FAKHFAKH RAOUIA

LE BLOCAGE DE LA SIGNALISATION DE LA MYOSTATINE ET DES AUTRES LIGANDS DE LA

SUPERFAMILLE DES TGF-p AUGMENTE LE SUCCÈS DE LA GREFFE DES MYOBLASTES CHEZ

DES SOURIS DYSTROPHIQUES

Thèse présentée

à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en biologie moléculaire et cellulaire

pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (PhD)

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2011

FakhfakhRaouia,2011

Résumé

La dystrophic musculaire de Duchenne est la plus sévère des dystrophies

musculaires de l'enfant. De transmission récessive liée à l'X, elle touche 1 nouveau-né

masculin sur 3500. L'absence presque complète de la dystrophine, protéine sub-

sarcolémique, est le premier marqueur moléculaire de cette myopathie.

La transplantation de myoblastes normaux est une approche possible pour introduire

une dystrophine fonctionnelle dans les fibres musculaires des patients dystrophiques.

Toutefois, cette stratégie a produit des résultats limités au cours de la dernière décennie.

L'amélioration de la capacité proliferative et de fusion des myoblastes transplantés ainsi

que de leur survie pourrait avoir des effets bénéfiques sur cette approche.

La superfamille des TGF-P regroupe des régulateurs négatifs de la croissance du

muscle squelettique et de la prolifération et la différenciation des cellules myogéniques. De

ce fait, l'objet dans cette présente thèse est de combiner l'inhibition de la signalisation des

membres de cette superfamille comme la myostatine et le TGF-p à la transplantation de

myoblastes humains, chez des souris dystrophiques immunodéficientes.

Au cours de mes travaux de thèse, j 'ai eu recours à différentes approches pour

bloquer la signalisation de la myostatine et des autres ligands de la superfamille des TGF-p.

La première consiste à modifier génétiquement les myoblastes humains à transplanter en

exprimant un récepteur de l'activine de type IIB muté, sous la forme dominant négatif. La

deuxième approche est de transplanter des myoblastes chez des souris dystrophiques

traitées avec du losartan, une molécule qui inhibe l'expression du TGF-P 1, et la troisième

stratégie consiste à injecter une forme soluble du domaine extracellulaire du récepteur de

l'activine de type IIB chez des souris dystrophiques.

In vitro, l'inhibition de l'action de ces facteurs augmente la prolifération et la fusion

des myoblastes humains avec une diminution de l'apoptose et modulation de l'expression

des facteurs régulateurs myogéniques. In vivo, 1'immunodetection de la dystrophine dans

des coupes du Tibialis antérieur, 1 mois après la transplantation des myoblastes, démontre

une amélioration du succès de la greffe.

Ainsi, l'inhibition des facteurs de la superfamille des TGF-P constitue une bonne

approche pour améliorer le succès de la thérapie cellulaire de la DMD, en plus de la

stimulation de la croissance musculaire.

Ill

Abstract

Duchenne muscular dystrophy is a recessive X-linked genetic disease caused by

dystrophin gene mutations. These mutations lead to an absence of dystrophin and to a

progressive muscular degeneration. Normal myoblast transplantation is a potential

approach to introduce a functional dystrophin gene in the dystrophic patient myofibers.

However, this strategy produced so far limited results. The super family of Transforming

growth factor p (TGF-P), a negative regulator of skeletal-muscle development, controls

numerous cellular responses from cell proliferation to differentiation.

Our aim was to verify whether the inhibition of the signalization induced by

myostatin and other ligand of this super family would enhance the success of myoblasts

transplantation thus making this combination an effective therapeutic approach for

dystrophin deficiency.

The first method, that I have investigated, was to express in the transplanted human

myoblasts a dominant negative mutant of the activin type IIB receptor (dnActRIIB). The

second method was to transplant myoblasts in dystrophic mice treated with losartan, a

molecule that down-regulates TGF-P expression. The third method was to inject a soluble

form of the extracellular domain of the activin IIB receptor (ActRIIB/Fc) in dystrophic

mice.

These three methods have led to comparable results. In vitro, blocking TGF-P super

family activity increased proliferation and fusion and decreased apoptosis in human

myoblasts. The expression of myogenic differentiation factors is up-regulated. The results

in vivo show that blocking the TGF-P super family signalization improves the success of

myoblast transplantation, decreases macrophage activation and changes the expression of

myogenic regulator factors in transplanted dystrophic muscle.

IV

Avant propos

Le bilan des ces quatre années de doctorat est à la fois scientifique et personnel.

D'une façon générale, ce doctorat m'a fait découvrir une nouvelle thématique avec toute la

curiosité que cela peut générer. Mais il m'a surtout permis de renforcer mes compétences

techniques, d'acquérir une certaine autonomie vis-à-vis de la conduite de mon projet

professionnel et avoir une certaine organisation du travail.

Pour cela, je tiens à remercier Dr. Jacques P. Tremblay, mon directeur de thèse, pour

m'avoir accepté au sein de son laboratoire, aussi riche d'expériences, de savoir et de savoir-

faire, et aussi pour sa très grande disponibilité et son attentive écoute.

Sa porte de bureau toujours ouverte m'a aidée à prendre confiance en soi pour imposer mon

point de vue et vendre mon projet. Cette capacité de persuasion a été indispensable pour

négocier la faisabilité d'une manipulation ou encore l'achat d'un produit coûteux mais

indispensable.

Je souhaite aussi exprimer ma gratitude à toutes les personnes et les membres du

laboratoire qui m'ont aidé et soutenues durant ce travail de doctorat et surtout à France

Couture, Nathalie Paquet et Gilles Doucet.

Un grand merci à mes ancien(ne)s compatriotes : Anissa, Tasnim, Yann, Marie-Anne,

Annick, Essam et Cathy. Je n'oublierai jamais les moments qu'on a passés ensemble que ce

soit à l'intérieur ou à l'extérieur du laboratoire.

Un merci spécial pour Amina. Tu m'as donné un nouveau souffle pour ces deux dernières

années.

Mes remerciements vont aussi à ma famille (ma sœur, mon frère, mon beau frère,

ma belle sœur, mes neveux et ma nièces) et surtout à mes parents, qui, avec cette question

récurrente, « quand est-ce que tu vas l'a finir cette thèse ? », bien qu'angoissante en période

de doutes, m'ont permis de ne jamais dévier de mon objectif final. Votre présence (malgré

la distance) et vos encouragements sont pour moi les piliers fondateurs de ce que je suis et

de ce que je fais.

Les remerciements les plus sincères reviennent à mon cher mari ainsi qu'à mes deux

petits trésors, qui ont vécu tous mes moments de joie, de colère et de déception et ont subi

toutes les conséquences qui s'y attachent. Vous étiez toujours là pour me rendre le sourire

et me soutenir dans tous mes travaux. Je vous aime.

Je remercie, aussi, mes ami(e)s en dehors du laboratoire pour les dîners et soirées à

la tunisienne, c'était parmi mes moments de détente et de défoulement.

Enfin, je dédie cette thèse à la mémoire de ma grand-mère, tu étais notre rayon de

soleil avec ta gentillesse extrême et ton grand cœur, aussi à la mémoire de mon oncle, mon

premier fan.

VI

«Lorsqu 'un jour le peuple veut vivre, Force est pour le destin de répondre

Force est pour les ténèbres de se dissiper Force est pour les chaînes de se briser»

Abou El Kasem El Chebbi

VII

Table des matières

Résumé I

Abstract Ill

Avant propos IV

Table des matières VII

Liste des abréviations XII

Listes de figures XIV

Liste des Tableaux XVI

Introduction 1

Chapitre I : Origine Embryonnaire et Structure du Muscle Squelettique 3

1.1. Origine embryonnaire et développement myogénique : 3

1.2. Le tissu musculaire strié squelettique : 7

1.3. Le tissu musculaire strié cardiaque : 8

1.4. Les myofibrilles : 9

1.4.1. Les filaments fins d'actine : 9

1.4.2. Les filaments épais de myosine : 10

1.5. Classification et diversité des fibres musculaires : 11

Chapitre II : Le Muscle Dystrophique et la Dystrophic Musculaire de Duchenne 14

II. 1. Introduction: 14

11.2. Rappel historique: 15

11.3. Le gène de la dystrophine : 17

11.3.1. Le gène et ses transcrits : 17

11.3.2. Les hypothèses d'un rôle structural : 19

11.3.2.1. Maintien de la stabilité membranaire : 19

11.3.2.2. Fonctions particulières dans des zones spécialisées : 19

11.3.3. Les hypothèses d'un rôle métabolique : 19

11.3.4. les différentes mutations : 19

II. 4. Le complexe dystrophine, glycoprotéines et protéines associées : 20

11.5. Muscle dystrophique : le plan histologique 21

11.5.1 Les fibres nécrotiques : 21

11.5.2. La prédominance de fibres de type 1 : 22

11.5.3. Les fibres hyper contractées : 22

11.5.4. L'inflammation et la fibrose musculaire : 23

II.5.4.1. La fibrose endomysiale : 25

11.5.5. Les partenaires cellulaires : 25

V I I I

11.5.5.1. Les cellules satellites : 25

11.5.5.2. Les cellules inflammatoires : 26

11.6. Les modèles animaux et leurs intérêts : 26

11.6.1. La souris mdx : 26

11.6.2. Le chien Golden Retriever : 28

11.6.3. Le modèle félin : 28

11.6.4. Autres modèles animaux : 29

11.6.5. La souris mdx, un modèle valide pour la DMD ? 29

11.6.5.1. Lésions cytotoxiques : 29

11.6.5.2. Lésions mécaniques : 29

Chapitre i n : Les Approches Thérapeutiques Pour La DMD 31

III.l. Les thérapies actuelles : 31

III. 2. L'approche thérapeutique : les avancées de la recherche 31

111.2.1. La thérapie médicamenteuse : 32

111.2.2. La thérapie génique et cellulaire : 34

111.2.2.1. La thérapie génique : 35

111.2.2.1.1. Utilisation des méganucléases : 36

111.2.2.1.2. Lesautd'exon : 36

111.2.2.1.3. La thérapie génique virale: 39

111.2.2.1.4. La thérapie génique non virale : 42

111.2.2.2. La thérapie cellulaire : 43

111.2.2.2.1. Les cellules satellites : 46

111.2.2.2.2. Les myoblastes ou cellules myogéniques: 47

111.2.2.2.2.1. La faible dispersion des myoblastes hors des sites d'injection: ...47

111.2.2.2.2.2. la mort précoce des myoblastes : 48 HI.2.2.2.2.3. le rejet à moyen et long terme dû à la réponse immune spécifique :

48

111.2.2.2.2. Les cellules souches dérivées du muscle ou MDSC (Muscle Derived Stem Cell): 49

111.2.2.2.3. Les cellules souches hématopoïétiques : 49

111.2.2.2.4. Les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules pluripotentes induites (iPS): 50

111.2.2.2.5. Les cellules AC133+ : 51

111.2.2.2.6. Les mésoangioblastes : 51

111.2.2.2.7. Les pericytes : 52

111.2.2.3. La thérapie génétique ex vivo : 52

IX

Chapitre IV : La Régulation De La Myogenèse Et De La DMD 54

IV.1. Les facteurs myogéniques MRF : 54

IV. 1.1. La première découverte des gènes myogéniques : 55

IV.1.2. La cinétique d'expression des gènes myogéniques : 55

IV.1.3. Les protéines d'interaction agonistes et antagonistes : 56

IV.1.4. Cycle cellulaire et les facteurs myogéniques : 57

IV.2. Les facteurs de croissance : 59

IV.2.1. Famille des Insuline et Insulin-like Growth Factors (IGFs) : 60

IV.2.2. Famille des Fibroblast Growth Factors (FGFs) : 62

IV.2.3. La superfamille des TGF-ps : 63

IV.2.3.1 Structure générale des ligands de la superfamille des TGF-Ps : 65

IV.2.3.2. Les ligands de la sous-famille des TGF-p/Activines/Nodal : 66

IV.2.3.2.1. Les TGF-ps: 66

IV.2.3.2.2. Les Activines : 69

IV.2.3.3. Les ligands de la sous famille BMP/GDF : 69

IV.2.3.3.1. Les BMPs : 69

IV.2.3.3.2. La myostatine (GDF-8) : 70

IV.2.3.3.2.1. Conservation de la séquence peptidique : 71

IV.2.3.3.2.2. Expression spatio-temporelle, in vivo : 72

IV.2.3.3.2.3. La myostatine et la myogenèse : 73

IV.2.3.3.2.4. La myostatine dans le processus de régénération musculaire :....75

IV.2.3.3.2.5. La myostatine et la DMD : 75

IV.2.3.4. Les récepteurs de la superfamille des TGF-P : 77

IV.2.3.4.1. Les récepteurs de type I des activine : 78

IV.2.3.4.2. Les récepteurs de type II des Activines : 78

IV.2.3.4.3. Mode d'activation et voies de signalisation : 79

IV.2.3.4.4. Expression et fonction du récepteur ActRIIB dans l'embryogenèse : 82

Chapitre V: L'inhibition de la Signalisation de la Myostatine par L'expression du Récepteur Dominant Négative Augmente le Succès de Transplantation des Myoblastes Humains 84

RÉSUMÉ 85

ABSTRACT 86

INTRODUCTION 87

RESULTS 88

DISCUSSION. 91

MATERIALS AND METHODS 92

ACKNOWLEDGMENTS 96

REFERENCES 97

TABLES 100

FIGURE LEGENDS 101

Chapitre VI : Le Losartan Augmente le Succès de la Greffe des Myoblastes 112

RÉSUMÉ 113

ABSTRACT 114

INTRODUCTION 115

MATERIALS AND METHODS 116

STATISTICAL ANALYSIS 121

RESULTS 121

DISCUSSION 123

ACKNOWLEDGMENTS 126

REFERENCES 127

TABLES 130

FIGURE LEGENDS 131

Chapitre VII : L'administration du Récepteur Soluble de L'activine de Type ID3 Augmente le Succès de la Transplantation des Myoblastes Humains chez Des Souris Dystrophiques 143

RÉSUMÉ 144

ABSTRACT 145

INTRODUCTION 146

MATERIAL AND METHODS 147

STATISTICAL ANALYSIS 150

RESULTS 150

DISCUSSION. 154

ACKNOWLEDGMENTS 155

REFERENCE 157

TABLE 160

FIGURE LEGEND 161

Chapitre VIII: Discussion / Conclusion 170

Villi. Discussion : 170 VIII. 1.1. L'inhibition de la signalisation de la myostatine par l'expression du

dnActRIIB augmente le succès de transplantation des myoblastes humains : 171

VIII. 1.1.1. Avantages: 171

VIII. 1.1.2. Limites: 172

XI

Villi.2. Le losartan augmente le succès de la greffe des myoblastes : 172

VIII. 1.2.1. Avantages: 174

VIII. 1.2.2. Limites: 174 VIII. 1.3. L'administration du récepteur soluble de l'activine de type lib améliore la

transplantation des myoblastes humains chez des souris dystrophiques : 174

VIII.1.3.1 Avantages: 175

VIII. 1.3.2 Limites: 175

VII. 2. Conclusion générale : 176

RÉFÉRENCES 178

XII

Liste des abréviations

AAV : Virus associées aux adenovirus

ACE : inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine

ActRIIB : récepteur de l'activine de type IIB

ActRIIBf c : fraction Fc soluble du récepteur à l'activine de type IIB

ADNc : ADN complémentaire

ALK : anaplastic lymphoma kinase

ATP : Adenosine Triphosphate

bFGF : facteur de croissance basique des fibroblastes

bFGF: basic Fibroblast Growth Factor

BMD : Dystrophic musculaire de Becker

BMP : protéines morphogénétiques osseuses

CAD : complexe associé à la dystrophine

Cdk : kinases cycline-dépendantes

CK : creatine kinase sérique

CKI : inhibiteurs des kinases cycline-dépendantes

DMD : Dystrophic musculaire de Duchenne

DnActRIIB : dominant négatif du récepteur de l'activine de type IIB

ES : cellules souches embryonnaires

FLRG : gène relié à la follistatine

GDF : facteur de croissance et differentiation

GRMD: Golden Retriever Muscular Dystrophy

HGF: Hepatocyte Growth Factor

IGF-1: Insulin Growth Factor -1

iPS : cellules pluripotentes induites

LAP : protéine précurseur inactive

MDSC : cellules souches dérivées du muscle

Mdx : dystrophic musculaire liée à l'X

XIII

MHC : chaîne lourde de myosine

MLC : chaîne légère de myosine

MMP : métallo-protéinases

MRF : facteurs de régulation myogénique

nNOS : Oxyde nitrique synthetase neuronale

OAs : Oligonucleotides anti-sens

Rb : rétinoblastome

TA : Muscle tibial antérieur

TGF-P : Facteur de croissance transformant béta

TNF-a : le facteur de nécrose tumorale a

XIV

Listes de figures

Figure 1 : Les trois stades du développement du muscle squelettique P4

Figure 2 : Myogenèse et régénération musculaire chez la souris P6

Figure 3: Organisation générale d'un muscle squelettique P7

Figure 4 : Organisation de la myofibrille P10

Figure 5: Voies pathogéniques d'un muscle dystrophique P15

Figure 6 : La manœuvre de Gowers P17

Figure 7 : Représentation schématique du gène de la dystrophine et ses principaux produits P18

Figure 8 : Organisation du complexe dystrophine et protéines associées au niveau du sarcolemme P21

Figure 9: Immunohistochimie du collagène IV sur des coupes d'un muscle normal et d'un muscle dystrophique P24

Figure 10 : Mécanisme de la régénération musculaire P27

Figure 11 : Stratégies de traitement de la DMD P32

Figure 12: Thérapies géniques et cellulaires pour la DMD P35

Figure 13: Exemple de saut d'exon P37

Figure 14 : Schéma du vecteur lentiviral codant le snARN U7opt-ex51 P39

Figure 15 : Structure des gènes de la dystrophine pleine longueur, de la quasi-dystrophine, de la mini-dystrophine et de la micro-dystrophine qui sont associés avec la restauration de la fonction du muscle dystrophique P41

Figure 16 : Les origines possibles des principales cellules utilisées en thérapie cellulaire pour la DMD P44

Figure 17 : Représentation schématique de la majorité des types cellulaires inclus dans la régénération du muscle squelettique P45

Figure 18: Expression des facteurs myogéniques de la famille MyoD au cours de la myogenèse P56

Figure 19: Représentation schématique de quelques régulateurs positifs et négatifs de MyoD, par des mécanismes d'interaction directe ou indirecte P57

Figure 20 : Représentation schématique des facteurs myogéniques et de croissance régulant la progression du cycle cellulaire des cellules myogéniques P58

XV

Figure 21: Les facteurs de croissances régulent la myogenèse et l'expression des facteurs myogéniques P60

Figure 22 : Représentation schématique des principales protéines impliquées dans les voies de signalisation de 1TGF-1 pour équilibrer la croissance du muscle squelettique P62

Figure 23 : La superfamille des TGF-P P64

Figure 24: Représentation schématique de la biosynthèse de la myostatine, un membre de la superfamille des TGF-P P66

Figure 25 : L'augmentation de l'activité du TGF-pi inhibe la régénération musculaire par le blocage de l'activation des cellules satellites P68

Figure 26: L'effet de l'inhibition de l'expression de la myostatine chez des modèles animaux et humains P71

Figure 27: Représentation schématique du gène de la myostatine et sa protéine P72

Figure 28: Inhibition de la prolifération des cellules musculaires par la myostatine P74

Figure 29 : Mode d'action de l'ACE-031, molécule thérapeutique, au niveau de la fibre musculaire P77

Figure 30: Représentation schématique des interactions possibles entre les ligands de la superfamille des TGF-P et les récepteurs de type I et de type II, chez les vertébrés P78

Figure 31 : Mode d'activation des récepteurs sérinettiréonine kinase de type I et de type II P80

Figure 32 : La transduction du signal à travers les récepteurs ActRII P82

XVI

Liste des Tableaux

Tableau 1 : Caractéristiques requises pour la classification des fibres musculaires squelettiques P13

Tableau 2: Comparaison des principaux vecteurs de transfert de gène P40

In t roduc t ion

Les muscles squelettiques ont pour fonction la motricité du corps dans son

environnement extérieur. Ils s'insèrent en général sur l'os au niveau d'empreintes

d'insertions. Ils peuvent aussi s'insérer sur des cartilages ou sur des lames fibreuses

superficielles ou profondes. Les deux extrémités d'un muscle long sont fixées aux

structures osseuses par l'intermédiaire des tendons.

La dystrophine, une protéine exprimée au niveau des fibres musculaires, joue un

rôle important dans le maintien de la stabilité et de l'intégrité de la matrice extra cellulaire

des muscles squelettiques et son absence cause une forme létale des dystrophies

musculaires.

En effet, la Dystrophic Musculaire de Duchenne (DMD) est caractérisée par la

dégénérescence progressive du tissu musculaire squelettique aboutissant à une atrophie de

la plupart des muscles dont la conséquence est un handicap moteur majeur variable selon le

stade d'évolution de la maladie. L'atteinte des muscles respiratoires rend l'enfant

particulièrement sensible aux infections broncho-pulmonaires et des troubles cardiaques

sont fréquents. Ce sont ces problèmes qui sont responsables de la mort des patients DMD

entre l'âge de 10 et de 29 ans. Il n'existe aucun traitement curatif mais certaines gammes

d'approches médicamenteuses sont utilisées pour retarder ou diminuer les conséquences de

cette maladie. Les autres types de thérapie (pharmacologiques, géniques et cellulaires) sont

encore à l'état de recherche. La thérapie cellulaire, dont fait l'objet la présente thèse, est

basée sur la transplantation des cellules myogéniques normales dans le muscle

dystrophique [1]. Ce type de thérapie fait face, malheureusement, à de nombreuses limites.

Ainsi, afin d'augmenter le niveau d'expression de la dystrophine dans le muscle

dystrophique transplanté avec des myoblastes normaux, il serait bénéfique d'augmenter la

capacité proliferative ainsi que la capacité de fusion de ces derniers.

Les facteurs de la superfamille des facteurs de croissance transformant bêta (TGF-P)

sont responsables de l'inhibition de la prolifération des cellules myogéniques ainsi que de

la régénération musculaire [2]. La myostatine, un membre de cette superfamille, est le

régulateur négatif de la croissance musculaire le plus étudié. L'objectif principal de cette

thèse est de vérifier si le blocage du signal de la myostatine et des autres ligands de la super

famille des TGF-P, dans les myoblastes transplantés ou dans le muscle dystrophique permet

d'améliorer le succès de la greffe de myoblastes dans le cadre de la DMD. Les articles

scientifiques insérés dans les chapitres de cette présente thèse présentent les différentes

stratégies utilisées.

En premiere partie, comme introduction, j 'ai abordé au chapitre I l'origine

embryonnaire et la structure du muscle squelettique. Le chapitre II présente une description

de la DMD et du muscle dystrophique. Par la suite, au chapitre III, les différentes

approches thérapeutiques dans la littérature sont discutées, en mettant plus l'accent sur la

thérapie cellulaire. Le chapitre IV explique la régulation de la myogenèse, suivie par une

description des différents facteurs myogéniques et de croissance les plus pertinents.

En deuxième partie, j 'ai présenté mes résultats au cours de mon doctorat sous forme

de trois articles scientifiques. Le Chapitre V comporte mon premier article scientifique

publié en 2010 dans le journal Molecular Therapy. Cet article décrit une des méthodes

utilisées afin de bloquer le signal de la myostatine au niveau des myoblastes humains

transplantés dans des muscles dystrophiques. Le Chapitre VI comporte mon deuxième

article scientifique, publié dans la revue Cell Transplantation. Des myoblastes humains ont

été transplantés chez des souris dystrophiques qui ont été traitées par une drogue inhibant

essentiellement l'expression du TGF-P 1. Le chapitre VII comporte mon troisième article

scientifique soumis pour publication dans la revue Cell Transplantation. Une autre

méthode d'inhibition de la myostatine et des autres ligands du récepteur de l'activine de

type IIB (ActRIIB) a été utilisée afin d'augmenter le succès des greffes des myoblastes

humains. Pour optimiser le résultat de cette méthode, un exercice de nage a été ajouté afin

d'augmenter les bris musculaires dans les muscles dystrophiques pour stimuler le

phénomène de réparation et d'adaptation musculaire.

En troisième partie, une conclusion générale clôture la thèse et discute les

différentes stratégies d'inhibition de la myostatine et des autres ligands de la superfamille

des TGF-p dans le cadre de la mise au point d'un traitement pour contrer la DMD.

Chapi t re I : Or ig ine E m b r y o n n a i r e et S t ruc tu re du Muscle Squelett ique

1.1. Origine embryonnaire et développement myogénique :

L'ensemble de la musculature du corps et des membres dérivent des somites

multipotentes, structures embryonnaires segmentées émanant du mésoderme présomitique

[2, 3]. Chaque somite se compartimente en un mesenchyme ventral, le sclerotome, à

l'origine des vertèbres, des os, du cartilage et des côtes et en un epithelium dorsal, le

dermomyotome, à l'origine du derme et des muscles squelettiques [3].

Les premières cellules myogéniques [caractérisées par l'expression des facteurs de

régulation myogénique (MRFs, exemples : Myf5, MyoD et MRF4] apparaissent aux

bordures de ce dermomyotome. Elles migrent ensuite entre le dermomyotome et le

sclerotome pour former le myotome primaire, premier muscle squelettique du corps. Ces

cellules myogéniques commencent à se différencier pour former des myoblastes [4].

Certains myoblastes restent isolés et vont former des cellules satellites du muscle mature.

D'autres vont arrêter leur phase mitotique, et quitter le cycle cellulaire de manière

irréversible pour fusionner et former des myotubes embryonnaires primaires. Le groupe

restant de myoblastes va s'agréger et fusionner pour former les myotubes primaires

multinucléés, attachés à chaque extrémité du tendon et du squelette en développement, une

chaîne centrale de noyaux se forme, entourée par du cytoplasme basophile riche en

polyribosomes. Ensuite, des myotubes secondaires sont ajoutés parallèlement aux myotubes

primaires, et une phase supplémentaire de croissance apparaît avec la fusion de cellules

satellites [5]. Cependant, comme les myotubes primaires se forment indépendamment de

leur innervation, d'autres facteurs de régulation doivent contrôler la fusion des myoblastes

et la diversification des fibres qui apparaissent au cours de la myogenèse primaire [6]

(Figure 1).

Dermomyotome (génère le derme cutané et les précurseurs musculaires)

I1 Determination

£X^Ç£>e>0> - h Proliferation et/ou migration

Masses prémusculaires

I Différenciation et fusion cellulaires

Myotube leaButa musculaire)

Figure 1 : Les trois stades du développement du muscle squelettique. Les somites sont des sphères épithéliales de cellules mésodermiques embryonnaires; certaines d'entre elles (le myotome) deviendront des myoblastes sous l'influence de signaux provenant d'autres tissus (1). Après que les myoblastes ont proliféré et migré dans les bourgeons des membres et ailleurs (2), ils entreprennent leur differentiation terminale en cellules musculaires squelettiques multi nucléées, les myotubes (3). Les facteurs de transcription principaux qui dirigent la myogenèse sont surlignés en jaune. [7]

Les myoblastes sont donc des cellules post-mitotiques capables de fusionner et de

synthétiser des protéines, dont la myosine. Il est intéressant de noter que les pré-myoblastes

en replication expriment déjà un phénotype musculaire spécifique car très tôt l'expression

de filaments intermédiaires de desmine est observable. Cette synthèse semble être initiée en

phase G du cycle cellulaire des pré-myoblastes en replication [2, 7]. Ces myoblastes post-

mitotiques mononuclées vont fusionner pour former des myotubes multinucléés. Ce

mécanisme résulte d'une séquence de plusieurs événements successifs qui comprend

l'alignement des myoblastes selon leur axe longitudinal, les étapes de reconnaissance et

d'adhésion intercellulaire, et enfin, l'union des bicouches lipidiques des myoblastes

adjacents afin d'établir une continuité cytoplasmique entre les cellules [8].

Les myotubes se différencient et accumulent des protéines contractiles actine et

myosine qui sont arrangées en faisceaux, ce sont les myofibrilles. Cet arrangement en

filaments fins d'actine et en filaments épais de myosine, sera à l'origine des unités

contractiles répétées visibles le long des myofibrilles, les sarcomeres. Initialement, ces

myofibrilles sont situées à la périphérie des myotubes nouvellement formés au centre

desquels se concentrent les différents noyaux. Ces derniers sont par la suite repoussés vers

la périphérie du myotube par les myofilaments qui s'organisent au centre selon l'axe

longitudinal de la cellule. Les myotubes accumulent également des protéines régulatrices,

des protéines contractiles comme la tropomyosine et la troponine et des enzymes

cytoplasmiques nécessaires à la production d'énergie de la cellule comme la myokinase et

la phosphocréatine kinase.

Certaines cellules restent à l'état mononuclé entre la membrane basale et la

membrane plasmique des fibres musculaires squelettiques et représentent un réservoir de

cellules précurseurs myogéniques indifférenciées : les cellules satellites. Elles sont

considérées comme les précurseurs quiescents présents pendant la période postnatale et

adulte. Lors de la croissance postnatale, d'un stress musculaire tel qu'un effort physique

important conduisant à une hypertrophie musculaire, ou lors de lésions musculaires, les

cellules quiescentes reproduisent un programme myogénique séquentiel, similaire à celui

observé lors du développement embryonnaire. Elles se divisent asymétriquement en deux

types de cellules filles. Le premier type se différencie, avant de fusionner avec les fibres

existantes ou former de nouvelles fibres. Le deuxième type issu de la division reste à l'état

quiescent, arrêt mitotique, assurant ainsi son autorenouvellement au sein de la niche (Figure

2).

Et?g e i n b n o n de souris 9.75 j ou rs

■H après fécondation

cellule souche _af| ^ T Pai3-t-/Pax7+

A. IQ myogenèse

J Drvls'on asymétrique

> s^p > progéniteur embryonnaire progéniteur foetal progéniteur adulte

Mvf5+, Mrf4% MyoD+

I VKI5+, MyolK

l cellule satellite

Pa»7+.(Myf5)

%

?

