Linum usitatissimum) is actually growing because of its high content in

valuable metabolites (mucilage, lignan and omega3 fatty acids). Whereas the formers accumulate in

the seedcoat, the later accumulate in the embryo. Fatty acid biosynthesis pathway has been largely

characterized in the model species Arabidopsis thaliana [1] and a relation was demonstrated

between genes involved in mucilage biosynthesis and the fatty acid content in embryo [2]. In

addition, in flax, it was suggested a relation between lignans and oil rate using a 1H-NMR

metabolomic approach [3]. In order to get information about the inter-regulation of these three

pathways in flax, phenotypic screenings of the mucilage proportion on recombinant inbreed lines

from the crossing between Oliver (a winter “oil” flax) and Viking (a spring “fiber” flax) was

performed. Ten stable lines with different proportions in mucilage, lignan and omega-3 contents

were selected. The epidermal cells of the seed coat of these lines is being analysed by histochemical

techniques and the carbohydrate composition of their mucilage is being chemically characterized.

Références bibliographiques

[1] R. Naran et al. (2008) Plant Physiol. 148, 132-141.

[2] L. Shi et al. (2012) Plant J. 69, 37-46.

[3] A Ramsay, these de l’Université de Picardie Jules Verne, 2011

Mots-clés : NMR, flax, seed coat, mucilage, embryo fatty acids, lignans

78

P18

Addressing the Bottlenecks in Compound Identification from High Resolution

Accurate Mass Spectrometry Data

Eva Duchoslav, Lyle Burton, André Schreiber, Suma Ramagiri and Ron Bonner

AB SCIEX, 71 Four Valley Drive, Concord, ON, L4K 4V8 Canada

Tools for compound identification from accurate mass spectrometry data have been advanced by

assigning ion type (i.e. protonated, sodiated or ammoniated) , grouping together complementary

data for one molecule, looking up possible chemical entities in local and public compound

repositories and an option to expand local repositories with putative identification results.

Performance of the new research grade Formula Finder tool has been assessed on samples covering

a variety of applications.

Mots-clés : mass spectrometry, ion type, compound identification,

79

P19

Effects of brown seaweed extracts on plant growth Metabolomic characterisation of brown seaweed extracts used as phytostimulants and

transcriptomic and metabolomic analyses of physiological responses in Arabidopsis thaliana

Céline CONAN 1 , Anne GUIBOILEAU

2 , Sophie GOULITQUER

1 , Gaëlle CORREC

1 ,

Jean-Marie JOUBERT 2 , Philippe POTIN

1 .

1 UMR 7139, Marine Plants and Biomolecules, CNRS-Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Station

Biologique, 29680, Roscoff - France. 2 Goëmar Company, Parc Technopolitain Atalante St-Malo - CS 41908 St-Jouan des Guérets, 35419, Saint

Malo cedex - France.

Ascophyllum nodosum (L.) Le Jolis. and other seaweeds are manufactured commercially by the

Goëmar company for use on agricultural crops in the form of liquid concentrate. Indeed, seaweed

extracts have been used to improve plant growth and food production.

Some of their modes of action have been elucidated by the Goëmar laboratory. However, the

bioactive ingredients have not been identified using classical methods of bioassay-guided

fractionation, and their mechanisms of action remain poorly understood.

The aim of this thesis project is, at first, to determine, using a metabolomic profiling, what are the

bioactive compounds responsible for the plant growth. Then, the physiological effects of these

seaweed extracts will be studied in the model plant Arabidopsis thaliana through transcriptomic and

metabolomic approaches. The metabolomic study will allow us to define which metabolite

pathways are activated or repressed by these seaweed extracts, while the transcriptomic approach

will allow gene regulation to be deciphered.

This integration of approaches will lead to the identification of new target genes, enzymes and

metabolites which will be used to develop a new bioassay-guided fractionation of Goëmar extracts

and thus to valorize new seaweed by-products.

Mots-clés : seaweed extracts, Ascophyllum nodosum, metabolomic, transcriptomic.

80

P20

Comparaison d’empreintes phytochimiques de différents organes de la variété

de rose ‘Jardin de Granville’.

Ludivine Riffault a&b

, Emilie Destandau a , Laure Pasquier

b , Patrice André

b , Claire Elfakir

a .

a Université d’Orléans, Institut de Chimie Organique et Analytique UMR 7311, rue de Chartres 45067

Orléans cedex2, France. b LVMH recherche, département Innovation Actifs, 185 avenue de Verdun, 45800 Saint-Jean-de-Braye,

France.

La variété Rosa hybrida cv. ‘Jardin de Granville’ a été sélectionnée à la fois pour sa beauté et

sa résistance aux maladies, par les parfums Christian Dior pour être intégrée dans certaines

formulations cosmétiques. Afin de caractériser le contenu phytochimique de cette plante,

responsable de son caractère unique, différentes parties de la plante sont étudiées. La famille des

polyphénols est ciblée en particulier, du fait des nombreuses études disponibles dans la littérature et

de la très large gamme d’activités biologiques de ces composés (activité antioxydante, implication

dans la coloration de la plante, molécules de défense contre les pathogènes…).

Ainsi, des extractions microondes à des stades de développement successifs de la plante ont été

réalisées. Au total 16 organes ont été sélectionnés pour cette étude : les bois de taille d’hiver, les

jeunes pousses de printemps, les boutons précoces, les boutons juste avant éclosion, les fleurs (1ère

floraison de printemps), quatre parties de la fleur analysées séparément (pétales, étamines, sépales

et réceptacles), les feuilles, les bois de taille d’été, les jeunes pousses d’été, les boutons juste avant

éclosion, les fleurs (2ème

floraison en fin d’été), les fruits et les racines. Le contenu moléculaire des

extraits a ensuite été évalué par des techniques chromatographiques complémentaires : HPTLC,

HPLC-DAD et UHPLC-ESI-HRMS. En combinant toutes les informations recueillies (spectres

d’absorbance, masses exactes, propositions de formules brutes) et grâce à la comparaison à certains

molécules de référence, plusieurs composés phénoliques dérivés de gallotanins, d’ellagitanins, et de

flavonoides quercétine et kaempférol ont été caractérisés.

Un traitement statistique d’ACP, de CAH et d’ANOVA a été réalisé sur les empreintes des

différents organes obtenues par UHPLC-UV à 270 nm. Une nette séparation entre organes

végétatifs et reproducteurs est alors observable. Ainsi, des composés tels que certains dérivés de

kaempérol sont représentatifs de la partie reproductrice de la plante alors que des tanins, dérivés de

catéchine notamment, caractérisent davantage la partie végétative.

Mots-clés : UHPLC-HRMS, polyphénols

81

P21

La RMN 3D hybride, une nouvelle stratégie pour la mesure des enrichissements

isotopiques 13C en fluxomique

Renaud Boisseau 1 , Benoît Charrier

1 , Stéphane Massou

2 , Jean-Charles Portais

2 , Serge

Akoka 1 et Patrick Giraudeau

1

1 Université de Nantes, CNRS, CEISAM UMR 6230, Nantes, France

2 Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, UMR 5504 CNRS & UMR

792 INRA, INSA, Toulouse, France

L’analyse du flux métabolique est rendue possible par l’utilisation du marquage au 13

C, qui permet

l’observation de métabolites marqués sites spécifiques. L’une des techniques phares pour mesurer

les enrichissements isotopiques est la RMN 2D 1 H homonucléaire.

1 Cependant, l’inconvénient

majeur de cette technique réside dans une longue durée d’acquisition (de quelques minutes à

quelques heures) ce qui affecte la précision des mesures quantitatives et limite son utilisation en

routine. Nous avons récemment développé une approche alternative basée sur la RMN 2D ultra-

rapide 2 , présentant d’excellentes performances analytiques. Cette stratégie a permis de réduire

considérablement la durée d’acquisition. 3 Toutefois la RMN 2D, qu’elle soit ultra-rapide ou

conventionnelle, est limitée par la persistance de recouvrements dans les mélanges complexes, qui

empêchent la mesure des enrichissements isotopiques.

Pour contourner ce problème, nous proposons de basculer les couplages 1 H-

13 C dans une

troisième dimension. L’acquisition d’un spectre de RMN 3D conventionnel nécessiterait une durée

d’expérience rédhibitoire, c’est pourquoi nous avons développé des séquences de RMN 3D hybride 4 combinant approches classiques et codage spatial pour obtenir un spectre 3D en quelques minutes

seulement. Les performances analytiques de ces séquences 3D hybrides sont évaluées sur une série

d’échantillons de glucose enrichi au 13

C avec un taux d’enrichissement connu (5 à 90%). Nos

séquences optimisées sont caractérisées par une justesse et une précision proche du %, ainsi que par

une excellente linéarité.

Références bibliographiques :

1. S. Massou et al. Phytochemistry 2007, 68, 2330

2. L. Frydman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 15858

3. M. Pathan et al., J. Magn. Reson. 2012, 214, 335 ; P. Giraudeau et al, Anal. Chem. 2011 ,

83, 3112

4. P. Giraudeau et al., ChemPhysChem , 2012, 13, 3098-3101

Mots-clés : fluxomique, RMN 3D, RMN ultrarapide

82

P22

Variation des profils urinaires au cours du temps pour des patients traités soit

avec la ciclosporine ou le tacrolimus.

Binta Diémé, Patrick Emond, Hélène Blasco, Yvon Lebranchu, Matthias Buchler, Jean

Michel Halimi et Chantal le Guellec.

EA4245, Université François Rabelais, Tours, France

Contexte : La détection d’une éventuelle dysfonction du greffon chez le patient transplanté rénal repose

actuellement sur la mesure de la clairance de la créatinine ou la biopsie rénale, chacune présentant des

limites. L’objectif de notre travail était d’évaluer la capacité de l’approche métabolomique urinaire à refléter

des changements fonctionnels rénaux qui pourraient, à terme, servir de base au développement de

biomarqueurs spécifiques et précoces de la dysfonction du greffon.

Méthodes : Dans cette étude, des urines de 48 patients transplantés rénaux traités par tacrolimus ou

ciclosporine (deux inhibiteurs de la calcineurine, CNI) ont été recueillies à 7 jours (J7), 3 mois (M3) et 12

mois (M12) après la greffe. Nous avons cherché s’il existait des variations du profil métabolique urinaire au

cours du temps et/ou en fonction du type de CNI utilisé, puis avons recherché des différences de profil

métabolique selon l’état fonctionnel du greffon et ceci à des stades très précoce (J7) et plus tardif (M3). Pour

celà, nous avons comparé au sein du sous-groupe de patients traités par tacrolimus ceux qui avaient une

bonne reprise de fonction du greffon définie par une créatinémie à J7 < 250 µmol/L et ceux ayant une

créatinémie >250 µmol/L. A M3, la comparaison a porté sur les patients ayant une clairance de la créatinine

> ou < 60 mL/min. Une analyse par chromatographie couplée à la spectrométrie de masse (GC/MS) a été

réalisée. Les données générées ont été analysées grâce à des logiciels d’analyse statistique multivariée

(SIMCA et R).

Résultats : Les résultats ont montré une séparation des profils métaboliques urinaires entre J7, M3 et M12,

et ceci pour les 2 CNI étudiés. Nous avons également montré que le profil métabolique à un temps donné

était différent selon l’inhibiteur de calcineurine utilisé. Enfin, il existait une signature métabolique permettant

de différencier les patients ayant eu une reprise immédiate de fonction du greffon de ceux chez qui la reprise

était retardée ou lente (figure).

Les métabolites qui permettent cette séparation étaient principalement des sucres (pentoses et hexoses), le

citrate, le lactate, l’acide hippurique et l’inositol.

Conclusion : Cette étude nous a permis de vérifier la faisabilité de l’approche métabolomique et son intérêt

potentiel pour le suivi des patients greffés. Elle a permis pour la première fois de décrire des variations

urinaires qui se produisent au cours du temps chez des patients transplantés rénaux et, au moins à J7 chez les

patients traités par tacrolimus, de relier un profil métabolique particulier à l’état fonctionnel du greffon,

ouvrant la voie à l’identification de nouveaux biomarqueurs.

Mots-clés : GC/MS (gas chromatography coupled to mass spectrometry) , fonction rénale, inhibiteurs de la

calcineurine.

83

P23

Etude de l’impact d’une exposition maternelle à un mélange de

polychlorobiphényles (PCB) chez la souris, sur le métabolisme de la descendance

par une approche métabonomique par RMN

Benedict Yanibada 1 , Marie Tremblay-Franco

1 , Roselyne Gautier

1 , Laurent Debrauwer

1 ,

Rachid Soulimani 2 et Cécile Canlet

1

1- INRA, UMR 1331 Toxalim, 180 Chemin de Tournefeuille BP 93173, 31027 Toulouse Cedex 3

2- Université de Lorraine, Neurotoxicologie Alimentaire et Bioactivité, MRCA/UR AFPA/INRA, BP

4102, 57040 Metz, France

L’augmentation des activités anthropiques a conduit à l’utilisation et au rejet de nombreux

produits chimiques dans l’environnement. L’exposition des écosystèmes à ces polluants peut

affecter la santé humaine et animale via la chaîne alimentaire. De récentes études épidémiologiques

ont révélé une augmentation des maladies neurologiques et mentales chez les enfants. Les polluants

environnementaux sont fortement suspectés d’induire des pathologies lorsque l’exposition a lieu à

un âge précoce de la vie (période de développement). Aussi, il est important d’étudier les

mécanismes d’action de ces contaminants par des approches globales : analyses transcriptomiques

et métabolomiques.

L’objectif des travaux présentés est d’étudier chez la souris l’impact d’une exposition

maternelle in utero et au cours de la lactation à un mélange de 6 Non-Dioxin-Like

PolyChloroBiphenyls (6 NDL-PCB) sur le métabolisme plasmatique et au niveau du cerveau en

utilisant une approche globale : la métabonomique par RMN du proton.