(S

ho

progéniteur embryonnaire progéniteur foetal précurseur adulte } f% myoblastes: Desmin+ myoblastes: Dcsmin - myoblastes: Dcsaàa+

l I V cellule tahUiti-

f ibre musculaire fibres musculaires l ibre musculaire embryonnaie foetales adulte

croissance développementalc

i r» 5

n

a a

B. IQ regeneration musculaire

«ai ne pas»

7>.«Mrf5IM|o4V %0*a-TL J e »

0 * » M A _ „ 3 s s s s s s K _ _

# âdifre i en raMMfVNM *

Figure 2 : Myogenèse et régénération musculaire chez la souris. [9]

1.2. Le tissu musculaire strié squelettique :

Le muscle squelettique désigne un groupe de vaisseaux sanguins, de neurofibres,

d'adipocytes et de fibres musculaires liées les unes aux autres par un tissu conjonctif à

plusieurs niveaux : épimysium (enveloppe de l'ensemble du muscle), perimysium (délimite

les faisceaux musculaires) et endomysium (entoure chaque fibre musculaire à l'intérieur

des faisceaux). Ces différents niveaux du tissu conjonctif, qui peut être vu comme une

structure élastique de soutien de l'architecture musculaire, se rejoignent aux extrémités du

muscle pour former les tendons [10] (Figure 3).

Au niveau moléculaire, les fibres musculaires, unités morphologiques et

fonctionnelles du muscle, sont des cellules cylindriques allongées, plurinucléées, dont les

noyaux sont situés en périphérie de la cellule, contre la membrane plasmique, ou

sarcolemme, qui est entourée d'une membrane basale. Son sarcoplasme contient les

organites cellulaires habituels, mais se caractérise surtout par la présence d'un matériel

protéique fibrillaire contractile, organisé de façon spécifique en myofibrilles.

Tendon

Muscle

Tendon

Fibre musculaire

îysium

aisceau A f ihref t

musculaires

ipimysïum

Figure 3: Organisation générale d'un muscle squelettique. (http://tpe.sport2006.free.fr/Meso/o20sites0/o20Web/Parti%20I.htm)

8

1.3. Le tissu musculaire strié cardiaque :

Le tissu musculaire cardiaque compose la paroi du coeur. À l'instar du muscle

squelettique ce tissu est strié. Cependant, ces contractions sont involontaires. De plus,

certaines des fibres qui le composent sont dotées d'autorythmicité, leur permettant d'établir

une cadence inhérente et alternative de contractions et de relâchements.

Les fibres du tissu musculaire cardiaque sont de forme parallélépipédique et font près de

14um de large. Elles sont composées de cellules mononuclées appelées cardiomyocytes.

Les noyaux de ces cellules sont au centre du sarcolemme. Bien que ressemblant à celui des

fibres musculaires squelettiques, le sarcolemme des myotubes cardiaques contient plus de

mitochondries. Ces mitochondries sont par ailleurs plus volumineuses. Enfin, l'unité

sarcomèrique est également semblable à celle observée dans le tissu musculaire strié

squelettique. L'ensemble des fibres musculaires cardiaques se ramifient et s'anastomosent

formant ainsi deux réseaux distincts. Les oreillettes, définissant la partie supérieure des

cloisons cardiaques, constituent le premier réseau. Les ventricules, définissant la partie

inférieure du coeur composent quant à elles le deuxième réseau. Pour un réseau donné,

chaque fibre s'interconnecte au niveau d'épaississements transverses irréguliers du

sarcolemme appelés disques intercalaires. Ces disques comprennent des desmosomes et des

jonctions lacunaires. Ces structures assurent réciproquement entre les fibres, un maintien

structural et un passage des potentiels d'action musculaires qui sont à l'origine des

contractions cardiaques. Ainsi lorsqu'une fibre est stimulée, toutes les autres fibres du

réseau le sont également. De ce fait, chaque réseau se comporte comme une unité

fonctionnelle.

Les fibres musculaires cardiaques sont des fibres à contractions perpétuelles et

extrêmement rapides. Cette distinction majeure avec les fibres qui composent le tissu

musculaire strié squelettique implique que le tissu musculaire cardiaque bénéficie d'une

bonne vascularisation et de la présence d'un nombre conséquent de mitochondries de

grande taille. Conséquemment, le muscle cardiaque utilise la voie de synthèse aérobie

comme mode principal de production de l'ATP. Enfin, à la différence du muscle strié

squelettique, le muscle cardiaque peut se contracter sans stimulation nerveuse extrinsèque

ou hormonale. En effet, des fibres cardiaques spécialisées lui confèrent une capacité

contractile autonome.

1.4. Les myofibrilles :

Les myofibrilles sont des structures tubulaires parallèles, allongées dans le sens de

la cellule. La base, l'unité contractile de l'organisation des myofibrilles, est le sarcomere,

constitué de myofilaments (filaments fins constitués d'actine associée à la tropomyosine et

la troponine, et filaments épais constitués de myosine). Ces myofilaments sont disposés

selon une organisation géométrique en trois dimensions extrêmement rigoureuse. Vus en

coupe longitudinale, (Figure 4), des filaments fins sont attachés de part et d'autre d'un

matériel protéique (le disque Z) comprenant en particulier de l'a-actinine, probable protéine

d'ancrage des filaments d'actine. Ils sont tous alignés parallèlement, faisant face, sans les

toucher, à d'autres filaments fins eux-mêmes attachés à un autre disque Z. Entre deux

disques Z, et dans les espaces laissés entre les filaments fins, on trouve les filaments épais

constitués par de nombreuses molécules de myosine.

1.4.1. Les filaments fins d'actine :

L'actine est une molécule polypeptidique de forme globulaire. La polymérisation

des monomères d'actine se fait sous une forme filamentaire. Les polymères d'actine

s'accolent par deux pour former une longue double hélice. Les myofilaments fins sont

formés de l'association de cette double hélice d'actine et de deux protéines régulatrices : la

tropomyosine, dimère filamenteux rigide de renforcement, et la troponine, complexe de

trois sous unités polypeptidiques disposées à intervalles réguliers, le long des filaments

d'actine en regard de chaque tête de myosine, et impliquées dans la régulation de la

contraction musculaire par le calcium. La nébuline, qui est associée à chaque filament fin

du muscle strié squelettique, détermine sa longueur en réalisant un guide pour la

polymérisation de l'actine.

10

Npysu

Reticulum sarcopfasmique

Mnochoodrie

ubu e transverse

Citerne terminale

Sarcolemme

Quelques myolibf s'es

■riiamem 1m lactine)

Filament eoais (myosin»)'

Disque Z

Filaments «pais el fins I myofilaments I

Figure 4 : Organisation de la myofibrille.

1.4.2. Les filaments épais de myosine :

La myosine est un composant majeur de l'appareil contractile des cellules musculaires squelettiques. La myosine fonctionnelle est un hexamère composé de deux chaînes lourdes (MHC, Myosin Heavy Chain, ~ 200kDa chacune) et de deux paires de chaînes légères (MLC, Myosin Light Chain, MLC 20 de 20kDa et MLC 17 de 17kDa).

Il existe de nombreuses isoformes de MHC : ils sont exprimés à différents temps de la myogenèse et rendent compte du caractère plus ou moins rapide de la contraction des différents types de fibres musculaires.

Les deux MHC de la même protéine sont identiques et accolées l'une à l'autre. Chaque chaîne est constituée d'une tête globulaire et d'une longue queue en hélice a. La

11

tête, appelée domaine moteur, a une activité ATPasique et peut transformer l'énergie

chimique due à l'hydrolyse de l'ATP en fonction mécanique permettant ainsi la contraction

musculaire. Les queues en hélice a forment des tiges enroulées, permettant l'assemblage

d'une molécule de myosine individuelle en un filament épais fonctionnel.

La connectine (ou titine) est une protéine qui, dans chaque demi-sarcomère, relie

chaque filament épais à la strie Z. Composante élastique, elle maintient l'alignement des

filaments épais et oppose une résistance à retirement excessif du sarcomere.

1.5. Classification et diversité des fibres musculaires :

Comme cela a été évoqué précédemment, plusieurs lignées myoblastiques

interviennent à différentes périodes du développement, pour former des myotubes primaires

et secondaires, en deux vagues successives [11]. Ces différentes lignées sont à l'origine de

la classification des fibres qui n'ont pas toutes la même fonction ni la même composition

[6]. Par exemple, leur contenu en myoglobine, la protéine rouge qui fixe l'oxygène dans le

tissu musculaire, varie grandement. Les fibres musculaires squelettiques riches en

myoglobine sont appelées des fibres rouges et celles qui en contiennent peu, fibres

blanches. Les fibres musculaires rouges contiennent également plus de mitochondries pour

la production d'ATP et sont irriguées par un plus grand nombre de capillaires sanguins.

Les fibres musculaires squelettiques se contractent et se relâchent à des vitesses

différentes. Une fibre musculaire sera qualifiée de «lente» ou de «rapide» selon la vitesse à

laquelle l'ATPase de ses têtes de myosines hydrolyse l'ATP. Il existe aussi des fibres

musculaires qui se différencient par les réactions métaboliques qu'elles utilisent pour

produire l'ATP et par la vitesse à laquelle elles se fatiguent. À partir de ces caractéristiques

structurales et fonctionnelles, on répartit les fibres musculaires en trois grandes catégories :

1) les fibres oxydatives lentes, 2) les fibres oxydatives-glycolytiques rapides et 3) les fibres

glycolytiques rapides (Tableau 1).

Les myoblastes de première génération ou myoblastes embryonnaires fusionnent

pour former les myotubes primaires, à l'origine principalement, des fibres lentes, mais aussi

de fibres rapides dans les muscles entièrement rapides [12]. Les myoblastes de seconde

12

génération ou myoblastes fœtaux forment les myotubes secondaires, à l'origine des fibres

rapides en majorité, mais également des fibres lentes dans les muscles entièrement lents ou

mixtes. Ces myotubes secondaires se développent autour des myotubes primaires, moins

nombreux et plus gros et qui leur servent de support. Une troisième génération de

myoblastes a été mise en évidence dans différentes espèces. En effet après les deux vagues

précédentes, des cellules de petite taille sont observées chez le porc [13], le mouton [14],

l'homme [15] et le bovin [16]. Lefaucheur et al [13] suggèrent à cette génération observée

que chez des mammifères de grande taille, un rôle dans l'origine des masses musculaires

plus importantes de ces animaux. Chez le bovin comme chez l'homme, elle semble être à

l'origine des fibres IIA. Ces cellules de petites tailles expriment généralement des formes

développementales de myosine et se positionnent autour des myotubes primaires, au

voisinage des myotubes secondaires. Chez le bovin, comme chez le mouton et l'homme, les

myoblastes de troisième génération sont détectés à la fin des deux premiers tiers de la vie

fœtale.

13

CARACTÉRISTIQUES STRUCTURALES

FIBRES OXYDATIVES

LENTES

FIBRES OXYDATIVES

GLYCOLYTIQUES RAPIDES

FIBRES GLYCOLYTIQUES

RAPIDES

Diamètre Myoglobine

Mitochondries Capillaires sanguins

Couleur

Le plus petit Grosse quantité

Nombreuses Nombreux

Rouge

Intermédiaire Grande quantité

Nombreuses Nombreux

Rouge - violet

Le plus grand Petite quantité

Peu nombreuses Peu nombreux Blanc (pâle)

CARACTÉRISTIQUES FONCTIONNELLES

Capacité à générer l'ATP: voies métaboliques utilisées

Vitesse d'hydrolyse de l'ATP par l'ATP ase de la myosine

Vitesse de contraction

Résistance à la fatigue

Stockage du glycogène

Ordre d'activation (recrutement)

Type de fibres et site d'abondance

Fonction primaire des fibres

Très élevée: par respiration cellulaire

aérobie

Lente

Lente

Élevée

Bas

En primaire

Type I, muscle de posture

Maintien de posture, activité d'endurance

Intermédiaire: par respiration cellulaire

aérobie et par glycolyse (anaérobie)

Rapide

Rapide

Intermédiaire

Intermédiaire

En deuxième

Type HX, muscle de jambes

Marche, sprint

Faible: par glycolyse

Rapide

Rapide

Faible: par glycolyse

Élevé

En troisième

Type II A, B Muscle des bras

Mouvement vigoureux rapide et de courte durée

Tableau 1 : Caractéristiques requises pour la classification des fibres musculaires squelettiques [17].

14

Chapitre II : Le Muscle Dystrophique et la Dystrophie Musculaire de

Duchenne

II. 1. Introduction:

La myopathie de Duchenne est à ce jour la maladie neuromusculaire la plus fréquente chez l'enfant avec une évolution inexorable, progressive conduisant au décès dans la troisième décennie. L'amélioration de la survie est liée à l'amélioration de la prise en charge orthopédique, au dépistage précoce des complications cardiaques et respiratoires mais aucune thérapeutique curative n'est applicable à ce jour.

La connaissance du gène et de la protéine impliquée, la dystrophine, a permis une amélioration du diagnostic prénatal et une meilleure compréhension des mécanismes conduisant à la destruction progressive du muscle. Toutefois, le degré variable d'évolutivité musculaire, d'atteinte cognitive et cardiaque des patients n'est pas totalement expliqué par la génétique moléculaire.

Les mécanismes précoces cellulaires et biochimiques favorisant la fibrose musculaire après des cycles de nécrose et de régénération, ne sont pas tous identifiés ce qui limite les perspectives thérapeutiques pharmacologiques ou de correction génique (Figure 5).

15

Mutation au niveau du gène DYS

Absence de la dystrophine : Duchenne

MUSCLE

Instabilité Membranaire

Efflux des composants intracellelfaTres

Efflux des enzymes musculaires

I / CK sérique

/ \ Efflux des facteurs myogéniques et de

croissances

FIBROSE e DEGENERATION MUSCULAIRE * - «

0 ^

^ REGENERATION Activation des cellules satellites _ . _ jj, MUSCULAIRE

4

Afflux des composants extracellulaires

I / Ca" intracellulaire

I

Q

NECROSE N Cytokines inflammatoires

^ Inflammation mononuclées

0-: Conséquence : Cycle répétitif : Épuisement de stocks

Figure 5: Voies pathogéniques d'un muscle dystrophique. Schéma simplifié des enchaînements de dommages causés aux fibres musculaires chez un patient atteint de la dystrophie musculaire de Duchenne.

IL2. Rappel historique:

En 1851, Edward Meryon rapporte dans Lancet, le cas de 9 garçons issus de trois

familles différentes atteints d'une faiblesse musculaire progressive [18]. Il décrit une

pseudo-hypertrophie musculaire, une marche un peu tardive, des difficultés à se relever du

16

sol à 6 ans. La marche décrite comme dandinant avec un abdomen proéminent et une

bascule du bassin est perdue entre 9 et 11 ans. L'atrophie musculaire progressive conduit au

décès au plus tard à 16 ans. A l'autopsie d'un des patients, il décrit des rétractions

tendineuses et une déformation du rachis; il confirme l'intégrité de la moelle épinière et des

nerfs et l'origine musculaire primitive probable de la paralysie avec destruction des fibres

musculaires et remplacement par une adipose. Il évoque une origine nutritionnelle

carentielle. En 1868, Duchenne décrit dans les Archives Générales de Médecine une

nouvelle forme de maladie musculaire à propos d'une série personnelle de 13 cas de

garçons qui développent durant l'enfance une faiblesse musculaire progressive avec un

aspect initial pseudo hypertrophique et un décès par insuffisance respiratoire vers 15 ans. Il

établit des critères diagnostiques:

• Diminution de la force musculaire débutant aux ceintures.

• Hyper lordose et marche dandinant.

• Pseudo-hypertrophie des muscles épargnés (mollets).

• Perte progressive de la force musculaire.

• Diminution de la contraction musculaire aux stimuli électriques à un stade avancé.

Il confirme l'atteinte musculaire primitive en 1868 avec le remplacement des fibres

musculaires par du tissu fibreux et graisseux.

En 1886, Gowers signale la fréquence des cas familiaux et le mode de transmission

maternelle. Il décrit le fameux signe de Gowers qui correspond à la façon de se relever du

sol des patients du fait du déficit pelvien (Figure 6).

Durant un siècle, la description reste clinique avec la découverte de l'élévation de la

creatine kinase sérique (CK), la confirmation de la transmission liée à l'X et la description

plus précise des lésions neuropathologiques par Bell [19]. La localisation du gène [20], la

découverte du gène [21], de la protéine dystrophine et de sa structure [22, 23] et du

complexe glycosarcolemmique dont fait partie la dystrophine [24], ont permis de

comprendre en partie les mécanismes moléculaires et cellulaires à l'origine de la DMD et

d'élaborer des stratégies thérapeutiques.

17

II.3. Le gène de la dystrophine :

IL 3.1. Le gène et ses transcrits :

Le gène de la dystrophine, dont le locus est situé en Xp21 [20], représente avec ses

2.3 Mb le plus grand gène connu chez les mammifères. Il occupe à lui seul à peu près 1%

de la longueur totale du chromosome X [26]. Sa très grande taille le rend plus vulnérable

que d'autres gènes humains à la survenue de petites ou grandes modifications spontanées.

90% du gène est composé d'introns et la séquence codante de 79 exons comprend 7

séquences promotrices liées aux premiers exons [27]. Des épissages alternatifs et

l'existence de ces promoteurs différents lui permettent d'avoir de nombreux transcrits

exprimés en fonction des étapes du développement et surtout spécifiques de certains tissus

(Figure 7) [28]. Les différentes isoformes de la dystrophine sont présents dans trois

principaux tissus : le cerveau, le cœur et le muscle squelettique, ce qui explique les

différents symptômes de la maladie.

La forme pleine longueur de la dystrophine est une protéine de poids moléculaire

427 kDa qui comprend 4 domaines. Le domaine amino terminal a des séquences

homologues avec l'a actine et contient 232 à 240 acides aminés. Le domaine central est une

succession de 25 séquences répétées hélicoïdales identiques à la spectrine d'environ 3000

résidus. Il existe par ailleurs une région riche en cysteine de 280 résidus. La dernière région

carboxyle terminale comprend 420 résidus. Cette protéine est associée avec la membrane

sarcolemmique du muscle cardiaque, squelettique, lisse et interagit avec les autres protéines

18

du complexe glycosarcolemmique (sarcoglycan, dystroglycan, syntrophine, et dystrobrévine). Les isoformes courtes proviennent de 4 promoteurs internes différents et produisent des protéines qui n'ont pas de domaine terminal «Actin binding» mais gardent leur domaine riche en cysteine et le domaine carboxy-terminal qui est le site de liaison avec les autres protéines du complexe glycosarcolemmique. Le promoteur de l'exon 30 code pour un transcrit de 260 kDa (Dp 260) qui est exprimé dans la rétine où il coexiste avec les isoformes muscle et cerveau de grande longueur (Dp 427) [29]. Le promoteur de l'exon 45 produit une isoforme de 140 kDa (Dp 140) qui s'exprime dans le cerveau, la rétine et le rein [30]. Le promoteur de l'exon 56 produit une isoforme de 116 kDa (Dp 116) qui ne s'exprime que dans le nerf périphérique [31]. Le promoteur de l'exon 63 produit une isoforme de 71 kDa qui ne s'exprime pas dans le muscle squelettique mais dans le cerveau, la rétine, le foie, le rein, le poumon et le cœur.

LU 1JI I HI I Mil I Xp21

IT) X chromosome

1 0 0 M

1 500 ÎOOO

P R

' l 1 I I I 111 I I I III Mil ■■ I l

B<

— i ■ ' i 1500 20OO

S G

M i l ' I I I I I I I I 1 11 H

2500 ko

l l l l 1 1 1 1 III III III ! l l l l l l l l HI II i 1 1 1 1 II III II 1 1 I I II

2500 ko

l l l l DP427B

DD427M Dp427P

Dp260 Dpl40

■ » / . . - ■-. ■■■ v-.A ■.;•-./. / I

■ I*»

Dpi 16 Dp71

I COOH Full length

I COOH Dp260

I COOH Dpl40

9 COOH D p l l 6

I COOH Dp71

Figure 7 : Représentation schématique du gène de la dystrophine et ses principaux produits. Les barres verticales représentent les 79 exons. Les flèches indiquent les différents promoteurs en particulier du cerveau (B), muscle (M), des cellules de Purkinje (P), de la rétine (R), des cellules de Schwann (S) et du promoteur général Dp71 (G) [28],

19

11.3.2. Les hypothèses d'un rôle structural :

11.3.2.1. Maintien de la stabilité membranaire :

Dans le muscle squelettique, l'association de la dystrophine à la membrane

sarcolemmale est supposée maintenir la stabilité membranaire, essentielle notamment lors

de la contraction musculaire [32]. Cette hypothèse découle notamment de l'analogie

structurale que présente le domaine central de la dystrophine et la spectrine [23]. L'activité

mécanique augmente la proportion de fibres dégénératives, suggérant que la dystrophine

apporte au sarcolemme une résistance mécanique aux stress subis pendant l'alternance

entre la contraction et la relaxation musculaire [33].

11.3.2.2. Fonctions particulières dans des zones spécialisées :

Au niveau des jonctions neuromusculaires, la dystrophine est exprimée dans les

«creux» membranaires, riche en canaux sodiques dépendant du voltage, et absente dans les

«crêtes», où se situent les récepteurs de l'acétylcholine. La relative abondance de la

dystrophine dans ces régions spécialisées suggère sa participation à leur organisation

topographique [34].

11.3.3. Les hypothèses d'un rôle métabolique :

L'observation dans le muscle de l'homme et de souris dystrophique révèle une

concentration intracellulaire élevée en calcium, une augmentation de l'activité des canaux

ioniques calciques et une modification de l'activité des proteases sensibles au calcium [35].

De ce fait, la dystrophine pourra jouer un rôle dans le métabolisme calcique. Toutefois ce

rôle pourrait être indirect, via la stabilisation du sarcolemme, les lésions membranaires dues

à l'absence de dystrophine entraînent secondairement un afflux anormal de calcium dans la

cellule [34].

11.3.4. les différentes mutations :

Le gène de la dystrophine peut être altéré par deux types de mutations. Les plus

fréquentes sont des deletions (65% des patients) ou des duplications (5%). Les mutations

20

ponctuelles sont suspectées dans les 30% des cas restants [21, 36]. Les deletions peuvent se

situer partout dans le gène mais il existe clairement deux points chauds «hotspot» : un dans

la partie centrale du gène entre les exons 45 et 55 mais avec un point de cassure dans

l'intron 44 et l'autre dans la partie proximale en 5' entre les exons 2 et 19 avec un point de

cassure fréquent dans l'intron 2 et 7 [28]. Il n'existe pas de corrélation entre la longueur de

la deletion et la sévérité de la maladie.

11.4. Le complexe dystrophine, glycoprotéines et protéines associées :

Le complexe dystrophine-glycoprotéines établit un lien entre la dystrophine et la

composante majeure de la matrice extracellulaire : la laminine [37]. A ce jour, le complexe

associé à la dystrophine (CAD) compte 18 protéines : la laminine-a2 [38], les

dystroglycanes (a, P) [39], les sarcoglycanes (a, P, 6, e, y) [40], la sarcospan [41], la

dystrobrevine [42], les syntrophines (al, pi et P2) [43], la NOs (nitric oxyde synthase)

[44], la MAST205 (microtubule associated serine/threonine kinase 205 Kd) [45], la

syncoiline [46], la calvéoline-3 [47] et la Grb2 [48] (Figure 8). Ce complexe

glycosarcolemmique forme un pont entre le sarcolemme et la membrane basale de la

matrice extracellulaire. Ensuite la dystrophine interagit avec le réseau sarcomérique par la F

actine. La première fonction du complexe glycosarcolemmique est de stabiliser le

sarcolemme et de protéger les fibres musculaires des dommages engendrés par les

contractions musculaires répétées [35]. En dehors de ce rôle mécanique, ce complexe

transmembranaire joue un rôle dans la communication intercellulaire par des signaux

biochimiques. La dystrophine est phosphorylée in vivo et in vitro par des kinases soit la

proline, soit la sérine-thréonine, soit la calmoduline dépendantes [49]. La phosphorylation

de la dystrophine modifie son affinité pour la F actine et la syntrophine, cette

phosphorylation pourrait être un signal de transduction [50].

21

Figure 8 : Organisation du complexe dystrophine et protéines associées au niveau du sarcolemme. Cette illustration est fournie par l'Association Française contre les Myopathies.

II.5. Muscle dystrophique : le plan histologique.

Les premières observations histologiques d'un muscle dystrophique montrent un

processus de nécrose et de régénération et un remplacement progressif du tissu musculaire

par une fibrose et du tissu adipeux [19]. Bell et collaborateurs signalent que le pourcentage

de fibres nécrotiques et en régénération est indépendant du degré évolutif de la maladie et

ils insistent sur l'augmentation des fibres de type 1 et l'aspect en foyer des lésions. Après

l'exclusion d'un mécanisme vasculaire, l'hypothèse d'une anomalie de la membrane

sarcolemmique est évoquée [51]. Depuis, plusieurs chercheurs s'intéressent à l'existence

des foyers de nécrose/régénération de myofibres et apportent des preuves convaincantes

que le ciblage de la fibrose musculaire peut améliorer la fonction musculaire et le

phénotype de la DMD et par conséquent peut représenter une approche thérapeutique utile

pour cette myopathie [52].

77.5.7. Les fibres nécrotiques :

Les fibres nécrotiques sont facilement reconnues au trichrome (colorées en bleu

22

vert) avec un réseau myofibrillaire absent ou désorganisé et une réactivité ATPasique ou

oxydative diminuée. Elles fixent de façon non spécifique la fraction C5b du complément ou

complexe d'attaque membranaire (MAC) et expriment la prostaglandine D2 [53] et sont

associées à des cellules inflammatoires. La fréquence des fibres nécrotiques varient d'un

patient à l'autre et d'un muscle à l'autre, de façon indépendante du degré évolutif de la

pathologie de 0.5 à 3.5% [19, 54]. La nécrose est causée par la défection du CAD, qui

augmente la perméabilité du sarcolemme, l'influx calcique dans le sarcoplasme et

l'activation des proteases [55]. Cette nécrose segmentaire est caractérisée par la présence de

fibres régénératives avec un cytoplasme basophile, une augmentation des activités

oxydatives et une immuno-réactivité pour la myosine fœtale et l'utrophine. L'installation

d'une inflammation chronique suivie par la production persistante des cytokines

profibrotiques et un excès de synthèse et de dépôt de protéines de la matrice extracellulaire

est observée suite au cycle répétitif de nécrose-régénération musculaire. De plus,

l'expression de différentes cytokines inflammatoires comme le TNFa, «Tumor necrosis

factor a», augmente en appuyant plus la nécrose. D'ailleurs, des études montrent que la

depletion des cellules inflammatoires comme les neutrophiles, le blocage de la

dégranulation des mastocytes ou le blocage pharmaceutique du TNFa réduisent la nécrose

dans les myofibres dystrophiques [56].

11.5.2. La prédominance défibres de type 1 :

La prédominance de fibres de type 1 varie selon les biopsies des muscles et l'âge des

enfants dystrophiques (quadriceps 41 à 75%). Les fibres de type 2B diminuent après l'âge

de 2 ans et disparaissent après 5 ans en rapport probablement à une fragilité de la

membrane sarcolemmique plus importante. Entre 1 et 5 ans, la taille moyenne des fibres

est plus élevée que chez les patients contrôles puis se normalise en alternant des fibres de

grandes tailles et des groupements de petites fibres [57]. Les centralisations nucléaires sont

présentes dans 2 à 4% des myocytes mais ne semblent pas liées à la sévérité de la

pathologie.

II. 5.3. Les fibres hyper contractées :

Les fibres hyper contractées sont arrondies, foncées, hyper réactives au trichrome et

23

souvent de grande taille. Elles témoignent d'anomalies sarcolemmiques permettant l'entrée

massive du calcium dans la cellule, induite par un stress. Chez les patients DMD, elles sont

plus fréquentes (4 à 8.3%) que chez le sujet normal (0.4%). Elles sont dépourvues en

desmine et en actine, témoignant d'une activation des proteases cytoplasmiques calcium

dépendantes [58]. La surcharge calcique des fibres musculaires non nécrotiques avec des

dépôts sub-sarcolemmiques du calcium est un fort argument pour l'hypothèse de défaut

sarcolemmique primitif permettant l'entrée du calcium dans les cellules. Cette anomalie est

déjà présente dans le muscle de sujets DMD à l'âge fœtal [59].

ILS. 4. L'inflammation et la fibrose musculaire :

L'inflammation et la fibrose sont deux événements très intriqués dans les différents

tissus. La fibrose est la clé de nombreuses affections pathologiques humaines qui vont de la

rétinopathie et la néphropathie diabétique à la cirrhose du foie, la fibrose pulmonaire

idiopathique, la sclerodermic ou l'insuffisance cardiaque congestive. La constitution de la

fibrose est une réponse mal régulée à une agression tissulaire et la succession d'événements

est la même quelque soit le tissu même si tous les partenaires ne sont pas aussi bien

identifiés comme dans le cas du muscle [52],

Le processus se déroule en trois étapes:

- Lors de la première phase, la rupture de la barrière vasculaire au moment du

traumatisme expose les plaquettes à la matrice extracellulaire et provoque une agrégation

plaquettaire avec une dégranulation qui libère différents facteurs dont la thrombine qui va

cliver le fibrinogène et former avec la fibronectine une matrice provisoire. Les cellules

inflammatoires et plus tard les fibroblastes arrivent sur le site. À la phase précoce, les

macrophages sont recrutés sur le site de la lésion. Avec l'aide des neutrophiles, ces

macrophages phagocytent les débris nécrotiques. Ils sécrètent dans le même temps des

cytokines et des facteurs chémotactiques qui vont attirer les cellules endothéliales pour

former de néo-vaisseaux, et des cellules T elles-mêmes activées et sécrétrices de cytokines

profibrotiques. Dans le même temps, les fibroblastes migrent vers le site, guidés par la

néomatrice de fibrine et se différentient en myofibroblastes. Ce complexe mixte peuplé de

macrophages, cellules T, myofibroblastes et néovaisseaux mêlés à une matrice de

collagène, fibronectine et acide hyaluronique est appelé tissu granulaire.

24

- La seconde phase est la constitution du tissu cicatriciel. Les myofibroblastes activés produisent de grandes quantités de collagènes I et III dans la matrice extracellulaire. Cette phase de remodelage est caractérisée par une synthèse et une dégradation des protéines de matrice extracellulaire avec un excès de collagène qui conduit à la formation du tissu cicatriciel. Au début, le collagène III prédomine puis il est remplacé progressivement par le collagène I. Les fibres de collagène s'organisent en un réseau stable et compact (Figure 9).

- La troisième phase est la résorption du tissu cicatriciel. Ce procédé associe une réduction de la production de collagène par les myofibroblastes et une augmentation de la dégradation résultant d'une variation du ratio entre les métalloprotéinases (MMPs) et leurs inhibiteurs (Tissue Inhibitors ol MetalloProteinases, TIMPs) produits par les macrophages, les granulocytes et les myofibroblastes. Il existe donc un équilibre global entre une activité de synthèse de la matrice extracellulaire (surtout initiale) et une activité protéolytique (surtout terminale) pour permettre la résolution du tissu cicatriciel. Le moindre déséquilibre entre les éléments (synthèse excessive ou protéolyse insuffisante) favorise la constitution de la fibrose chronique dans le tissu.

un art ne

Normal muscle DMD muscle

un art ne

Figure 9: Immunohistochimie du collagène muscle dystrophique. L'immuno-marquage DMD présente plus de dépôt de collage biopsie musculaire normale [52].

V sur des coupes d'un muscle normal et d' montre que la biopsie musculaire d'un patù ne endomysium (rouge) par rapport à u

un art ne

25

H.5.4.1. La fibrose endomysiale :

La fibrose endomysiale est un marqueur précoce de problèmes moteurs (perte de

marche précoce). L'analyse de la fibrose endomysiale musculaire dans les muscles des

patients dystrophiques a permis de retrouver deux facteurs significativement corrélés à son

importance :

- la distance entre le capillaire et le myocyte qui est augmentée de 2.5 fois, source

potentielle de perturbation des échanges gazeux et d'aggravation de la souffrance

myocytaire.

- l'augmentation des macrophages CD206+.

L'ensemble des mécanismes qui concourent à cette myofibrose dans la DMD est

encore mal connu. Néanmoins plusieurs travaux ont souligné le rôle de cytokines pro-

fibrosantes comme le TGF-P impliquées dans la régénération musculaire, vers la

production de fibroblastes, les MMP, et les macrophages [60-64].

II. 5.5. Les partenaires cellulaires :

Les différents partenaires sont les myofibroblastes dont certains pourraient être

d'origine médullaire et les cellules recrutées sur le site lésionnel tel que les macrophages et

les lymphocytes T.

II.5.5.1. Les cellules satellites :

Le pourcentage de fibres nucléées accompagnées de cellules satellites est 3 à 7 fois

plus élevé dans le muscle DMD que dans le muscle normal. Cette augmentation des

cellules satellites est aussi rapportée dans la myotonie et les polymyosites. Il semblerait

donc que la capacité à maintenir une population de cellules myogéniques est augmentée

même si la capacité de division et de fusion de ces cellules est peut être altérée [65]. Mais,

la DMD, comme d'autres formes de myopathies, mime une lésion musculaire chronique,

donc recrute en permanence les cellules satellites jusqu'à épuisement total, déclenchement

de l'atrophie musculaire et installation de la fibrose.

26

II.5.5.2. Les cellules inflammatoires :

Les cellules inflammatoires sont péri-vasculaires dans le perimysium et

l'endomysium où elles sont proches des foyers de régénération : ce sont des macrophages

ou plus rarement des lymphocytes T, CD8+ dans un tiers des cas. Le nombre de cellules

inflammatoires dans les infiltrats endomysiaux est plus faible que dans les polymyosites

que ce soit les macrophages ou les lymphocytes T dans une proportion de 1 à 10 [66]. Les

fibres déficientes en dystrophine sont plus sensibles à la protéolyse induite par les

mastocytes [67]. Les macrophages ont un rôle important dans toutes les lésions musculaires

mais aussi de support pour la régénération musculaire à partir des cellules satellites [68,

69]. La majorité des macrophages recrutés après lésion musculaire est d'origine

monocytaire qui subit un changement de phénotype en macrophages anti-inflammatoires

qui stimulent la myogenèse et la croissance des fibres musculaires.

II.6. Les modèles animaux et leurs intérêts :

Pour pouvoir comprendre les mécanismes physiopathologiques et effectuer des

essais thérapeutiques précliniques, les chercheurs étudient des modèles animaux qui

reproduisent la myopathie de Duchenne.

Les principaux modèles animaux sont : la souris mdx, le chien GRMD et le modèle

félin.

II. 6.1. La souris mdx :

Pour la DMD, la souris mdx (muscular dystrophy X-linked) est connue comme un

mutant naturel depuis 1984 [70], elle possède une mutation (transversion d'un nucleotide C

en un T) à la position 3185, dans l'exon 23 du gène de la dystrophine. Cette mutation

convertie le codon glutamine CAA en un codon stop TAA. Le produit du gène muté de la

dystrophine est tronqué (a une taille de 27% par rapport à celle de la dystrophine normale)

et ne possède pas la capacité fonctionnelle de s'attacher au sarcolemme [22, 71]. De plus,

comme chez les patients DMD, il en résulte une absence marquée du CAD [72]. Par contre,

les souris mdx ne présentent que peu de phénotypes associés à la maladie et elles ont la

capacité de se reproduire. On observe peu de fibres musculaires en nécrose qui sont

27

continuellement remplacées par des fibres régénératrices au lieu du tissu conjonctif. Cette régénération est importante comme l'atteste la variabilité de la taille des fibres [73].

Deux autres souches de souris mdx ont été produites. La première souche 'mdx3Cv' est obtenue par mutagenèse chimique pour inactiver les isoformes de 427 kDa et de 70 kDa du gène de la dystrophine. Le développement de la maladie s'effectue de la même manière que chez la souris mdx mais très peu de nouveau-nés par portée de mdx3Cv survivent [72].

La seconde souche n'exprime pas l'utrophine, en plus de la dystrophine, (double mutée utrophiny/indx). Ce dernier modèle est très proche de la sévérité de la DMD humaine.

Sachant que la différence majeure entre la souris et l'humain se trouve dans la longueur de leurs telomeres, qui sont substantiellement courts chez l'humain, Sacco et al. ont pensé à développer un nouveau modèle pour la DMD, la souris mdx avec un défaut au niveau de l'activité des télomérases (mdxmiTR). La réduction de la longueur des telomeres dans les cellules souches satellites peut sévèrement limiter le stock des cellules satellites conçues pour la réparation musculaire, d'où une perte progressive et sévère de la forme et de la fonction musculaire [74] (Figure 10).

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El§ 1̂ 8

%

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Û Figure 10 : Mécanisme de la régénération musculaire. Une représentation schématique de la série d'événements au cours de la régénération musculaire dans le modèle de souris mdx (à gauche) comparé au modèle mdx4nTR dystrophiques (à droite). D'après Sacoo et al. [74]

28

//. 6.2. Le chien Golden Retriever :

L'absence de dystrophine chez les chiens cause une myopathie et une

cardiomyopathie similaire aux patients DMD. L'affection canine, décrite pour la première

fois par Valentine et al. en 1986 [75], est appelée « GRMD » (Golden Retriever Muscular

Dystrophy). On observe des taux de CK élevés qui sont augmentés par l'exercice. Les

chiens dystrophiques ont une stature raide avançant à petits pas, une démarche

chambranlante, une difficulté à ouvrir la mâchoire et à se nourrir. Ils salivent aussi

excessivement à cause de l'épaississement de la base de leur langue. Du point de vue

histologique, les fibres nécrosées sont graduellement remplacées par du tissu fibreux

causant une atrophie. Seule la partie aminoterminale de la dystrophine canine peut être

détectée à l'aide d'anticorps chez les chiens atteints de la maladie. La mutation est causée

par un changement d'une base A par G à l'intérieur d'un site d'épissage consensus situé à

l'extrémité 3' de l'intron 6, un déplacement du cadre de lecture et un codon stop prématuré,

ce qui résulte en une protéine manquant les exons 6 à 8 de 390 kDa (91% de la taille

normale) [76]. Le modèle GRMD est très avantageux puisque il a une très grande

similitude avec la DMD. Il est donc un bon modèle pour l'étude de thérapies. Cependant,

les coûts de reproduction des chiens dystrophiques et de leur maintien en laboratoire sont

très élevés ce qui limite leur utilisation.

11.6.3. Le modèle félin :

Les dystrophies chez les chats sont plus rares et les symptômes sont observés durant

leur première ou leur deuxième année de vie. Les chats malades présentent un

élargissement musculaire, une langue proéminente, une mobilité affectée et des signes de

cardiomyopathie. Sur des coupes de muscles, on observe des amas de fibres musculaires

nécrotiques et un faible marquage pour la dystrophine. Le site de mutation n'a pas été

identifié à ce jour. Le modèle félin est particulièrement intéressant dans l'étude des facteurs

de progression des dystrophinopathies et dans l'évaluation des thérapeutiques

éventuellement utilisables en phase précoce de la DMD.

29

11.6.4. Autres modèles animaux :

Quelques laboratoires utilisent aussi des invertébrés tel que Cœnorhabditis elegans

parce que ses 19733 gènes sont connus. De plus cet animal est formé de seulement 959

cellules, dont 95 sont des cellules musculaires. Ses muscles possèdent une dystrophine

similaire à celle de l'homme, qui peut aussi subir des mutations entraînant des symptômes

dystrophiques. [77] Un autre modèle animal introduit plus récemment est la drosophile

[78].

11.6.5. La souris mdx, un modèle valide pour la DMD ?

A nos jours, la souris mdx est le modèle le plus utilisé afin d'étudier les mécanismes

cellulaires et moléculaires dans la DMD. Mais une étude l'a défini comme un pauvre

modèle dystrophique [79], puisqu'il ne présente pas un phénotype de maladie progressive

et sévère, des contractures articulaires, impuissance respiratoire et cardiaque, qui sont des

marques de la myopathie humaine. Cela limite notre compréhension de sa physiopathologie

et les essais de traitement potentiel. De ce fait, l'utilisation des souris double mutées

utrophine^" dystrophine^" est suggérée mais aussi des stratégies sont utilisées afin

d'augmenter les lésions musculaires.

11.6.5.1. Lésions cytotoxiques :

Les agents utilisés sont des venins de serpents (notexine ou cardiotoxine) qui

provoque une lyse myocytaire sans détruire le pool de cellules satellites, ni les vaisseaux, ni

les nerfs, ni interrompre les relations entre les myofibres et l'appareil musculo-tendineux.

L'injection unique de ces agents permet de créer une lésion musculaire aiguë très différente

des processus dystrophiques pathologiques mais permet de reproduire et d'évaluer les

interactions cellulaires dans le processus de nécrose-régénération.

11.6.5.2. Lésions mécaniques :

Ce sont des lésions musculaires par rupture de l'appareil musculotendineux causés

par des aiguilles ou des micro capillaires. Ce qui va engendrer le déclenchement d'une

cascade de mécanismes cellulaires :

30

0-24 heure: rupture myofibrillaire et hématome qui dissocie les fibres, infiltration

du perimysium par les macrophages et activation des cellules satellites à 12 heures.

J2-J3: differentiation des cellules satellites en myoblastes et fusion des myotubes,

phagocytose par les macrophages des myofibres nécrosées.

J5: les myofibres régénérées commencent à adhérer au tissu interstitiel conjonctif.

Les myotubes emplissent l'espace sarcolemmique évidé.

J7: les myofibres régénérées s'étendent hors de l'espace de la lame basale.

J14: formation de mini jonctions neuromusculaires à la fin des fibres régénérées.

J21-56: organisation des myofibres dans le sarcolemme, migration des noyaux à la

périphérie des myocytes.

31

Chap i t r e I I I : Les Approches Thérapeu t iques Pour La DMD

La taille, la complexité, le nombre de produit du gène de la dystrophine dans des

tissus différents augmentent les difficultés pour développer une thérapeutique efficace.

La prise en charge médicale est, pour l'instant, symptomatique. Elle vise

essentiellement à prévenir les complications, notamment orthopédiques, cardiaques et

respiratoires, et à améliorer le confort de vie des personnes atteintes de la DMD.

III. 1. Les thérapies actuelles :

À nos jours, il n'existe aucun traitement capable d'arrêter l'inexorable progression

de la DMD mais la médecine d'aujourd'hui essaye de retarder certains symptômes. Lors de

difficultés respiratoires, une ventilation non invasive est d'abord mise en place mais celle-ci

devient invasive en cas de troubles respiratoires importants. Le développement d'une

scoliose peut être stabilisé via une arthrodèse vertébrale. L'ajout à l'alimentation des

patients de vitamine D et de calcium permet de lutter contre l'ostéoporose.

Sur le plan pharmacologique, deux médicaments sont actuellement d'usage

courant : les inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACEi) et les

corticostéroïdes. Les premiers étaient utilisés de longue date dans le traitement de

l'insuffisance cardiaque. Leurs effets bénéfiques chez les patients Duchenne ont été

démontrés par des essais cliniques et le périndopril est devenue la première molécule ayant

prouvée son efficacité sur la durée de vie dans la DMD [80, 81]. Les corticostéroïdes

(décrits plus en détail dans la section des thérapies médicamenteuses) sont efficaces dans le

traitement de la DMD avec un gain d'autonomie motrice initialement important. À plus

long terme, ce bénéfice est probablement moindre tandis que les effets secondaires

augmentent encore la dépendance.

III.2. L'approche thérapeutique : les avancées de la recherche.

Plusieurs équipes scientifiques poursuivent leurs recherches dans le but de trouver

une thérapie efficace pouvant contrer les effets néfastes liés à l'absence de la dystrophine

dans les muscles des patients. Trois approches thérapeutiques sont particulièrement

intéressantes : la thérapie médicamenteuse, la thérapie génique et la thérapie cellulaire

32

(Figure 11).

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P l a n u d t - dyrtropluoe. AAV-iMnidyflioji*int

> t •— MçK*ty<1r*iît(

Figure 11 : Stratégies de traitement de la DMD.

III.2.1. La thérapie médicamenteuse :

Les premiers essais pour améliorer les conditions de vie des patients souffrant de la

DMD ont impliqué l'utilisation des corticostéroïdes visant à diminuer l'inflammation et

ralentir la progression de la maladie. Des essais cliniques d'administration orale de la

prednisone démontrent un ralentissement significatif de la progression de la maladie ainsi

qu'une augmentation de la masse musculaire des patients dystrophiques [82-85]. Mais des

effets secondaires, comme un retard de comportement, de poids et de densité osseuse,

limitent l'utilisation de la prednisone et nécessitent une réduction de la dose journalière.

Le déflazacort, un dérivé de la prednisone, semble offrir une alternative efficace

pour des patients dystrophiques en maintenant leurs fonctions motrices et augmentant les

fonctions des muscles respiratoires mais avec moins d'effets secondaires [86-88]. Une

partie de ces effets bénéfiques du déflazacort est due à sa capacité de permettre l'expression

de la laminine, la fusion des myoblastes et la differentiation myogénique [89].

Récemment, il a été démontré que l'administration de déflazacort stimule la voie de

signalisation calcineurine /NFAT et l'expression de l'utophine [90]. L'utrophine est une

33

protéine apparentée à la dystrophine, avec une très grande similarité qui lui permet

d'assurer en partie, la fonction de la dystrophine déficiente et ralentir la dégénérescence du

muscle [91].

En rapport avec le rôle important que joue l'utrophine, une entreprise de

biotechnologie du nom de VASTox cherche des composés pharmacologiques susceptibles

de stimuler l'expression de son gène. Un essai clinique de phase I avec le BMN-195, un

inducteur de l'expression de l'utrophine administré par voie orale, a débuté en janvier 2010

(http://www.news-medical.net/news/20100803/BioMarin-completes-BMN-195-Phase-1 -

clinical-trial-for-Duchenne-muscular-dystrophy.aspx.).

D'autres types de composés sont utilisés par les chercheurs pour augmenter la

masse musculaire par exemple les facteurs de croissance comme IGF-I (Insulin Growth

Factor I), les inhibiteurs de la myostatine et les agonistes beta-2 [92-94]. Un essai clinique

utilisant un anticorps contre la myostatine MYO-029 (Laboratoire pharmaceutique Wyeth,

USA) a été réalisé chez des personnes atteintes de dystrophie musculaire de Becker ou de

myopathie des ceintures. Les résultats publiés en 2008, montrent que le traitement est

sécuritaire et a été bien toléré mais aucune amélioration de la force et de la fonction

musculaire n'a été observée [95, 96].

L'ataluren (antérieurement dénommé PTC 124) est un nouveau médicament,

développé par la société PTC Therapeutics, utilisé dans le traitement des maladies

génétiques dues à des anomalies génétiques de type non-sens. L'ataluren a la capacité de

passer spécifiquement outre ces mutations non-sens prématurées (on parle de

«translecture») et non les signaux de codons stop normaux afin de restaurer la production

d'une protéine fonctionnelle. La restauration de la dystrophine dans une culture de

myoblastes DMD humains ou murins, suite au traitement à l'ataluren, a été reporté et

confirmé in vivo dans des muscles dystrophiques du modèle murin dystrophique [97].

L'avantage de poursuivre le développement de cette thérapie est la voie d'administration

orale convenable et son potentiel large pour plusieurs applications cliniques, surtout que

l'ataluren a été bien toléré dans un essai clinique de phase I [98]. Un essai clinique de phase

IIA et de phase IIB, de 48 semaines de traitement ont été lancés afin d'évaluer l'expression

musculaire de la dystrophine et son effet sur la performance musculaire. La distance

34

parcourue pendant un test de 6 minutes de marche est utilisée comme principale mesure

d'effet (NCT00592553, clinicaltrials.gov).

L'utilisation de l'ataluren est une thérapie très prometteuse, elle est cependant

confrontée à une grande limitation du nombre de patients dystrophiques qui présentent une

mutation ponctuelle non-sens dans leur gène de la dystrophine (10 à 15%).

III.2.2. La thérapie génique et cellulaire :

La thérapie génique consiste à réparer ou remplacer le gène défectueux par un gène

thérapeutique, par contre, la thérapie cellulaire consiste à transplanter des cellules capables

de se différencier et de se fusionner avec les myofibres existantes ou d'en former des

nouvelles. Les noyaux des cellules transplantées incorporés dans ces myofibres vont

exprimer le gène manquant.

Une nouvelle voie thérapeutique prometteuse résulte de la combinaison de la

thérapie génique et la thérapie cellulaire dans le cadre de la DMD. Elle consiste à

transplanter des cellules modifiées génétiquement in vitro (Figure 12).

35

Patient

R e p a r u t i o n p a r des pe t i t s

f r agmen ts homf)lfif>uvs

Figure 12: Thérapies géniques et cellulaires pour la DMD. Représentation schématique résumant les différentes thérapies géniques et cellulaires utilisées pour traiter la DMD [99].

HI.2.2.1. La thérapie génique :

Dans le cas de la DMD, le but est de faire exprimer de nouveau la dystrophine sous la membrane des fibres musculaires. Des obstacles, comme la très grande taille du gène de

36

la dystrophine, la persistance de l'expression du gène introduit restent encore à franchir

avant de pouvoir envisager d'appliquer efficacement cette technique à l'homme [72].

111.2.2.1.1. Utilisation des méganucléases :

Les méganucléases sont des ciseaux moléculaires qui coupent l'ADN. Cette

chirurgie du génome par méganucléases s'appuie sur les systèmes de réparation de l'ADN

naturelle de la cellule. Les premières méganucléases dirigées contre le gène de la

dystrophine ont été livrées par Cellectis et des essais in vitro et in vivo sont en cours dans

l'équipe du Dr. Tremblay [100].

Un autre type de nuclease utilisé récemment est les nucleases à doigt de zinc.

L'introduction d'une cassure double-brin de l'ADN par ces nucleases à proximité du site à

corriger est connue pour très fortement stimuler les mécanismes de réparation de type

recombinaison homologue. Cependant, ces nucleases ne sont pas totalement spécifiques et

peuvent casser l'ADN à divers endroits du génome, d'où leur toxicité. Des expériences in

vitro sont en cours dans l'équipe du Dr Tremblay.

111.2.2.1.2. Le saut d'exon :

Le phénomène de saut d'exon est rencontré de façon spontanée dans certaines fibres

musculaires chez les patients DMD permettant une ré-expression de la dystrophine dans ces

rares fibres appelées fibres révertantes. Ce phénomène spontané dans le gène de la

dystrophine a conduit certaines équipes à développer une nouvelle thérapie génique pour la

DMD [101]. En fait, elle consiste à restaurer un cadre de lecture opérationnel d'un transcrit

muté en éliminant un ou plusieurs exons de l'ARNm. Cette opération est rendue possible

par l'usage de séquences ou oligonucleotides anti-sens (OAs) masquant les sites d'épissage

du ou des exons bornant la mutation lors de la réaction d'épissage de l'ARN pré-messager.

Dans la majorité des cas, l'ARNm ainsi réhabilité permet la synthèse d'une dystrophine

certe tronquée mais fonctionnelle tel que démontré in vitro [102] et in vivo chez des

modèles animaux dystrophiques [101, 103, 104] (Figure 13). Plusieurs études essayent de

déterminer les sites cibles pour les OAs qui peuvent être les plus efficaces dans un essai

clinique [105, 106]. Une étude hollandaise décrit le succès de transferts des OAs induisant

des doubles et triples sauts pour les exons 43 et 44, 46 à 50 dans des myotubes de deux

37

patients DMD en culture [107].

PERSONNE SAINE Maturat ion par « «1-plssogc »

du pré-messager normal de la dystrophine

* * * sites d'éprasag» Messager mûr normal

PERSONNE DMD AVEC DELETION DE L'EXON 50

Pre-n*essager anormal de la dys t roph in»

mm m épissage naturel

/ ^ r§> r * 5

saut de l'exon 51 provoqué par des oligonucleotides

anti-sens ciblés

Messager mûr non fonctionnel

Messager mûr fonctionnel

Pas de dyst rophine

Dystrophine légèrement raccourc ie

mais FONCTIONNELLE

Figure 13: Exemple de saut d'exon. Représentation du mécanisme du saut d'exon chez un patient DMD ayant une deletion de l'exon 50 permettant la restauration du cadre de lecture et conduisant à une dystrophine incomplète mais fonctionnelle. (Avancée de la recherche. 2007, AFM)

Cette thérapie est confrontée à plusieurs limitations : La première est la nécessité de

personnaliser les molécules thérapeutiques [108]. Les différentes deletions dans la DMD

requièrent le saut de différents exons, ce qui nécessite l'optimisation et les essais cliniques

de plusieurs OAs spécifiques. Étant donné que les deletions concentrées près des exons 45-

53 et des exons 2-20 du gène de la dystrophine représentent respectivement 50% et 15% de

l'ensemble des mutations, un saut de multi-exons a été proposé [109].

La deuxième limitation est la non stabilité des OAs et leur modification par des

composants chimiques affectant le rendement et la transmission aux cellules in vitro et

aussi in vitro. Pour cela, les OAs ont été développés sous forme de 2'-0-methyl-

phosphorothioate OAs afin d'augmenter leur stabilité par rapport un ARN non méthylé.

38

Présentement, des oligomères morpholino semblent prometteurs pour des

applications in vivo [104, 110, 111]. Ces oligomères incorporent des anneaux de

morpholine à la place des anneaux de ribose au niveau de l'ARN ce qui les rend non

ioniques, évitant ainsi les interactions électrostatiques non spécifiques avec les cellules.

La troisième limitation est le non ciblage du cœur par les OAs. Récemment,

plusieurs équipes ont réussi à atteindre tout le système musculaire strié y compris le cœur

par l'incorporation des peptides ou des groupements chimiques qui facilitent l'absorption

cellulaire [112-114].

Finalement, pour rediriger l'expression génique, les OAs doivent être

continuellement administrés au noyau cellulaire car ils ciblent la transcription plutôt que le

gène en plus de leur courte demi-vie biologique. Jusqu'à date, on ne connait pas les effets

secondaires de l'administration répétée des OAs chez les patients, sachant que ce type de

traitement vise plus les jeunes patients. Une forme de OAs camouflée dans un transgène

correspondant à un petit ARN non codant (snARN U7 ou Ul) modifié ou vectorise, est

développée afin de contourner ce problème et assurée une expression permanente du

transgène (Figure 14).

39

▼ r LTR

uc U G

CG AU CC UA CG UA * *—,

HS1A0N2 hSIAONl sit* dt liaison u î - A . UA

S'CCUCUGUGAUUUUAUAACUU GAU/U CAAGGAAGAUGGaUUUCU AAUUU UU GGAGCAG CCCU 3'

Protein* Sm site dt liaison

o n c3DgnD ŒBCHD

QL i Sa ut d'exon 51

DDOEKOH: Figure 14 : Schéma du vecteur lentiviral codant le snARN U7opt-ex51. A. Le U7snARN transformé en U7opt-ex51 spécifique de l'exon 51 du gène de la dystrophine humaine est clone entre le WPRE et le cPPT. B. Représentation du phasage exonique au voisinage de la deletion A49-50 et stratégie de réhabilitation par élimination de l'exon 51. LTR : séquence terminale longue répétée ; Psi : séquence signal d'encapsidation ; RRE : élément de réponse Rev; cPPT : central polypurine tract ; WPRE : élément de réponse woodehuck du virus de l'hépatite. [115],

III.2.2.1.3. La thérapie génique virale:

Les virus représentent les vecteurs naturels les plus évolués pour le transfert d'une

information génétique étrangère dans une cellule. Plusieurs virus ont fait l'objet

d'adaptation en vecteur dans le cadre de la DMD. Les chercheurs essaient d'optimiser ces

vecteurs pour qu'ils contiennent de moins en moins de gènes viraux tout en gardant leur

efficacité de transduction. La majorité de ces vecteurs est résumée dans le tableau 2.

40

Avantages Inconvénients Application pour lu DMD

Adenovirus (non intégratif)

Fort taux de transduction in vivo et ex vivo

Transduction des cellules

quiescentes et en division

Production aisée

Taille limite du gène : 7,5 kb

Ré-administration impossible

Durée d'expression courte (transitoire)

Réponse immunologique

Expression de la dystrophine dans 30% du muscle dystrophique injecté avec un

adenovirus - dystrophine pleine longueur [116]

Expression de la dystrophine dans le muscle dystrophique suite a la

transplantation des cellules myogéniques infectées aux adénovirus-

mini-dystrophine [117]

Retrovirus (intégratif)

Taux de transduction élevé

ex vivo Durée

d'expression assez longue

Peu immunogène

Faible taux de transduction in vivo

Transduction des cellules en division

uniquement Risque de mutation

insertionelle Taille limite du gène :

8kb Production difficile

Expression de la dystrophine dans 6% du muscle dystrophique injecté avec retrovirus - mini-dystrophine [118] Expression de la dystrophine dans du

muscle dystrophique suite à la transplantation des cellules satellites

infectées aux rétrovirus-mini-dystrophine [119]

Lentivirus (intégratif)

Transduction des cellules

quiescentes et en division

Affilié aux virus immunodépresseurs

Taille limite du gène :8kb

Production difficile

AAV (intégratif)

Transduction des cellules

quiescentes et en division Durée

d'expression longue in vivo

Peu immunogène

Ré administration impossible

Taille limite du gène : 4,5kb

Production moyenne

Vecteur synthétique : le plasmide

Sécurité d'emploi Très peu

immunogène Production simple

Gène de grande taille

Transfection très peu efficace

Durée d'expression très courte

Ciblage de la transfection difficile

Essai clinique en cour phase MI: injection de plasmide Myodys chez des

patients DMD par voie intraveineuse. [ 120]

Lipides cationiques et

particules d'ADN

condensées

Transfection efficace in vivo (complexes non

ioniques) Peu immunogène Production assez

simple

Transfection inefficace in vivo (complexes

cationiques) Durée d'expression

très courte Toxicité

Tableau 2: Comparaison des principaux vecteurs de transfert de gène.

41

Généralement, les transgènes utilisés correspondent à l'ADN complémentaire

(ADNc) d'un gène, mais la grande taille de VADNc de la dystrophine (d'environ 11 kb,

dystrophine pleine longueur) et la capacité limité d'incorporation de gène des vecteurs

viraux ont favorisé l'utilisation d'ADNc partiellement tronqué codant pour une dystrophine

qui conserve une certaine fonction même s'il lui manque certaines de ses séquences. En

effet, des patients Becker ayant une dystrophine fonctionnelle malgré la deletion de

plusieurs exons a favorisé la construction de mini et de micro versions du gène de la

dystrophine (Figure 15).

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Figure 15 : Structure des gènes de la dystrophine pleine longueur, de la quasi-dystrophine, de la mini-dystrophine et de la micro-dystrophine qui sont associés avec la restauration de la fonction du muscle dystrophique [121].

La première utilisation du vecteur lentiviral dans le cadre de la DMD eut lieu en

2003. Comme la taille d'encapsidation du lentivirus ne permet pas d'y introduire la

dystrophine pleine longueur, c'est la micro-dystrophine de souris qui y fut incorporée.

L'injection de ce virus dans le muscle de souris mdx a permis la réexpression de cette micro

42

dystrophine dans 65% du muscle après 4 mois, avec une augmentation de la force

spécifique et une amélioration de la résistance accrue aux dommages [122].

L'utilisation d'un lentivirus comme approche thérapeutique dans la DMD est prometteuse mais il faut néanmoins faire attention au risque de tumorigénicité de ce vecteur viral.

D'autres efforts se concentrent sur le développement de thérapies géniques basées

sur l'utilisation des vecteurs virales adéno-associés (AAV). L'administration intraveineuse

de l'AAV de serotypes 1 et 2 [123] codant pour la micro-dystrophine a restauré

l'expression de ce transgène dans les muscles respiratoires, cardiaques et des membres

inférieurs chez des souris dystrophiques avec une réduction considérable de la pathologie

du muscle squelettique [124]. Des expériences ont aussi été réalisées chez le chien avec des

AAV de serotypes 6 et 8 mais bien que l'expression de la micro-dystrophine fût observée,

une réponse immunitaire contre la capside virale fut également détectée [125]. Un AAV8

codant pour le même transgène a aussi été introduit chez le primate non-humain. A 5 mois,

l'expression de la micro-dystrophine atteint environ 80 % dans le muscle traité mais en

présence des anticorps préexistants contre l'AAV chez l'hôte, ce niveau d'expression

diminue d'environ 40 % [126].