Les souris gestantes ont été exposées aux PCB soit par gavage par un mélange de 6 NDL-PCB

constitué des composés purs (3 faibles doses), soit à partir d’une matrice alimentaire contaminée

(anguilles). Les 6 NDL-PCB ont été dosés dans les anguilles de façon à administrer des doses de

PCB comparables en utilisant les deux matrices (composés purs et poissons). Le plasma et le

cerveau ont été récupérés chez les souriceaux mâles et femelles âgés de 14 jours. Deux parties du

cerveau ont été analysées : le cortex et le cervelet. Les analyses des échantillons de plasma, des

extraits aqueux de cervelet et de cortex ont été réalisées par RMN du proton à la fréquence de 600

MHz.

Les analyses PLS-DA obtenues à partir des spectres RMN de plasma, du cortex et du cervelet

des souris âgées de 14 jours traitées ou non avec le mélange des 6 NDL-PCB montrent clairement

des empreintes métaboliques différentes suivant le traitement et le sexe.

En conclusion, une exposition aux PCB à des doses auxquelles aucune toxicité n’est rapportée

(< dose sans effet), peut être caractérisée par une empreinte métabolique spécifique témoignant des

effets de l’exposition.

Mots-clés : polychlorobiphényles, exposition in utéro et période de lactation, analyse RMN

84

P24

Comparison of lipid synthesis and carbohydrate metabolism in developing

linseed and rapeseed embryos : A fluxomic study.

Sébastien ACKET 1, Abdelghani IDRISSI TAGHKI

1, Mohamed KOUBAA

2, Albrecht ROSCHER

3,

Brigitte THOMASSET1

1 Université de Technologie de Compiègne, CNRS-FRE 3580, BP 20529, 60205 Compiègne Cedex, France.

2 Department of Molecular Genetics, The Ohio State University, 1060 Carmack Rd, 053 Rightmire Hall,

43210 Columbus, OH, USA. 3 Université de Picardie Jules Verne, CNRS-FRE 3580, 33 rue Saint Leu, 80039 Amiens Cedex, France.

Oilseed plants accumulate high levels of oil (up to 50% of the dry weight in the form of

triacylglycerols: TAGs) in their seeds with potential applications in food and industrial domains. In

fact, developing embryos efficiently convert synthesized sugars into storage reserves (TAG, starch,

proteins…), but depending on precursor availability and enzyme kinetics, this conversion differs

between plant tissues and leads to different biomass patterns. Thus, oilseed embryos have an initial

phase of starch accumulation, before the accumulation of storage oil. Starch levels decline later

during development as rates of accumulation of storage oil and protein increase [1]. However,

linseed (Linum usitatissimum) and rapeseed (Brassica napus) embryos synthesize different amount

of starch during the same developmental stage [2]. In linseed, the starch accumulation is very low

when compared to the rapeseed starch accumulation [1].

In order to understand the differences observed in lipid accumulation between rapeseed and

linseed and to gain insights into the identification of mechanisms involved in biomass accumulation

for these two oilseed plants, we have studied the biomass accumulation using 13

C Metabolic Flux

analysis to calculate carbon fluxes [3]. Developing linseed (Linum usitatissimum) and/or rapeseed

(Brassica napus) embryos aged 15 days after pollination were dissected under aseptic conditions

and incubated for 7 days in a medium containing [U- 13

C]glucose. After incubation, biomass and

free metabolites (free amino acids and organic acids) were extracted and the 13

C labeling was

quantified using GC-MS. The model of central metabolic pathways for developing linseed and

rapeseed embryos was built according to literature.

Our results show first that, in rapeseed and linseed embryos, precursors for fatty acid synthesis

in embryos are mainly generated from the plastid and the major precursor supporting fatty acid

synthesis is glucose 6-phosphate imported from the cytosol. In our studies, we have also reported

that the rates of sucrose turnover are different between the two studied plant species.

Références bibliographiques : [1] Idrissi Taghki A. (2009) Etude de type métabolisme intégré entre embryons de colza

transgéniques ou non. Thèse de l’Université de Technologie de Compiègne.

[2] Troufflard S., Roscher A., Thomasset B., Barbotin J.N., S. Rawsthorne S. et Portais J.C. (2007)

In vivo 13

C-NMR determines metabolic fluxes and steady state in linseed embryos.

Phytochemistry, 68 , 2341-2350.

[2] Wiechert W. (2001) 13C metabolic flux analysis, Metab. Eng ., 3 , 195–206.

Mots-clés : rapeseed, linseed, lipids, sugar metabolism, fluxomic

85

P25

Influence of Diurnal factor on compositional changes of tomato fruit and leaf

Camille Bénard 1 , Stéphane Bernillon

2* , Sonia Osorio-Algar

4 , Mickaël Maucourt

3* , Benoît

Biais 2 , Emilie Labadie-Lemière

2 , Patricia Ballias

2* , Catherine Deborde

2* , Daniel Jacob,

Cécile Cabasson 3*

, Michel Génard 1 , Alisdair Fernie

4 , Dominique Rolin

3* , Hélène Gautier

1 , Yves Gibon

2* , Annick Moing

2*

1 INRA UR 1115 Plantes et Systèmes de culture Horticoles, Domaine St Paul, Site Agroparc, 84914 Avignon, France

2 INRA UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France

3 Université de Bordeaux, UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave

d’Ornon, France

* Plateforme Métabolome du Centre de Génomique Fonctionnelle Bordeaux, IBVM, Centre INRA Bordeaux, 71 av

Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France

4 Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, 14476 Potsdam-Golm, Germany

The Fruit Integrative Modelling project is an Eranet EraSysBio+ project which aims at

describing and modelling the influence of environmental factors on tomato fruit central metabolism

during its development. In this project, high-throughput biochemical phenotyping, MS and NMR

spectrometry have been used to characterise fruit and leaf metabolites and estimate their levels for

tomato plants (Solanum lycopersicum cv Moneymaker) cultivated in a greenhouse. Within this

frame, one experiment focussed on the effect of harvest time on tissue composition throughout a

day and night cycle. First, expanding fruits, and the mature leaves close to the harvested fruit

cluster, were harvested on two different representative days. Analyses of pericarp tissue and foliar

limb were performed on water/methanol/chloroform extracts using GC/EI-ToF-MS after

derivatization, methanol/water extracts using LC/ESI-QToF-MS and ethanol/water extracts for

robotized biochemical phenotyping and 1 H-NMR quantitative profiling. Metabolite data were

processed using univariate, multivariate and clustering analyses. For source leaves, metabolite

changes were related to well-known physiological processes. For green fruits, several metabolites

were shown to change throughout the day. The second step of this study was the combined data

analysis of the compositional changes of mature leaves close to the harvested fruit cluster with that

of the fruit pericarp.

Mots-clés : Tomato, fruit, leaf, light, metabolism, NMR, MS, metabolomic

86

P26

Analyse métabolomique sur l’hémolymphe d’abeille, contraintes de l’étude et

évaluation d’un stress biotique (nosémose).

Régis Fontbonne1,2, Céline Dalle1-4, Marie Lagrée3, Mounir Traïkia3,4, Michaël Roussel1,2, Cyril

Jousse3,4, et Frédéric Delbac1,2

[1]

Clermont Université, Université Blaise Pascal, Laboratoire Microorganismes : Génome et

Environnement , BP 10448, F-63000 Clermont-Ferrand (France) [2]

CNRS, UMR 6023, LMGE, F-63177 Aubière [3]

Plateforme d’exploration du métabolisme, Université Blaise Pascal, BP 80026, F-63171 Aubière [4]

Clermont Université, Université Blaise Pascal, Institut de Chimie de Clermont-Ferrand, BP

10448, F-63000 Clermont-Ferrand (France)

Courriel : cyril.jousse@univ-bpclermont.fr

L’objectif de ce travail est d’évaluer les conséquences physiologiques d’une infection par Nosema

ceranae sur l’abeille européenne Apis mellifera [1,2]. Cette microsporidie colonise l’épithélium

intestinal et engendre un stress énergétique associé à la fois à une baisse de l’immunité et à une

altération de la production de phéromones [3,4]. L’hémolymphe est le liquide circulant qui assure

alimentation, défense et communication à l’échelle de l’organisme. La découverte du métabolome

de ce tissu commence à peine [5,6,7] et peut nous apporter une première information concernant les

perturbations métaboliques engendrées par l’infection.

Sur un des deux lots d’abeilles émergentes issues du rucher expérimental du LMGE (Clermont-

Ferrand), une infection manuelle est réalisée en proposant à chaque abeille 5μl d’eau sucrée

contenant 125000 spores de N. ceranae. L’hémolymphe est récoltée 2 et 10 jours post-infection et

analysée à l’aide du Metabolic Profiler [8,9] (PFEM, Clermont-Ferrand), par spectroscopie de

résonance magnétique nucléaire du proton (RMN 500MHz) puis par chromatographie liquide

(UPLC) couplée à un spectromètre de masse à temps de vol (ESI-μToF). Les protocoles analytiques

ont été adaptés au regard des quantités d’hémolymphe disponible, 10 à 15 µL par abeille. Le

traitement des données (bucketing/ binning), l’analyse statistique en composantes principales (ACP

& PLS) et l’interrogation des banques de données, ont permis d’identifier des métabolites

discriminant significativement les lots d’individus.

Cette expérience s’inscrit en préliminaire de plus vastes études, étant donnée l’importance

écologique (biodiversité), agronomique (rendement agricole) et économique (apiculture) de cet

insecte social.

Références bilbiographiques : 1. Higes et al., J Invertebr Pathol, 2006, 92: 93-95

2. Martin-Hernandez et al., Appl Environ Microbiol, 2007, 73: 6331-6338

3. Goblirsch et al., PLoS ONE, 2013, 8: e58165.

4. Dussaubat et al., Journal of Invertebrate Pathology, 2013, 113: 42-51

5. Hammer et al., Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics, 2012, 7: 292-302

6. Poyton et al., Environ Sci Technol, 2011, 45: 3710–3717

7. Aliferis et al., Journal of Insect Physiology, 2012, 58: 1349-1359

8. Godjohann, J Chomatogr A, 2007, 1156: 87-93

9. Sun et al., J Chromatogr B, 2008, 871: 328–340

Mots-clés : Abeille, pathogène, métabolomique, hémolymphe, environnement.

87

P27

MeHaloCoA project (MarinE HALOgenated COmpounds Analysis)

Yann Guitton 1,3

, Elodie Blanchet 1,2

, Marieke Vansteelandt 1, Catherine Roullier

1, Marie

Geiger 1,3

, Thibaut Robiou du Pont 1, Yves François Pouchus

1, Olivier Grovel

1

1 University of Nantes, Faculty of Pharmacy, F-44035 Nantes, France;

2 ATLANTHERA, 1 rue Gaston Veil,

F - 44000 Nantes, France;

3 IFREMER, F-44311, Nantes, France

Numerous halogenated natural compounds have been described from all natural sources. They are

considered as biologically important and could play an interesting role as lead compounds for drug

discovery [1]

. Despite the abundance of chlorine in the marine environment, only nine compounds

from marine-derived Penicillium strains have been described [2]

to possess a chlorine atom in their

chemical structure and they all displayed biological acivities such as antifungal activity for

griseofulvin or cytotoxicity for ligerin, a chlorinated sesquiterpene which exhibited a specific

antiproliferative activity against osteosarcoma cell lines and in vivo antitumor activity. In the course

of our ongoing research on bioactive fungal metabolites, we are particularly interested in finding

new halogenated compounds from marine-derived Penicillium. In order to simplify the data

treatment and to fasten discoveries of natural halogenated compounds we have developed several

addons for R XCMS. The first addon is HaloDetect.R which is a script allowing the fast screening

of LC-MS data in order to find putative chlorinated or brominated compounds. The second

MSMSclust.R is based on MS/MS data analysis and classifies compounds based on MS/MS

similarities. The last MStoOPLS.R is an integrated workflow going from raw MS data to OPLS-DA

analysis (with S-Plot generation) and is a combination of XCMS, CAMERA and MUMA packages.

All those R scripts have been developed and validated on chlorinated-compounds containing

samples analyzed on an LC-ESI-IT-ToF apparatus (Shimadzu) belonging to the new

THALASSOMICS metabolomic core facility. All those tools are available upon request and will be

soon integrated in an R package.

Références bibliographiques : 1- Gribble, Gordon W. Naturally Ocurring Organohalogen Compounds, Acc. Chem. Res. 1998, 31, 141-152

2- Vansteelandt, Marieke, Elodie Blanchet, Maxim Egorov, Fabien Petit, Loïc Toupet, Arnaud Bondon,

Fabrice Monteau, et al. “Ligerin, an Antiproliferative Chlorinated Sesquiterpenoid from a Marine-

Derived Penicillium Strain.” J. Nat. Prod. 76, no. 2 (February 22, 2013): 297–301

Mots-clés : Halogeneted compound detection, Marine Fungi, Penicillium, LC-HRMS/MS, R scripts

88

P28

Contrôle de l’administration des anabolisants chez le cheval : développement

d’une approche métabolomique sur l’urine par couplage GC-EI-QTOF

B. Loup1, N. Floch

1, AC. Paris

1, N. Stojiljkovic

1, P. Garcia

1, L. Pascaud

2,

L. Bailly-Chouriberry1, MA. Popot

1 et Y. Bonnaire

1.

1 LCH,

Laboratoire des Courses Hippiques, 15 rue de Paradis, 91370 Verrières-le-Buisson ; b.loup@lchfrance.fr

2 Agilent Technologies France, Parc Technopolis – ZA Courtaboeuf, 3 avenue du Canada, CS 90263, 91978 Les Ulis

Cedex

Afin de lutter contre les pratiques de dopage aux anabolisants et détecter leur éventuelle

administration, des méthodes analytiques directes sont utilisées en routine dans les laboratoires de

contrôle anti-dopage.

La mise au point de nouvelles méthodes comme la métabolomique peuvent permettre

d’augmenter les temps de dépistages en suivant, non plus la présence de la molécule en elle-même,

mais ses effets. Ainsi, de telles approches constituent un axe de recherche intéressant dans

l’amélioration de la lutte contre le dopage et ont déjà été développées au LCH pour des couplages

LC-HRMS [1][2].

Dans cette étude nous proposons le développement d’une nouvelle méthode innovante d’analyse

métabolomique par couplage GC-HRMS (GC-EI-QTOF, Agilent Technologies) à partir

d’échantillons urinaires provenant d’une administration de stanozolol.