Malgré les résultats encourageants, la thérapie virale est limitée par des difficultés

associées à la production de quantités suffisantes de vecteurs, au tropisme virale, à

l'expression ectopique des gènes, à la méthode de livraison de tout le matériel virale et aux

défis immunologiques inhérents et aussi au jeune age des patients[127].

III.2.2.1.4. La thérapie génique non virale :

Cette technique permet d'introduire un transgène dans un tissu sans avoir recours à

un virus, et du coup, éviter la réponse immunitaire contre les protéines virales. Les vecteurs

non-viraux sont des plasmides d'ADN, produits dans des bactéries. Le premier essai

clinique de phase I chez des patients DMD, a été réalisé en 2004 [128], en injectant un

plasmide codant pour la dystrophine pleine longueur. Malheureusement, ces patients ont

montré peu de fibres musculaires exprimant la dystrophine. Donc, l'utilisation des

plasmides peut être une solution pour contourner le problème de la réponse immunitaire,

43

mais une entrave à la transfection de l'ADNc complet de la dystrophine dans les fibres

musculaires.

Afin d'améliorer la transfection des plasmides, plusieurs techniques ont été

développées. Des méthodes chimiques comme les lipoplexes et les polyplexes ont montré

de bons résultats mais elles se sont avérées toxiques et peu efficaces in vivo. Des méthodes

physiques comme l'électroporation, la sonoporation montrent de meilleurs résultats dans le

muscle que ce soit du point de vue de l'efficacité ou de la sécurité [129]. Cependant aucune

méthode physique n'a encore été explorée chez de grands animaux dans le cadre de la

DMD.

III.2.2.2. La thérapie cellulaire :

Le muscle squelettique est un tissu très dynamique, capable de s'auto-régénérer.

Cette capacité regenerative est due à la présence de population de cellules satellites.

D'ailleurs, les myoblastes, précédemment utilisés pour des essais de thérapie cellulaire pour

la DMD, sont produits par la prolifération de ces cellules.

Outre ces cellules satellites, il existe de nombreux autres types cellulaires qui

pourraient être utilisés pour des thérapies cellulaires dans le cadre de la DMD mais seules

les plus prometteuses sont abordées dans la présente thèse [130-133] (Figure 16 et 17).

44

r Ceflules souebes Cellules souches AC 133+

Ceflules souebes bêzDatopoiëtiques

Cellules souebes U t n é t t du muscle

CàpiBare

Mésoangjoblastrs

Figure 16 : Les origines possibles des principales cellules utilisées en thérapie cellulaire pour la DMD. Modifié de Farini et al. [134]

45

0 0 0 0 0 0 <3. <s? ^ ^ O i c ^ r - v ^ ^ r w i r m x r ê ,o „ OT( O_ O^ <

Ç # p CSMO Q Q cellale endothelial*

Q S p pericyte

t~0 j ■esoaagioMa.ste

C ^ cellule satellite quiescente

N ^ T p ceilmle satellite t» proliferation

O myofibroblaste

V # ~ ? ceilmle myogenique

noyaus myogénique

mouvement et fusion ceUulaire - ► facteurs d'actiration

flux sanguin

Figure 17 : Représentation schématique de la majorité des types cellulaires inclus dans la régénération du muscle squelettique. [135]. CSMO: cellule souche de la moelle osseuse.

46

III.2.2.2.1. Les cellules satellites :

Les muscles ont leurs propres cellules souches, les cellules satellites, qui se situent

entre la membrane basale et le sarcolemme de chaque fibre musculaire. Suite à un stress

oxydative ou un stimulus spécifique, ces cellules se différentient en myoblastes et

fusionnent les unes avec les autres pour donner des myotubes. Les myoblastes peuvent

aussi se fusionner avec les fibres musculaires déjà existantes pour assurer la réparation des

muscles.

Les cellules satellites expriment plusieurs marqueurs moléculaires, mais Pax7

«Paired-box transcription factors 7» joue un rôle crucial dans la persistance des cellules

satellites durant la vie post-natale [136]. Une population pure de cellules satellites fut isolée

directement du diaphragme des souris Pax7-GFP-KO [137]. Ces cellules ont restauré

l'expression de la dystrophine, 3 semaines après une injection intra-musculaire chez des

souris dystrophiques. De plus, chez une souris dystrophique irradiée, ces cellules ont

régénéré le stock des cellules satellites murines qui expriment en même temps Pax7 et Pax3

[137].

Récemment, une greffe de myofibres a pu restaurer le programme myogénique

après des dommages musculaires répétés, montrant que le pool de cellules satellites des

myofibres n'est pas seulement efficace pour réparer le muscle endommagé mais aussi pour

repeupler la niche de cellules satellites capables de s'activer lors d'un autre dommage

musculaire [138]. Cette étude met en évidence le fait que les cellules satellites isolées

mécaniquement et séparées de leurs myofibres, ont un bon succès de greffe et sont capables

de former de nouvelles myofibres suite à une injection intramusculaire; seulement 150

cellules satellites ont participé à la réparation de 10% de nouvelles fibres musculaires. Par

contre, les cellules satellites isolées par une digestion enzymatique sont 1000 fois moins

efficaces pour la formation des fibres musculaires après un dommage [138, 139].

La méthode d'isolation des cellules satellites est donc cruciale pour le succès de la

greffe et de la régénérescence. Quelques équipes ont montré l'efficacité de greffer une

dizaine de fibres sur la masse musculaire et sur la régénérescence des cellules souches

satellites du receveur.

47

III.2.2.2.2. Les myoblastes ou cellules myogéniques:

La transplantation des myoblastes est un traitement possible pour différentes

dystrophies musculaires. La première démonstration que la transplantation des myoblastes

peut restaurer l'expression de la dystrophine dans des fibres de souris dystrophique date de

1989 [1]. Ces résultats prometteurs ont déclenché rapidement une série d'essais cliniques

sur des patients DMD [140-144]. Pour ce type de thérapie, une biopsie musculaire est prise

d'une personne saine, les cellules satellites sont mises en culture. Les myoblastes résultant

de leur differentiation prolifèrent par la suite en quantité suffisante pour être transplantés

dans le muscle dystrophique. Ces myoblastes fusionnent entre eux et avec les fibres de

l'hôte, ceci entraîne la formation de fibres hybrides exprimant la dystrophine avec

restauration du CAD.

De nombreux immunosuppresseurs ont été utilisés lors de ces essais cliniques

comme la cyclophosphamide ou la cyclosporine mais des expériences ultérieures ont

démontré que ces substances anti-tumorales tuent les myoblastes et inhibent leur fusions,

respectivement [145, 146]. Les essais cliniques récents de l'équipe Tremblay montrent que

l'utilisation du Tacrolimus (FK506) comme immunosuppresseur permet d'obtenir un bon

succès de greffe de myoblastes (> 50 %). Cependant, l'utilisation prolongée du FK506 peut

entraîner une neurotoxité et une néphrotoxicité [147].

Malheureusement, ces essais cliniques font face à de nombreux autres obstacles qui

limitent le succès de l'approche [148]. Trois majeurs problèmes ont été identifiés par

l'équipe Tremblay. Des travaux sont en cours afin de les contourner et d'améliorer

l'efficacité de la transplantation de myoblastes [149, 150].

HI.2.2.2.2.1. La faible dispersion des myoblastes hors des sites d'injection:

Les myoblastes transplantés ne migrent pas plus que 200 pm du site de l'injection

intramusculaire. Cette capacité migratoire limitée nécessite l'exécution de trajectoires

d'injection très rapprochées augmentant ainsi les bris effectués au muscle transplanté [151].

D'autres solutions ont été testées in vivo sur des modèles murins dystrophiques, comme le

prétraitement des myoblastes avant leur transplantation par un inducteur des MMP.

48

Ce pré-traitement améliore la dispersion des myoblastes à travers la matrice

extracellulaire [152, 153]. De plus, une augmentation significative de la migration a été

observée suite à l'exposition de myoblastes à une lectine (la concanavaline A) avant la

transplantation. Cette molécule induit l'expression de différents MMP.

En se basant sur les recherches des cellules cancéreuses, il a été démontré que

certains facteurs de croissance peuvent aussi promouvoir la migration cellulaire. En entre

autre, l'IGF-1 (Insulin-like growth factor) et le MGF (Mechano-Growth Factor) ont

augmenté la capacité migratoire des myoblastes lors de leur co-injection intramusculaire

[154-156].

Finalement, l'exercice physique peut aussi améliorer le succès de la greffe de

myoblastes en augmentant la migration mais aussi la prolifération et la survie des cellules

transplantées via la libération de facteurs de croissance capables de réguler positivement le

système protéolytique [157].

111.2.2.2.2.2. la mort précoce des myoblastes :

Soixante quinze pourcents des myoblastes transplantés meurent dans les 3 premiers

jours après leur transplantation [158, 159]. Actuellement, cette mort rapide est compensée

par la transplantation d'un grand nombre de myoblastes (30 millions cellules par cm )

[151]. De nombreuses études tentent d'identifier les différents facteurs responsables de

cette mort précoce in vivo. La réponse inflammatoire médiée par les neutrophiles est une

des causes [160]. Le stress physique lors de la transplantation cellulaire active l'apoptose

médiée par les kinases de stress tel que l'extracellular signal-regulated protein kinases

(ERK) et la p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) [161]. La perte d'adhésion

cellulaire (anoïkis) est impliquée dans l'induction de l'apoptose post-greffe [162].

Finalement, le blocage de certains médiateurs inflammatoires comme le facteur de nécrose

tumorale-a (TNF-a) peut s'avérer bénéfique pour le régénérescence musculaire [163].

111.2.2.2.2.3. le rejet à moyen et long terme dû à la réponse immune spécifique :

Les recherches sont présentement dirigées vers la mise au point de méthodes pour le

développement d'une tolérance immunologique envers les cellules greffées [164]. C'est-à-

49

dire essayer d'induire une tolérance du receveur vis-à-vis les cellules du donneur. La

tolérance peut se faire de façon périphérique en modulant les lymphocytes des organes

lymphoïdes secondaires, ou centraux via le thymus où a lieu l'éducation lymphocytaire.

Des expériences chez la souris ont montré la formation d'un chimérisme hématopoïétique

chez la souris receveuse suite à une transplantation de moelle osseuse du donneur. Ce

chimérisme a permis la tolérance envers la transplantation des myoblastes provenant de ce

même donneur [165].

111.2.2.2.2. Les cellules souches dérivées du muscle ou MDSC (Muscle Derived

Stem Cell) :

Les MDSCs sont des cellules non-différenciées isolées à partir du muscle

squelettique et capables de se différencier en plusieurs types cellulaires myogéniques ou

non-myogéniques [166]. Leur isolation est basée sur la méthode du «pre-plating». Elles ont

par la suite été caractérisées par la cytometric en flux comme exprimant le CD34+ et le

Bcl2+. La transplantation intramusculaire de ce type de cellules chez le modèle murin de la

DMD a montré un grand potentiel de formation des myofibres positives pour la dystrophine

[167, 168].

111.2.2.2.3. Les cellules souches hématopoïétiques :

Cette population cellulaire forme les types cellulaires majeurs du système sanguin,

incluant les erythrocytes, les granulocytes et les lymphocytes [169]. La capacité de ces

cellules de régénérer le muscle squelettique a été démontrée pour la première fois par

injection intramusculaire [170]. L'injection intraveineuse de ces cellules souches a entraîné

une amélioration de la fonction locomotive ainsi que la régénération de 12% du muscle

[171]. Mais l'utilisation des cellules souches hématopoïétiques reste limitée à cause des

résultats in vivo peu concluants chez la souris mdx et du faible nombre de fibres

dystrophine positives formées chez les patients dystrophiques [172].

50

III.2.2.2.4. Les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules pluripotentes

induites (iPS):

Les ES sont des cellules souches pluripotentes, capables de régénérer plusieurs

types tissulaires. Elles dérivent de la masse cellulaire interne des blastocystes [173]. Elles

présentent l'avantage de pouvoir être cultivées in vitro longtemps sans se différencier. Elles

peuvent cependant se différentier en plusieurs types cellulaires en modulant l'expression de

différents facteurs de transcription. En fait, l'étape clé pour l'établissement du potentiel

médicale des ES est le développement d'une technique de conversion vers des précurseurs

appropriés pour la transplantation. Récemment, Barberi et al. [174] ont illustré la

progression du développement des ES vers une differentiation mésenchymateuse en isolant

des sous populations de cellules CD73+. La majorité de ces cellules isolées exprime MyoD,

se différentie in vitro en myotube et s'intégre dans les myofibres des souris SCID

immunodéficientes après injection in vivo.

Une étude en cour dans notre laboratoire montre une efficacité de conversion des

cellules ES en myoblastes en induisant l'expression de MyoD à l'aide d'un adenovirus. Des

études récentes ont décrit la dérivation d'une autre population cellulaire similaire à celle

des ES, les cellules souches pluripotentes inductibles (iPSCs), suite à l'induction de

l'expression de facteurs de transcription exprimés dans les ES (OCT3/4, KLF4, SOX2 et c-

Myc) [175]. Le développement d'une nouvelle thérapie cellulaire spécifique pour chaque

patient est limité par le potentiel oncogénique des iPS. La surexpression continue des

facteurs de transcription, spécialement celui du gène MYC, peut induire des tumeurs [175].

La reprogrammation des cellules par transduction virale est très efficace, mais

implique des insertions aléatoires des séquences d'ADN dans le génome humain. Plusieurs

nouvelles méthodes ont été développées récemment pour induire les iPS de façon plus

sécuritaire [176-178]. Bien que l'induction des souches pluripotentes puisse être obtenue

aussi avec le système de transposon amovible «PiggyBac» ou le système épisomique, ces

deux approches utilisent encore des constructions dADN. De ce fait, les lignées cellulaires

obtenues doivent être minutieusement analysées afin de confirmer qu'elles sont exemptes

de toutes modifications génétiques nuisibles.

Une méthode pour changer le destin des cellules sans utiliser l'ADN sera très

utile pour la médecine regenerative. Récemment, Plews et al. [179] démontrent que la

51

transfection d'ARNm peut être une approche utile pour contrôler à court terme et avec

précision le niveau d'expression des facteurs de la reprogrammation (synthèse de l'ARNm

codant pour OCT4, SOX2, c-Myc KLF4 et SV40) et induire une differentiation des cellules

somatiques en iPS.

111.2.2.2.5. Les cellules AC 133+ :

Les cellules CD 133+ sont considérées comme des cellules hématopoïétiques de la

moelle osseuse qui peuvent se différencier en cellules endothéliales et en myoblastes et

exprimer à leur surface des marqueurs myogéniques [149]. Des injections intramusculaires

et intra-artérielles faites chez des souris mdx immunodéficientes ont démontré que ces

cellules étaient capables de se fusionner avec les fibres musculaires de l'hôte en restaurant

l'expression de la dystrophine [180]. Des cellules AC 133+ isolées à partir de biopsie

musculaire expriment les mêmes capacités que celles issues du sang, avec un grand

potentiel de differentiation pour les lignées musculaires et endothéliales [181]. Un essai

clinique de phase I a été réalisé sur des patients DMD par injection intramusculaire des

cellules autologues CD133+. Aucune toxicité due à ces cellules ne fût détectée mais aucune

amélioration phénotypique ne fut retrouvée puisque ces cellules n'étaient pas modifiées

génétiquement [182].

Malgré leurs caractéristiques myogéniques intéressantes, l'efficacité de ces cellules

reste à démontrer dans d'autres essais cliniques, ce qui nécessite d'améliorer leur

prolifération in vitro.

111.2.2.2.6. Les mésoangioblastes :

Les mésoangioblastes sont des cellules progénitrices multipotentes, associées à

l'aorte dorsale, capables de générer tous les tissus qui dérivent du feuillet mésodermique.

Ils ont une grande capacité de s'auto renouveler in vitro [183]. Lors de leur injection dans

la circulation sanguine, les mésoangioblastes s'accumulent au niveau des capillaires mais

ne peuvent migrer à travers ceux-ci qu'en présence de facteurs chémoattractants [184]. Des

injections de mésoangioblastes, prétraités au TNFa, ont montré une amélioration

phénotypique des muscles chez la souris déficiente en a-sarcoglycane et chez le chien

dystrophique [131, 184]. Un essai clinique est en cours suite à ces résultats [185].

52

Cependant, il faudrat vérifier les effets secondaires des accumulations de ces cellules dans

différents organes vitaux.

III.2.2.2.7. Les pericytes :

Contrairement aux mésoangioblastes qui sont issus de vaisseaux sanguins

embryonnaires, les pericytes sont dérivés des vaisseaux sanguins de différents tissus [186].

Une étude a caractérisé ces cellules comme étant idéales pour une application dans une

thérapie cellulaire contre les dystrophies musculaires [132] et cela en se basant sur leurs

avantages. Premièrement, ces cellules sont facilement accessibles dans des tissus adipeux,

le pancréas et le placenta. Deuxièmement, elles présentent un fort pouvoir d'expansion in

vitro et peuvent être facilement transduites avec des vecteurs viraux. Finalement, elles sont

capables de transmigrer vers le muscle squelettique après injection dans la circulation

sanguine et de se différencier en cellules musculaires in vivo suite à un dommage [132].

Mais il reste à résoudre plusieurs problèmes comme la méthode d'injection pour des tissus

spécifiques.

III.2.2.3. La thérapie génétique ex vivo :

La combinaison de la thérapie génique et la thérapie cellulaire consiste à

l'administration de cellules (autologues ou non) modifiées génétiquement ex vivo afin

d'induire l'expression des transgènes thérapeutiques dans le muscle squelettique suite à leur

fusion avec les fibres musculaires existantes.

Loin d'être en concurrence avec les approches de thérapie génique directe (injection

de vecteurs thérapeutiques) ou pharmacogénétiques (AON synthétiques), cette approche se

veut complémentaire et vise à stimuler et renforcer le potentiel régénératif chez des patients

déjà installés dans le processus myopathique et présentant un tissu musculaire très

endommagé.

L'introduction du transgène dans les cellules représente le défi majeur de cette

thérapie : la modification génétique avec des lentivirus qui ont une capacité integrative, est

une des approches possibles. Récemment, les lentivirus ont été utilisés afin de délivrer le

gène de la micro-dystrophine dans des MDSCs obtenues de souris et de singe [187].

53

Des résultats de plusieurs études laissent entrevoir la possibilité d'une thérapie

cellulaire pour la DMD basée sur la transplantation de cellules souches autologues

modifiées génétiquement dont le cadre de lecture est restautré par saut d'exon de l'ARNm

de la dystrophine. Denti et al. ont généré des cellules autologues CD133+ exprimant la

dystrophine tronquée (saut des exon 49-50) mais fonctionnelle. Ces cellules, après leur

injection intramusculaire, sont capables de fusionner avec les fibres régénératives et

d'exprimer non seulement la dystrophine humaine fonctionnelle, mais aussi les protéines a-

et p-sarcoglycane associées [188].

L'approche du saut d'exon fut aussi abordée avec l'AAV. Un AAV1 codant pour le

gène U7 modifié pour permettre l'épissage de l'exon 23 de la dystrophine de souris a été

injecté à des souris mdx. L'expression de la dystrophine tronquée de l'exon 23 fut observée

jusqu'à 3 mois après l'injection [189] et même après 1 an et demi de l'injection [190].

Malgré ces résultats encourageants, cette approche doit être démontrée chez de plus grands

animaux.

Mais, étant donné que la transplantation intramusculaire reste une thérapie locale, ne

touchant pas tous les muscles dystrophiques, plusieurs études se focalisent sur l'injection

intra-artérielle de cellules autologues modifiées génétiquement. Il reste encore à étudier

l'impact de l'insertion du génome du vecteur thérapeutique sur le devenir des cellules

transduites et transplantées. Il faut entre autre étudier la possibilité qu'il y ait formation de

tumeurs.

La differentiation et transplantation des iPS du patient modifiées avec un

chromosome artificiel humain contenant tout le gène de la dystrophine (incluant non

seulement tous les exons mais aussi tous les introns) est une nouvelle approche

thérapeutique proposée récemment [191]. Des essais in vitro et in vivo sur des modèles

murins dystrophiques sont en cours dans notre laboratoire.

54

Chapitre IV : La Régulation De La Myogenèse Et De La DMD

Plusieurs équipes se sont attachées à définir le patron d'expression des protéines de

l'inflammation, de la myogenèse, de la matrice extracellulaire dans le muscle de DMD. Une

phase pré-symptomatique a déjà mis en évidence avec un patron d'expression des gènes très

différente de celle d'un muscle normal. Cette signature "dystrophique" est caractérisée par

l'induction de gènes impliqués dans la réponse inflammatoire, le remodelage de la matrice

extracellulaire et la régénération musculaire.

La myogenèse est un phénomène biologique qui conduit à la formation des tissus

musculaires lors du développement de l'embryon, décrit dans le chapitre I. Ce phénomène

fait intervenir les facteurs de croissance FGF (Fibroblast Growth Factor) et TGF, des

facteurs de transcription spécifiques du muscle (MRF) ainsi que les facteurs MEF (Myocyte

Enhance Factor). Dans ce chapitre, j 'ai développé que les MRF et les facteurs de

croissance qui ont fait l'objet de mon projet doctoral.

IV. 1. Les facteurs myogéniques MRF :

Les facteurs myogéniques appartiennent à la famille des facteurs de transcription à

motif bHLH (basic Helix-Loop-Helix) et activent la transcription de gènes cibles en se liant

directement sur une séquence consensus « CANNTG » de l'ADN, appelée boîte E [192,

193]. Cette séquence est retrouvée dans les promoteurs de nombreux gènes spécifiques aux

muscles, ce qui suggère une activation directe et indirecte de la transcription par les

facteurs myogéniques. Cette famille regroupe quatre facteurs: MyoD (Myoblast

Determination gene), Myf5 (Myogenic factor 5), Myogénine et MRF4 (Muscle Regulatory

Factor 4). Leurs domaines bHLH se complexent en homodimère, mais aussi en

hétérodimère, avec des co-facteurs ubiquitaires codés par les gènes E2-2 et E2-5. Durant

toute la myogenèse, ils agiront de concert avec les membres de la famille MEF2 pour

activer le programme de différenciation et induire la transcription des gènes de régulation et

des gènes structuraux spécifiques aux muscles.

55

IV. 1.1. La première découverte des gènes myogéniques :

Les gènes myogéniques constituent un bel exemple du mode de contrôle

qu'exercent les facteurs de transcription sur la differentiation progressive dans un linéage

cellulaire. Des études in vitro avec les lignées de fibroblastes appelées C3H 10T1/2 ont joué

un rôle central dans la dissection des mécanismes de contrôle de la transcription régulant la

myogenèse squelettique, étant donné la fréquence élevée avec laquelle ces cellules

devenaient des myotubes. Les protéines de la famille MyoD ont été décrites comme des

facteurs de détermination myogénique, à cause de leur capacité à induire un devenir

myogénique à des cellules non musculaires [194]. Une démarche similaire a mené à

l'identification de trois autres gènes, Myogénine, Myf5 et MRF4, qui interviennent aussi

dans le développement musculaire.

IV. 1.2. La cinétique d'expression des gènes myogéniques :

L'expression des gènes myogéniques est restreinte au muscle squelettique. Durant

toute la myogenèse, de nombreux signaux externes, positifs ou négatifs, influencent

l'activation spatio-temporelle de ces facteurs myogéniques, qui est déterminante pour

l'induction de la différenciation des cellules musculaires [193]. Chaque facteur myogénique

a un profil d'expression différent des autres au cours de la myogenèse, qui diffère

également entre les somites et les masses pré-musculaires des membres. En culture, ce

profil varie aussi selon la lignée musculaire [194]. In vitro, des taux élevés de transcrits

MyoD peuvent être détectés dans les myoblastes de certaines lignées cellulaires murines,

contrairement à d'autres, qui contiennent davantage de transcrits Myf5. La Myogénine est

toujours exprimée dans les cellules qui se différencient suivie d'une diminution progressive

de MyoD et Myf5. Les transcrits MRF4 s'accumulent uniquement dans les cultures en fin

de différenciation, quand les gènes de structure caractéristiques des fibres matures sont

activés [195] (Figure 18).

56

PROLIFERATION < >

DIFFERENTIATION < >

FUSION

Figure 18: Expression des facteurs myogéniques de la famille MyoD au cours de la myogenèse. MyoD et Myf5 induisent la spécification des myoblastes alors que la Myogénine et MRF4 sont importants pour la differentiation terminale [196],

TV. 1.3. Les protéines d'interaction agonistes et antagonistes :

Les facteurs myogéniques bHLH interagissent avec de nombreuses protéines, qui régulent positivement ou négativement la transcription des gènes spécifiques aux muscles et par conséquent F activation ou non de la différenciation des cellules musculaires. Les protéines agonistes non myogéniques E12 et E47 s'associent en hétérodimères avec les facteurs myogéniques, renforcent leur liaison à l'ADN sur la boîte E, et activent ainsi la transcription de gènes spécifiques aux muscles. D'autres co-régulateurs spécifiques aux muscles, comme la famille MEF2, activent la transcription de d'autres gènes [197]. D'autres protéines interagissent avec les facteurs myogéniques, comme la protéine MLP (Muscle LIM Protein), qui n'a pas d'activité transcriptionnelle mais qui favorise la fixation des hétérodimères MyoD/E47 à l'ADN, ou encore le co-activateur p300/CBP qui augmente l'activité transcriptionnelle de MyoD et MEF2C [198,199] (Figure 19).

Par contre, les protéines antagonistes exercent leur activité en se complexant directement avec les facteurs myogéniques ou les co-activateurs, et empêchent leur liaison à l'ADN [193] (Figure 19). Ainsi, la protéine Id (Inhibitor of DNA-Binding), contenant le motif de dimérisation bHLH, forme des hétérodimères avec les facteurs myogéniques et avec les protéines E12 et E47 qui ne pourront ainsi se fixer à l'ADN. La protéine Twist agit également en séquestrant les produits du gène E2A grâce à son motif bHLH, ou par interaction directe avec MEF2 ou MyoD. Enfin, la protéine I-mfa (Inhibitor of MyoD family) retient les facteurs myogéniques dans le cytoplasme en masquant leur site de localisation nucléaire.

57

Les membres de la famille Jun, dont v-Jun, c-Jun et JunB, peuvent devenir aussi des

inhibiteurs de la myogenèse quand ils sont surexprimés dans les cellules musculaires.

Certains auteurs pensent que c-Jun interagit directement avec MyoD pour former un

hétérodimère inactif et d'autres pensent qu'il inhibe indirectement l'action de MyoD en

séquestrant le facteur co-activateur p300 pendant les stades de prolifération des myoblastes.

Daury et al. ont montré que les fonctions de c-Jun sont différentes selon la nature des

protéines avec lesquelles il coopère et qu'il peut ainsi être impliqué dans la stimulation ou

la répression de la différenciation [200].

MyoD

Régulateurs positifs par interaction directe

Domaine C -terminale

Régulateurs négatifs par interaction directe

Figure 19: Représentation schématique de quelques régulateurs positifs et négatifs de MyoD, par des mécanismes d'interaction directe ou indirecte. Régions distinctes de MyoD qui ont été décrites comme s'associant avec des protéines activatrices, représentées en rouge, ou avec des protéines inhibitrices, représentées en bleue. MyoD peut être considéré comme représentatif des autres facteurs myogéniques, même si quelques unes de ces interactions n'ont pas été décrites pour la Myogénine, Myf5 et MRF4. (D'après Puri et al. [193]).

IV. 1.4. Cycle cellulaire et les facteurs myogéniques :

De nombreux travaux ont mis en évidence le lien étroit existant entre le cycle

cellulaire et le programme de différenciation des myoblastes.

Les différents états transitoires du cycle cellulaire sont contrôlés par les complexes

cyclines/kinases cycline-dépendantes (Cdks), par l'état de phosphorylation de la protéine

Rb, codée par le gène de susceptibilité au rétinoblastome, et par l'état d'activation des

facteurs de transcription de la famille E2F. Ainsi, en phase G le facteur E2F est maintenu à

l'état inactif par la forme hypo-phosphorylée de Rb, et le passage en phase S est lié à sa

phosphorylation par les cyclines D/Cdks4, 6 et les cyclines E/Cdk2 qui libèrent E2F et

58

l'activent. L'arrêt de la prolifération est induit par des inhibiteurs des kinases cycline-

dépendantes (CKIs) des familles pi6 et p21.

Dans les cellules myogéniques, les MRF et les protéines du cycle cellulaire

contrôlent mutuellement leur expression et leur activité. Ainsi, les CKIs agissent

parallèlement à la myogénine pour contrôler la différenciation des myoblastes [201], et

MyoD induit l'expression de p21. Novitch et al. [202] ont, quant à eux, montré

l'implication de Rb dans la différenciation des myoblastes en réponse à son activation par

MyoD (Figure 20).

Differentiation IGF-I TGF-0

Activation V NitricOxkJe

HGF

Prolifération HGF IGF-I IL-6 cytokines FGF

D

Figure 20 : Représentation schématique des facteurs myogéniques et de croissance régulant la progression du cycle cellulaire des cellules myogéniques. Les cellules myogéniques au repos (GO) sont activées, prolifèrent et, finalement, se différencient pour produire de nouvelles fibres musculaires. D'après Hawke et al. [203].

59

IV.2. Les facteurs de croissance :

Une variété de facteurs extracellulaires régule aussi la transcription des MRF et

ainsi module les différents stades de développement du muscle squelettique, de la

détermination des précurseurs myogéniques jusqu'à leur différenciation et la formation des

fibres musculaires. Ces facteurs, exprimés dans les régions axiales et latérales de l'embryon

en développement, sont importants pour la formation des somites et la détermination des

différentes lignées de cellules musculaires, à savoir, les lignées myogéniques épaxiales et

hypaxiales. Les facteurs ainsi sécrétés, sont, entre autres, les Wnts, les IGFs, les FGFs et les

molécules de la superfamille des TGF-p\ Tous ces facteurs régulent la détermination et la

différenciation myogénique (Figure 21). Dans la présente thèse, je n'ai détaillé que trois

grandes familles de facteurs de croissance, qui jouent un rôle crucial dans la promotion de

la myogenèse: la famille de l'Insuline et des IGFs, la famille des FGFs et la famille des

TGF-Ps.