Dans un premier temps, l’injection d’une dizaine de séquences d’échantillons (n=10) nous a

permis de déterminer les conditions expérimentales assurant l’obtention d’une empreinte la plus

riche possible ainsi qu’une bonne reproductibilité. Ces essais nous ont amenés à choisir pour la

préparation d’échantillons une précipitation à l’acétonitrile suivi d’une dérivation MSTFA/ITMS.

L’analyse des données a montré une bonne reproductibilité de la méthode avec notamment des

coefficients de variation (CV) inférieurs à 15% sur les étalons internes. Concernant les analytes,

37% et 44% d’entre eux présentent des CV compris respectivement entre 0-30% et entre 30-70%.

Par ailleurs, le pré-traitement des données a permis d’obtenir des résultats comparables entre le

logiciel Mass Hunter (Agilent Technologies) et XCMS. En effet, après optimisation des paramètres

de XCMS au couplage GC-EI-QTOF, la comparaison des aires des pics extraits selon les deux

méthodes montre une corrélation supérieure à 95%.

La seconde étape de cette étude consiste à analyser les échantillons urinaires de chevaux ayant

(n=5) ou non (n=4) reçu une administration de stanozolol (0,30mg/kg) dans des conditions

contrôlées, selon le protocole et les conditions établies précédemment. Des méthodes d’analyses

factorielles (ACP) seront mises en œuvre dans le but d’explorer et d’interpréter les données.

[1] Boyard-Kieken F et al., J Sep Sci., 2011, Dec;34(24):3493-501.

[2] Kieken F et al., Anal Bioanal Chem., 2009, Aug;394(8):2119-28.

89

P29

Détection des métabolites urinaires par spectrométrie de masse à très haute

résolution : comparaison entre les approches DI /ESI-FTICR et LC/ESI-LTQ-

Orbitrap

B. Xue

1 ; S. Alves

2 ; J-C. Tabet

2 ; R. B. Cole

2 ; A. Paris

3 ; E. Rathahao-Paris

1 ; C. Junot

4

1 INRA, AgroParisTech, Équipe IAQA, UMR 1145 Ingénierie Procédés Aliments, 75231 Paris Cedex 05

2 UPMC, EquipeCSOB, Institut Parisien Chimie Moléculaire, 75252 Paris Cedex 05

3 INRA, AgroParisTech, Mét@risk , 75231 Paris Cedex 05

4 CEA, LEMM, 91191 Gif sur Yvette Cedex

La spectrométrie de masse (MS) couplée à la chromatographie liquide (LC) s’est évélée être un

outil ultra sensible et spécifique pour les études métabolomiques depuis une dizaine d’années 1.

C’est une méthode analytique en deux dimensions puisque les métabolites sont caractérisés par

leurs temps de rétention et par les ions rapports m/z générés par leur ionisation/désorption. Les

principaux défauts de cette approche sont la complexité du traitement automatique des données dus

à des variations de temps de rétention, et les temps d’analyse assez longs. Une technique à haut

débit, telle que l’introduction directe des échantillons dans le spectromètre de masse (DI-MS) est

attractive à des fins d’études métabolomiques à grande échelle en raison de sa rapidité et son faible

coût 2. Cependant, sans l’utilisation du couplage avec la LC, les composés introduits simultanément

dans la source d’ionisation electrospray engendrent des effets de suppression des ions qui limitent la

détection exhaustive de l’ensemble des métabolites dans un échantillon biologique. Le spectre de

masse acquis est beaucoup plus complexe dans le cas de DI-MS, puisque de nombreux d’ions

isobares peuvent se positionner au même rapport m/z nominal. Un instrument d’ultra haute

résolution, tel que l’instrument FT-ICR (Fourier Transform-ion cyclotron resonance), est alors

indispensable pour ce type d’approche directe car il permet de distinguer ces ions isobares au

contraire des appareils faible résolution tel que les filtres quadripolaires et les piège à ions.

L’objectif de notre étude est de développer une méthodologie pour réaliser en une seule analyse la

détection et l’identification d’un nombre maximum de métabolites avec une bonne précision dans la

mesure en masse. Nous nous intéressons, dans un premier temps, à la matrice urinaire. L’urine

présente un grand intérêt pour les études métabolomiques car elle contient une grande diversité de

métabolites aussi bien dans leurs structures que dans leurs concentrations 3 . Le mode d’injection en

flux continu (FIA, «flow injection analysis») couplé à un instrument FT-ICR (7 Tesla) avec un

pouvoir résolutif d’environ 260 000 (à m/z 400) a été utilisé pour l’analyse directe des échantillons

d’urine dilués. Dans cette communication, seront présentés les résultats obtenus en comparaison

avec l’approche classique réalisée par couplage entre la LC et un appareil FT-MS équipé de

l’Orbitrap et possédant un pouvoir résolutif maximum de 100 000 (à m/z 400). Nous évaluerons le

nombre de métabolites détectables et identifiables. Nous examinerons la précision de la mesure en

masse ainsi que celle du rapport d’abondance isotopique relative (RIA, relative isotopic abundance).

Références bibliographiques : 1 : Dettmer K. ; Aronov P.A. ; Hammock B.D. Mass Spectrometry Reviews , 2007 , 26, p51-78.

2 : Werner E. ; Heilier J-F. ; Ducruix C. ; Ezan E. ; Junot C. Journal of Chromatography B , 2008 , 871, p143-163.

3 : Fernáandez-Peralbo M.A. ; Luque de Castro M.D. Trends in Analytical Chemistry , 2012 , 41, p75-85.

Mots-clés : phénotypage métabolique, analyse haut débit, spectrométrie de masse à ultra haute résolution,

échantillons urinaires

90

P30

Impact métabolique de la glycine bétaïne exogène ou produite par transgénèse

chez Arabidopsis thaliana sous traitement salin

Raphaël Lugan

1,2 , Marie-Françoise Niogret

1 , Laurent Leport

1 , Jean-Paul Guégan

3 ,

Ronan Sulpice 4 , Joachim Kopka

5 , Alain Bouchereau

1

1 UMR 1349 IGEPP, INRA-Agrocampus Ouest-Université de Rennes 1, Rennes-Le Rheu

2 Plateforme Métabolomique IBMP, Institut de Botanique, Strasbourg

3 UMR 6226, ENSCR, CNRS-Université de Rennes 1, Rennes

4 MPIMP, Potsdam-Golm, Germany

5 MPIMP, Potsdam-Golm, Germany

La glycine bétaïne (GB), produite et accumulée par différentes espèces animales, végétales et

microbiennes, possède des propriétés avérées d’osmoprotection et de thermoprotection [1]. Chez les

végétaux, ce sont plus particulièrement des espèces halotolérantes ou résistantes à la dessiccation

qui accumulent cette bétaïne [2]. Ses modes et mécanismes d’action restent cependant obscurs et en

dépit de propriétés qualifiées de compatibles rien n’indique que ses fonctions protectrices soient

seulement circonscrites à des activités de chaperoning chimique et qu’elles soient effectives dans

n’importe quel contexte biologique. Par ailleurs, dans le cadre d’actions qui tendraient à valoriser

ces propriétés pour améliorer la performance, en conditions de stress, d’espèces d’intérêt

agronomique non accumulatrices [3], il apparaît essentiel, non seulement d’en démontrer la

fonctionnalité en système hétérologue mais aussi de vérifier son innocuité et sa compatibilité

effectives. Ainsi, une première expérimentation à consisté à appliquer de la GB dans la solution

nutritive de plantes d’Arabidopsis thaliana (écotype Col non accumulateur de GB) cultivées en

hydroponie puis, par profilage métabolique (GC-Tof) des tissus foliaires, à en vérifier l’impact sur

le métabolome après traitement salin. Une seconde expérimentation s’est également traduite par le

phénotypage métabolique de plantes d’Arabidopsis thaliana exprimant par transgénèse le gène

codA d’Arthrobacter globiformis [4] et néoproductrices de GB obtenue par oxydation directe de la

choline. Un traitement salin a également été appliqué à ces plantes transformées. Les deux

situations conduisant à accumuler la GB dans les tissus foliaires se traduisent par des modifications

importantes du métabolome amenant à penser, qu’en absence de toute contrainte saline, la molécule

à caractère « xénobiotique » est inductrice d’un stress chimique et que sa compatibilité en système

hétérologue est toute relative. Les phénotypes métaboliques établis en conditions de traitement salin

suggèrent, en revanche, que les propriétés protectrices de la GB puissent s’exprimer dans ces

conditions [5].

Références bibliographiques : [1] Sakamoto A. and Murata N., 2002, Plant Cell and Environment, 25, 163-171

[2] Ashraf F. and Foolad MR., 2007, Environmental and Experimental Botany, 59, 206-216.

[3] Khan MS. et al., 2009, Plant Biotechnology, 26, 125-134

[4] Sulpice R. et al., 2003, The Plant Journal, 36, 165-176.

[5] Lugan R., 2008, Thèse de Doctorat de l’Université de Rennes 1

Mots-clés : Soluté compatible, stress salin, codA, phénotypage métabolique, marqueurs d’exposition

91

P31

Couplage EPC/RMN/Statistiques pour la caractérisation en mélange d’un

extrait végétal valorisé en Cosmétique

Sylvain Purson

1 , Jane Hubert

1 , Jean-Marc Nuzillard

1 , Romain Reynaud

2 ,

Jean-Hugues Renault

1 : UMR CNRS 7312, Université de Reims Champagne-Ardenne, Moulin de la Housse, BP 1039, 51687 Reims Cedex 2,

France 2 : Soliance, Route de Bazancourt, 51110 Pomacle, France

La valorisation d’extraits naturels occupe actuellement une place prépondérante dans l’industrie

cosmétique. Mieux connaître le contenu de ces extraits reste un enjeu majeur, non seulement pour

répondre aux contraintes réglementaires grandissantes imposées aux industriels de ce secteur

(REACH…) mais aussi pour déterminer la composition, l’activité biologique et l’innocuité de ces

extraits et ainsi leur conférer davantage de valeur-ajoutée. Les méthodes actuelles de caractérisation

des substances naturelles consistent généralement à isoler les composés de manière individuelle afin

ensuite de procéder à leur identification ; ce qui est long, fastidieux et coûteux.

C’est dans ce cadre qu’une nouvelle approche basée sur la caractérisation de métabolites naturels en

mélange a été développée. Elle repose sur la combinaison originale d’une méthode de

fractionnement par Extraction de Partage Centrifuge (EPC), d’analyse par RMN du 13

C et de

traitement bioinformatique des données générées. L’intérêt majeur de cette approche est qu’elle

permet d’accéder à la composition globale de l’extrait de départ sans purifier systématiquement

chaque composé.

L’exemple choisi est un extrait d’Orobanche rapum, une plante originaire des landes du Massif

central français. Le fractionnement par EPC, basé sur l’utilisation d’un système triphasique de

solvants en mode élution séquentielle (Hamzaoui et al. – 2012) a d’abord fourni des mélanges

sélectifs et simplifiés de molécules en fonction de leur polarité. Les fractions moyennement polaires

obtenues ont ensuite été analysées par RMN du carbone 13

C, la durée de chaque analyse étant fixée

à 10 minutes. Enfin, un algorithme développé localement a permis d’aligner les intensités de

l’ensemble des signaux collectés automatiquement dans chaque fraction selon leurs déplacements

chimiques avec une fenêtre de 0.2 ppm. La Classification Ascendante Hiérarchique du jeu de

données ainsi généré offre une visualisation directe des clusters de déplacements chimiques présents

dans plusieurs fractions successives et correspondants à des squelettes carbonés représentatifs de

métabolites particuliers.

Il en résulte ainsi une analyse globale des résonances détectées dans chaque fraction, conjuguée à

un protocole d’EPC efficace. Cela nous a permis de discriminer des molécules de structure proche

ayant des résonances en commun. L’application de cette nouvelle approche est en cours sur des

extraits plus complexes afin de parfaire sa mise au point.

Références bibliographiques : - H. Wagner et G. Ulrich-Merzenich, « Synergy research: Approaching a new generation of

phytopharmaceuticals », Phytomedicine , vol. 16, n o 2-3, p. 97-110, mars 2009.

- M. Hamzaoui, J.-H. Renault, J.-M. Nuzillard, R. Reynaud, et J. Hubert, « Stepwise Elution of a Three-

phase Solvent System in Centrifugal Partition Extraction: A New Strategy for the Fractionation and

Phytochemical Screening of a Crude Bark Extract », Phytochem Anal , févr. 2013.

Mots-clés : substances naturelles, Extraction de Partage Centrifuge, RMN 13C, métabolomique

92

P32

Secondary metabolites profiling of the invasive Fallopia japonica: variability

between populations from France and Japan ?

Buonomo A 1 , Meiffren G

1 , Puijalon S

2 , Bellvert F

1 , Rouifed S

2 , Comte G

1 , Piola F

2

1 CESN, UMR 5557, CNRS Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne F-69622 France

2 UMR 5023, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne F-69622 France

Biological invasions are increasingly recognized as important elements in global change and constitute an

important factor in the loss of biodiversity (Vitousek et al , 1996). Most invasive plants are phytochemically

unique in their habitats, and many of the phytoconstituents from these plants have been reported to have

multiple activities, including antiherbivore, antifungal, antimicrobial and allelopathic effects, which provide

the plants with several advantages in their new environments (Cappucino and Arnason, 2006).

Japanese knotweed Fallopia japonica is a well-known East Asian perennial that was introduced to Europe in

the 19 th century as ornamental plant. It rapidly expanded throughout Europe and North America with

functional impacts such as modifying ecosystems by altering nutrient cycles (Dassonville et al ., 2007 & 2011)

and threatening endemic biodiversity by reducing the plant species diversity of invaded sites (Vanderhoeven et

al ., 2005; Gerber et al ., 2008). Allelopathic properties and chemical composition of rhizome extracts from

different species of Fallopia have been reported (Vrchotova and Sera, 2008; Bertrand et al ., 2008; Fan et al .;

2009 & 2010; Murrell et al ., 2011) and could be involved in the invasive capacities of F. japonica .

As the presence of different metabolites might confer ecological advantages to the introduced varieties, the

aim of this work was to find out whether the invasive plants growing in France differed in their secondary

metabolites composition from the native plants growing in Japan. Plants were collected from different areas

in Japan (5 genotypes) and in the Rhône-Alpes region in France (1 genotype). Clonal individuals were

obtained and roots hydro-alcoholic extracts have been performed and analyzed by UHPLC/DAD/ESI-Q-

TOF. Retention time of each peak of the chromatograms was aligned and its relative intensity recorded in a

matrix (24 samples, 174 components) to perform PCA.

Secondary metabolites profiles showed some similarities in the phytochemical composition between French

and Japanese extracts. Main peak of the profiles were phenolic compounds, UV and mass spectra were

characteristic of flavanols, stilbenes, anthraquinones and di-anthrones that were identified for the first time in

F. japonica.

PCA showed an obvious discrimination between the French and Japanese individuals. French plants were

almost identical. Statistical analysis based on Wilcoxon rank-sum test didn’t reveal any significant

differences in the composition of chemical weapons between French and Japanese individuals but the

relative quantity of stilbenes and anthraquinones for which interesting bioactivities have already been

reported (Jayatilake et al., 1993) tended to be higher in French populations.

Références bibliographiques : Bertrand C et al. (2008) Planta Med 74(9):1134-1134.

Cappucino N, Arnason JT (2006) Biol Lett 2:189-193.

Dassonville N, et al. (2007) Ecoscience 14:230-240.

Dassonville N, et al. (2011) Biol Invasions 13:1115-1133.

Fan P, et al. (2009) Biochem Syst Ecol 37:24-34.

Fan P, et al. (2010) Chemoecol 2:223-227.

Gerber E, et al. (2008) Biol Conservation 141:646-654.

Jayatilake GS, et al. (1993) J Nat Prod 56:1805–1810.

Murrell C, et al. (2011). Am J Bot 98:38-43.

Vanderhoeven S, et al. (2005) Plant Soil 275(1/2):169-179.

Vitousek PM, et al. (1996) Am Sci 84:468-478.

Vrchotova N, Sera B (2008) Plant Soil Environ 54(7):301-303.

Mots-clés : Invasion, secondary metabolism, Fallopia, LC-MS

93

P33

Développement d’une méthode LC/ESI/MS/MS pour la détermination

simultanée de 8 vitamines hydrosolubles dans des farines de blé, des pâtons, du

pain et des pains grillés

Nurit Eric

1 , Lyan Bernard

1 , Piquet Agnès

2 , Branlard Gérard

3 , Pujos-Guillot Estelle

1

1 INRA, UMR1019, Plateforme d’Exploration du Métabolisme, UNH, F-63000 Clermont-Ferrand, France

2 VetagroSup, Campus Agronomique de Clermont, 89 avenue de l’Europe, BP35, F-63370 Lempdes

3 INRA, UMR 1095, Génétique, Diversité et écophysiologie des céréales, site de Crouël, F-63039 Clermont-

Ferrand, France

L’amélioration de l’état nutritionnel de la population constitue, en ce début de XXI e siècle, un

enjeu majeur pour les politiques de santé publique menées en France, en Europe et dans le monde.

Fort de ce constat, il semble donc normal de vouloir s’interroger sur l’impact des procédés de

production et d’intensification des cultures dans l’agriculture. Le blé est la seconde céréale la plus

largement cultivée dans le monde. Elle est également la plus consommée par les hommes après

transformation en pain, pâtes, biscottes, biscuits et beaucoup d’autres produits. Par conséquent le

blé apporte une importante contribution aux besoins nutritionnels quotidiens pour les humains. Il

apparait donc nécessaire au vue des enjeux de développer la caractérisation du métabolome du blé

et de préciser les facteurs génétiques associés à sa valeur nutritionnelle. L’objectif principal de ce

travail a été de développer une méthode de chromatographie liquide suivie d’une analyse en

spectrométrie de masse LC/MS à la fois rapide et à haut débit permettant la détermination

simultanée de 8 vitamines hydrosolubles dans quatre matrices végétales différentes (de la farine de

blé, des pâtons, des pains et des pains grillés). La mise en place d’une méthode d’extraction rapide

permettant la libération totale des vitamines hydrosolubles sous leurs formes libres ainsi qu’une

injection directe de l’extrait d’hydrolyse sans aucune étape de purification ou de concentration a

rendu possible l’analyse des vitamines en un seul « run ». Les résultats ont montré que la méthode

LC-ESI-MS/MS développée est suffisamment sensible et sélective (la linéarité ainsi que la

spécificité de la méthode appréciées par des tests de Fisher et de Student ont été significativement

concluants) pour être appliquée dans la détermination des teneurs naturelles en vitamines dans les

quatre matrices. La fidélité Intra- et Inter-jours de la méthode évaluée par le coefficient de variation

se situe dans un intervalle compris entre 2.21% et 11.35% pour l’ensemble des vitamines. La

méthodologie développée a été appliquée à la mesure de ces métabolites sur des farines de blé de

type T110 ainsi que sur les produits dérivés de la transformation de ces farines (pâtons, pains et

pains grillés).

Références bibliographiques : A Gentili, F Caretti, G D’Ascenzo, S Marchese, D Perret, D Di Corcia, L Mainero Rocca (2008) Rapid

Commun. Mass Spectrom.; 22: 2029–2043.

A Leporati, D Catellania, M Sumana, R Andreolib, P Maninib, WMA Niessenc (2005) Analytica Chimica

Acta, 531, 87–95.

Z Chen, B Chen, S Yao (2006) Analytica Chimica Acta 569, 169–175

F Batifoulier, MA Verny, E Chanliaud, C Rémésy, C Demigné (2006) Europ. J. Agronomy 25, 163–169.

S Ndaw, M Bergaentzlé, D Aoudé-Werner, C Hasselmann (2002) Food Chemistry 71, 129–138

Mots-clés : vitamines hydrosolubles, LC-ESI-MS/MS, Blé, farine T110, Pâton, pain, pains grillés

94

P34

Metabolomics of growth and type B trichothecenes production in Fusarium

graminearum

L. Legoahec 1,

V. Atanasova-Penichon 1 , N. Ponts

1 , C. Deborde

2,3 , M. Maucourt

3,4 , S.

Bernillon 2,3

, A. Moing 2,3

, F. Richard-Forget 1

1 INRA, UR1264-MycSA, CS20032, 33140 Villenave d’Ornon, France;

2 INRA, UMR1332 Fruit Biology, CS20032, 33140 Villenave d’Ornon, France;

3 Metabolome Facility of Bordeaux Functional Genomics Center, IBVM Centre INRA de Bordeaux, CS20032, 33140

Villenave d’Ornon, France; 4 Univ. Bordeaux, UMR1332 Fruit Biology and Pathology, Centre INRA de Bordeaux, CS20032, 33140 Villenave

d’Ornon, France

The plant fungal pathogen Fusarium graminearum can produce type B trichothecenes, a family

of sesquiterpene molecules with toxic properties upon human or animal ingestion. Deoxynivalenol,

or DON, and its acetylated forms belong to this family of secondary metabolites and are frequent

contaminants of cereals worldwide.

The biosynthesis of trichothecenes initiates with the condensation of two molecules of farnesyl

pyrophosphate, at the end of the mevalonate pathway in Fusarium ’s metabolomics chart, and is

under the control of various factors such as the redox parameters of the environment or carbon

source. For example, supplementing liquid submerged cultures of F. graminearum with phenolic

acids was shown to reduce the accumulation of DON and its acetylated forms in the medium. Such

result, however, gives a partial glimpse of the effect of phenolic acids, from the trichothecene

production point of view only.

The present study analyzed F. graminearum ’s metabolome in conditions when DON and its

acetylated forms are produced. Mass spectrometry and nuclear magnetic resonance were used to

identify metabolites produced by the fungus, secreted in the culture medium or not, over the course

of 14 days.

Fifty-two polar and semi-polar metabolites were identified in the culture medium, i.e., the exo-

metabolites, and/or in the mycelium, i.e., the endo-metabolites. Among them are amino acids and

derivatives, sugars, polyketides, and terpenes including trichothecenes. We found that samples

composition varies over time in terms of primary metabolites as well as secondary metabolites. In

the presence of caffeic acid, a phenolic acid that reduces the accumulation of DON and its

acetylated forms in the culture medium, endo- and exo-metabolic profiles are different from the

ones observed in not supplemented cultures. Signature metabolic profiles were identified for both

conditions and are different depending on the exo- or the endo-metabolites are considered.

Mots-clés : metabolomics; secondary metabolite; Fusarium graminearum

95

P35

Metabolomic approach using NMR to study the regulation of energy metabolism

on chicken lines divergently selected for low or high abdominal fat deposition

Lalande Julie

1 , Gondret Florence

2 , Louveau Isabelle

2 , Tea Illa

1 , Duclos Michel

3 ,

Baéza Elisabeth3

1 CNRS, Chimie et Interdisciplinarité: Synthèse, Analyse, Modélisation (CEISAM), UMR 6230, Faculté des Sciences,

Université de Nantes, BP 92208, 2 rue de la Houssinière, F-44322 Nantes Cedex 03, France 2 INRA, UMR1348 Physiologie, Environnement et Génétique pour l'Animal et les Systèmes d'Elevage (PEGASE), F-

35590 Saint-Gilles, France 3 INRA, UR 83 Recherches Avicoles, F-37380 Nouzilly, France

The feed cost represents about 60% of total cost in broiler production. In a context of high prices for

raw materials used in animal feed, it is therefore necessary to optimize feed efficacy and particularly the use

of dietary energy. For monogastric animals, feed energy is mainly provided by cereals presenting high starch

content and oil. The aim of this study was to analyze how broilers can adapt their energy metabolism

according to dietary energy source.

For that purpose, we reared 48 chickens issued from two lines divergently selected on the abdominal fat

content (3.4 and 1.3% relative to body weight for FL and LL lines, respectively) and fed from 3 to 9 weeks

of age with two different diets, HF and LF containing 80 and 20 g of lipids/kg of feed, and 379 and 514 g of

starch/kg of feed, respectively. Both diets were isoproteic (190 g crude proteins/kg of feed) and isoenergetic

(3000 kcal metabolisable energy/kg of feed). At 9 weeks of age, blood samples were collected on heparin

from all chickens, 3 hours after feed distribution in order to analyze plasma metabolites.

A metabolomic approach using the 1D 1 H NMR experiments was recorded on a Bruker Avance 500

spectrometer with a cryoprobe. NOESY 1D NMR sequence including water presaturation was used to obtain

plasma metabolic profiles. After identifying metabolites, a statistical approach was applied on data for

metabolites discrimination. The statistic tests included univariate (ANOVA, BoxPlot) and multivariate

analysis (PCA, PLS-DA) using the free R software and SIMCA P+ (Umetric®), respectively.

The multivariate analysis allowed discriminating the four groups. Among the 38 identified metabolites,

six had the main effects: glutamine, histidine, betaine, lipids, methionine and low density lipoproteins (LDL).

FL chickens had lower plasma levels of glutamine and histidine but higher plasma levels of betaine,

methionine and lipids than LL chickens. These data confirmed the highest ability of FL chickens to

synthesize lipids and to use glucogenic amino acids (AA) for this metabolism thus increasing the plasma

level of lipids for a further deposition in peripheral adipose and muscle tissues and decreasing the plasma

pool of free glutamine and histidine. Chickens fed with HF diet had higher plasma levels of lipids,

glutamine, methionine and betaine and lower plasma level of LDL than chickens fed with LF diet. The

circulating lipids were mainly provided by HF diet and were directly deposited in peripheral adipose and

muscle tissues with a low return towards the liver explaining the low level of plasma LDL. With HF diet,

chickens decreased the hepatic use of glucogenic AA which level then remained high in plasma.

The more interesting was the effect of line and diet on the plasma levels of methyl donors (methionine

and betaine) suggesting the implication of methionine and folate metabolisms in the control of hepatic lipid

synthesis.

This project was supported by the French ANR FatInteger program (ANR-11-BSV7-0004).

Mots-clés : Metabolomics, NMR, chicken, plasma, diet

96

P36

Use of NMR-based metabolomic to study cold stress on Miscanthus

Hyacinthe Le Gall, Jean-Xavier Fontaine, Roland Molinié, Jean-Marc Domon, Jérôme

Pelloux, Catherine Rayon, François Mesnard, Françoise Gillet, Ophélie Fliniaux.

EA 3900-BIOPI, Université de Picardie Jules Verne, 80000 Amiens, France

Miscanthus is a potential energy crop grass with several advantages in biomass production

(Glowacka, 2011). However, it can be damaged by late frost when shoots emerge too early in the

spring and during the first winter after planting (Farrell et al, 2006). The effects of cold acclimation

on cell wall composition has been described in Domon et al (2013). Herein, the effects of cold

acclimation on metabolome were investigated in different Miscanthus ecotypes.

NMR metabolomic approach was largely used to assess the impact of stress conditions on

plants (Kim et al, 2011). Within this context, a 1H NMR metabolomic study was performed on

frost-sensitive, frost-resistant or intermediate Miscanthus. After 28 days of culture in a growth

chamber (Zub et al, 2012), the different ecotypes were grown under cold acclimation or under

control conditions during 4 and 8 days then aerial parts were harvested, extracted and analysed by 1H NMR. Multivariate data analysis revealed a clear separation between the different ecotypes in

standard culture conditions and between cold acclimation and control conditions for the same

ecotype. The metabolites corresponding to the discrimination were identified using 1D and 2D

NMR spectra.

Références bibliographiques : Glowacka, 2011. A review of the genetic study of the energy crop Miscanthus. Biomass Bioenerg 35, 2445–

2454.

Farrell et al, 2006. Genotypic variation in cold tolerance influences the yield of Miscanthus. An. Appl Biol

149, 337–345.

Domon et al, 2013. Cell wall compositional modifications of Miscanthus ecotypes in response to cold

acclimation. Phytochemistry 85, 51–61.

Kim et al, 2011. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends Biotechnol.

29, 267–275.

Zub et al, 2012. The frost tolerance of Miscanthus at the juvenile stage: differences between clones are

influenced by leaf-stage and acclimation. Eur J Agron 36, 32–40.