60

- ^ Ê M ^ ^ m - ^ ^ Ê M ^ ^ ^ — ^ ^ Ê M ^ ^

M y o fibre tnult inucU immature

Figure 21: Les facteurs de croissances régulent la myogenèse et l'expression des facteurs myogéniques. Après un stress oxydatif ou un dommage (A), les cellules satellites quiescentes sont activées par le HGF et entrent dans un cycle de division asymétrique (B) et de prolifération (C). Les cellules satellites activées se caractérisent par l'expression de Pax7, MyoD et Myf5. La differentiation partielle est marquée par la diminution de l'expression de Pax7 et l'augmentation de l'expression de MRF4 et de Myogénine. Les myoblastes différentiés (D) fusionnent avec les fibres musculaires endommagées ou bien forment des nouvelles fibres multinuclées. Finalement, les cellules satellite centro-nuclées migrent vers la position sarcolemique des myofibres (E). Après activation, les cellules satellites retournent à leur stade quiescent afin de régénérer le stock des cellules satellites (F). SCa, cellule satellite activée; SCq, cellule satellite quiescente; MB, myoblaste; N, noyaux. D'après Broek el al. [204].

IV.2.1. Famille des Insuline et Insulin-like Growth Factors (IGFs) :

L'insuline, IGF-I et IGF-II sont des régulateurs du programme de différenciation myogénique, dont l'expression, et celle de leurs récepteurs, sont détectées très tôt dans l'embryogenèse, au niveau du tube neural et du mésoderme paraxial. Mais, 1TGF-1 a un effet positif plus important sur la prolifération des cellules satellites, la differentiation des myoblastes et leur fusion en myotubes [205-207], ce qui accroît la croissance du muscle squelettique. En effet, la croissance musculaire est régulée par de nombreux mécanismes. Premièrement, l'addition des nouveaux myofibres aux fibres en régénérescence cause une

61

expansion de la masse tissulaire. Deuxièmement, l'augmentation des taux protéiques dans

les tissus musculaires, à travers la régulation positive des voies de signalisation de la

synthèse protéique, active une réponse hypertrophique. Finalement, la régulation négative

des voies d'atrophie myogénique permet le maintien de la masse musculaire squelettique.

Ces trois branches de signalisation sont activées par la surexpression de 1TGF-1, et cela,

par deux cascades de signalisation intracellulaire : la voie des MAP-kinases (mitogen-

activatedprotein) et la voie PI3-kinase (phosphatidyl-inositol 3) [208]. L'action stimulante

d'IGF-I sur la prolifération des myoblastes, est associée à une inhibition de l'expression de

la Myogénine. Par conséquent, l'induction de la différenciation, débutera par la levée de

cette inhibition mais aussi par une diminution de l'expression de Myf5 (Figure 22).

La surexpression de 1TGF-1 humain chez des souris transgéniques induit une

hypertrophie des myotubes lors du développement du muscle squelettique [209]. De plus,

l'injection directe de 1TGF-1 augmente la régénération musculaire [210], alors que la

deletion des gènes codant pour 1TGF-I, 1TGF-II et les récepteurs de 1TGF, conduit à une

diminution de la masse musculaire associée à des troubles du développement [206]. In

vitro, l'ajout d'IGF-I sur des myoblastes en culture, provoque une augmentation de leur

activité mitotique, suivie de l'induction de leur programme de différenciation [208]. Cet

effet passe par une altération du niveau d'expression des transcrits de la Myogénine, du

MRF4, du Myf5, du p21 et de certaines cyclines. Dans notre laboratoire, une étude a

montré que l'injection d'un peptide dérivé de 1TGF-1 augmente le succès de la

transplantation des myoblastes chez des souris immunodéficientes [211].

62

Dégradation des proteins s

Augmentation delà croissance musculaire squelettique Figure 22 : Représentation schématique des principales protéines impliquées dans les voies de signalisation de 1TGF-1 pour équilibrer la croissance du muscle squelettique. IGFBP: Insulin like Growth Factor Binding Protein, IGF : Insulin like Growth Factor, IGFR : Insulin like Growth Factor Receptor, IRS1 : Insulin Receptor Substrate 1, MAPK : Mitogen Activated Protein Kinase, PI3K : Phosphoinositide-3-kinase, PKB/Akt : Protein Kinase B, mTOR : mammalian target of rapamycin, GSK3-P : Glycogen Synthase Kinase-P, Foxo : Forkhead Box, NFATc2 : Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 2, IL 13 : Interleukin 13, MuRFl : Muscle-specific RING finger protein 1, MAFbx : Muscle Atrophy F-box. Flèche bleue : effet stimulateur, flèche rouge : effet inhibiteur. D'après Otto et al. [205]

IV.2.2. Famille des Fibroblast Growth Factors (FGFs) :

Les FGFs sont des facteurs solubles séquestrés dans la matrice extracellulaire, liés à

des protéoglycannes héparane-sulfate, jusqu'à leur utilisation locale.

Le facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) est un des membres de

cette famille le plus largement distribué et également le plus compétent pour

l'augmentation de la prolifération des cellules myogéniques et l'inhibition de leur

différenciation terminale [212]. Ce puissant effet inhibiteur sur la différenciation des

63

cellules myogéniques, passe par la répression de l'expression des marqueurs tardifs de la

différenciation et par le contrôle de l'activité des facteurs myogéniques [213], en induisant

leur activation par des protéines kinases AMPc dépendantes et par des protéines kinases C.

L'implication du bFGF dans la régénérescence musculaire est démontrée par la

réduction du nombre et de la taille des fibres musculaires lors de l'administration d'un

anticorps neutralisant contre le bFGF aux animaux, immédiatement après un dommage

musculaire [214, 215]. De plus, l'injection intramusculaire de bFGF à des souris mdx

améliore la prolifération des cellules satellites et la régénération en général. Par contre,

l'injection de bFGF à des souris normales n'améliore pas la réparation du muscle [216].

Cela suggère que le bFGF n'est pas un facteur limitant de la régénérescence dans des

conditions normales.

Dans le cadre de la transplantation cellulaire, le traitement des cellules myogéniques

murines ou humaines en culture avec du bFGF a permis de quadrupler ou de doubler le

nombre des fibres exprimant la dystrophine dans des souris mdx et SCID, respectivement

[124, 294]. De plus, il a été démontré que le bFGF favorise la motilité des myoblastes

murins in vitro et in vivo [217-219].

IV.2.3. La superfamille des TGF-fis :

Plusieurs membres ont été identifiés dans la superfamille des TGF-Ps. Tous ces

facteurs sont sécrétés par la cellule et exercent une action autocrine, paracrine ou endocrine

dans divers processus allant du développement embryonnaire et de la régulation de

l'homéostasie jusqu'à la guérison des plaies. Récemment, ces membres ont été subdivisés

en quatre sous-familles majeures : les TGF-p, les Activines/Inhibines, les protéines

morphogénétiques osseuses (BMP) / les facteurs de croissance et differentiation (GDF) et

les GDFN.

Ces différents facteurs sont regroupés sur la base de leur homologie de séquence et

sur la spécificité de la voie de signalisation qu'ils activent (Figure 23).

64

BMP*/ GDFs

Figure 23 : La superfamille des TGF-p. Sur la base de leurs caractéristiques structurales, les 35 membres de la superfamille des TGF-P sont subdivisés en (1) TGF-Ps, (2) activinesdnhibines, (3) les protéines morphogénétiques osseuses (BMP), les facteurs de croissance et de différenciation (GDF) et (4) le groupe le plus éloigné de ligands GDNF [220].

Ces ligands partagent un grand nombre de récepteurs, dont les arrangements induisent différentes voies de signalisation et jouent un rôle très important dans les stades précoces de l'embryogenèse et dans le maintien de l'homéostasie des tissus adultes, en régulant la croissance et la différenciation cellulaires, ainsi que l'apoptose et la dégradation protéique [221].

Dans ce chapitre, j'ai décrit, de manière générale, les caractéristiques de cette superfamille, en détaillant plus particulièrement, les TGF-ps, les activines, les BMPs.

Je me suis intéressée plus particulièrement à la myostatine (ou GDF-8), un ligand appartenant à la famille des activines, étant donné que la majorité de mon projet doctoral se base principalement sur l'inhibition de sa signalisation.

65

IV.2.3.1 Structure générale des ligands de la superfamille des TGF-Ps :

Les différents membres de la superfamille des TGF-/3s partagent plusieurs

caractéristiques structurales :

• Un groupement d'acides aminés hydrophobes dans la partie N-terminale qui

constitue le signal de sécrétion.

• Une séquence consensus RXXR dans la partie C-terminale qui permet de libérer la

partie bio-active de la protéine précurseur.

• Dans la partie C-terminale, six à neuf résidus cysteines très conservés en nombre et

en positionnement dans la séquence, qui forment des ponts disulfides inter et intra

chaînes, et qui facilitent la formation d'un « corps cysteine ».

Deux sites de clivage sont donc présents et nécessaires pour la libération de la

protéine active. Le premier permet l'élimination du peptide signal et la libération de la

protéine précurseur dans la lumière du reticulum endoplasmique. Chaque membre de cette

famille est en effet libéré sous forme d'une protéine précurseur inactive (LAP) caractérisée

par un pro-domaine et une partie bio-active proprement dite. Le deuxième clivage, réalisé

par des proteases de la famille des subtilisines telle que la furine, a lieu dans l'appareil de

Golgi, après la dimérisation de la protéine mature. Le pro-domaine représente environ 70%

du LAP et possède plusieurs fonctions importantes. Il a un rôle majeur dans le repliement et

la dimérisation de la protéine, mais aussi dans le transport de la protéine active sécrétée

(Figure 24).

66

1

I

1

X

9

La myostatine. synthétisée sous forme d'un précurseur, subit deux clivages protéolytiques (flèches noires): l'un permet la libération du peptide signal (en bleu), l'autre génère le fragment C-termmal (en vert), qui possède 1 activité biologique et l'activité de liaison au récepteur.

Suite au second clivage protéolytique. le propeptide (en rose), et le dimère C-terminal hé par un pont di-sulfure (en gris), restent liés de manière non covalente. et forment un complexe latent.

La forme latente de la myostatine peut être activée par certaines inëtalloprotéinases de la famille des BMP-1 tolloid. qui clivent le propeptide, provoquant la dissociation du complexe latent propeptide dimère actif.

Le dimère C-terminal libéré devient actif, et peut se fixer sur le récepteur afin d'activer une cascade de visualisation intracellulaire.

Figure 24: Représentation schématique de la biosynthèse de la myostatine, un membre de la superfamille des TGF-p [222].

IV.2.3.2. Les ligands de la sous-famille des TGF-p/Activines/Nodal :

IV.2.3.2.1.LesTGF-ps:

Chez les mammifères, trois isoformes sont répertoriées: TGF-pi, TGF-p2, TGF-P3,

et deux autres sont décrits mais uniquement chez le poulet et le xénope: TGF-P4 et TGF-

P5, respectivement [223].

In vivo, les TGF-P 1, -p2, -P3 sont potentiellement impliqués dans le développement

myogénique du tube neural [224] avec une régulation spatio-temporelle caractérisée par

67

une forte expression de ces trois facteurs pendant la prolifération mais aussi pendant la

différenciation, à l'exception de TGF-P 1. Les TGF-Ps sont en fait des inhibiteurs de la

différenciation myogénique. Ils bloquent de nombreuses étapes comme la fusion,

l'augmentation de l'activité de la CK ou encore, l'accumulation des protéines spécifiques

du muscle. Cette inhibition est réversible si l'on retire ces facteurs du milieu, et comme

pour les FGFs, les cellules différenciées ne répondent plus à leur stimulation à cause d'une

diminution du nombre de récepteurs de surface et de l'affinité des ligands pour ces

récepteurs.

Les mécanismes par lesquels les TGF-Ps inhibent la différenciation, passent par

l'induction ou la répression de l'expression des protéines du cycle cellulaire, ou par

l'induction des proto-oncogènes c-fos, c-jun et JunB. Les TGF-Ps inhibent aussi

l'expression des MRF, et notamment l'activité du MEF2 en le séquestrant dans le

cytoplasme.

Les TGF-Ps peuvent induire et stimuler la myogenèse dans les somites en

s'associant à d'autres facteurs de croissance. Stern et al [224] ont montré que TGF-P 1, en

plus du bFGF, induit la myogenèse du mésoderme paraxial, soit en augmentant la

prolifération des myoblastes, soit en favorisant leur survie. Pirskanen et al. [225] ont

montré une action de ces deux facteurs avec l'Insuline et les IGFs sur l'induction de la

myogenèse dans les somites, la prolifération des cellules et l'inhibition de l'apoptose.

Le TGF-P 1 est la cytokine la plus impliquée dans les mécanismes d'inflammation et

dans la fibrose musculaire qui participent au développement des symptômes de la

dystrophie musculaire [62]. L'expression du TGF-P 1 dans le diaphragme de la souris est

élevée à 6 et 9 semaines de façon corrélée au collagène I mais se normalise qu'à 12

semaines. L'adjonction de décorine fait diminuer la fibrose de 40% confirmant le rôle du

TGF-p dans la constitution de la fibrose et l'effet anti fibrose de la décorine [226].

68

Le stress mécanique engendré par les contractions musculaires peut être générateur

de fibrose, favorisant l'activation du TGF-P 1 via la signalisation Smad 2/3 et son action sur

la matrice extracellulaire [227]. Le stress mécanique produit un signal moléculaire qui

permet la differentiation des myofibroblastes et l'expression de l'actine-a musculaire lisse

(a-SMA), marqueur des cellules fibrogéniques.

En plus, le TGF-P 1 est reconnu pour être un facteur de croissance qui inhibe la

prolifération des cellules épithéliales, immunitaires, endothéliales et myogéniques, causant

l'arrêt du cycle cellulaire dans la phase Gl. Le TGF-P 1 stimule, entre autre, la transcription

des gènes pi5 et p21 qui sont des CKI. L'activation de pi5 favorise aussi la liaison du p27

à d'autres complexes cdk/cyclines bloquant ainsi le cycle cellulaire. D'autre part, le TGF-

Pl bloque la transcription du proto-oncogène c-Myc, ce qui empêche aussi la prolifération

de plusieurs types cellulaire. Les effets que TGF-P 1 sur les fibroblastes sont inverses. En

effet, le TGF-p 1 est un activateur puissant des processus de migration et de prolifération

chez les fibroblastes.

Étant donné ses effets, le TGF-P est une cible thérapeutique pour plusieurs

maladies, entre autres, la DMD. L'inhibition du TGF-P par des anticorps antagonistes ou

des drogues comme le losartan ou la suramine montre des effets bénéfiques sur les muscles

des souris mdx [228] (Figure 25). Ces effets incluent une amélioration de 1'histopathologic

du muscle, la diminution de la fibrose et l'augmentation du nombre et de la force des

myofibres.

Mkrofirxes Mutant

T.txHirvl

MyoWaste

J>SMAD2/S

" Fibre musculaire

~gf~> Regeneration

Necrose

Figure 25 : L'augmentation de l'activité du TGF-P 1 inhibe la régénération musculaire par le blocage de l'activation des cellules satellites. Le blocage du signal du TGF-P 1 peut se faire par le losartan. D'après Chambelain et al. [229].

69

IV.2.3.2.2. Les Activines :

Les Activines sont des facteurs de croissance et de différenciation produits par de

nombreux types cellulaires et de multiples tissus, sur lesquels ils agissent également [230].

Elles ont été identifiées comme des protéines régulant l'action de la FSH (Follicule-

Stimulating Hormone) dans les gonades, mais sont aussi impliquées dans d'autres

processus biologiques : la survie des cellules neuronales, l'induction du mésoderme dans

les embryons de Xénope et l'ostéogenèse. La capacité des Activines à exercer ces diverses

fonctions est liée à leur capacité à stimuler et à réprimer l'expression de nombreux gènes, à

leur effet prolifératif et anti-prolifératif, et aussi à leur activité de différenciation cellulaire.

Cette famille est constituée de trois activines, les activines -A, -B et -AB résultants de la

dimérisation de deux monomères, BA et BB, reliés par un pont disulfure. Ces deux sous

unités sont exprimées chez l'embryon et chez l'adulte.

Les Inhibines sont des protéines antagonistes des activines. Ce sont des

hétérodimères constitués de 2 sous unité a associées à /?A (inhibine A) ou à BB (inhibine

B), reliées elles aussi par un pont disulfure.

L'effet de l'inhibition de l'activine est étudié récemment sur différentes maladies et

représente une nouvelle cible thérapeutique pour la DMD et pour le contrôle de la masse

musculaire, outre que la myostatine et le TGF-P.

IV.2.3.3. Les ligands de la sous famille BMP/GDF :

IV.2.3.3.1. Les BMPs:

La famille des BMPs comprend plus de trente membres. Ce sont des protéines

sécrétées, identifiées dans la formation et la régulation du tissu osseux, mais qui présentent

d'autres fonctions importantes pendant le développement de l'embryon. Elles ont des rôles

déterminants dans l'induction des interactions pendant l'embryogenèse chez les vertébrés et

les invertébrés.

Dans la myogenèse, le plus étudié est BMP4. Il est exprimé dans le tube neural et

inhibe le développement du myotome [231]. Il réprime l'activation des facteurs

myogéniques et maintient l'expression du gène Pax3 qui lui réprime la différenciation des

myoblastes au cours de leur migration. Plus récemment, GDF-11 (ou BMP 11) est identifié

70

et intervient dans la régulation de la mise en place du squelette axial [232] en inhibant

l'expression de Pax3 et de MyoD. Ce facteur présente 90% d'homologie de séquence avec

la myostatine.

La majorité des BMP se trouve dans la circulation sanguine sauf quelques uns

sélectifs pour des tissus (par exemple : l'expression du BMP-10 est restreinte pour le cœur)

[233]. Différents antagonistes des BMPs, comme Noggin, dorsomorphine et leur dérivée

LDN, sont utilisés afin de réprimer la signalisation des BMPs in vivo [234, 235]. Ce qui

suggère l'utilisation de l'un de ces antagonistes comme un éventuel traitement pour des

maladies où la signalisation des BMPs est dérégulée, entre autres la DMD [236].

Toute fois, plusieurs questions importantes doivent être adressées avant d'envisager

une utilisation thérapeutique des antagonistes des BMPs. Premièrement, il faut déterminer

le rôle potentiel de la signalisation des BMPs dans des muscles normaux et dystrophiques.

Il a été décrit que la signalisation des BMPs est activée dans des cellules satellites

quiescentes et réprimée dès l'activation des ces cellules suite à un dommage musculaire,

suggérant un rôle dans la régulation de la prolifération des cellules satellites [237] [238,

239]. Deuxièmement, l'effet de traitement à long terme des inhibiteurs des BMPs n'est pas

bien étudié et peut présenter des effets secondaires. Finalement, les cascades de

signalisation additionnelles, comme celle de la myostatine ou des TGF-P, jouent aussi un

rôle important dans la pathologie de la DMD et ca sera important de déterminer l'effet

additif ou synergique du ciblage de multiples voies de signalisation.

IV.2.3.3.2. La myostatine (GDF-8) :

La myostatine est un membre très étudié de la superfamille des TGF-/J, décrite pour

la première fois en 1997 par McPherron et al. [222]. Elle joue un rôle prépondérant dans la

régulation négative de la croissance musculaire. Son inactivation, naturelle ou

expérimentale, provoque une augmentation du poids des animaux liée spécifiquement à une

augmentation de leur masse en muscle squelettique (qui peut atteindre plus 200 à 300 %) et

aussi de leur force absolue et parfois spécifique. Par contre, sa sur-expression provoque une

atrophie musculaire.

L'étude de la myostatine, et plus particulièrement sa voie de signalisation, est

appliquée sur plusieurs myopathies comme la DMD (Figure 26).

71

I m souris KO LsȎ i&Phmp* 1999

Le boruf bclgian Blue L'homme

truite arc-en-ciel h:ei;

Figure 26: l'effet de l'inhibition de l'expression de la myostatine chez des modèles animaux et humains. Le gène de la myostatine chez les souris KO et la truite arc-en-ciel est muté afin d'inhiber l'expression de la myostatine. Le bœuf Belgian Blue, le chien et l'homme représentent des modèles dont la mutation est spontanée. Modifiée de Lee et al. [240].

IV.2.3.3.2.1. Conservation de la séquence peptidique :

Chez l'homme [241, 242] et le bovin [243], le gène codant pour la myostatine est localisé sur le chromosome 2, tandis que chez le porc [244] et la souris [245], il se situe sur les chromosomes 15 et 1, respectivement. Ce gène, en général, est constitué de trois exons et deux introns [246], l'exon 3 codant pour le domaine bioactif de la protéine mature (Figure 27).

La forte conservation de la séquence de la myostatine à travers les espèces suggère que la fonction de la myostatine est aussi conservée et qu'elle joue un rôle primordial dans la croissance musculaire à un stade embryonnaire, néonatale qu'adulte.

72

1 24 25 375

ss Propeptide Partie mature

373 374 7*7 .748 1128 2 1 » 2 5 »

Exon 1 -//- Exon 2 -//- Exon 3 3*UTR

Figure 27: représentation schématique du gène de la myostatine et de sa protéine. Le shéma décrit la structure de la myostatine incluant la séquence signal (S S), les régions du propeptide et la protéine mature. Le gène est représenté en bas, avec des chiffres ci-dessus indiquant la position des acides aminés. D'après Nishiyama et al. [247].

IV.2.3.3.2.2. Expression spatio-temporelle, in vivo :

La myostatine est détectée très tôt au cours du développement fœtal, dès 9.5 jours

post-coitum chez la souris, dans les cellules précurseurs myogéniques, au niveau du

compartiment myotomal des somites [222]. Chez le bovin, elle est faiblement détectée à 16

jours de gestation puis son expression augmente dès 30 jours de vie fœtale [248]. À des

stades plus tardifs du développement et à l'âge adulte, les premières études montraient une

expression restreinte dans les muscles squelettiques, et pratiquement indétectables dans les

autres tissus [222]. Cependant d'autres auteurs ont observé une faible expression de la

myostatine dans les myocytes cardiaques de mouton et de souris, particulièrement après un

infarctus du myocarde [249], dans les glandes mammaires de truie en lactation [250], dans

le tissu adipeux de souris [222], ainsi que dans le cerveau et le tissu ovarien [251]. Chez la

souris, l'expression des transcrits de myostatine a été détectée dans les fibres musculaires

rapides de type II du muscle Gastrocnemius [252], alors que chez le rat et l'homme, elle est

localisée dans tous les types de fibres [253].

Généralement, le muscle squelettique produit la myostatine sous une forme inactive

qui subit différents clivages comme la majorité des membres de la superfamille des TGF-P

pour être ensuite larguée systémiquement dans la circulation [254]. Mais la réponse

spécifique au muscle murin suite à la deletion du gène de la myostatine suggère qu'une

action locale autocrineparacrine de la myostatine peut être prédominante [222, 255]. Une

73

fois sécrétée, la myostatine reste sous sa forme latente qui peut former des complexes avec

de nombreuses protéines régulatrices différentes incluant son propre propeptide, la

follistatine, le gène relié à la follistatine (FLRG) et le GASP-1 (differentiation factor

associeted serum protein-1) [256-258]. Plus que 70% de la myostatine circulante se lie à

son propeptide. De plus, GASP-1 peut se lier au domaine du propeptide de la myostatine,

suggérant un control positif de la régulation extracellulaire de la myostatine. Un dernier

clivage de ces complexes latents est nécessaire afin de libérer une myostatine

biologiquement active. Il est démontré qu'une famille des MMP, BMP-1/TLD (Bone

morphogenetic protein- 1/Tolloid) est capable de cliver le propeptide dans ce complexe

latent au niveau de l'aspartate 76 et libérer de ce fait la myostatine active [259].

IV.2.3.3.2.3. La myostatine et la myogenèse :

Durant la myogenèse fœtale primaire et secondaire, les cellules satellites

myogéniques expriment le récepteur de l'activine et répondent, par conséquent, à la

signalisation de la myostatine. La perte subséquente de ce récepteur dans les embryons

myostatine -/- induit une augmentation importante du nombre des cellules satellites durant

les phases myogéniques primaires et aussi une augmentation de la formation des myofibres

squelettiques durant la phase myogénique secondaire [260-262]. Par contre, les cellules

satellites du muscle squelettique post-natal répriment l'expression du récepteur de

l'activine, ce qui bloque l'action de la myostatine sur leur prolifération et leur

differentiation. Du coup, l'inhibition expérimentale post natale de la myostatine n'affecte

pas la population des cellules satellites et n'induit que l'augmentation de la taille des

muscles squelettiques (hypertrophie musculaire) sans augmentation de l'accumulation

nucléaire (hyperplasie musculaire) [262-264].

L'action inhibitrice de la myostatine est également accompagnée d'une dérégulation

des MRFs. Les études in vitro, réalisées essentiellement dans des cellules C2C12, montrent

que la surexpression ou l'administration ectopique de la myostatine cause une diminution

dramatique de leur prolifération et differentiation par le biais de la régulation positive du

taux intracellulaire du facteur de transcription p21 et de la régulation négative du taux

intracellulaire et de l'activité de Cdk2 [265, 266], laissant penser que la myostatine peut

affecter les myoblastes in vivo de la même manière (Figure 28). En effet, les analyses en

74

cytometric en flux des myoblastes traités avec la myostatine montrent une accumulation de

cellules en phase GfXjl et en phase G2 du cycle cellulaire, ce qui diminue le nombre des

cellules en phase S du cycle [267].

L'influence négative de la myostatine sur la differentiation des myoblastes est

accompagnée par la répression du niveau d'expression protéique de la Myogénine, de

MyoD et de Myf5 [267, 268]. Toutefois, l'expression de la myostatine pourrait aussi être

régulée par les cytokines et les facteurs de croissance, comme 1TGF-1, puisque des

séquences consensus de fixation de ces éléments ont été détectées dans la région promotrice

du gène bovin [246].

"Â Myogénine

z* MvoD A Proliferation ^ jM W Differentiation

écurseurs . . , , » ../& ^ w ui Myoblastes R b " « ^Myoblastes

Précurseurs

Présence de la myostatine

B

■*► p21 — Cdk2

Myogénine

I MvoD A Proliferation Zf* \W 4 f Differentiation Î4t* A ' Myf$

Précurseurs Myofi! k i» ̂ s» Rb V L ^ ^ Myotubes > Myoblastes

Absence de y ^ ^ . L x , „ X m P21 — COU la myostatine ' '

Figure 28: inhibition de la prolifération des cellules musculaires par la myostatine. In vitro, la myostatine recombinante, ajoutée au milieu de culture des myoblastes C2C12, augmente l'expression du facteur de transcription p21, ce qui provoque une diminution du taux intracellulaire et de l'activité de Cdk2 avec hypo-phosphorylation de Rb. En conséquence, la prolifération reste bloquée en phase Gl, et peu de myotubes se forment (A). En l'absence de myostatine fonctionnelle, les protéines Rb sont dans un état hyper-phosphorylé, ce qui provoque une prolifération exacerbée des myoblastes et une augmentation du nombre des fibres musculaires (B) [266].

75

IV.2.3.3.2.4. La myostatine dans le processus de régénération musculaire :

Une surexpression de la myostatine est observée dans les processus de régénération

musculaire, comme par exemple, au niveau des myocytes cardiaques bordant la région d'un

infarctus [249], et aussi dans les zones de lésion du tissu musculaire squelettique [269].

L'action inhibitrice de la myostatine sur la prolifération et/ou la différenciation des cellules

satellites joue un rôle important dans le processus de régénération, en contrebalançant

l'action activatrice de 1TGF-1 et du bFGF.

De plus, la myostatine a un effet sur la distribution de types des fibres et les études

in vivo sur les muscles rapides et lents de référence (EDL «Extensor digitorum longus» et le

soléaire respectivement) montre une augmentation de poids du muscles et de la force suite à

l'inhibition de la myostatine sur les muscles rapides mais aucun effet sur les muscles lents.

L'analyse histologique des fibres montrent que les fibres rapides de type IIB, IIA et IIX

(fibres rapides) sont plus sensibles à l'action de la myostatine contrairement aux fibres de

type I (fibres lentes), avec une grande préférence pour les fibres IIB rapides et

glycolytiques. Ce qui explique les contractions courtes et rapides chez les souris myostatine

-/-, avec une diminution du nombre des mitochondries [270].

IV.2.3.3.2.5. La myostatine et la DMD :

L'inhibition de l'action de la myostatine présente une voie thérapeutique très

prometteuse pour la DMD, en stimulant la croissance musculaire. Tandis que les activines

et les TGF-Ps agissent sur presque tous les types cellulaires, la myostatine affecte

spécifiquement les cellules myogéniques. La fibrose du muscle squelettique est aussi

améliorée par l'inhibition de la myostatine [271]. Plusieurs équipes ont développé

différentes stratégies d'inhibition (dont la majorité est résumée dans le tableau 2 de la revue

du Trollet et al. [121]) afin de traiter les myopathies inflammatoires, les cachexies, les

dystrophies musculaires et la sarcopénie. Entre autre, l'efficacité de l'inhibition de la

myostatine a été étudiée sur plusieurs modèles animaux dystrophiques dans le cadre de la

DMD, en démontrant l'intérêt d'avoir un traitement musculaire stimulant sans faire des

exercices pour les patients.

76

Le blocage de l'action de la myostatine par l'injection d'anticorps monoclonal

induit une augmentation de la masse musculaire, de sa force absolue et de sa

résistance chez des souris mdx [263]. En 2005, un anticorps MYO-029 a été utilisé

dans un essai clinique de phase MI sur des patients dystrophiques mais

malheureusement, aucun effet positif n'a été observé malgré la bonne tolérance du

produit injecté [95].

Le propeptide, stabilisé par la fusion à l'IgG-Fc, est efficace pour l'amélioration de

la pathophysiologie de la DMD [272]. Une forme du propeptide plus résistante aux

métallos proteinases a été développée en mutant le site du clivage Asp76. Par

conséquent, une simple injection du propeptide augmente la masse musculaire avec

un effet plus persistant.

La follistatine est une glycoprotéine sécrétée qui se lie à la myostatine et inhibe son

interaction avec le ActRIIB [273]. Une autre protéine sécrétée, follistatin-like 3,

(FSTL3) ou FLRG, est capable de se fixer sur la myostatine soluble et d'inhiber

ainsi sa fixation sur son récepteur [256]. La surexpression du gène de la follistatine

ou de la FSTL3 chez des souris transgéniques augmente la masse musculaire [240,

274]. Ces effets sont observés en sur-exprimant le gène de la follistatine chez des

souris dystrophiques, avec augmentation du succès de la greffe des myoblastes dans

leurs TAs [275].