Mots-clés : Miscanthus; Cold stress; NMR metabolomic

97

P37

Development of a high-throughput fingerprinting protocol for carotenoids and polyphenols in

tropical root and tuber crops

Ismael MUÑOZa, Vincent LEBOT

b, Laurent LEGENDRE

a

a CNRS, UMR 5557, Ecologie Microbienne, Université Lyon 1, Université de Lyon, F-69622 Villeurbanne,

France b CIRAD UR 75, P.O. Box 946, Port-Vila, Vanuatu

Background

Cassava, taro and the greater yam (tropical root and tuber crops) are major sources of starch in

developing tropical countries around the world. Nevertheless, they are often poor in secondary

metabolites such as carotenoids and polyphenols, representing a good opportunity for

biofortification. The human health benefits of consuming secondary metabolites are broad and are

the subject of an increasing number of epidemiological studies

Aim

With the long-term goal of identifying varieties for the development of plant breeding programmes

and studying the relationship between geographic distribution, genetic and chemical diversity of

tropical root and tuber crops varieties in Vanuatu (South Pacific), this study aimed to develop a

high-throughput fingerprinting protocol for carotenoids and polyphenols in these species

Methodology

Sampling was carried out at the experimental site in VARTC (Vanuatu Agricultural Research and

Technical Centre, Espiritu Santo) from July to September 2012. Germplasm was harvested when

fully mature to limit differences due to ontogeny. A core-sample of 352 accessions from the

VARTC collection was assembled to represent the full range of variation in flesh colour of the

storage organs. Inner tuber samples were excised, frozen and freeze-dried before being shipped to

France for carotenoids and polyphenols extraction and analysis by HPLC/DAD

Results

We developed the extraction and chromatographic protocols to analyse a wide range of phenolic

and carotenoid compounds in these species. Around 60 anthocyanins, flavonoids, phenolic acids

and carotenoids were identified based on retention time and UV-vis spectrum data

Conclusions

Our preliminary results indicate that tropical root and tuber crop varieties of Vanuatu differ

generally in their phenolic and carotenoid profiles or content and these differences can be exploited

to spot potentially useful parental varieties for future breeding programmes.

98

P38

A NMR-based metabolomic study of plant-insect interaction : Solanum

chomatophilum- Macrosiphum euphorbiae

Vincent Le Roux a , Roland Molinié

b , Jean-Xavier Fontaine

b , Philippe Giordanengo

c ,

François Mesnard b .

a EDYSAN EA 4698, Université de Picardie Jules Verne, 80000 Amiens, France. b EA 3900-BIOPI, Université de Picardie Jules Verne, 80000 Amiens, France.

c Institut Sophia Agrobiotech, CNRS 7254 – INRA 1355, Université de Nice Sophia Antipolis, 06903 Sophia

Antipolis, France.

The wild potato Solanum chomatophilum (Bitter) is an interesting model for crop protection against

aphids such as Macrosiphum euphorbiae (Thomas), as this plant presents a strong antibiosis

defense, which could be due to toxic compounds, but only on mature leaves. Indeed, the young

leaves are susceptible to this aphid [1, 2]. As leaf age, the pre-infestation by aphids is likely to

modify Solanum defense [3]. This would suggest a different content in metabolites as a function of

leaf age. To determine the compounds implied in S. chomatophilum defense in young and mature

leaves previously infested or not by aphids, we used NMR metabolomic [4]. Multivariate data

analysis revealed a clear separation between the different leaves previously infested or not by

aphids. The metabolites corresponding to the discrimination were identified using 1D and 2D NMR

spectra. Trigonelline, GABA, malic acid and phenylalanine were notably discriminant.

Références bibliographiques : [1] Le Roux V. , Dugravot S., Campan E. D. M., Dubois F., Vincent C. & Giordanengo P. (2008) - Wild

Solanum resistance to aphids : antixenosis or antibiosis ? Journal of Economic Entomology 101 : 584-591.

[2] Le Roux V. , Campan E. D. M., Dubois F., Vincent C. & Giordanengo P. (2007) - Screening for

resistance against Myzus persicae (Sulzer) and Macrosiphum euphorbiae (Thomas) among wild species of

Solanum in laboratory. Annals of Applied Biology 151 : 83-88.

[3] Brunissen L. , Cherqui A., Pelletier Y., Vincent C. & Giordanengo P. (2009) – Host-plant mediated

interactions between two aphid species. Entomologia Experimentalis et Applicata 132 : 30-38.

[4] Plischke, A., Y. H. Choi, P. M. Brakefield, P. G. Klinkhamer, and M. Bruinsma. (2012) –

Metabolomic plasticity in GM and non-GM potato leaves in response to aphid herbivory and virus infection.

Journal of agricultural and food chemistry 60: 1488-1493.

Mots-clés : NMR, metabolomic, Solanum chomatophilum, aphids, Macrosiphum euphorbiae

99

P39

NMR METABOLOMICS STUDY OF THE HEPATIC GLUCOSE AND

GLUTAMINE METABOLISM REPROGRAMMATION DURING HCV

INFECTION

Gilles Rautureau 1, Elodie Jobard

1, Pierre Lévy

2, Birke Bartosch

2,3, Bénédicte Elena-

Herrmann 1

1 Centre de RMN à Très Hauts Champs, Institut des Sciences Analytiques, CNRS/ENS Lyon/UCB Lyon 1,

69100 Villeurbanne, France; 2 Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052 CNRS 5286, 69003 Lyon, France;

3 Hospices Civils de Lyon (HCL), 69004 Lyon, France

Gilles Rautureau : gilles.rautureau@ens-lyon.fr

Background and aims: Hepatitis C virus (HCV) is known to perturb hepatic glucose and lipid

metabolism with important pathophysiological consequences. Chronic carriers often develop

steatosis, insulin resistance and type 2 diabetes, which resolve with successful antiviral treatment.

The exact circumstances of this metabolic reprogramming still remain vague. Here we show that

HCV infection induces an important reduction of glucose utilization that seems to be in part

compensated by anaplerotic mechanisms following an activation of glutamine metabolism.

Methods: The properties of the hepatitis C virus (HCV) JFH1 isolate have made it possible to

produce and study HCV in an infectious cell culture system. 1 H-NMR-based metabolomic at

600MHz and biological analyses in the context of diverse nutrient situations were performed with

JFH1 infected Huh7.5 cell extracts and supernatants. The metabolic signature was obtained using a

range of univariate and multivariate statistical methods.

Results: NMR-based metabolomic assays showed that HCV infected cells have a reduced glucose

utilization compared to non infected cells. Their lactate production in the absence of glucose is

highly increased in comparison to non infected cells. The alternative source to glucose that drives

the metabolism of HCV-infected cells seems to be glutamine. Indeed, cell proliferation rates of

HCV infected and uninfected cells in conditioned growth media showed that infected cells become

dependent on glutamine and lose their glucose dependence.

Conclusions: Altogether, these data suggest that HCV reprograms the hepatocyte metabolism and

establishes glutamine dependence. This HCV-induced metabolic reprogramming shares some

similarities to that commonly found in many types of tumor cells.

Mots-clés : HCV, RMN, métabolomique

100

P40

NMR metabolomic analysis of Arabidopsis thaliana deficient for pinoresinol

reductases

Romain Roulard, Jean-Xavier Fontaine, Roland Molinié, François Mesnard

Université de Picardie Jules Verne, BIOPI, UFR des Sciences, Ilot des poulies, 33 rue Saint Leu,

80039 Amiens cedex, France

Lignin and lignans are both biosynthesized from the phenylpropanoid pathway and therefore

share the same precursors: the monolignols. Lignin is a complex three-dimensional phenolic

polymer naturally present in the walls of certain specialized cells (xylem, sclerenchyma), where it

plays an important role in plant mechanical support and defense (Huis et al , 2012). Lignans are

dimeric structures containing two monolignols linked together by 8-8’ carbon bonds. The

dimerization of coniferyl alcohol results in the formation of pinoresinol, which is then converted

into lariciresinol and secoisolariciresinol via the action of the pinoresinol-lariciresinol reductases

(PLR; Davin and Lewis, 2003). In Arabidopsis thaliana , the genes coding for these enzymes show

a high level of expression in the xylem vessels (Nakatsubo et al , 2008). This localization

strengthens the hypothesis of a narrow relation between lignin and lignans biosynthesis. The

possibility of a regulation system between lignin and lignan has already been hypothesized when

elicitation experiments performed on flax with Fusarium oxysporum had showed a dramatic

decrease in lignan accumulation and an increase in lignin formation, without lowering the PLR

expression (Hano et al , 2006, Beejmohun et al , 2007). In order to verify this hypothesis,

Arabidopsis thaliana deficients for these enzymes (At1g32100 et At4g13660) were obtained and a

NMR metabolomic analysis was performed on their seeds and compared to wild types. A number of

differences in primary and secondary metabolites accumulation was found.

Références bibliographiques : Beejmohun V, Fliniaux O, Hano C, Pilard S, Grand E, Lesur D, Cailleu D, Lamblin F, Laine E, Kovenski J,

Fliniaux MA, Mesnard F. Coniferin dimerisation in lignan biosynthesis in flax cells. Phytochemistry

(2007), 68, 2744-2752

Davin LB, Lewis NG. An historical perspective on lignan biosynthesis: monolignol, allyphenol and

hydroxycinnamic acid coupling and downstream metabolism. Phytochemistry Review (2003) 7, 257–288

Hano C, Addi M, Bensaddek L, Crônier D, Baltora-Rosset S, Doussot J, Maury S, Mesnard F, Chabbert B,

Hawkins S, Lainé E, Lamblin F. Differential accumulation of monolignol-derived compounds in elicited

flax ( Linum usitatissimum ) cell suspension cultures. Planta (2006), 223, 975-989

Huis R, Morreel K, Fliniaux O, Lucau-Danila A, Fénart S, Grec S, Neutelings G, Chabbert B, Mesnard F,

Boerjan W, Hawkins S. Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation

in flax stems. Plant Physiology (2012), 158, 1-23

Nakatsubo T, Mizutani M, Suzuki S, Hattori T, Umezawa T. Characterization of Arabidopsis thaliana

Pinoresinol Reductase, a New Type of Enzyme Involved in Lignan Biosynthesis Journal of Biol ogical

Chemistry (2008), 283, 15550-15557

Mots-clés : Pinoresinol-lariciresinol reductases, lignans, phenylpropanoids, NMR, Arabidopsis thaliana

101

P41

A systems biology approach for the effect of nitrogen supply on anthocyanin

accumulation in grapevine cell suspensions.

E. Soubeyrand 1*

, S. Colombié 3 , I. Merlin

1 , G. Hilbert

1 , B. Beauvoit

3 , Z.W. Dai

1 , S.

Cluzet 2 , C. Renaud

1 , Y. Gibon

3 , J.M. Mérillon

2 , S. Delrot

1 and E. Gomès

1

1 University of Bordeaux, INRA, ISVV, UMR 1287 EGFV, Bordeaux, France

2 University of Bordeaux, ISVV, EA 3675, GESVAB, Bordeaux, France

3 University of Bordeaux, INRA, UMR 1332 BFP, Bordeaux, France

* Corresponding author: eric.soubeyrand@bordeaux.inra.fr

Grapevine berry composition depends on the accumulation of primary (sugar and organic acids) and

secondary metabolites (anthocyanins, flavonols …). Anthocyanin accumulation is influenced by

environmental factors and nutrient supply. High sugar and/or low nitrogen supply stimulate

anthocyanin production in berry skin cells of red grape varieties (Larronde, et al. 1997; Hilbert et

al. 2003). The present work aims to understand the molecular mechanisms involved in the response

of anthocyanin accumulation to changes in nitrogen supply. We applied an integrated approach

combining transcript, enzyme and metabolite profiling, with cell suspensions of cv. Gamay

teinturier cultivated in the presence of two different concentrations on Nitrogen: Low (5 mM of

KNO3 - ) and Control (25 mM of KNO3

- ). Sugar, amino acid and anthocyanin concentrations;

gene expression and enzyme activities were measured and compared. The low nitrogen medium

increased the total anthocyanin content, especially peonidin and petunidin derivatives including

anthocyanin molecules that were not accumulated in high nitrate cultivated cells. Moreover, the low

phenylalanine concentration in low nitrogen-fed cells is in agreement with the increase in

phenylpropanoid catabolic flux, supported by the increase in phenylalanine ammonia-lyase activity.

Gene expression analysis on structural genes involved in anthocyanin synthesis confirmed the

stimulation of the phenylpropanoid pathway. Indeed, transcripts encoding 4 enzymes of the

anthocyanin biosynthetic pathway (phenylalanine ammonia-lyase, chalcone synthase, flavanone-3-

hydroxylase and dihydroflavonol-4-reductase) were higher in nitrogen-limited cell suspensions.

These experimental data will be used for constraint-based modeling, using a Flux Balance Analysis.

For that, a stoichiometric metabolic model including both primary and secondary metabolism will

describe the carbon and the nitrogen flux partitioning in the cells. Assuming a metabolic steady

state at 4 and 6 days of cell culture, and using the metabolite accumulation rates in the biomass, the

fluxes in the network will be calculated. Then, the flux maps could help us to point out the

metabolic changes when nitrogen is supplied to the cells and the model should help to get a

comprehensive view of anthocyanin biosynthetic pathway regulation by nitrogen.

Références bibliographiques : Larronde, F., Krisa, S., Decendit, A., Ch, C., & Deffieux, G. (1998). Regulation of polyphenol production in

Vitis vinifera cell suspension cultures by sugars. Vitis, 946–950.

Hilbert, G., & Gaudillère, J.-P. (2003). Effects of nitrogen supply on must quality and anthocyanin

accumulation in berries of cv . Merlot. Vitis, 42(2), 69–76.

Mots-clés : Nitrogen, Anthocyanin, Flux Balance Analysis

102

P42

Metabolite correlation networks for the study of tropane alkaloid pathway: How

Agrobacterium rhizogenes deregulates the secondary metabolism of Datura

innoxia Mill. plants?

Kieu Oanh Nguyen1, Arnaud Lanoue

2, Eric Gontier

1, Rebecca Dauwe

1

1 Université de Picardie Jules Verne, BIOPI, UFR des Sciences, Ilot des poulies, 33 rue Saint Leu, 80039

Amiens cedex, France 2Université François-Rabelais Tours, Plant Biotechnology and Biomolecules, Faculté des Sciences

Pharmaceutiques, 31 Avenue Monge, 37200 Tours, France

nguyen.thi.kieu.oanh0711@gmail.com

Scopolamine and hyoscyamine are two medically important tropane alkaloids that are

synthesized in the roots of Datura innoxia Mill.. Although the biosynthesis pathway has amply

been studied using isotopic markers, major questions persist up to today, such as concerning the

role of hygrine as a precursor. On the other hand, it is well known that transformation of D. innoxia

with Agrobacterium rhizogenes induces a strong increase in the production of scopolamine and

hyoscyamine. It remains unknown, however, if just the mere fact of an increase in the amount of

young root cells is at the origin of this increased production, or if specific biosynthetic steps are

stimulated.

Here, we quantified a large number of precursors and derivatives of scopolamine and

hyoscyamine in the roots of a large number of transformed and untransformed Datura innoxia

individuals. These metabolites were quantified and structurally identified using a combination of

GC-MS and UPLC-MS. Correlation networks of the metabolites strongly suggested certain

architectural aspects of the hyoscyamine-scopolamine biosynthesis pathways and identified rate

limiting steps. Biosynthetic steps that were specifically up-regulated in the A. rhizogenes

transformed individuals were clearly revealed. Our results suggest thus that metabolite correlation

networks form a promising tool for the unraveling of different biosynthetic pathways.

103

P43

Coordinated methodological developments for plant metabolomics at Bordeaux

Stéphane Bernillon 1*

, Benoît Biais 1 , Catherine Deborde

1* , Lætitia Fouillen

2* , Yvon

Guntz1 , Daniel Jacob

1* , Mickaël Maucourt

3* , Yves Gibon

1* , Éric Pedrot

4* , Tristan

Richard 4*

, Annick Moing 1*

1 INRA, UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France

2 CNRS, UMR 5200 Laboratoire de Biogenèse Membranaire, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon,

France

3 Université de Bordeaux, UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave

d’Ornon, France

4 Université de Bordeaux, GESVAB, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France

* Plateforme Métabolome du Centre de Génomique Fonctionnelle Bordeaux, IBVM, Centre INRA Bordeaux, 71 av

Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France

Bordeaux Metabolome Facility (BMF) is dedicated to plant metabolomics from chemical to data

analyses. Besides routine analyses, this facility has developed methods to improve metabolome and

lipidome coverage, facilitate metabolite identification, and increase throughput from extraction to

data processing. This poster focuses on three on-going method developments:

(1) Lipidomics has been established at BMF in 2010 (a). To improve lipid coverage, a method

involving LC-QTRAP-MS has been developed for quantification and characterization of

triacylglycerols.

(2) Identification is a key point in metabolomics to link biomarkers discovery to biological

information. A pipeline has been developed to identify metabolites by a combination of LC-MS and

LC-NMR (b), as exemplified by metabolite identification in tomato organs.

(3) In order to increase the throughput of 1 H-NMR metabolomic profiling, sample preparation has

been improved through robotization of extraction and titration, eventually revealing the bottleneck

of data processing. Therefore, an automated binning tool for NMR spectra has been developed to

speed up bin design and integration calculations (c). Moreover, chemical information can be

highlighted by bin clustering and use of reference spectra libraries, thus providing a helpful support

for compound identification.

In the near future, these three types of development will allow BMF to achieve new ambitious plant

metabolomics projects.

Fundings: INRA National Commission of Joint Tools (CNOC), IBiSA (Infrastructures in Biology,

Health and Agronomy) and Functional Genomic Center Bordeaux

Références bibliographiques : a- Cacas et al. 2012 Anal Bioanal Chem DOI: 10.1007/s00216-012-6060-1

b- Acevedo et al. 2012 Anal Chim Acta DOI: 10.1016/j.aca.2011.11.060

c- Jacob et al. 2013 Anal Bioanal Chem DOI 10.1007/s00216-013-6852-y

Mots-clés : Développement technologique, RMN, LC-MS, Métabolomique, bioinformatique

104

P44

Approche métabolomique de la résistance de la vigne au mildiou

Clémence Grosab

, Anne Poutaraudab

, Emilce Pradoab

, Christophe Schneiderab

, Sabine Wiedemann-

Merdinogluab

, Raymonde Baltenweck-Guyotb, Philippe Hugueney

ab, Didier Merdinoglu

ab

a INRA, UMR 1131, SVQV, 68000 Colmar, France

b Université de Strasbourg, UMR 1131, SVQV, 68000 Colmar, France

En vue de limiter l’application de produits phytosanitaires sur la vigne, l’équipe de Génétique

et d’Amélioration de la Vigne de Colmar développe des variétés résistantes (1). La création de ces

variétés est réalisée par introgression de différents gènes de résistance provenant d’espèces

asiatiques ou américaines dans des variétés sensibles de l’espèce Vitis vinifera présentant de bonnes

qualités viticoles et vinicoles (2, 3). Dans ce cadre, la connaissance des mécanismes biochimiques

liés à ces gènes est importante. L’interaction entre la vigne et le mildiou (Plasmopara viticola)

provoque chez la plante une cascade de réactions qui conduit à la sensibilité ou à la résistance.

L’objectif de notre étude vise à identifier les molécules intervenant dans le mécanisme d’un facteur

de résistance de la vigne au mildiou provenant de Muscadinia rotundifolia : RPV2.

Sept génotypes ont été étudiés. Cinq issus d’une population correspondant au 4ème retro

croisement de Vitis vinifera (sensible) sur des plantes présentant le facteur de résistance RPV2 issu

de Muscadinia rotundifolia et leur 2 parents. Ainsi ont été analysés 3 genotypes sensibles au

mildiou et 4 génotypes résistant présentant RPV2.

Des feuilles de niveau 6 de chacun de ces génotypes ont été prélevées en serre puis inoculées

avec du mildiou ou placées dans de l’eau (control). Des disques foliaires de 2 cm de diamètre ont

été prélevés à différents temps post traitement : 0h, 12h, 24h, 48h, 72h puis extraits avec du

méthanol à chaud. Ces extraits ont été analysés avec une UHPLC Ultimate 3000 (Dionex) couplée à

un spectromètre de masse Orbitrap Exactive (Thermo). Les analyses ont été effectuées en mode

positif et négatif avec une méthode chromatographique de 30 min (gradient acétonitrile eau).

Les résultats sont en cours d’analyse avec le logiciel SIEVE 1.3 (Thermo) avec une approche

ciblée sur certaines molécules d’intérêt et non ciblée. Plusieurs centaines de « frames » (masse

précise à un temps de rétention donné) ont été extraits de ce jeu de données.

La comparaison des sept génotypes, présentant ou non le facteur de résistance au mildiou

RPV2, à différents temps post infection a déjà permis de mettre en évidence plusieurs familles de

molécules impliquées dans la résistance dont certains stilbènes mais également d’autres molécules

en cours d’identification.

Références bibliographiques : 1. Merdinoglu, D., Merdinoglu-Wiedemann, S., Mestre, P., Prado, E., and Schneider, C. (2009) The

contribution of varietal innovation to the reduction of pesticide inputs in the vineyard: the example of

resistance to mildew and oidium, Progres Agricole et Viticole 126, 244-247.

2. Perazzini, R., Leonardi, D., Ruggeri, S., Alesiani, D., D'Arcangelo, G., and Canini, A. (2008)

Characterization of Phaseolus vulgaris L. Landraces Cultivated in Central Italy, Plant Food Hum Nutr 63,

211-218.

3. Blanc, S., Wiedemann-Merdinoglu, S., Dumas, V., Mestre, P., and Merdinoglu, D. (2012) A reference

genetic map of Muscadinia rotundifolia and identification of Ren5, a new major locus for resistance to

grapevine powdery mildew, TAG. Theoretical And Applied Genetics. Theoretische Und Angewandte

Genetik 125, 1663-1675.

105

P45

Identification de signatures métabolomiques sériques séquentielles de la récidive

après traitement par radiofréquence d’un carcinome hépatocellulaire sur

cirrhose par RMN 1H

C.Goossens1, M.Triba

1, M.Yaziciyan

1, O.Seror

2, P.Savarin

1, P.Nahon

2

1 Université Paris 13, Sorbone Paris Cité, CSPBAT, UMR 7244, CNRS, Bobigny, France

(METEVBO : plateforme Métabolomique Evry-Bobigny) 2 Service d’Hépatologie, Université Paris 13, Hôpital Jean Verdier, Bondy, France

Contexte : Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le plus fréquent des cancers primitifs du foie.

La tumeur s’accroissant très rapidement, le taux de survie ne dépasse pas 5% après cinq ans si la

personne n’a pas été traitée. La cirrhose est considérée comme une condition précancéreuse

prédisposant au développement du CHC. Les causes de cette atteinte hépatique sont essentiellement

les virus de l’hépatite B, C et la consommation excessive d’alcool. Alors que l’ablation par

radiofréquence (RFA) est un des traitements les plus utilisés, la récurrence tumorale est de l’ordre

de 50% suite à ce traitement. A l’heure actuelle, le pronostic de ces patients est particulièrement

délicat à préciser. Les praticiens hospitaliers manquent de marqueurs cliniques et biologiques

fiables pour classifier le CHC. C’est pourquoi, la métabolomique apparaît être une technique de

choix permettant d’identifier et de caractériser de nouveaux biomarqueurs. Elle permet d’identifier

et de quantifier des métabolites dans un fluide biologique.

Objectifs : Identifier un profil métabolomique sérique associé à la récidive du petit CHC traité par

radiofréquence. Déterminer des biomarqueurs susceptibles d’affiner la prédiction de la récidive et le

pronostic de patients traités.

Matériel et méthodes : 19 patients présentant un CHC développé sur foie cirrhotique et éligibles

pour la RFA ont été présélectionnés. Trois sera correspondant aux temps J (jour précédent la RFA),

J+1 (1 jour après la RFA) et J+30 (30 jours après la RFA, plus de traces de nodules visibles) ont été

prélevés. Chaque échantillon de sérum est analysé par RMN 1H à 23°C sur un spectromètre Bruker

500 MHz suivant la séquence d’acquisition CPMG. Le traitement des différents spectres obtenus est

réalisé à l’aide du logiciel NMR Pipe (Delaglio et al, 1997). Les méthodes statistiques multivariées

utilisées sont de type analyse en composantes principales ACP et OPLS.

Résultats préliminaires : L’analyse multivariée supervisée permet de discriminer les échantillons J

des échantillons J+1. Nous avons dans un deuxième temps réalisé une seconde étude statistique sur

les échantillons J+1 et J+30. Les biomarqueurs mis en évidence dans ces deux modèles sont très

similaires. Nous avons ainsi établi une signature métabolique caractérisant l’ablation par

radiofréquence.

Conclusion : Ces résultats sont de bon augure. L’analyse du suivi longitudinal des sera séquentiels

sera effectuée de manière à déterminer des biomarqueurs susceptibles d’affiner la prédiction de la

récidive et le pronostic de patients traités.

106

P46

Development of a work-flow for high performance thin layer chromatography

data processing for untargeted metabolomics

Coralie Audoin

(1,2), Khadidja Romari

(2), Olivier P. Thomas

(1), Grégory Genta-Jouve

(1,3)

(1) Nice Institute of Chemistry UMR 7272 CNRS-PCRE, University of Nice-Sophia Antipolis, Parc Valrose,

06108 Nice, France email: coralie.audoin@unice.fr

(2) GREENSEA SAS, Promenade du Sergent Jean-Louis Navarro, 34140 Mèze, France

(3) School of Biosciences, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham, B15 2TT, United Kingdom

Nowadays, most of the metabolomics studies are performed using NMR or MS techniques [1]. One

technique however seems to have been left apart in this field: the high performance thin layer

chromatography (HPTLC). Although the different practical steps of a HPTLC experiment are now all

automated, this technique is suffering the lack of computational treatment of the data. A large number

of qualitative and quantitative protocols have been developed using HPTLC for the study of plants

extracts [2-4]. While for quantitative analyses UV detection is mainly use, qualitative comparisons of

different samples are often realized by direct visualization of the plates.

In this context we developed the first work-flow dedicated to the analysis of HPTLC data, including

the steps commonly used in metabolomics analyses. This development resulted in the increase of

features detected, and more importantly, in the reduction of the common diffusion drift observed

during HPTLC plate development.

Références bibliographiques : [1] R. Schuhmacher, R. Krska, W. Weckwerth, R. Goodacre, Anal. Bioanal. Chem. (2013) 1–2.

[2] X.-H. Wang, P.-S. Xie, C. W. Lam, Y.-Z. Yan, Q.-X. Yu, J. Pharm. Biomed. Anal. 49 (2009) 1221–1225.

[3] S. Bonny, L. Paquin, D. Carri´e, J. Boustie, S. Tomasi, Analytica Chimica Acta 707 (2011) 69–75.

[4] J. P. Piwowarski, A. K. Kiss, Phytochem. Anal. (2013).

107

Communications Etudiants Master Nantais

EM1

Présentation du Master 2 A3M (Analyse, Molécules, Matériaux, Médicaments)

Renaud BOISSEAU

Laboratoire CEISAM, Groupe EBSI, CNRS-Université de Nantes UMR6230, 2 rue de la Houssinière, 44322 Nantes

cedex,

renaud.boisseau@etu.univ-nantes.fr

EM2

L'apport de la métabolomique pour la toxicologie.