La forme soluble de la partie extracellulaire du récepteur ActRIIB, fusionnée à

l'IgG-Fc, (ActRIIB^Fc), bloque l'action de la myostatine in vivo, avec une

augmentation remarquable du poids musculaire, de la force absolue et aussi des

activités musculaires [276]. En plus de la myostatine, l'activine et le GDF-11 sont

inhibés par l'ActRIIB'Fc, d'où un effet plus prononcé. En se basant sur ces effets

encourageants, la campagnie pharmaceutique Acceleron Pharma a synthétisé une

protéine thérapeutique ACE-031. C'est une protéine de fusion recombinante

construite à partir de l'ActRIIB humain et d'un anticorps humain. Des études

cliniques de phase II dans la mypathie de Duchenne sont lancées (Figure 29).

77

Fibres Musculaires

Autres régulateurs ^m± négatifs

La myostatine «t 0'autres ligands inhibent la croissance du tissus

musculaire

ACt-011

régulateurs négatifs

Figure 29 : Mode d'action de l'ACE-031, molécule thérapeutique, au niveau de la fibre musculaire (http://www.acceleronpharma.com/content/products/ace-031 .jsp)

L'utilisation d'un promoteur ciblé au foie en amant des gènes des inhibiteurs de la

myostatine assure leur production systémique par la hôte après une seule administartion, ce

qui est un outil précieux pour les essais précliniques et ouvre des perspectives nouvelles sur

les effets à long terme et les lacunes de l'inhibition de la myostatine sur le muscle strié

[277].

IV.2.3.4. Les récepteurs de la superfamille des TGF-P :

Les récepteurs de la famille des TGF-P sont des récepteurs à Sérine/Thréonine

kinases, dont 12 membres ont été identifiés chez l'homme : 7 sont de type I,(anaplastic

lumphoma kinase, ALK1 à ALK7) et 5 sont de type II, TPR-II, ActRIIA et ActRIIB ,

BMPR-II et AMHR-II (Anti Mullerian Hormone Receptor II) (Figure 30).

Dans ma présente thèse, je me suis intéressée aux récepteurs de l'activine et plus

précisément, l'ActRIIB ciblant ainsi la voie de signalisation de la myostatine

principalement et des autres ligands qui s'y attachent.

78

.Nodal BMP2 Ligands TGF-// Inhibin Aftivin GDF8 C.DF1 BMF4

Vj l BMP7

BM?4 GDF5 BMP7 AMH/MIS TCF-/Î

Rarrptcuri

Snud4

Smad: Smad 3

1 Smad 1 S mad ? SmadS

t Smad 4

-500 gènes cibles 500 gènes cibles

Figure 30: Représentation schématique des interactions possibles entre les ligands de la superfamille des TGF-B et les récepteurs de type I et de type H, chez les Vertébrés. Les R-Smads 1, 2, 3, 5 et 8 représentés en dessous, sont groupés en fonction de leur spécificité de signalisation [221].

IV.2.3.4.1. Les récepteurs de type I des activine :

Contrairement au récepteur de type II, le récepteur de type I (ActRI) contient une

seule séquence caractéristique SGSGSG, appelée domaine GS, situé en position N-

terminale du domaine kinase. Ce domaine est une succession de résidus serine et glycine

qui seront phosphorylés par le récepteur de type II pour permettre l'activation du récepteur

de type I.

IV.2.3.4.2. Les récepteurs de type II des Activines :

Deux récepteurs de type II [278] existent dans la famille des Activines : ActRIIA et

ActRIIB. Structuralement ils se ressemblent avec 51% d'identité protéique dans la partie

extracellulaire, 42% dans la partie transmembranaire et 75% dans la partie

intracytoplasmique [279], mais ils diffèrent significativement au niveau de leur structure

primaire et de leur affinité pour la myostatine. Dans la partie N-terminale, ils possèdent

deux sites de N-glycosylation et un motif de dix résidus cysteines très conservé près de la

79

région transmembranaire. Ces deux récepteurs partagent aussi une extrémité C-terminale

riche en résidus serines et threonines qui sont des sites potentiels d'autophophorylation.

Sous la membrane, une région riche en résidus prolines est également présente qui

ressemble aux domaines SH3 (Src-homology 3). Ce sont des sites d'interactions possibles

avec d'autres molécules intracellulaires.

IV.2.3.4.3. Mode d'activation et voies de signalisation :

Les récepteurs sérine/thréonine kinases de type I et II forment des complexes

hétérotétramériques liés de manière non covalente à la surface des cellules [280]. Les deux

types de récepteurs sont indispensables à la signalisation intracellulaire induite par la

fixation d'un ligand [281]. La phosphorylation joue un rôle prépondérant dans l'activation

du récepteur de type I. Des études biochimiques pour caractériser les récepteurs de type II

ont été réalisées, et ont indiqué que ces molécules sont constitutivement phosphorylées sur

des résidus serines, à cause en partie, d'une autophosphorylation [278]. L'activité

d'autophosphorylation des récepteurs de type II n'est pas régulée par le ligand et le

récepteur de type I, ces récepteurs pouvant également être phosphorylés par d'autres

kinases sérine/thréonine intracellulaires.

L'état de phosphorylation des récepteurs de type I a été analysé in vivo par

surexpression de ces récepteurs dans des cellules de mammifères. Il semblerait que ces

derniers se trouvent dans un état d'hypophosphorylation quand ils sont exprimés seuls ou

avec les récepteurs de type II, et que l'ajout de ligand augmente rapidement leur état de

phosphorylation. De plus, quand ils sont co-exprimés avec un récepteur de type II mutant,

ce niveau basai de phosphorylation reste inchangé. Le récepteur de type I est donc le

substrat direct de l'activité kinase du récepteur de type II [281 ]. (Figure 31)

80

Ligands

00 « TGFpi. T6fp2. TGFpî .act ivm-p^-p^-pc.-PE • nodal • BMP2-7. BMP8A. BMP8B. BMP». BMP1S .GDft-3.6DFS-HGDFrS

Récepteurs de type I ALK4 ALK1

Récepteurs de type II TGFpRIl ACTRII ACTRIIB BMPRII AMHRII

Récepteurs

SMADs

Régulation génique Régulation génique

Figure 31 : Mode d'activation des récepteurs sérine4hréonine kinases de type I et de type II [281].

La myostatine, le plus important des ligands des récepteurs de l'activine, peut se fixer à une combinaison de récepteurs ActRIIAB sur la membrane cellulaire, mais avec une plus grande affinité au récepteur ActRIIB [240, 282]. Suite à cette fixation, le récepteur ActRI (ALK4 ou ALK5) est recruté pour former un complexe héterodimérique. Le récepteur ActRII, après le nouveau réarrangement moléculaire, acquiert une activité kinase, et phosphoryle ActRI sur des résidus serines et (ou) threonines. Ainsi activé, ActRI peut alors à son tour phosphoryler les facteurs de transcription et déclencher des voies de signalisation.

81

La cascade de signalisation de la myostatine la plus connue est celle des voies des

TGF-ps/Activines/Nodal en activant les Smad2 et les Smad3. Les Smads 1 et les Smads 5

sont activés par les protéines de la famille des BMP. Les Smads phosphorylés forment alors

un complexe avec Smad4, et c'est ce complexe qui pénètre dans le noyau afin de réguler

l'expression de différents MRF et des CKI afin de moduler le cycle cellulaire.

De plus, l'activation des récepteurs ActRIIB et/ou ActRIIA par la myostatine

diminue la signalisation de la voie AkVTORCl/p70S6K qui joue un rôle important dans la

differentiation des myoblastes et la grosseur des myotubes formés [283] (Figure 32). En

effet, l'association à la tyrosine phosphorylée du récepteur de type I induit l'activation de la

sous unité catalytique pi 10 de la PI-3 kinase, ce qui phosphoryle les lipides membranaires

servant d'encrage pour Akt et le PDK-1. L'Akt est alors phosphoryle par le PDK-1 et

bloque la GSK-3p, d'où, une activation du cycle cellulaire et blocage de l'apoptose. Hors,

en présence de la myostatine, la phosphorylation de pi 10 est inhibée donc F Akt reste à

l'état non phosphoryle et la GSK3-P actif phosphoryle la cyclin-D, ce qui induit une

ubiquitination et une dégradation de la protéine avec une inhibition des facteurs de

transcription impliqués dans la prolifération.

Une troisième voie affectée par la myostatine à travers les récepteurs ActRII, est la

voie des MAPK. Elle comporte 4 sous familles : la voie des Erkl/2, la voie des Jnk, la voie

des p38 et la voie des Erk5. La voie des MAPK et la voie de la PI3-k sont interdépendantes.

Les deux activent la voie des JNK avec une phosphorylation de c-jun et une activation du

facteur de transcription AP-1 responsable de l'induction de la cycline-D.

82

InMbtae

Art!» I» MyosUrtlne

t . n i 11 fy

FoMtsUtane pour ractivine et la myostatine Propeptide pro -my os tatm pour la myostatine

Récepteur soluble (ActRIIB-Fc) pour ractrvrt*. la ■. * G D F - i i e t l e B M P 2

I>>(acl>can Tjpr IIK I M K W I

MAfK SmwAl.ï Akl/PDK Wa<g « t t e *

ftp •VvaMSCriptJonefs

I——-> Expression génique ' off on

Figure 32 : la transduction du signal à travers les récepteurs ActRII. D'après Tsuchida et al. [284].

IV.2.3.4.4. Expression et fonction du récepteur ActRIIB dans l'embryogenèse

Pendant l'embryogenèse, ActRIIB est exprimé au niveau de l'épiblaste des

embryons de souris en pré-gastrulation, de l'ectoderme embryonnaire et dans plusieurs

tissus durant l'organogenèse, comme le cerveau, la moelle épinière, l'estomac et l'intestin

[285]. De nombreuses expérimentations ont élucidé le rôle d'ActRIIB pendant cette

période. La surexpression d'une forme tronquée de ce récepteur bloque la formation du

mésoderme induite par l'activine, tandis que des injections de ce récepteur tronqué dans la

partie dorsale gauche de blastomères de Xénope au stade 16 cellules, établit au hasard un

cœur d'embryon. De plus, des souris, dont le gène ACVR2B est inactif, meurent à la

naissance à cause de graves malformations cardiovasculaires et congénitales.

ActRIIB semble donc être un régulateur vital du développement de la souris, avec

un rôle majeur dans l'initiation de l'axe gauche-droite et de l'organogenèse. Chez les

mammifères, la myostatine et les peptides similaires sont les ligands qui semblent le plus

interagir avec ActRIIB durant les stades précoces de l'embryogenèse. ActRIIB est aussi un

récepteur fonctionnel pour les ligands BMP-2 et BMP-7. Kusumegi et al. [286] ont montré

83

que le complexe ActRIIB/BMP-7 est impliqué dans la régulation de l'apoptose des cellules

de l'endomètre.

84

Chapitre V: L'inhibition de la Signalisation de la Myostatine par

L'expression du Récepteur Dominant Négative Augmente le Succès de

Transplantation des Myoblastes Humains

Raouia Fakhfakh, Annick Michaud and Jacques P. Tremblay

Contribution de chaque auteur :

J'ai effectué toutes les manipulations retrouvées dans ce présent article. Annick

Michaud était l'étudiante à la maitrise qui a commencé ce projet. J'ai rédigé l'article sous la

supervision de Jacques P. Tremblay.

Résultats publiés dans le journal Molecular Therapy, 2010. (Mol Ther. 2011.

Jan;19(l):204-1)

85

RESUME

La DMD est une maladie récessive causée par une mutation du gène de la

dystrophine. La transplantation des myoblastes permet d'introduire le gène de la

dystrophine dans les fibres musculaires dystrophiques. L'inhibition de la myostatine, un

régulateur négatif de la myogenèse, au niveau de ces myoblastes peut augmenter le succès

de leur greffe. La myostatine se lie avec une haute affinité au récepteur ActRIIB. Notre

objectif était de vérifier si le succès de la transplantation des myoblastes est renforcé par le

blocage du signal de la myostatine en exprimant un mutant dominant négatif d'ActRIIB

(dnActRIIB). In vitro, le blocage de l'activité de la myostatine avec un lentivirus portant un

dnActRIIB induit une augmentation de la prolifération et la fusion des myoblastes humains

accompagner par une régulation de l'expression de plusieurs MRF. In vivo, les myoblastes

infectés par le lentivirus dnActRIIB ont été transplantés dans des souris immunodéficientes

dystrophiques. Les sections de coupe des tibials antérieurs après la transplantation des

myoblastes exprimant le dnActRIIB révèlent plus de myofibres exprimant la dystrophine

humaine. Ainsi, le blocage du signal de la myostatine avec dnActRIIB améliore le succès

de la transplantation de myoblastes.

86

BLOCKING THE MYOSTATIN SIGNAL WITH A DOMINANT NEGATIVE

RECEPTOR IMPROVES THE SUCCESS OF HUMAN MYOBLAST

TRANSPLANTATION IN DYSTROPHIC MICE

Raouia Fakhfakh, Annick Michaud and Jacques P. Tremblay

Unité de recherche en Génétique Humaine, Centre de recherche de CHUL,

CHUQ, Faculté de médecine, Université Laval, Sainte-Foy, Québec, Canada.

ABSTRACT

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a recessive disease caused by a dystrophin

gene mutation. Myoblast transplantation permits to introduce the dystrophin gene in

dystrophic muscle fibers. However, the success of this approach is reduced by the short

duration of the regeneration following the transplantation, which reduces the number of

hybrid fibers. Myostatin is a negative regulator of skeletal-muscle development and

responsible for limiting regeneration. It binds with high affinity to the activin type IIB

receptor (ActRIIB). Our aim was to verify whether the success of the myoblast

transplantation is enhanced by blocking the myostatin signal with expression of a dominant

negative mutant of ActRIIB (dnActRIIB). In vitro, blocking myostatin activity with a

lentivirus carrying dnActRIIB increased proliferation and fusion of human myoblasts

because myostatin regulates the expression of several myogenic regulatory factors (MRFs).

In vivo, myoblasts infected with the dnActRIIB lentivirus were transplanted in immuno-

deficient dystrophic mice. Dystrophin immunostaining of Tibialis anterior cross-sections of

these mice 1 month post-transplantation revealed more human dystrophin-positive

myofibers following the transplantation of dnActRIIB myoblasts than of control myoblasts.

Thus blocking the myostatin signal with dnActRIIB improved the success of myoblast

transplantation by increasing the myoblast proliferation and fusion and changed the

expression of MRFs.

87

INTRODUCTION

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe X-linked, muscle-wasting

recessive disease affecting 1 in 3500 male births [1]. It results from a mutation in the gene

encoding dystrophin, a 427 kDa protein composed of 3,685 amino acids [2]. Dystrophin is

located just beneath the membrane of skeletal myofibers and its absence in DMD patients

causes sarcolemma instability leading to frequent muscle fiber damages and repairs [3, 4].

In dystrophic muscles, regeneration gradually fails and the normal cycle of degeneration-

regeneration is tipped in favour of degeneration [3]. This defective muscle repair resulting

from myoblast senescence leads to death early in the third decade. Delivery of the normal

dystrophin gene by the transplantation of muscle-derived precursor cells (i.e., myoblasts)

obtained from a healthy donor results in the long-term restoration of this protein. Indeed,

the transplanted myoblasts fuse with the host fibers and introduce in them the normal

dystrophin gene [5]. The success of myoblast transplantation, however, is reduced by the

limited muscle regeneration in mdx mice and DMD patients [6].

Myostatin (MSTN), a member of the transforming growth factor-beta (TGF-P)

family, is a negative regulator of skeletal muscle growth [7, 8]. The dramatic effect of

myostatin on postnatal growth is due to its negative regulation of satellite cell activation,

proliferation and self-renewal [9] and to its inhibition of myoblast proliferation and

differentiation [8, 10]. MSTN is also implicated in muscle regeneration process by blocking

the macrophage migration and thus the inflammatory response that occurs after muscle

damage [11].

MSTN, initially secreted as a precursor protein, is composed of two identical 352

amino-acid polypeptide chains, held together by a disulphide bond. The presence of the N-

terminal 243 amino-acid segments of this dimmer, called myostatin propeptide renders the

myostatin precursor biologically inactive [12]. Proteolytic cleavage of these segments

generates the mature form of myostatin, which exhibits biological activity only after its

complete detachment from the pro-peptides. Prior to this detachment, the complex is

referred to as a latency-associated protein (LAP). After the proteolytic processing, C-

terminal mature myostatin, a 25 kDa protein composed of two identical 109 amino acid

polypeptide chains, held together by a single disulfide bond [13], binds to one of the two

type II cell surface serine/threonine kinase receptor (activin receptor type IIB (ActRIIB)) to

88

a greater degree than to ActRIIA) to elicit its biological function [14-17]. Its binding to

ActRIIB leads to the phosphorylation and activation of the Activin type I receptor, which in

turn initiates the intracellular signalling cascade by phosphorylation of the receptor-

regulated proteins Smad2 and Smad3 [14, 15, 18]. Upon phosphorylation, Smads form

heterodimer with a Co-Smad, Smad4. This complex trans-locates into the nucleus, binds to

DNA, and finally modulates transcription of various target genes [14, 15, 17, 18]. Within

the cell, myostatin blocks myoblast growth by inhibiting the expression of myogenic

regulatory factors, such as MyoD and by stimulating expression of cyclin-dependent kinase

(Cdk) inhibitors such as p21 [19].

There are several myostatin inhibiting strategies currently under pre-clinical or

clinical investigation. One of them is to block the myostatin signalling induced by its

interaction with the activin type IIB receptor. Myostatin binding to ActRIIB receptors is

specific and transgenic mice with increased muscle expression of dominant negative form

of ActRIIB (dnActRIIB) have increased muscle weights [16]. A study in our laboratory

confirmed these results and also indicated that the success of normal myoblast

transplantation was improved in mdx mice carrying the dnActRIIB. This study

demonstrated that myoblasts obtained from these nondystrophic transgenic mice formed

more abundant dystrophin-positive fibers when transplanted in mdx muscles. [20]. It has

also been shown that the myostatin propeptide inhibited binding of myostatin to ActRIIB

receptors and blocked its inhibitory action on muscle growth in vivo [21]. Other studies

investigated another potential myostatin inhibitor, follistatin, which inhibits the activity of

other TGF-P family members [22]. Mice expressing increased levels of follistatin in muscle

have dramatic increases in muscle weight, caused by both hyperplasia and hypertrophy.

Our research group has recently demonstrated that follistatin improved the success of

transplantation of normal myoblasts in mdx mice [16, 23].

Since in humans, there are no myoblast donors, who carrying a dnActRIIB, we

aimed to introduce this gene with a lentivirus in the human cells during their pre-

transplantation expansion in culture to evaluate the impact on the formation of dystrophin

positive fibers, thus improving the success of myoblast transplantation.

RESULTS

Permanent expression of dnActRIIB:

89

Human myoblasts were infected with a lentivirus carrying or not dnActRIIB

(Figure SI). These cells were then lysed and the protein concentration of cell extracts was

determined using BCA protein assay kit (Pierce). Samples were separated by 10% SDS-

PAGE and immuno-blotted with an anti-ActRIIB antibody. Western blot analyses

demonstrated the dnActRIIB expression in myoblasts infected with lenti-CMV-dnActRIIB

(Fig. 1). The band of truncated receptor (25 kDa) was more intense than the normal

receptor band (100 kDa).

• Increase of myoblast growth following inhibition of the myostatin signal:

Myostatin is a negative regulator of myoblast proliferation. To determine the effects

of inhibition of the myostatin signal with a dnActRIIB, the proliferation of myoblasts

carrying or not the dnActRIIB was evaluated with a florescence based assay (CyQuant) that

correlates with cell number. Myoblast growth medium was supplemented or not with 500

ng/ml myostatin and changed every two days. Cells were allowed to proliferate for 4 days

and then plates were assayed for total cell number. Myostatin significantly decreased the

proliferation of normal myoblasts (expressing the normal ActRIIB) compared to untreated

normal myoblasts (Fig. 2). Myoblasts expressing dnActRIIB proliferated more than normal

myoblasts and this difference was more important in presence of myostatin in medium.

• Inhibition of differentiation by myostatin of normal myoblasts but not of

dnActRIIB-expressing myoblasts:

Myogenic differentiation of human myoblasts was assessed 3 days after switching

confluent myoblasts to a differentiation medium containing or not recombinant myostatin

(500 ng/ml) The cultures were fixed and stained with DAPI, to visualize nuclei, and were

treated with antibodies to MyHC (Fig. 3a). Myostatin treatment resulted in significant

decreases of both the size and the number of ActRIIB myotubes but had no effect on the

formation of dnActRIIB-expressing myotubes (Fig 3b, c). Subsequent analysis of the

fusion index and the diameters of the myotubes demonstrated that myostatin treatment

inhibited the fusion of normal myoblasts by about 45% (Fig. 3b) and reduced the myotubes

diameter by 87% (Fig 3c). However, this inhibitory effect was not observed for the

dnActRIIB-expressing myoblasts. Indeed for these myoblasts, the fusion index and size of

myotubes was elevated with or without myostatin in the differentiation medium, indicating

90

that the expression of dnActRIIB facilitated myoblast differentiation and myotube

diameters were enlarged by 12% to 57% with myostatin in the differentiation medium.

• Modulation of myostatin pathway in dnActRIIB-expressing myoblasts:

We tested whether the endogenous Smad2 is regulated by dnActRIIB expression.

The best way to monitor Smad trans-activation is by in vitro transfection of Smad sensors,

which control the expression of a reporter gene such as GFP. DnActRIIB reduced reporter

activity of Smad2 (Fig. 4), our results confirm those presented in another study [24].

• Expression of MyoD family mRNA in myoblasts carrying or not dnActRIIB:

MyoD family (i.e., the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors: Myf5,

MyoD and myogenin) plays an essential role as central regulators of myogenesis [25].

Myf5 and MyoD are expressed in myoblasts and myotubes, and are required for

myogenesis. Myogenin is critical for myotubes formation and terminal myogenic

differentiation events [25], since it is highly expressed when myoblasts commit to

differentiation state to form myotubes.

Several studies have described that myogenic cells respond to myostatin by down-

regulating the expression of key transcriptional regulators of muscle development such as

MyoD family, Pax3, Pax7, P21, explaining its inhibitory effects in differentiation [9, 26-

28]. Therefore, inhibition of myostatin should lead to an increased expression of these

regulators.

Reverse transcription PCR analysis of MyoD family in myoblasts carrying or not

dnActRIIB with or without myostatin in medium (Fig. 5) showed that MyoD, myogenin,

Myf5 and MyHC mRNA were detected with their expected size (Fig 5a). The expression of

these genes was increased in dnActRIIB-expressing myoblasts when compared with normal

myoblasts, mostly in the expression of Myf5, myogenin and MyHC (7"<0,05 ). However, in

presence of myostatin in medium, we observed an inhibition of the expression of these

genes and MyoD in normal myoblasts, but not more in dnActRIIB-expressing myoblasts

(Fig. 5b). The expression of the myogenic factor seems almost higher in dnActRIIB-

expressing myoblasts with or without myostatin treatment.

• Improved transplantation success in Rag/mdx of human myoblasts carrying a

dominant negative form of myostatin receptor (dnActRIIB):

91

To investigate the effect of blocking the myostatin signal in dystrophic mice on the

long-term success of the transplantation of normal human myoblasts, half a million

myoblasts carrying or not dnActRIIB were transplanted in each TA muscle of Rag/mdx

mice. Fig. 6a illustrates representative cross-sections of transplanted muscles with control

myoblasts (Fig. 6a, left side) and dnActRIIB-expressing myoblasts (Fig. 6a, right side).

Analysis of variance revealed that more muscle fibers expressing human dystrophin (105 ±

20) were detected in the muscle cross-sections of Rag/mdx mice transplanted with

myoblasts carrying dnActRIIB. Only 62 ± 2 muscle fibers positive for human dystrophin

were detected in the muscle cross-section of Rag/mdx mice transplanted with normal

myoblasts (Fig. 6b). Thus, 40% more dystrophin positive fibers were present following the

transplantation of dnActRIIB-expressing myoblasts. This result can be explained by the

reduced myostatin inhibition of the myoblasts expressing the mutated myostatin receptor.

DISCUSSION

Myostatin is a key regulator of skeletal muscle development and growth. The

present study provided several important insights concerning the signalling of the myostatin

pathway and its contribution to success of myoblast transplantation. Thus, blocking the

myostatin signal in the transplanted human myoblasts enhanced the number of muscle

fibers expressing human dystrophin in the muscles of Rag/mdx mice. This improved

transplantation success was explained by the binding of endogenous myostatin to the

truncated myostatin receptors, which were inefficient. Moreover, the dnActRIIB proteins

also formed dimmers with the normal ActRIIB proteins, therefore forming inactive

receptors. We propose the following model (fig. 7) to illustrate the effect of presence of

dnActRIIB in myoblasts, in which myostatin binds to the dnActRIIB receptor but without

triggering signal transduction. The phosphorylation of the GS domain of the type I receptor

is inhibited due to the lack of intracellular kinase of the mutated type II receptor. So, the

Smad complex cannot be activated.

Because of the lack of inhibition by myostatin, we hypothesized that human

myoblasts genetically modified to express dnActRIIB would proliferate and fuse more with

the host muscle fibers, thus producing more muscle fibers expressing human dystrophin

than the normal human myoblasts. Our in vitro results confirmed this hypothesis, indeed

myostatin, even added exogenously, has no inhibitory effect on myoblasts carrying the

92

dnActRIIB and thus, these cells proliferated more than normal myoblasts (expressing only

ActRIIB). These physiological changes involve variations in myogenic factor expression.

Myostatin decreases the proliferation and differentiation of myoblasts by repressing the

expression of MyoD family of bHLH transcription factors, which include MyoD,

myogenin, Myf5 and MRF4 [287]. The present study showed that expressions of

Myogenin, Myf5 and MyHC mRNAs are significantly higher in dnActRIIB-expressing

myoblasts even in presence of exogenous myostatin.

Taken together, our results show that inhibition of the myostatin signal enhances the

regenerative capacity of muscle. The dnActRIIB-expressing myoblasts are less susceptible

to myostatin resulting in an increase in proliferation, fusion index, myotubes diameter and

expression specifically of Myf 5, Myogenin and MyHC.

Numerous studies have examined the regulation of myostatin expression in response

to a variety of stimuli and under different physiological conditions, and up-regulation or

down-regulation of myostatin expression was detected in many of these studies [13, 21, 30-

41]. Clearly, much more work will be required to determine whether targeting the

myostatin pathways will have beneficial effects for the treatment of dystrophies. However,

our study indicates that the genetic modification of human myoblasts with a dnActRIIB

increases the formation of dystrophin positive muscle fibers in dystrophic skeletal muscles

by increasing the fusion with the host myofibers. This approach could improve the success

of cell therapy for the DMD, without the need of systemic inhibition of myostatin in the

patient. This approach thus has the advantage that it permits to improve the proliferation

and fusion of only the grafted myoblasts without leading to a muscle hypertrophy of the

patient muscles, which may be at the expense of an early worn out of the proliferative

capacity of the patient own myoblasts, which may eventually accentuate the dystrophic

process.

MA TERJALS AND METHODS

Animals: All the experiments were approved by the animal care committee of the

CHUL (Centre Hospitalier de l'Université Laval). The Rag/mdx (immunodeficient

dystrophic mouse model on a C57BL10J genetic background) mice are our internal

laboratory colonies from crossing mdx mice with Rag mice.

93

Design and Cloning of cDNA Cassettes: The ActRIIB cDNA (NM004302) was

studied to design sense and anti-sense primers to amplify a truncated ActRIIB formed by

nucleotides 5 to 487 of the ActRIIB mRNA. This truncated receptor is called dnActRIIB

(Table 1). A Sail restriction site was inserted at the 5 'antisense primer and BamHI at the 5

'primer sense to permit the insertion of the amplicon in a lentiviral vector. The pCMV-

dnActRIIB lentiviral vector was constructed from a lentivirus vector initially containing a

cassette for the EGFP gene under the control of a CMV promoter. The EGFP gene was

withdrawn and replaced by the gene encoding the dnActRIIB. In fact, the resulting protein

lacks the serine / threonine domain resulting in a receptor unable to activate the subsequent

signalling pathway. Two other lentivirus vectors were used for control: lenti-pCMV and

lenti-pCMV-eGFP (Figure SI).

Transfection and Lentivirus Vector Production: Lentivirus particles were produced

by transient transfection of 293T cells growing in a serum-free suspension with three

plasmids encoding the vector components, using the calcium phosphate method as

described [288]. Plasmid CMV-eGFP was used as a transfection control. Infectious

lentivirus were harvested at 12, 24, 36 and 48 h post-transfection and filtered through 0.22

um.

Myoblast Preparation: Primary myoblast cultures were grown from muscle biopsies

performed in the Quadriceps femoris of a human cadaveric donor aged 13 months. The

biopsies were dissociated with collagenase and trypsin as described [289] and cultured in

MB-1 medium (Hyclone, South Logan, UT, USA) with 15% fetal bovine serum (FBS,

Gibco, Burlington, Ontario, CA), 1% of penicillin-streptomycin (P/S, Gibco, Burlington,

Ontario, CA) and 10 ng/ml of basic Fibroblast Growth Factor (bFGF, Strathmann Biotec

AG, Hamburg, Germany) in a humidified atmosphere with 5% C02 at 37°.

Myoblast Infection: After 24 h, culture of human myoblasts were supplemented

with 20 x 106 lentiviral particles (multiplicity of infection (MOI) of 10) and with 10 ug/ml

polybrene. Supernatant was removed after 6 hr of infection and replaced with growth

medium MB-1. Human myoblasts were infected with a lentivirus carrying or not

dnActRIIB. Lentivirus CMV-eGFP was used as a control of infection.

Western Blot Analysis of ActRIIB: human myoblasts with various treatments were

lysed in a buffer containing 20 raM Tris 7.5, 1 mM DTT, 1 mM PMSF and 1% SDS. The

94

total protein concentration of cell extracts was determined using BCA protein assay kit

(Pierce inc.). Samples were separated by 10% SDS-PAGE and immuno-blotted with anti-

ActRIIB antibodies.

Cell Proliferation Assay: Cellular growth curves were measured using the

CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Invitrogen) according to the manufacturer's

instructions. Human myoblasts were seeded in 24-well plates at initial densities of 2 X 10

cells per well in a total volume of 100 pi MB-1 culture medium supplemented with 10%

FBS and various doses of myostatin as noted. Cells were allowed to divide for the number

of days indicated, with medium replaced every 2 days. At the indicated times, the medium

was discarded, and plates were frozen. The day of the assay, plates were thawed, cells were

lysed, and total cellular nucleic acid was measured using florescence at 520 nm emission

following excitation at 480 nm.

Cell Differentiation Assay: Myoblast differentiation was determined by myotube

formation, myotubes were defined as the cells with three or more nuclei. After the

myoblasts were cultured in the growth medium for 24 h, the medium was replaced with a

fusion medium containing only 2% FBS. Thereafter myoblasts were cultured in this fusion

medium for 72 h. Myotubes were visualized by MyHC labelling. The cells were fixed with

95% ethanol and then washed twice with PBS for 10 min and blocked with 10% FBS in

PBS. The samples were incubated for 2 h at room temperature with anti-MyHC antibody

(MF20, DSHB, Department of biological Sciences, Iowa City, IA) (1:100) and for 1 h with

anti-mouse Alexa 546-conjugated secondary antibody diluted 1:100. Finally, the cells were

washed with PBS and mounted on microscope glass slides. 4', 6-Diamidino-2-phenylindole

(DAPI) staining was done to label the nuclei. The number of nuclei incorporated in

multinucleated myotubes was counted to estimate the terminal differentiation and

normalized with the total number of nuclei.

To analyse diameters, four pictures were taken per well and area of myotubes were

measured (using Image J 1.40g, National Institutes of Health, USA); myotube diameters

were determined as average from three independent measurements per myotubes.

RT-PCR: To detect MyoD family and MyHC mRNA, the total RNA was extracted

using TRIzol reagent (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) from normal myoblasts

containing the ActRIIB and from genetically modified myoblasts containing an additional

95

dnActRIIB. First strand cDNAs were synthesized using 1 ug total RNA with the oligo (dt)

primer and Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen). PCR was performed with 1 ug

of the RT reaction using the primers specific for MyoD, Myogenin, Myf5 and MyHC

(Table 1). The annealing temperatures were 63°C for MyoD, myogenin, MyHC and 64°C

for Myf5. The numbers of cycles of PCR was 33 for MyoD, myogenin, MyHC, and 10 + 25

for Myf5. GAPDH specific primers were used as internal controls (Table 1).

PCR products were then separated by electrophoresis in 2% agarose gels and were

stained with Ethidium bromide. For MyoD family and MyHC mRNA, the images of the

gels were digitized using PCBAS 2.0 computerized densitometry program (iNSERM U148

Montpellier) and the results were normalized to GAPDH. ANOVA was used for statistical

analysis. The differences between means were considered significant at P<0.05.

Myoblast Transplantation: Half million myoblasts carrying or not the dominant

negative form of ActRIIB were transplanted in the TA of 5 to 8 weeks old Rag/mdxjnice.

Mice were sacrificed after 30 days and the TA muscles were frozen in liquid nitrogen.

Immunohistochemistry: Immunoassays with an anti-human dystrophin antibody

(7F7, MRIC Biochemistry Group, Wrexham, UK) and with anti-lamin A/C (Vector

laboratory, USA) to visualise nuclei of human myoblasts, were performed on muscle

cryostat sections. Non-specific binding sites were blocked by incubating the sections with

FBS (10%) in PBS for 1 h. Sections were then incubated with a mouse anti-human

dystrophin antibody (1/50, 1 h), followed by 30 min with a biotinylated anti-mouse

antibody (Dako, Copenhagen, Denmark), and 30 min with streptavidin-Cy3 (Sigma). After

a second blocking, sections were incubated with anti-lamin A/C (1/100, lh) followed by an

anti-mouse IgG conjugated with Alexa 488 (1/300, lh). Incubations were done at room

temperature.

Immunohistochemical quantification of dystrophin-positive myofibers in skeletal

muscles of Rag/mdx mice was evaluated by manual counting on 12 cryostat sections

distributed at 150 urn interval for each of the 5 muscles of each group. Afterward, the 5

highest sections of 5 TA muscles from each group were selected, and the means ± SD were

calculated.

Statistical Analyses: The experimental values were presented as means + SD.

Statistical analysis was performed using the StatView statistical package (StatView 5, SAS

96

Institute Inc.). Comparisons of different variables between groups were performed using

ANOVA techniques. Differences were considered statistically significant at P<0.05.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank Glenn E. Morris and Le Thanh Lam (MRIC Biochemistry Group,

Wrexham, UK) for providing the MANDYS104 antibody. This work was supported by

grants from the Muscular Dystrophy Canada, Amyotrophic Lateral Sclerosis Foundation

and the Canadian Institute for Health Research.

97

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TABLES

100

Gene name Orientation Primers Sequence

Number A n n . ^ ^

cycle Temp. Size (bp) antisense CGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTG

dnActRIIB sense TGCTGTGAAGGCAACTTCTG antisense CGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTG

ActRIIB sense GCAGACGGACCCGTGGATGA antisense GTTAAGCATTGCAACAAGCTACCC

Myf5 sense CCAGGCTTATCTATCATGTGCTATG antisense CGATATACCAGGTGCTCTGAGGG

MyoD sense GGGTGGGTTACGGTTACACCTGC antisense TAAGGTGTGTAAGGGAAGTCG

Myogenin sense CCACAGACACATCTTCCACTGT antisense CTGCTGAAGGAGAGGGAGCT

MyHC sense TGATTAGCTGGTCACACCTT antisense CCCCTTCATTGACCTCAACTACA

GAPDH sense TTGCTGATGATCTTGAGGCTGT

30

30

65 373

65 1162

10 + 25 68,64 320

33

33

33

29

63 430

63 438

63 850

56 342

Table 1 : Primers Sequences to amplify the normal (ActRIIB), the dominant negative

(dnActRIIB) receptors, Myf5, MyoD, Myogenin, MyHC and GAPDH.

101

FIGURE LEGENDS

Figure 1: Western blot illustrating the permanent expression of dnActRIIB

after infection with the lentivirus pCMV-dnActRIIB. Cultures of human myoblasts

were supplemented with 20 X 106 lentiviral particles carrying or not dnActRIIB, and with

10 ug/ml polybrene. Supernatant was removed after 6 h of infection and replaced with

growth medium MB-1. After 24 h, the proteins were extracted. Samples were separated by

10% SDS-PAGE and immunoblotted with an anti-ActRIIB antibody. The wild type

ActRIIB was expressed in both the control myoblasts and in those infected with the

lentivirus pCMV-dnActRIIB. However, the dnActRIIB protein was expressed only in the

myoblasts infected with the pCMV-dnActRIIB.

Figure 2: Effect of myostatin on the proliferation of human myoblasts carrying

or not dnActRIIB. Changes in cell number was evaluated with CyQUANT Cell

Proliferation Assay Kit (arbitrary fluorescent unit) after 4 days with (+MSTN) 500 ng/ml

myostatin or without myostatin. In the absence of MSTN, the myoblasts expressing the

dnActRIIB proliferated more than the normal myoblasts expressing only the ActRIIB. In

the presence of MSTN, the proliferation of the normal myoblasts was inhibited, while the

proliferation of the dnActRIIB-expressing myoblasts was not changed. The presented data

are means + SD (n=5).

Figure 3: Inhibition of human myoblast differentiation by myostatin.

Myoblasts carrying or not dnActRIIB were differentiated into myotubes for 3 days in

the presence or not of myostatin in the differentiation medium, (a): myotubes

differentiated for 3 days, in the absence (DMEM 2%) or in the presence of myostatin (500

ng/ml), were stained with anti-myosin heavy chain (MyHC) and DAPI. (b): In the absence

of myostatin, the normal ActRIIB myotubes and the dnActRIIB-expressing myotubes had

similar fusion indexes. In the presence of myostatin, the fusion indexes of the normal

ActRIIB myoblasts were significantly reduced compared with the same myoblasts without

myostatin. However, the fusion index of the dnActRIIB-expressing myotubes was not

affected by the presence of myostatin. (c): The myotube diameters are expressed as

percentage of ActRIIB myotubes diameters (without myostatin). In the absence of

myostatin, the normal ActRIIB myotubes and the dnActRIIB-expressing myotubes were of

102

similar size. Presence of myostatin in differentiation medium reduced significantly the sizes

of both the normal ActRIIB myotubes and the dnActRIIB-expressing myotubes compared

with the same myoblasts without myostatin. However, the size of the normal ActRIIB

myotubes was reduced significantly more than that of dnActRIIB-expressing myoblasts.

Representative pictures are presented, scale bar = 0.2 mm. Means + SD from 3 independent

experiments are illustrated. *P < 0.05

Figure 4: Modulation of myostatin pathway in human myoblasts by

dnActRIIB. (a) Illustration of a Smad2 dependent reporter, in which the Smad2-binding

site (CAGA) is repeated 12 times in a promoter controlling the expression of GFP. (b)

Human myoblasts carrying or not the dnActRIIB were transfected with the reporter gene

illustrated in a. The négatif control was normal human myoblasts transfected with the GFP

reporter controlled by a minimal promoter. Cells were then incubated with myostatin at 500

ng/ml during 2 days. The vertical axis is a measure of the GFP fluorescence in these cells.

This fluorescence is a measure of the transcriptional activity of endogenous Smad2. The

transcriptional activity was reduced in the dnActRIIB-expressing myoblasts compared with

the normal ActRIIB myoblasts.

Figure 5: Expression of MyoD family mRNAs in wild type and dnActRIIB-

expressing human myoblasts. First strand cDNAs were synthesized from 1 pg total RNA

from wild type (ActRIIB) and dnActRIIB-expressing myoblasts incubated during 2 days

without (a) or with MSTN (500 ng/ml) (b) in the culture medium. PCR amplification was

done using specific primers for MyoD (430 bp), Myf5 (320 bp), Myogenin (438 bp) and

MyHC (850 bp). GAPDH served as the internal standard. The mRNA expression of the

myogenic factors was semi-quantified using a densitometry method (c). The expression of

MyoD, Myf5, Myogenin and MyHC were modified by the presence of the dnActRIIB in

myoblasts and of myostatin in medium. They were higher in the dnActRIIB-expressing

myoblasts than in the normal (WT) myoblasts, this increase did not the same extent, but

significantly for Myogenin and MyHC; the presence of myostatin reduced the expression of

MyoD family factors in WT myoblasts but not as in dnActRIIB-expressing myoblasts.

The data presented are means + SD (n=3), *P<0,05.

103

Figure 6: Increased graft success in Rag/mdx mice transplanted with myoblasts

carrying dnActRIIB. (a). Immunohistochemical detection of dystrophin (red) and lamin

A/C (green) in TA muscle sections of Rag/mdx mice transplanted with either control human

ActRIIB myoblasts or with dnActRIIb-expressinghuman myoblasts, (b). Graphical

representation of the number of dystrophin-positive fibers per cross-section of TA muscles

transplanted with ActRIIB or dnActRIIb-expressingmyoblasts. There is, on average, 69%

more dystrophin-positive fibers in TA muscles transplanted with dnActRIIb-

expressingmyoblasts than in those transplanted with ActRIIB myoblasts. (N=5, dnActRIIb-

expressingmyoblast transplantation: 105 ± 28 dystrophin-positive fibers; control ActRIIB

myoblast transplantation: 62 ± 12 dystrophin-positive fibers). Representative pictures are

presented. Scale bar = 0.2 mm. The data presented are means + SD (n=5), P < 0.05.

Figure 7: Blocking the myostatin signal with a dominant negative receptor, (a).

(1) Mature myostatin binds to the dimmer activin receptor type IIB (ActRIIB). (2) The

ActRIIB recruits the activin receptor type I (ActRI). (3) Activation of the kinase activity of

ActRI by trans-phosphorylation. (4) Smad2 and Smad3 are subsequently activated through

phosphorylation. (5) Smad4 forms a complex with the Smad2-Smad3 heterodimer. (6) The

complex translocates into the nucleus. (7, 8) Interaction with different cellular partners in

order to regulate the transcription of various downstream response genes, (b). (9) Mature

myostatin binds to the dimmer dominant negative ActRIIB (dnActRIIB). (10) Due to lacks

of the kinase domain of dnActRIIB, ActRIIB will not recruit or activate the ActRI. Thus

there is no activation of Smad protein function and a down-regulation of specific gene

expressions (11).

Figure SI: Illustration of the pCMV, pCMV-dnActRIIB and pCMV-eGFP plasmids.

104

Control dnActRIIB myoblast myoblast

Figure 1

ActRIIB (100 kDa)

dnActRIIB (25 kDa)

210 -i

105

-3T 1 9 0 -*■»

'c ID d 170

< 150 L. o

ja E 130 3 Z

§ 110

90 DO D2 D4

Figure 2

dnActRIIB

-X--dnActRIIB+MSTN

"O-ActRIIB

-A-ActRIIB+MSTN

106

a)

DMEM2%

DMEM2% +MSTN

ActRIIB myoblasts dnActRIIB myoblasts

b) ■ ActRIIB myoblasts c ) □ dnActRIIBmyoblasts

■ ActRIIB myoblasts D dnActRIIBmyoblasts

KXH

DMEM2% DMEM2% + MSTN

DMEM2% DMEM2% + MSTN

Figure 3

a)

107

b)

CAGA-reporter mmêmmm | GFP U

CAGA (Smad site)

c o

C

O LX.

El négatif control ■ ActRIIB myoblasts D dnActRIIBmyoblasts

Figure 4

108

a) WT dnActRIIB

b)

GAPDH «MftJMft

MyoD

Myf5 * * * * * * *

Myogenin ^a\W waW%

MyHC — _

WT dnActRIIB

GAPDH

MyoD

Myf5

Myogenin

MyHC

c) MyoD

WT dnActRIIB WT+ dnActRIIB + MSTN MSTN

Myf5

WT dnActRIIB WT+ dnActRIIB + MSTN MSTN

Myogenin

WT dnActRIIB WT+ dnActRIIB+ MSTN MSTN

MyHC

WT dnActRIIB WT+ dnActRIIB + MSTN MSTN1

Figure 5

109

* )

b)

ActRIIB myoblasts

dnActRIIB myoblasts

Figure 6

110

a) MSTN

Figure 7

I l l

Figure SI

112

Chap i t re VI : Le Losa r t an Augmente le Succès de la Greffe des

Myoblastes

Raouia Fakhfakh, Yann Lamarre, Daniel Skuk and Jacques P. Tremblay

Contribution de chaque auteur ;

J'ai effectué la plupart des manipulations retrouvées dans le présent article. Yann

Lamarre m'a aidé pour la greffe des myoblastes et pour les tests d'apoptose in vitro. Daniel

Skuk m'a aidé dans l'interprétation des immunohistochimies pour la détection des

macrophages. J'ai rédigé l'article sous la supervision de Daniel Skuk et de Dr. Jacques P.

Tremblay.

Résultats publiés dans le journal Cell transplantation, 2011 (Cell Transplant. 2011 Apr 29)

113

RESUME

La DMD est une maladie récessive liée au chromosome X causée par des mutations

génétiques au niveau de la dystrophine. La thérapie cellulaire peut être une approche

possible visant à introduire une dystrophine fonctionnelle dans les fibres musculaires des

patients dystrophiques. Toutefois, cette stratégie a produit des résultats limités. Le TGF-P

est un régulateur négatif du développement du muscle squelettique et de la régénération

myogénique. La combinaison de l'inhibition de la signalisation TGF-P par la transplantation

de myoblastes peut être une approche thérapeutique efficace pour les patients

dystrophiques. Notre objectif était de vérifier si le succès de la transplantation de

myoblastes humains chez des souris immunodéficientes dystrophiques est renforcé par le

losartan, une molécule qui inhibe l'expression du TGF-p. In vitro, le blocage de l'activité du

TGF-P avec le losartan augmentation de la prolifération et la fusion avec une diminution de

l'apoptose des myoblastes humains. In vivo, les myoblastes humains ont été transplantées

chez des souris traitées avec le losartan par voie orale. L'immunodétection de la

dystrophine humaine dans des coupes de Tibialis antérieurs a révélé plus de myofibres

positives pour la dystrophine humaine dans ces souris que chez les souris non-traitées.

Ainsi, le blocage du signal du TGF-P avec un traitement au losartan augmente le succès de

la transplantation de myoblastes en augmentant la prolifération des myoblastes et leur

fusion, en diminuant l'activation des macrophages et changeant l'expression des facteurs de

régulation myogénique.

114

LOSARTAN ENHANCES THE SUCCESS OF MYOBLAST

TRANSPLANTATION

Raouia Fakhfakh, Yann Lamarre, Daniel Skuk and Jacques P. Tremblay

Unité de recherche de recherche en Génétique Humaine, Centre de recherche de CHUL,

CHUQ, Faculté de médecine, Université Laval, Québec, QC, Canada.

ABSTRACT

Duchenne muscular dystrophy is a recessive X-linked genetic disease caused by

dystrophin gene mutations. Cell therapy can be a potential approach aiming to introduce a

functional dystrophin in the dystrophic patient myofibers. However, this strategy produced

so far limited results. Transforming growth factor P (TGF-P) is a negative regulator of

skeletal-muscle development and is responsible for limiting myogenic regeneration. The

combination of TGF-P signaling inhibition with myoblast transplantation can be an

effective therapeutic approach in dystrophin deficient patients. Our aim was to verify

whether the success of human myoblast transplantation in immunodeficient dystrophic

mice is enhanced with losartan, a molecule that down-regulates TGF-P expression. In vitro,

blocking TGF-P activity with losartan increased proliferation and fusion and decreased

apoptosis in human myoblasts. In vivo, human myoblasts were transplanted in mice treated

with oral losartan. Immunodetection of human dystrophin in Tibialis anterior cross-

sections 1 month post-transplantation revealed more human dystrophin-positive myofibers

in these mice than in non-treated dystrophic mice. Thus blocking the TGF-P signal with

losartan treatment improved the success of myoblast transplantation probably by increasing

myoblast proliferation and fusion, decreasing macrophage activation and changing the

expression of myogenic regulator factors.

115

INTRODUCTION

The super family of transforming growth factor P (TGF-P) cytokines exerts a potent

level of control over muscle gene expression. In 1981, Roberts and colleagues [290]

reported that TGF-P induced the proliferation of rat kidney fibroblasts. Since then, TGF-P

has been found to have a plethora of effects, such as regulation of cell growth, proliferation,

differentiation, adhesion, migration and apoptosis [291]. Its aberrant expression has been

implicated in fibrotic and inflammatory conditions in kidney, liver, and lung [292-294].

Recently, an in vivo role for TGF-P 1 in skeletal muscle regeneration was confirmed [228].

Mice deficient for the extracellular matrix protein fibrillin-1 have increased TFG-pi

signaling activity that causes failure of skeletal muscle regeneration [228]. These mice are

used as a model for the human Marfan syndrome, which is caused by a mutation of the

fibrillin-1 gene [295].

There is recent evidence that elevated TGF-P 1 signaling also limits regeneration in

muscular dystrophies. Conn et al. [228] investigated this possibility in mdx mice, a model

for Duchenne muscular dystrophy (DMD). DMD is caused by mutations in the dystrophin

gene, which leads to a severe deficiency of the dystrophin protein in the muscle. Mutations

within the dystrophin gene can either be inherited or occur spontaneously during germ line

transmission, affecting 1 in 3500 male births. Dystrophin, the dystrophin-associated

glycoprotein complex, and laminin ct-2 form a link between the intracellular cytoskeleton

and the extracellular matrix. This link is crucial to maintain the structural integrity of

myofibers [35, 296]. The main consequence of dystrophin absence in skeletal muscle is

sarcolemmal instability leading to increased myofiber vulnerability to mechanical stress,

resulting in myofiber necrosis, followed by regeneration as long as the regenerative

capacity is not annihilated. The frequent cycles of myofiber necrosis and regeneration lead

to fibrosis and fat infiltration, which progressively replace the muscle tissue.

Cohn et al. [228] found that muscles from mdx mice expressed elevated levels of

proteins induced by TGF-P 1 signaling, and also elevated levels of thrombospondin-1 (TSP-

1), which activates latent TGF-P 1 in response to signaling through the angiotensin II type 1

receptor (ATI). Losartan, an FDA-approved drug, is a potent inhibitor of ATI activation,

thus blocking TGF-P 1 activation by inhibiting TSP-1 production. This blockade restored

116

the regenerative capacity and improved muscle function in mouse models of Marfan

syndrome and DMD [228].

Many older DMD patients are currently being treated with losartan for the

presumptive cardiac benefits and fibrosis reduction induced by angiotensin II-type 1

receptor blockers. A clinical trial of losartan in children with DMD to evaluate its effects on

skeletal muscle strength and function is anticipated to begin enrollment in 2010.

DMD treatment may eventually require a combination of several therapeutic

approaches. Our research group has recently demonstrated that dystrophin expression

following the transplantation of normal myoblasts protects mdx muscle from contraction-

induced damage [297]. Moreover, inhibition of myostatin signal, a member of TGF-P super

family, improved the success of transplantation of myoblasts in max mice and in

immunodeficient Rag'~/mdx mice [275, 298]. Thus, in order to verify whether the blockade

of TGF-P 1 signal improves the success of myoblast transplantation, we have treated Rag '

/mdx mice with losartan and transplanted normal human myoblasts in their Tibialis anterior

(TA) muscles.

MA TERIALS AND METHODS

Isolation of human myoblasts

Primary myoblasts cultures were grown from muscle biopsies of a human cadaveric

donor obtained following informed consent of the family and approval by the Human Ethic

Committee of the Research Center Hospital of Laval University (CRCHUL). The muscle

samples were dissociated with collagenase and trypsin as described (17) and cultured in

MB-1 growth medium (Hyclone, South Logan, UT, USA) with 15% fetal bovine serum

(FBS), 1% penicillin-streptomycin (Gibco, Burlington, Ontario, Canada) and 10 ng/ml

basic Fibroblast Growth Factor (Strathmann Biotec AG, Hamburg, Germany) in a

humidified atmosphere with 5% CO2 at 37°.

Cell proliferation assay

Cellular growth curves were measured using the CyQuant Cell Proliferation Assay

Kit (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) according to the manufacturer's instructions.

Human myoblasts were seeded in 24-well plates at initial densities of 2 x 10 cells per well

117

in a total volume of 100 ul MB-1 supplemented with 10 % FBS and two concentrations of

losartan potassium (Galenova, St-Hyacinthe, QC, Canada) ranging from 0 to 100 uM.

Medium was changed every 2 days. At 0, 3 and 6 days, the medium was discarded, and

plates were frozen at -80°C. The day of the assay, plates were thawed and a cell lysis buffer

(20 mM Tris, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1% SDS) was added to each well. The total

cellular nucleic acid was measured using florescence at 530 ± 12.5 nm emission following

excitation at 485 ± 10 nm by a Hitachi F-4500 fluorescence spectrophotometer (Hitachi

Instruments, Boulder, CO).

Cell differentiation assay

Myoblast differentiation was evaluated by counting the percentage of nuclei inside

myotubes. i.e., syncytia with three or more nuclei. For this test, myoblasts were cultured in

MB-1 for 24 h and the proliferation medium was replaced for 72 h by a fusion medium

(Dulbecco's modified Eagle medium, St. Louis, MO, Canada) containing only 2 % FBS in

presence or not of losartan (10 or 100 uM). Myotubes were visualized by myosin heavy

chain (MyHC) immunodetection. The cells were fixed with 95% ethanol, washed twice

with phosphate-buffered saline (PBS) for 10 min and blocked with 10% FBS in PBS for 1

h. The samples were incubated 2 h at room temperature with a mouse anti-MyHC mAb

(MF20, DSHB, Iowa City, IA) (1:100) and then for 1 h with an anti-mouse Ig Alexa 546-

conjugated secondary antibody (Invitrogen) diluted 1:100. Finally, the cells were washed

with PBS and mounted with PBS/glycerol. 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)

staining was done with PBS to label the nuclei. The number of nuclei in the myotubes was

counted and normalized with the total number of nuclei in the culture well as a measure of

terminal differentiation.

Analysis of apoptosis and necrosis

An apoptosis and necrosis assay was performed by flow cytometry according to the

manufacturer's protocol (BD BioSciences, San Jose, CA). Briefly, myoblasts treated or not

with losartan (10 uM) were exposed or not to 10 mM hydrogen peroxide (H2O2,

Merck&CO., Inc NJ) for 2 h. After trypsinization, the cells were harvested, washed twice

with Hank's balanced salt solution, and suspended in binding buffer (10 mmol/1 HEPES,

118

pH 7.4, 140 mmol/1 NaCl, 2.5 mmol/1 CaC12). Aliquots of 100 ul suspension (lxlO5 cells)

were incubated with 5 ul Annexin V-FITC and 5 ul propidium iodide (PI) (50 ug/ml) for

15 min at room temperature in the dark. 400 ul of binding buffer was added to the cell

suspension. The cells were gently vortexed and analyzed within 1 h by flow cytometry

(Becton-Dickinson, Oxford, UK). Apoptotic cells were quantified by percentage of

Annexin V-FITC-positive cells among the total gated cells, while necrotic cells were

quantified by calculating the percentage of Pi-positive cells in the total gated cells.

Cell radio-labeling

Myoblasts cultured in MB-1 for 24 h were radio-labeled by further proliferation for

48 h in MB-1 containing 0.25 uCi/ml [methyl-14C]-thymidine (50mCi/mmol) before their

transplantation.

Animals

All experiments were performed in two-month-old Rag' '/mdx mice produced in our

animal facilities by crossing mdx/mdx mice (a DMD model due to a mutation leading to

dystrophin deficiency) with Rag mice (an immunodeficient mouse that accepts human

grafts). The mice were maintained under pathogen-free conditions. All the experiments

with mice were conducted in accordance with the Laboratory Animal Care and use Ethics

Committee of Laval University

Losartan treatment and cell transplantation

The myoblast transplantation success was evaluated in mice previously treated or

not with oral losartan (0.6 g/1 [228, 299, 300] in drinking water; n=5) during 15 days. 5 x

105 human myoblasts resuspended in 10 ul of HBSS were transplanted in both TAs using a

glass capillary along 12 transversal axis trajectories. Mice were euthanatized one month

after myoblast transplantation.

For muscle regeneration and cell survival experiments, mice were treated or not

with oral losartan (0,6 g/1 in drinking water; n=5) for 40 days and 5 x 105 radio-labeled

cells were transplanted in both TAs.

119

Muscle sampling and processing

Mice were killed at different post-transplantation times depending on the

experiment, i.e., at 1 month for experiments to evaluate the myoblast transplantation

success and at days 0, 3 and 5 for experiments to evaluate the early grafted-cell survival.

Muscles for histological analyses were mounted in embedding medium and snap-frozen in

liquid nitrogen. Serial 12 urn cross-sections were obtained in a cryostat at -25°C. Muscles

for DNA or RNA extraction were placed in microtubes, snap-frozen in liquid nitrogen and

stored at -80°C.

Quantification of early grafted-cell death

The DNA of the TAs grafted with radio-labeled cells was extracted after 0 and 3

days using the phenol - chloroform method. Briefly, muscles were minced and incubated

with 50 ul of proteinase K (10 mg/ml) at 56°C until the solution became clear. Digested

muscles were then mixed with 500 ul of a solution of phenol/chloroform/isoamyl alcohol

(25:24:1) and centrifuged 3 min at 13,000 rpm. The upper solution was recovered and

mixed with the same volume of chloroform and centrifuged again. The upper solution was

recovered and 25 ul of 3 M sodium citrate was added before the addition of 1 ml of 100%

ethanol. After centrifugation 8 min at 13,000 rpm, the pellets were washed in 70% alcohol

before another centrifugation. The pellets were then dried before the suspension of the

DNA in 100 ul sterile water. Similar aliquots of the DNA solution were mixed with 5 ml of

a liquid scintillation counting cocktail (Sigma, Oakville, ON, Canada) and radioactivity

was measured in a counter system. (Mod. Wallac 1409, Woodbridge, Ontario, Canada).

Histological immunodetection

For immunohistochemistry, the TA cross-sections were fixed in 4%

paraformaldehyde, washed in PBS for 15 min and blocked with FBS (10%) in PBS for 1 h.

The following antibodies were used for this study: a mouse anti-human dystrophin mAb

(7F7, MRIC Biochemistry Group, Wrexham, UK) (1 h, 1:300), a rabbit polyclonal antibody

against pSmad2 (Cell Signal, Danvers, MA) (O/N, 1:1000), a mouse mAb against human

lamin A/C (Vector laboratory, CA) (30 min, 1:300) to visualize human nuclei, and a rabbit

polyclonal antibody against periostin (Abeam Cambridge, MA) (1 h, 1:250). Depending on

120

the primary antibody, the second reaction was done either with a biotinylated anti-mouse Ig

antibody (Dako, Copenhagen, Denmark) (1/300) followed by streptavidin-Cy3 (Sigma)

(1:300), Alexa 488 fluor-conjugated goat anti-rabbit Ig or anti-mouse Ig (Invitrogen

Burlington) (1:300) for 1 h at room temperature. Nuclei were stained with DAPI (1:10000)

for 5 min and cryostat sections were mounted using fluoromount G (Electron Microscopy

Sciences, Hatfield, PA)

The dystrophin-positive myofibers were counted in 12 cryostat sections separated

by 150 um for each of the 5 muscles of each group. Afterward, the 5 highest sections of 5

TAs from each group were selected and the means + SD were calculated.

Immunodetection of inflammatory cells were performed on muscle cross-sections of

mice treated 45 days with oral losartan and transplanted 5 days before the end of the

treatment. After fixation with 4% paraformaldehyde, non-specific binding sites were

blocked by incubating the sections with FBS (10%) in PBS for 1 h. Sections were then

incubated with a rabbit anti-mouse Mac-1 polyclonal antibody (Roche Diagnostics,

Mississauga, ON, Canada) or a biotinylated monoclonal anti-mouse F4-80 (Peninsula

Laboratories, San Carlos, CA) for 1 h at room temperature, followed respectively by 30

min with a goat anti-rabbit Ig secondary antibody conjugated with Alexa 546 (Invitrogen)

and streptavidin-Cy3. To quantify the labeling fluorescence, we used the Image J. 1.40g

(Wayne Rasband, National Institues of health, USA).