Jérémy MARCHAND, Marie ALLAIN, Renaud BOISSEAU, Sylvain KENAN, Elise

LEMASSON, Alexis RIPOCHE

Université de Nantes UMR6230, 2 rue de la Houssinière, 44322 Nantes cedex

jeremy.marchand@etu.univ-nantes.fr

EM3

L'apport de la métabolomique pour l'étude de l'obésité

Estelle N'TSIBA, Dalinda BEN ZINA, Claire BIERLING, Simon GIRAUD, Tiffany

GUITTET, Nicolas GUILLOPE

Université de Nantes UMR6230, 2 rue de la Houssinière, 44322 Nantes cedex

estelle.ntsiba@etu.univ-nantes.fr

108

Atelier 1

Initiation au traitement de données de métabolomique

obtenues par RMN

Personnes encadrant la formation : Roland Molinié, Jean-Xavier FONTAINE

roland.molinie@u-picardie.fr

jean-xavier.fontaine@u-picardie.fr

Public envisagé et les prérequis :

- Public : novice ou initié en programmation

- Prérequis : connaissance du principe de la métabolomique par RMN

Compétences acquises à la sortie de la formation : aperçu de certaines méthodes d’alignement et de

« binning »

Objectif de la formation :

Initiation au traitement de données de métabolomique obtenues par RMN. Exemples

d’utilisation d’algorithmes développés sous Matlab (Mathworks). Travail pratique sur un

jeu de données réalisées dans le cadre du test inter-plateformes du RFMF (metaboring) :

Compétences acquises à la sortie de la formation :

- Alignement des spectres (utilisation de l’algorithme icoshift1)

- « Binning » simple et adapté2

- Traitement statistique simple (ACP, …)

Durée de la formation : 2 heures.

Date : Lundi 10 juin à 10H en salle informatique, sur le lieu des 7 JS RFMF

Format : Travail pratique sur ordinateur (a priori, 2 personnes par ordinateur)

Nb de places max : 30 personnes (2 par ordinateur).

Références bibliographiques :

1 : F. Savorani, G. Tomasi, S.B. Engelsen, icoshift: A versatile tool for the rapid alignment of 1D

NMR spectra, J. Magn. Reson. (2010) 202: 190-202

2 : P. E. Anderson, D. A. Mahle, T. E. Doom, N. V. Reo, N. J. DelRaso, M. L. Raymer. Dynamic

adaptive binning: an improved quantification technique for NMR spectroscopic data.

Metabolomics (2011) 7 : 179-190

109

Atelier 2

Exploitation des données acquises par Spectrométrie de Masse.

Personnes encadrant la formation : Frédérique Courant, Christophe Junot, Jean-Charles Martin,

Estelle Pujos-Guillot

Public envisagé et les prérequis :

- Public : toute personne pratiquant ou désireuse de pratiquer l'analyse métabolomique par

spectrométrie de masse ; adapté aux débutants « éclairés » mais non spécialistes

- Prérequis : Connaissance pratique de la spectrométrie de masse ; notions de traitement des

données par xcms

Objectif de la formation :

● Traitement des données : parfaire ses connaissances sur l’utilisation des scripts xcms et leurs

différentes fonctions / arguments en fonction de la forme des données brutes (GC ou LC, LR ou

HR…),

● Quality Controls : apprendre à utiliser les Quality Controls dans un objectif de diagnostique des

pitfalls et de correction de la dérive analytique,

● Identification des biomarqueurs : acquérir des bases d’élucidation structurale (application des 7

règles d’or pour arriver à une formule brute, spectrométrie de masse multidimensionnelle pour

approcher la formule développée, interrogations de bases de données en ligne, construction de

banque de données interne).

Compétences acquises à la sortie de la formation : meilleure connaissance du pipeline

métabolomique, du traitement des données MS à l’élucidation structurale des candidats

biomarqueurs.

Durée de la formation : 3 heures.

Date et lieu : Mercredi 12 juin à 14h -17h , Amphi Baudelocque, sur le lieu des 7 JS RFMF.

110

Atelier 3

Techniques d’acquisition et de suppression de solvant en RMN 1D.

Personnes encadrant la formation : Serge Akoka, Illa Tea, Patrick Giraudeau.

Public envisagé et les prérequis :

- Public : Toute personne pratiquant ou désireuse de pratiquer l'analyse métabolomique par RMN ;

- Prérequis : Connaissance pratique de la RMN 1D et notions de base en RMN 2D.

Objectif de la formation :

Acquérir ou parfaire les bases théoriques et pratiques de la suppression du signal de l'eau en RMN-

1D à visée quantitative.

Compétences acquises à la sortie de la formation : vision objective des performances analytiques

(justesse, précision, robustesse) des différentes stratégies.

Durée de la formation : 2 heures.

Date et lieu : Mercredi 12 juin à 14h dans l’amphi Parmentier sur le lieu des 7 JS RFMF.

111

Atelier 4

How to submit data to MetaboLights ?

Personnes encadrant la formation : Kenneth Haug et Reza Salek, EBI Cambridge UK.

EMBL - European Bioinformatics Institute. Wellcome Trust Genome Campus,

Hinxton, Cambridge, CB10 1SD, UK

Public envisagé et les prérequis :

o Expérimentateurs qui travaillent sur la gestion des données métabolomiques

o Bioinformaticiens

o Personnes qui souhaitent déposer des données lors d’une publication

Objectif de la formation:

L'objectif est d'acquérir une connaissance de l’architecture de la base MetaboLights et une certaine

autonomie dans le dépôt et la recherche de données métabolomiques.

Overview of MetaboLights: MetaboLights (http://www.ebi.ac.uk/metabolights) is the first general-

purpose, open-access repository for metabolomics studies, their raw experimental data and

associated metadata, maintained by one of the major open-access data providers in molecular

biology. Metabolomic profiling is an important tool for research into biological functioning and into

the systemic perturbations caused by diseases, diet and the environment. The effectiveness of such

methods depends on the availability of public open data across a broad range of experimental

methods and conditions. The MetaboLights repository, powered by the open source ISA

framework, is cross-species and cross-technique. It will cover metabolite structures and their

reference spectra as well as their biological roles, locations, concentrations and raw data from

metabolic experiments. Studies automatically receive a stable unique accession number that can be

used as a publication reference (e.g. MTBLS1). At present, the repository includes 15 submitted

studies, encompassing 93 protocols for 714 assays, and span over 8 different species including

human, Caenorhabditis elegans, Mus musculus and Arabidopsis thaliana. Eight hundred twenty-

seven of the metabolites identified in these studies have been mapped to ChEBI. These studies

cover a variety of techniques, including NMR spectroscopy and mass spectrometry.

Compétences acquises à la sortie de la formation :…..

- Une compréhension générale de l'utilisation de MetaboLights et de l'outil d'édition ISAcreator

- L’autonomie dans le dépôt de données sur MetaboLights

Durée de la formation : 2 heures.

Date et lieu : Mercredi 12 juin à 14h en salle informatique sur le lieu des 7 JS RFMF

Nb de places max : 30 personnes maximum.

Référence bibliographique : Kenneth Haug, Reza M. Salek, Pablo Conesa, Janna Hastings, Paula de Matos, Mark Rijnbeek, Tejasvi

Mahendraker, Mark Williams, Steffen Neumann, Philippe Rocca-Serra, Eamonn Maguire, Alejandra

González-Beltrán, Susanna-Assunta Sansone, Julian L. Griffin and Christoph Steinbeck. MetaboLights-- an

open-access general-purpose repository for metabolomics studies and associated meta-data. Nucl. Acids Res.

(2012) doi: 10.1093/nar/gks1004

112

Liste des Participants

Acket Sébastien

UTC, GEC CNRS-FRE 3580,

BP 20259

60205 Compiègne

Aidoud Nacima

UMR Inserm 1062 / Inra 1260 Nutrition

obésite et risque thrombotique

27 bvd Jean Moulin, Fac Méd La Timone

13005 Marseille

Akoka Serge

CEISAM - Bat9

2 rue de la houssinière,

44322 Nantes cedex

Alves Sandra

Equipe CSOB

Bâtiment F 7ème

étage case 45,

4 Place Jussieu

75252 Paris cedex 05

Arnaud Luc Agilent Technologies France

Parc Technopolis ZA Courtaboeuf

3 av du Canada

91978 Les Ullis cedex

Assemat Olivier BRUKER

34 rue de l'Industrie, BP 10002

67166 Wissembourg

Audoin Coralie

Institut de Chimie de Nice

28 avenue Valrose - Parc Valrose

06100 Nice

Balayssac Stéphane

Groupe de RMN Biomédicale Laboratoire de

Synthèse et Physico-Chimie de Molécules

d'Intérêt Biologique (SPCMIB) UMR CNRS

5068, Université Paul Sabatier

118, Route de Narbonne

31062 Toulouse Cedex 9

Baltenweck-Guyot Raymonde

UMR1131 INRA/UdS - équipe MSV-

Métabolisme secondaire de la Vigne

28 rue de Herrlisheim

68021 Colmar

Bayle Marie-Laure

Pôle Ecotox

1 avenue de la Gare BP 15173 Alixan-

ROVALTAIN

26958 Valence Cedex 9

Bellvert Floriant

Centre d'Etude des Substances Naturelles

CESN

Université Lyon 1 la Doua

Bât. Forel 4ème

étage –

43 bd du 11 Novembre 1918

69100 Villeurbanne

Berardocco Solenne

UMR INRA 1349 IGEPP

Bâtiment A - Numéro 301 - Domaine de la

Motte

35653 Le Rheu cedex

Bertrand Cédric

UPVD - LCBE

58 Avenue Paul Alduy

66860 Perpignan

113

Bertrand Samuel

School of Pharmaceutical Sciences, EPGL,

University of Geneva, University of

Lausanne, quai Ernest-Ansermet 30,

CH-1211 Genève

Suisse

Blasco Hélène

U930

2 BD Tonnelle

37044 Tours

Boccard Julien

Ecole de Pharmacie Genève-Lausanne

20 Bd d'Yvoy

CH-1211 Genève 4,

Suisse

Boisseau Renaud

CEISAM - Bat9

2 rue de la houssinière,

44322 Nantes cedex

Bonnard Isabelle

UPVD - LCBE

58 Avenue Paul Alduy

66860 Perpignan

Bonnet Claire

INRA, UMRH1213 Herbivores,

63122 Saint-Genès-Champanelle

Bouchemal-Chibani Nadia

CSPBAT - UMR CNRS 7244

UFR SMBH

74 rue Marcel Cachin

93017 Bobigny

Bouchereau Alain

UMR INRA 1349 IGEPP

Bâtiment A - Numéro 301 - Domaine de la

Motte

35653 Le Rheu cedex

Boudra Hamid

INRA, UMRH-DIMA

63122 Saint Genès Champanelle

Broudin Simon

Profilomic

CEA Saclay - Batiment 136

91191 Gif-Sur-Yvette

Buonomo Antoine

CESN

29 cours Emile Zola

69100 Villeurbanne

Cahier Karine

CNRS UMR7139

Station Biologique

29688 Roscoff

Cahoreau Edern

Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes

Biologiques et des Procédés

135 avenue de Rangueil

31077 Toulouse cedex 4

Charles Christian

SIGMA PLUS

6 rue Collange

92300 Levallois-Perret

Chéreau Sylvain

ONIRIS-LABERCA

ONIRIS Chantrerie, Route de Gachet

44307 Nantes

Cilindre Clara

Equipe Effervescence, Champagne et

Applications

GSMA UMR CNRS 7331 - Université de

Reims Champagne Ardenne - Moulin de la

Housse - BP1039

51687 Reims

Clément Christophe

URVVC EA 4707

URCA - UFR SEN - Moulin de la Housse -

Bâtiment 18 - BP 1039

51687 Reims

Colsch Benoît

CEA, DSV/iBiTec-S/SPI/LEMM

Centre CEA-SACLAY

91190 Gif sur Yvette

114

Combourieu Bruno

Pôle Ecotox

1 avenue de la Gare BP 15173 Alixan-

ROVALTAIN

26958 Valence Cedex 9

Comte Blandine

UNH - PhéMABIO

Centre de recherche de Clermont-

Ferrand/Theix

63122 Saint-Genès Champanelle

Conan Céline

UMR7139-Végétaux Marins et Biomolécules

Place Goerges Teissier

29688 Roscoff

Constans Jean-Marc

CHU Amiens et BIOFLOWImage

Radiologie Hôpital Nord

80000 Amiens

Cotton Jérome

Profilomic

31 rue d'Aguesseau

92100 Boulogne Billancourt

Courant Frédérique ONIRIS-LABERCA

ONIRIS Chantrerie, Route de Gachet

44307 Nantes

Dalle Céline Institut de Chimie de Clermont-Ferrand

Laboratoire Microorganismes: Génome et

Environnement,

BP 10448,

63000 Clermont-Ferrand

Dalle Nicolas

INRA, UMR 1019, Plateforme d’Exploration

du Métabolisme, UNH,

63000 Clermont-Ferrand

Dariy Ekaterina

LGBM, Genoscope

2 rue Gaston Crémieux

91000 Evry

Dauly Claire

Thermo Fisher Scientific

16 avenue du Québec - Silic 765 Villebon-

sur-Yvette

91963 Courtaboeuf Cedex

Dauwe Rebecca

BIOPI EA3900 UPJV

UFR des Sciences, Ilot des poulies,

33 rue Saint Leu

80000 Amiens

De Luca Deborah

Biologie humaine et toxicologie

6 avenue du champ de mars

7000 Mons

Belgique

Deborde Catherine

Plate-forme Métabolome &UMR1332

Biologie du Fruit & Pathologie, INRA

Université Bordeaux

71, avenue E. Bourlaux, BP 81

33140 Villenave d'Ornon

Diémé Binta

Equipe 2-Inserm U930

Bâtiment vialle

10 bd Tonnellé

37000 Tours

El Boutachfaiti Redouan

BIOPI EA3900 UPJV

Ilot des poulies, UFR des Sciences,

33 rue Saint Leu

80039 Amiens cedex

Emond Patrick

UMR INSERM 930

10 bd Tonnellé BP3223

37032 Tours cedex 1

Ferchaud-Roucher Véronique

Plateforme spectrométrie de masse CRNH,

U915

IRT-UN 8 quai Moncousu BP70721

44007 Nantes

115

Fliniaux Ophelie

BIOPI EA3900 UPJV

Ilot des poulies, UFR des Sciences,

33 rue Saint Leu

80039 Amiens cedex

Fontaine Jean-Xavier

EA3900-BIOPI

Rue des Louvels

80000 Amiens

Foucquier Julie

CEA LIST, Laboratory of Tools for Data

Analys

91191 Gif-sur-Yvette

Gagneul David

UMR INRA-USTL 1281 SADV

Université de Lille1, Cité Scientifique

59655 Villeneuve d'Ascq

Gaveau Nathalie

URVVC Université de Reims Champagne-

Ardenne, UFR Sciences Exactes et Naturelles,

Campus Moulin de la Housse, Chemin des

Rouliers,BP 1039

51687 Reims

Genta-Jouve Gregory

Environmental Metabolomics Research

Laboratory - University of Birmingham

71, Lottie Road

B296JY Birmingham

UK

Ginies Christian

BIOMET-INRA1260

27 boulevard Jean Moulin

13385 Marseille

Giraudeau Patrick

CEISAM - Bat9

2 Rue de la Houssinière,

44322 Nantes cedex

Gontier Eric

BIOPI EA3900-UPJV "Biologie des Plantes

et Innovation" Ilot des poulies, UFR de

Sciences,

33 rue Saint Leu

80039 Amiens

Goossens Corentine

Metevbo, CSPBAT-UMR7244, UP13

74, rue Marcel Cachin

93017 Bobigny

Gosselin Isabelle

Génie Enzymatique et Cellulaire

33 rue Saint Leu

80039 Amiens cedex

Goyer Aymeric

UMR IGEPP 1349

bat 301 - A - Domaine de la Motte

35653 Le Rheu

Grand Eric

Laboratoire des Glucides

33 Rue Saint Leu

80039 Amiens

Gros Clémence

Génétique et amélioration de la vigne

28 rue de Herrlisheim

68021 Colmar

Guitton Yann

Mer Molecule Santé

2 rue de la Houssinière - BP92208

44322 Nantes

Halter David

INRA Colmar

28 rue de Herrlisheim

68000 Colmar

Hance Philippe

UMR SADV USTL/INRA 1281

USTL - Avenue Mendeleëv -Bât SN2

59655 Villeneuve d'Ascq

Haug Kenneth

EMBL - European Bioinformatics

Institute. Wellcome Trust Genome Campus,

Hinxton, Cambridge, CB10 1SD,

UK

Hay Anne-Emmanuelle

CESN ISPB UMR5557 Ecologie

Microbienne UCB Lyon 1

Pavillon Netien 2ème

étage - 8 av. Rockefeller

69373 Lyon

116

Hilbert Jean-Louis

UMR SADV USTL/INRA 1281

USTL - Avenue Mendeleëv -Bât SN2

59655 Villeneuve d'Ascq

Hubert Jane

Institut de Chimie Moléculaire Reims

Université de Reims Champagne-Ardenne,

Moulin de la Housse, BP 1039

51687 Reims

Idrissi Abdel

UTC, GEC CNRS-FRE 3580

BP 20259

60205 Compiègne

Jacob Daniel

Plate-forme Métabolome-Fluxome,

&UMR1332 Biologie du Fruit & Pathologie,

INRA Université Bordeaux

71, avenue E. Bourleaux, BP 81

33140 Villenave d'Ornon

Jamali Arash

BIOPI EA3900-UPJV "Biologie des Plantes

et Innovation" Ilot des poulies,

UFR de Sciences,

33 rue Saint Leu

80039 Amiens

Jourdain Sabine

Bruker Daltonique

34 rue de l'industrie

67166 Wissembourg

Jourdan Fabien

Toxalim INRA

180 chemin de Tournefeuille

St-Martin-du-Touch BP 3

31931 Toulouse cedex

Jousse Cyril

ICCF/PFEM

Chimie 4 (1er

étage),

24 avenue des Landais, BP 80026

63171 Aubière

Junot Christophe

CEA

DSV/iBiTec-S/SPI/LEMM

91191 Gif sur Yvette cedex

Kerzaon Isabelle

CESN ISPB UMR5557 Ecologie

Microbienne UCB Lyon 1

Pavillon Netien 2ème

étage

8 av. Rockefeller

69373 Lyon

Kopka Joachim

Max Planck Institute of Molecular Plant

Physiology, Applied Metabolome Analysis;

Department Prof. Dr. L. Willmitzer

Am Mühlenberg 1

14476 Potsdam-Golm

Allemagne

Koubaa Mohamed

The Ohio State University - Department of

Molecular Genetics

1060 Carmack Rd, 053 Rightmire Hall

43229 Columbus, OH

USA

Kovensky José

Laboratoire des Glucides CNRS FRE 3517

33 Rue Saint-Leu

80039 Amiens

Lalande Julie

CEISAM

2 rue de la Houssinière

44322 Nantes Cedex 3

Lanoue Arnaud

EA2106 Biomolecules Biotechnologies

Végétales

31 Av Monge UFR Pharmacie

37200 Tours

Lartigaut Florence

UMR1332 BFP

33140 Villenave d'Ornon

Le Gall Hyacinthe

BIOPI - EA 3900 - UPJV

Ilot des Poulies - UFR des Sciences

33 rue Saint Leu

80039 Amiens cedex

117

Le Moyec Laurence

Université d'Evry Val d'Essonne

UBIAE INSERM U902

rue du père Jarlan

91025 Evry

Lechaplais Christophe

LGBM, Genoscope

2, rue Gaston Cremieux - CP5706

91057 Evry Cedex

Legendre Laurent

UMR 5557 Ecologie Microbienne

UCBL CNRS

43 Bd du 11 Nov 1918

69622 Villeurbanne

Legoahec Laurie

UMR IGEPP 1349

bat 301 - A - Domaine de la Motte

35653 Le Rheu

Lenuzza Natacha

CEA/DRT/LIST/DM2I/LOAD

CEA Saclay, Digiteo Labs- Bât. 565 - PC192

91191 Gif-sur-Yvette Cedex

Leroux Fanny

Profilomic

CEA Saclay - Batiment 136

91191 Gif-Sur-Yvette

Lombard Marie-Lou

UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie

SFR Biologie Intégrative et Ecologie

INRA, BP 81

33140 Villenave d'Ornon

Lopez Claire

Centre de RMN à Très Hauts Champs

5 rue de la Doua

69100 Villeurbanne

Lorrain Yves

Advanced Chemistry Development

(ACD/Labs)

3 quai Kléber, Tour Sébastopol,

67000 Strasbourg

Loup Benoit

Laboratoire des Courses Hippiques

15 rue de Paradis

91370 Verrières le Buisson

Madji Hounoum Blandine

UR 1067 NuMeA Nutrition Métabolisme et

Aquaculture

INRA Pôle d'Hydrobiologie

64310 St Pée/Nivelle

Marcelo Paulo

Plateforme ICAP

3 rue des Louvels

80000 Amiens

Marchand Jeremy

Université de Nantes

2 Rue de la Houssinière

44322 Nantes

Martin Jean-Charles

Biomet_NORT

Faculté de médecine de La Timone

27 bd Jean Moulin

13385 Marseille

Maucourt Mickaël

UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie &

Plateforme Métabolome-Fluxome Bordeaux

71 Avenue Edouard Bourlaux

33140 Villenave d'Ornon

Mauger Florence

CEA/IG/CNG/LEE

2 rue Gaston Crémieux

91057 Evry

Mavel Sylvie

INSERM U930, Université François Rabelais

31 av Monge

37200 Tours

Meiffren Guillaume

Plateforme CESN - Lyon

Université Lyon 1 la Doua

Bât. Forel 4ème

étage –

43 bd du 11 Novembre 1918

69100 Villeurbanne

118

Mesnard François

BIOPI

Ilot des poulies, UFR des Sciences,

33 rue Saint Leu

80039 Amiens cedex

Miart Fabien

BIOPI EA3900 UPJV

Ilot des poulies, UFR des Sciences,

33 rue Saint Leu

80039 Amiens cedex

Michalet Serge

Centre d'Etude des Substances Naturelles

CESN

Université Lyon 1 la Doua

Bât. Forel 4ème

étage –

43 bd du 11 Novembre 1918

69100 Villeurbanne

Mohamadi Fahoullia (Mme)

LCBE- Universite de Perpignan

52 Av Paul Alduy

66000 Perpignan

Molinié Roland

Laboratoire de Phytotechnologie - EA3900 -

BioPI UFR de Pharmacie – UPJV

1, rue des Louvels

80037 Amiens

Muñoz Ismael

CNRS UMR 5557 Ecologie Microbienne

6, rue Raphaël Dubois

69622 Villeurbanne

Nguyen Thi Kieu Oanh (Mme)

BIOPI EA3900 UPJV

Ilot des poulies, UFR des Sciences,

33 rue Saint Leu

80039 Amiens cedex

Nicar Henri

ABSCIEX

3 avenue du Canada, Parc Technopolis –

Bâtiment Sigma

91940 Les Ulis

N’Tsiba Estelle

Université de Nantes

2 Rue de la Houssinière

44322 Nantes

Nurit Eric

UNH PFEM

INRA, UMR1019, Plateforme d’Exploration

du Métabolisme, UNH

63000 Clermont-Ferrand

Oria Gabrielle

UPJV

Chemin du Thil

80025 Amiens Cedex 1

Ouguerram Khadija (Mme)

Institut du Thorax UMR_S1087

IRT-UN 8 quai Moncousu BP 70721

44007 Nantes

Paris Alain

Mét@risk - INRA

16, rue Claude Bernard

75231 Paris cedex 05

Péricard Pierre

CNRS - Station Biologique de Roscoff

Place G. Teissier

29680 Roscoff

Perret Alain

LGBM, Genoscope

2, rue Gaston Crémieux CP5706

91057 Evry cedex

Petit Emmanuel

BIOPI EA3900 UPJV

Ilot des poulies, UFR des Sciences,

33 rue Saint Leu

80039 Amiens cedex

Portais Jean-Charles

LISBP, UMR5504, UMR792 CNRS, INRA,

INSA, INSA Toulouse

31077 Toulouse cedex 4

Portela José

Waters S.A.S.

BP 608

78056 Saint-Quentin en Yvelines Cedex

119

Poutaraud Anne

Génétique et amélioration de la vigne

28 rue de Herrlisheim

68021 Colmar

Pujos-Guillot Estelle

INRA

Plateforme d'Exploration du Métabolisme

UNH INRA

63122 Saint-Genès-Champanelle

Purson Sylvain

ICMR, Université de Reims Champagne-

Ardenne, Moulin de la Housse, BP 1039,

51687 Reims Cedex 2,

Quéro Anthony

Laboratoire de Phytotechnologie - EA3900 -

BioPI UFR de Pharmacie – UPJV

1, rue des Louvels

80037 Amiens

Rathahao-Paris Estelle

Laboratoire de Chimie Analytique

16 rue Claude Bernard

75231 Paris

Rautureau Gilles

CRMN,

5 rue de la Doua

69100 Villeurbanne

Renaud David

IGEPP

UMR IGEPP 1349

bat 301 - A - Domaine de la Motte

35653 Le Rheu

Rey Marjolaine

CESN

69621 Villeurbanne cedex

Riffault Ludivine

Institut de Chimie Organique et Analytique,

Université d'Orléans

rue de Chartres, BP 6759

45067 Orléans cedex 2

Rivet Laurent

Plate-forme Corsaire Biogenouest

Domaire de la Motte - BP 35327

35653 Le Rheu cedex

Rolin Dominique

UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie

71, avenue E. Bourlaux, BP 81

33140 Villenave d'Ornon

Roscher Albrecht

Génie Enzymatique et Cellulaire

33 rue St Leu

80039 Amiens

Roulard Romain

BIOPI EA3900 UPJV

Ilot des poulies, UFR des Sciences,

33 rue Saint Leu

80039 Amiens

Salek Reza

EMBL - European Bioinformatics Institute.

Wellcome Trust Genome Campus,

Hinxton, Cambridge, CB10 1SD,

UK

Sanchez Lisa

Stress Défenses et Reproduction des Plantes

Reims

Sarazin Catherine

Unité de Génie Enzymatique et Cellulaire

33, rue St Leu

80039 Amiens

Savarin Philippe

CSPBAT

74 rue Marcel Cachin

93017 Bobigny

Seeburn Gaëtan

EURISO-TOP

Parc des Algorithmes, Bât Homère,

Route de l'Orme

91194 Saint-Aubin Cedex

Simon Yann

LECO France

120

Smilde Age

Biosystems Data Analysis

Swammerdam Institute for Life Sciences,

University of Amsterdam, the Netherlands

Soubeyrand Eric

MR 1287- EGFV

210 Chemin de Leysotte

33140 Villenave d'ornon

Stuani Lucille

LGBM, Genoscope

2, rue Gaston Cremieux - CP5706

91057 Evry Cedex

Taghi Meryam (Mme)

C-TAC

4 av de l'observatoire

75006 Paris

Tagliatti Vanessa Biologie Humaine et Toxicologie

Chemin du Canon 1A

7000 Mons

Belgique

Tea Illa (Mme)

CEISAM UMR CNRS 6230

2 rue de la Houssinière

44322 Nantes

Thibaudeau Christophe

Université de Picardie Jules Verne - Génie

Enzymatique et Cellulaire

33 rue Saint-Leu

80039 Amiens

Thiombiano Benjamin

BIOPI

1, rue des Louvels

80037 Amiens

Thomasset Brigitte

UTC, GEC CNRS-FRE 3580

BP 20259

60205 Compiègne

Traïkia Mounir

ICCF

Clermont Université, Université Blaise Pascal

63000 Clermont-Ferrand

Triba Mohamed Nawfal

CSPBAT

74 rue Marcel Cachin

93017 Bobigny

triba@smbh.univ-paris13.fr

Trivelli Xavier

UGSF UMR CNRS 8576 Université Lille1

Université Lille1, Bat. C9, Cité Scientifique

59655 Villeneuve d'Ascq

Ubhi Baljit (Mme)

AB Sciex UK Limited

Phoenix House, Lakeside Drive, Centre Park

WA1 1RX Warrington, Cheshire

UK

Verdu Alexandre

Bruker Daltonique

4, allée Hendrik Lorentz

77447 Marne la Vallée Cedex 02

Volant Chloé

UMR IGEPP 1349

bat 301 - A - Domaine de la Motte

35653 Le Rheu

Werner Erwan

TECHNOLOGIE SERVIER

27 Rue Eugene Vignat

45000 Orléans

Xue Baiyi (Mme)

Laboratoire de Chimie Analytique

16, rue Claude Bernard

75231 Paris

Yanibada Benedict INRA Toxalim

180 chemin de tournefeuille

31300 Toulouse