Quantitative RT-PCR

Quantitative RT-PCR (Q-RT-PCR) was used to examine the mRNA expression

levels of TSP-1, myogenic regulator factors (MRFs) (MyoD, Myf5 and Myogenin),

inducible nitric oxide synthase (iNOS) and type 1 collagen in the TAs of 45 days oral

losartan treated or untreated mice. The mRNA was extracted using an RNeasy Plus kit

(Qiagen, Mississauga, ON Canada). The cDNA templates for Q-RT-PCR were synthesized

by an inverse transcriptase with 1 ug RNA in superscript II Rnas H-RT reaction

(Invitrogen). Q-RT-PCR was carried out in a Light Cycler 480 (Roche) with SYBR Green

light Cycler Fast Start DNA Master Plus (Roche) as a detector. All target gene expressions

121

were normalized to GAPDH levels. The primer pairs were designed with GeneTools

logiciels (Biotools Inc., Madrid, Spain) and are displayed in Table 1.

STA TISTICAL ANAL YSIS

The experimental values were presented as means + SD. Statistical analyses were

performed by analysis of variance (one-way ANOVA) with Fisher's PLSD test and tukey's

test for multiple comparisons post-hoc in the StatView statistical package (StatView 5,

SAS Institute Inc. Cary, NC). Differences were considered statistically significant at

P<0.05.

RESULTS

Losartan treatment increased myoblast growth in vitro

A fluorescence-based assay that correlates with cell number was used to determine

the effects of losartan on human myoblast proliferation. Myoblast proliferation was

significantly increased after 6 days of treatment with 10 and 100 uM losartan (P<0.05)

(Figure 1A).

Considering that TGF-P 1 is a myoblast differentiation inhibitor, we wanted to

evaluate in vitro the effect of losartan on the myogenic differentiation of human myoblasts.

After switching confluent myoblasts to a differentiation medium, a losartan treatment

during 3 days increased significantly the number of myotubes immunostained for MyHC

(Figure IB). Moreover, the fusion index was significantly increased by 10% with 10 uM

losartan and by 15% at 100 uM (Figure 1C). Thus the increased differentiation of human

myoblasts by losartan was dose dependent.

Losartan prevented H202-induced apoptosis and necrosis in myoblasts

Myoblast apoptosis was induced with H2O2 in presence or absence of losartan. The

percent of apoptotic and necrotic cells was determined by flow cytometry following

staining with Annexin V-FITC and PI (Figure 2A-D). The treatment with 10 uM losartan

did not change the percentage of viable cells when they were not exposed to H2O2, but

reverted apoptosis and necrosis induced by H2O2 (Figure 2E).

Improved success of human myoblast transplantation in mice treated with

losartan

122

To investigate the effect of blocking the TGF-P 1 signal on the long-term success of

the transplantation of human myoblasts in dystrophic mice, human dystrophin was detected

by immunohistochemistry in muscles transplanted with myoblasts in mice treated or not

with losartan during 45 days (Figure 3A, B). About 50% more dystrophin-positive

myofibers were present in the muscle cross-sections of mice treated with losartan (191 ±40

myofibers per muscle cross-section) than in control mice (126 ± 29) (Figure 3C).

Losartan enhanced the survival of engrafted human myoblasts

To identify the cause of the increased success of human myoblast transplantation in

mice treated with losartan, we evaluated the survival of the grafted cells. We first quantified

the human nuclei (identified by human lamin A/C immunodetection) present in the cell-

grafted TAs. The number of human nuclei was significantly higher in the TAs of losartan-

treated mice compared to the controls (Figure 3D).

In a second experiment, the early post-transplantation survival of human myoblasts

was evaluated by first radiolabeling them with [14C]-thymidine before their transplantation

and then quantifying the radiolabel in the cell-grafted muscles at the time of transplantation

and 3 days later. Approximately 6% of the radiolabel present in the cell-grafted muscles at

time 0 was detected 72 h post-transplantation in mice untreated with losartan, in contrast

10% of the radiolabel was still present in losartan-treated mice (Figure 4). Thus there was a

significant increase of myoblast survival in mice treated with losartan.

Increased expression of p S mad2 and periostin in losartan-treated mice

To evidence a cause-and-effect relationship between losartan treatment and

inhibition of TGF-P 1 signaling, we detected periostin, pSmad2, and TSP-1 in skeletal

muscles of mice treated or not with losartan during 45 days (Figure 5). Periostin, a protein

induced by TGF-P 1 and expressed in regenerating skeletal muscle, was detected by

immunoshistochemistry in the sarcolemma and endomysium of control mice, but was

almost absent in losartan-treated mice (Figure 5A). pSmad2, the mammalian homolog of

the Drosophila mothers against decapentaplegic (Mad) implicated as downstream effectors

of TGF-p/BMP signaling, was detected in myofiber nuclei of control mice, but not in mice

treated with losartan (Figure 5B). Expression of TSP-1 mRNA, a potent mediator of

123

angiotensin Il-induced TGF-P 1 activation via AT-1 was greatly reduced in losartan-treated

mice compared with control mice (Figure 5C).

Expression of MyoD family mRNA in mice treated with losartan

Q-RT-PCR analyses of Myf5, myogenin and MyoD showed significant increases in

the expression of Myf5 and myogenin in mice treated 45 days with losartan compared with

control mice (Figure 6).

Reduction of macrophage infiltration in losartan-treated mice

Immunodetection of Mac-1, a cell surface marker for macrophages but also for bone

marrow, spleen and natural killer cells, granulocytes and blood monocytes, in the TAs of

Rag-Mndx mice 5 days after myoblast transplantation demonstrated the presence of

inflammatory cells, but no difference was observed between losartan-treated or untreated

mice (Figure 7A). However, immunodetection of F4/80, an antigen present on major

subpopulations of resident tissue macrophages [301], in the same muscles demonstrated a

lower amount of macrophages in losartan-treated mice (Figure 7B). Since iNOS is a main

mediator of macrophage cytotoxicity, we wanted to verify whether the decrease in the

number of macrophages was accompanied by a decrease in iNOS expression. Using real

time PCR, we observed a decrease of > 60% in iNOS expression in the TAs of losartan-

treated mice compared with control mice (Figure 7C).

Dystrophin-positive myofibers size and collagen content

No difference in cross-sectional area of human dystrophin-positive myofibers was

observed between losartan-treated and untreated mice (Figure 8A). On the other hand, the

losartan-treated mice had significantly lower concentrations of type I collagen mRNA than

untreated mice (Figure 8B).

DISCUSSION

TGF-P 1 is a member of the TGF-P family and is an endogenous negative regulator

of muscle growth. It is homologous to myostatin and induces several similar effects in

muscles, including the inhibition of proliferation and differentiation of muscle precursor

124

cells, and stimulation of fibrosis [302, 303]. The inhibition of TGF-P 1 is a potential

therapeutic strategy for DMD [61, 304]. One study showed that losartan, an angiotensin II-

type I receptor blocker usually used for the treatment of hypertension, was well tolerated in

mdx mice, and that the administration of this drug for 6 to 9 months led to muscle

improvements such as less fibrosis and increased absolute force [228]. Many DMD patients

in advanced stages of the disease are currently being treated with losartan for the

presumptive cardiac benefits of angiotensin Il-type I receptor blockers.

Considering the potential benefits of losartan for the treatment of muscle diseases,

we decided to test its effects in the context of myoblast transplantation, another potential

therapeutic tool for DMD [150]. Indeed, our study is the first to demonstrate a potentially

beneficial role of TGF-6 1 inhibition for human myoblast transplantation in DMD. We used

a Rag'Vmdx mouse model, which accommodates xenotransplantation, hence human

myoblast implantation.

Despite the absence of T cells, important producers of TGF-P, the biological effect

of TGF-P was present because this cytokine was secreted by other cells such as myeloid

and dendritic cells [305, 306]. Thus, we observed that mice treated with oral losartan

presented 50% more dystrophin-positive myofibers and human nuclei than untreated mice

after human myoblast transplantation. Considering the other results of the present study,

this improvement could be explained by factors such as an increased early survival,

proliferation and/or differentiation of the transplanted myoblasts, as discussed below.

Some of our experiments support the potential role of the increased early survival of

the transplanted myoblasts in the improved myoblast transplantation success due to the

losartan treatment. In vivo, we observed a 40% improvement of the early survival of the

implanted myoblasts in the recipient muscle, measured by quantifying the radio labeled

cells grafted in losartan-treated mice. Indeed, one of the problems of a therapy based on

myoblast transplantation is the transplanted myoblasts acute death within the first 3 days

post-transplantation [158, 160, 307]. This phenomenon was attributed by some researchers

to a cell killing by the inflammatory cells that infiltrate the myoblasts grafts, such as

neutrophils and monocytes/macrophages. If this is the case, the improvement of the early

survival of the implanted myoblasts in losartan-treated mice could be explained by the

reduction of the macrophage infiltration and iNOS expression evidenced after myoblast

125

transplantation in the present study. Our in vitro experiment showing a protective effect of

losartan against oxidative-induced cell death may further explain the increased early

survival of the transplanted myoblasts and the increased myogenic differentiation [308]. An

attenuation expression of molecules involved in macrophage recruitment and the associated

reduction of macrophage recruitment was observed in renal allograft [309].

Other causes of the myoblast transplantation improvement observed are the

beneficial effects of losartan on the proliferation and/or differentiation of human myoblasts.

In our study, the proliferation and differentiation of human myoblasts was significantly

increased after inhibition of TGF-P 1 in vitro. This positive effect was not observed in

C2C12 cells, an immortal mouse myoblast line [310], Moreover, the estimation of these

development stages was problematic in vivo. MRFs, which are key orchestrators of muscle

gene expression, are targeted by TGF-P 1 signaling. Thus, our results demonstrated the

effects of losartan treatment on the mRNA expression of these genes. MyoD family (i.e.,

the basic helix-loop-helix transcription factors: Myf5, MyoD and myogenin) plays an

essential role as central regulators of myogenesis [311]. Myf5 and MyoD are expressed in

myoblasts and myotubes, and are required for myogenesis. Myogenin is critical for

myotubes formation and terminal myogenic differentiation events [311], since it is highly

expressed when myoblasts commit to differentiation state to form myotubes. Our result

confirmed that the expression of MRFs in muscle treated with losartan was increased. Thus,

inhibition of TGF-P 1 re-programs gene expression in muscle cells promoting the

proliferative capacity and myogenic differentiation of myoblasts. Brennan and colleagues

[312] showed that TGF-P 1 inhibited the transcriptional activity of myogenin without

affecting its DNA binding affinity. Further, it has been shown that TGF-P 1 targets the basic

helix-loop-helix region of all MRFs, decreasing their DNA transcriptional activity without

affecting their binding properties [313, 314]. Among a plethora of secreted soluble growth

factors affecting muscle differentiation, TGF-P 1 has been implicated as a potent repressor

of the myogenic gene expression program as it initiates an intracellular cascade that

prevents activation of genes associated with terminal differentiation in muscle cells [315,

316].

Collaterally, we also observed that losartan-treated mice had lower amounts of type

I collagen mRNA than non-treated mice. Since fibrosis is a major factor in muscle function

126

impairment in DMD patients, our preliminary observation implies that losartan should be a

promising agent to avoid or reduce the development of fibrosis in the skeletal muscles of

these patients. More studies are needed to evaluate the actual clinical relevance of this first

observation in dystrophic mice. However, the effect of losartan as an anti-fibrotic therapy

to promote optimal skeletal muscle healing has already been demonstrated [317]. Similar

success in reducing residual fibrosis and enhancing myofiber regeneration, as well as

success in improving function, has been observed in animal models, albeit after treatment

with potentially harmful compounds [318, 319]. Another study demonstrated a lower

amount of connective tissue following islet grafts with a chronic losartan treatment was due

to the inhibition of the pro-fibrotic properties of angiotensin II mediated through the ATI

receptor [320].

In conclusion, losartan was demonstrated in this study to have many potential

beneficial effects on myoblast transplantation in dystrophic mice.

Losartan is approved for clinical use and is presently being used in DMD patients,

including a clinical trial to evaluate its effects on muscle strength and fibrosis that was

anticipated to begin in 2010 (MDA DMD Clinical Research Network). Thus, we can

envisage a potential clinical combination of losartan and myoblast transplantation for the

treatment of DMD in the future, aiming to improve the quality of life of these patients.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank Glenn E. Morris and Le Thanh Lam (MRIC Biochemistry Group) for

providing the MANDYS104 (7F7) antibody. This work was supported by grants from the

Muscular Dystrophy Canada, Amyotrophic Lateral Sclerosis Foundation and the Canadian

Institute for Health Research.

127

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130

TABLES

Gene Name ( GenBank™ no.)

PCR

Region products

(Pb)

Primer pair

(S : sense primer, A : anti-sense primer)

Thrombospondin (TSP-1)

(NM_011580)

myogenic differentiation l(Myod)

(NM_010866)

myogenic factor 5 (Myf5)

(NM_0O8656)

myogenin (Myog)

(NM031189)

induciblenitric oxide synthase (iNos)

(NM_010927)

Type 1 alpha 1 collagen

(NM007742)

gly ceral dehyde-3 -phosphate

dehydrogenase (GAPDH)

(NM_008084)

2517-2672 156

1240-1391 152

535-746 212

622-827 206

772-892 121

3937-4074 138

647-840 194

S: 5'-CCCTACAACCACAACCCTGAC-3'

A: 5'-AACCCCATCCATGTCCGTGTC-3'

S:5'-AGCTTAAATGACACTCTTCCCAACT-3,

A:5 ' AAAAACAAACAAACAACTGAAGGACTA-3 '

S:5'-CCACCAACCCTAACCAGAGACT-3'

A : 5 '-GCTGCTGTTCTTTCGGGACC A-3 '

SiS'-TGACCCTACAGACGCCCACAATO'

A:5'-GACATCAGGACAGCCCCACTTA-3'

S:5'-AGGATCCAGTGGTCCAACCTGCA-3'

A:5 '-CCGACCTGATGTTGCCATTGTTG-3 '

S:5'-TGCAACATGGAGACAGGTCAGA-3'

A:5'-GAACGGGAATCCATCGGTCAT-3'

S:5'-GGCTGCCCAGAACATCATCCCT-3'

A: 5'-ATGCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'

Table 1: Primer pair design.

131

FIGURE LEGENDS

Figure 1: Losartan stimulated human myoblast proliferation and

differentiation. Human myoblasts were cultured in MB-1 alone or with losartan potassium

at 10 uM and 100 uM for 6 days. The number of cells was evaluated with the CyQuant Cell

Proliferation Assay Kit at time 0 and after 3 and 6 days (A). The results are expressed as

arbitrary fluorescent units measured at 530 nm (means + SD, N=5). The * indicate

significantly greater values at 6 days in losartan-treated cultures than untreated cultures due

to increased proliferation. (B) Myoblasts were transferred to differentiation medium

(DMEM, 2% FBS) for 3 days in the presence of losartan at 10 uM and 100 uM or without

losartan. The cultures were immuno-stained with anti-MyHC and with DAPI to visualize

the nuclei. Representative pictures are presented in B, scale bar = 0.2 mm. (C) The mean

fusion indexes (+ SD, N=3) are illustrated. The * indicate significantly higher results in

losartan-treated myoblasts than control myoblasts. ** Significantly higher in 100 uM

losartan-treated myoblasts than 10 uM losartan-treated myoblasts.

Figure 2: Losartan prevents myoblast apoptosis and necrosis induced by H202

Myoblasts were treated with or without losartan potassium (10 uM) in vitro for 2 days.

They were then incubated with hydrogen peroxide for 2 h and stained with annexin V-FITC

and PI for flow cytometry analysis. The downright quadrants of A to D represent early

apoptosis (Annexin V-FITC-positive cells and Pi-negative cells). The top right quadrants

represent late apoptosis and necrosis (Annexin V-FITC-positive cells and Pi-positive cells).

(A) Untreated control cells. (B) Cells treated with 10 uM losartan potassium. (C) Cells

treated only with hydrogen peroxide. (D) Cells treated with both 10 uM losartan potassium

and hydrogen peroxide. (E) Cells were counted in quadrant scatter plot. The percentage of

132

apoptotic cells was calculated by dividing the Annexin V-FITC-positive and Pi-negative

cells (AV+/PI-) by the total number of gated cells and multiplying by 100. The percentage

of necrotic cells was calculated as the number of the Annexin V-FITC-negative and PI-

positive cells (AV-/PI+) divided by the total number of gated cells and multiplying by 100.

Representative pictures are presented. The mean expressions (+ SD, N=3) are illustrated.

The * indicate significantly higher levels of apoptosis in H2Û2-treated myoblasts than in

other treatments. The ^ indicate significantly higher levels of necrosis in H202-treated

myoblasts than other treatments.

Figure 3: Increased success of human myoblast transplantation in mice treated

with losartan. Immunohistochemical detection of human dystrophin (red fluorescence) in

TA sections of untreated Rag~'~/mdx mice (A) and losartan-treated Rag'/rndx mice (B) one

month after the transplantation of human myoblasts. C: Graphical representation of the

mean number (+SD, N=5) of dystrophin-positive myofibers per cross-section of TAs

transplanted with human myoblasts in Rag'/rndx mice treated or not with losartan during

45 days (15 days before and 30 days after the transplantation). There are, on average, 51%

more dystrophin-positive myofibers in TA of mice treated with losartan. D: The mean

numbers (+SD, N=5) of lamin A/C positive nuclei per cross-section of TA muscles

transplanted with human myoblasts and treated or not with losartan during 45 days. There

are, on average, 50% more human lamin A/C positive nuclei in the TA of mice treated with

losartan. Representative pictures are presented in A and B. Scale bar = 50 urn. * indicates a

significantly higher result in losartan-treated Rag'/rndx mice than control Rag'"/mdx mice.

Figure 4: Losartan treatment increased the early survival of transplanted

myoblasts.

133

5x105 radio-labeled cells were transplanted in the TA of Rag-/vmdx mice treated

or not with oral losartan. The muscles were removed at day 3 after transplantation and the

DNA was extracted to quantify the radioactivity. There is 40% more radiolabel in the DNA

extracts of losartan-treated mice, indicating a better survival of the radio-labeled human

myoblasts. The mean radioactivity's (+SD, N=5) are illustrated. * indicates a significantly

higher result in losartan-treated Rag-/-/mdx mice than in control Rag-/-/mdx mice.

Figure 5: Losartan decreases angiotensin-II-mediated TGF-P signaling in Rag"

/mdx mice. A and B: Immunofluorescent detection of target proteins downstream of

angiotensin-II receptor. The TAs of control non-treated Rag~'~/mdx mice show periostin

expression in the sarcolemma and extracellular matrix (A) and nuclear expression of

pSmad2 (B) on the contrary of losartan-treated Rag^/mdx mice. C: Real-time PCR to

quantify the expression of TSP-1 mRNA. The graphic shows a significant decrease of TSP-

1 expression in losartan-treated Rag'/rndx mice compared to untreated Rag^/mdx mice.

Scale bar = 50 um. The mean expressions are represented (+ SD, N=5). * Significantly

higher in losartan-treated Rag'/rndx mice than control Rag'/rndx mice.

Figure 6: Expression of MyoD family mRNAs in muscles of Rag^'/mdx mice

treated or not with losartan. The mRNA expression of the MRFs was quantified by Q-

RT-PCR. The expression of Myf5 and myogenin were significantly increased by the

treatment with losartan in Rag'/rndx mice. The expression of Myf5, the earliest marker of

myogenic commitment, was the most up-regulated (more than 50%). The mean expressions

are represented (+ SD, N=5). * Significantly higher in losartan-treated Rag '/mdx mice than

in control Rag'''/mdx mice.

134

Figure 7: Fewer macrophages are found in muscles of losartan-treated Rag"

/mdx mice grafted with myoblasts. A and B: The fluorescent immunodetection of Mac-1

and F4/80 was quantified in TAs of Rag'/rndx mice treated or not with oral losartan during

45 days. The myoblasts were transplanted after 40 days of the treatment. C: The mRNA

expression of iNOS was quantified by Q-RT-PCR. The expression of iNOS was

significantly decreased in losartan treated Rag''/mdx mice compared with untreated Rag'''

/mdx mice. The mean expressions are represented (+ SD, N=5). * indicates a significantly

lower expression in losartan-treated Rag'/rndx mice than control Rag'/rndx mice.

Figure 8: Inhibition of TGF-p signaling does not induce hypertrophy but

reduces expression of collagen type I. A: Cross-sectional area of human-dystrophin

positive myofibers, measured in the TAs of Rag/mdx mice treated or not with oral losartan

for 45 days and transplanted with human myoblasts at day 15.There is no significant

difference between both groups. B: The mRNA of collagen type I was quantified by Q-RT-

PCR. The expression of collagen type I was significantly decreased by the treatment with

losartan in Rag'/rndx mice. The mean expressions are represented (+ SD, N=5). * indicates

a significantly lower expression in losartan-treated Rag'/rndx mice than control Rag'/rndx

mice.

135

© M

"S 3

-<

E s e

"ô! V

9

8 H

7

6 H

5

4

3

2

1

0 DayO

D Control myoblasts E3 Losartan treated myoblasts

(10p.M) ■ Losartan treated myoblasts

(100p.M)

Day 3 Day 6

Control myoblasts Losartan treated myoblasts (10p.M)

Losartan treated myoblasts (lOOuM)

□ Control myoblasts 0 Losartan treated myoblasts

(10nM) ■ Losartan treated myoblasts

(lOOuM)

Day 3

Figure 1

136

£- ,

< i

Qt

Q 4

-134 qpaq—i 11 n i | — m n ^ — r m n ^ — r 0 W 10' I»

4 10' FITC-A

-134 ■ I ■ Ht)—r-n™q—I 11 n i

0 10-' I03 104 I0?

FITC-A

B

Q l

-134

D

Q 2

Q «

pnf—i 11 n»|—n-m«|—rrrn»q—r 0 ] & 10' I0

4 10" FITC-A

S-i

2-i

< s-i Q i Q 2 a. :

o— 3 ° q * ■ * » ' Q *

-134 o \(f io5 IO1 io?

FITC-A

6 -,

D Apoptosis 5 - ■ Necrosis

S 4 -

« 3 S ■o

u l

1 -

I 1

T-1

J L , r T^

Control Losartan H,0, H,Oyiosartan myoblast treated treated ~ treated

myoblasts myoblasts myoblasts (lOpM) (10 pM)

Figure 2

137

B

Rag" '/mdx mice Losartan Rag"7mdx mice

D

□ Rag/mdx mice

0 Losartan Rag"7mdx mice

D Rag/mdx mice

0 Losartan Rag" /mdx mice

Figure 3

138

1600 I 1 10.04%

a

<

o

1400 a

<

o

1200

1000

1 u

800

600

400

200

0

□ Rag'Vmdx mice ■ Losartan Rag'/rndx mice

Figure 4

139

Rag "'"/mdx mice Losartan Rag'/rndx mice

u ir. C u

PU

B Rag'/rndx mice Losartan Rag'/rndx mice

DRag"'"/mdx mice ■ losartan Rag'/rndx mice

Tsp. 1

Figure 5

140

DRag'/rndx mice ■ Losartan Rag'/rndx mice

MyoD Myf5 Myogenin

Figure 6

141

B

□ Rag'/rndx mice ■ Losartan Rag'Vmdx mice

MAC-1

□ Rag'/mdx mice ■ Losartan Rag'/mdx mice

F4-80

Figure 7

□ Rag'/mdx mice ■ Losartan Rag'/mdx mice

iNOS

142

1 30

o T —

^ 25 a - 70 a c © 15 V o S/2 10 c« t/5 O lu.

5 O

D Rag-/-mdx mice ■ Losartan Rag"'7mdx mice

B 16U

v - ^ S 140 O </5 120 i/5 0>

-100

a a» 80 < 60 Z S 40 s

D Rag'/mdx mice ■ Losartan Rag'/mdx mice

Collagen I

Figure 8

143

Chapitre VII : L'administration du Récepteur Soluble de L'activine de

Type IIB Augmente le Succès de la Transplantation des Myoblastes

Humains chez Des Souris Dystrophiques.

Raouia Fakhfakh, Se-Jin Lee and Jacques P. Tremblay

Contribution de chaque auteur :

J'ai effectué toutes les manipulations retrouvées dans le présent article. Se-Jin Lee

nous a fournit le récepteur soluble de l'activine. J'ai rédigé l'article sous la supervision de

Dr. Jacques P. Tremblay.

Résultats soumis pour le journal Cell transplantation, 2010.

144

RÉSUMÉ

La DMD est une maladie récessive causée par une mutation du gène de la dystrophine. La transplantation de myoblastes permet l'introduction du gène de la dystrophine dans les fibres musculaires dystrophiques. Cependant, cette stratégie a jusqu'ici produit des résultats limités. La modulation de la signalisation des facteurs de croissance de la superfamille des TGF-P favorise la différenciation du muscle squelettique et la croissance et la régénération myogénique. Nous avons étudié la possibilité de combiner l'inhibition de la signalisation de la superfamille des TGF-P avec la transplantation de myoblastes chez des souris dystrophiques. In vitro, le blocage de la signalisation de la myostatine et d'autres ligands avec une forme soluble du domaine extracellulaire du récepteur de l'activine IIB (ActRIIBFc) augmente l'expression des facteurs de différenciation myogénique ainsi que la fusion des myoblastes humains. In vivo, l'inhibition systémique de la signalisation des ActRIIB par l'injection de l'ActRIIB/Fc augmente le succès de la transplantation de myoblastes. Cet effet est plus prononcé en forçant la souris à la nage pour inciter les cycles de la dégénérescence musculaire et la régénération. Le traitement des souris dystrophiques avec ActRIIB/Fc augmente leur poid corporel, leur masse musculaire squelettique et le succès de la transplantation de myoblastes humains. Ainsi, l'administartion de l'ActRIIB/Fc représente une stratégie thérapeutique efficace pour les dystrophies musculaires, et ses effets sont renforcés en les combinant avec de l'exercice musculaire.

145

ADMINISTRATION OF A SOLUBLE ACTIVIN TYPE IIB RECEPTOR PROMOTES

THE TRANSPLANTATION OF HUMAN MYOBLASTS IN DYSTROPHIC MICE

Raouia Fakhfakh1, Se-Jin Lee2 and Jacques P. Tremblay1

1 Unité de recherche de recherche en Génétique Humaine, Centre de recherche de

CHUL, CHUQ, Faculté de médecine, Université Laval, Québec, QC, Canada.

department of Molecular Biology and Genetics, Johns Hopkins University School

of Medicine, Baltimore, Mayland, USA.

ABSTRACT

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a recessive disease caused by a dystrophin

gene mutation. Myoblast transplantation permits the introduction of the dystrophin gene

into dystrophic muscle fibers. However, this strategy has so far produced limited results.

Modulation of transforming growth factor p (TGF-P) superfamily signaling promotes

skeletal muscle differentiation and growth and myogenic regeneration. We investigated the

possibility that the combination of TGF-P superfamily signaling inhibition with myoblast

transplantation might be an effective therapeutic approach in dystrophin deficient patients.

In vitro, blocking myostatin and other ligands with a soluble form of the extracellular

domain of the activin IIB receptor (ActRIIB/Fc) up-regulated the expression of myogenic

differentiation factors and increased human myoblast fusion. In vivo, systemic inhibition of

activin IIB receptor signalling by delivery of ActRIIB/Fc increased the success of the

myoblast transplantation. This effect was further increased by forcing the mice to swim

weekly to induce cycles of muscle degeneration and regeneration. Treatment of dystrophic

mice with ActRIIB/Fc led to increased body weight, increased skeletal muscle mass and

improved myoblast transplantation. Thus ActRIIB/Fc represents an effective therapeutic

strategy for muscular dystrophies, and its effects are enhanced when combined with muscle

exercise.

146

INTRODUCTION

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe degenerative disorder of skeletal

and cardiac muscles that affect ~ 1 in 3500 male births [321]. DMD patients

characteristically display progressive muscle weakness, which begins in early childhood

[322]. Although the mutation in the gene encoding dystrophin responsible for DMD is

present at birth, clinical symptoms are not evident until 3-5 years of age [323]. New

insights into the pathophysiology of dystrophic muscle, the identification of compensating

proteins, and the discovery of new binding partners are paving the way for novel

therapeutic strategies to treat this fatal muscle disease. Dystrophin is required for the

assembly of the dystrophin-glycoprotein complex and provides a mechanically strong link

between the cytoskeleton and the extracellular matrix.

So far there is no corrective therapy for the DMD, but several potential therapies

have been considered to increase muscle mass, improve muscle physiology and reduce

fibrosis [271]. A particularly attractive strategy is the inhibition of TGF-P signaling

pathways. TGF-P superfamily members, including TGF-P 1 and myostatin, are known to

negatively regulate muscle growth [324]. Myostatin, also known as growth/differentiation

factor-8 (GDF-8), is predominantly expressed in skeletal muscle tissue, where it is secreted

and circulated as a serum protein [324]. Myostatin inhibition has been shown to ameliorate

the phenotype of mouse models of muscular dystrophy (mdx mice) by increasing muscle

growth and regeneration [263, 325, 326]. The development of myostatin inhibitors, such

follistatin [240, 327], follistatin-related gene [256] GDF-associated serum protein-1 [257],

anti-myostatin antibodies [263, 328] and the myostatin propeptide [240, 329] has offered a

multifaceted approach to the treatment of muscle degenerative diseases currently under pre­

clinical or clinical investigation. They range from suppression of myostatin activity to

inhibition of myostatin activation. Interestingly, Lee et al. demonstrated that a soluble

version of the activin type IIB receptor (ActRIIB/Fc), which competes with the natural

receptor for circulating agonists of this receptor, promotes skeletal muscle growth in wild

type mice [276]. The in vivo ligands for ActRIIB include activin, inhibin, members of the

bone morphogenetic protein (BMP) family, myostatin and growth and differentiation factor

11 (GDF11) [279, 330]. Sako et al. demonstrated that both myostatin and GDF-11 bind the

147

extracellular domain of ActRIIB with high affinities comparable with those of activin-A,

whereas the affinities of BMP-2 and BMP-7 for ActRIIB are lower by orders of magnitude

[331].

Myoblast transplantation represents a potential approach to restore the missing

dystrophin [151, 332]. However, this technique requires multiple close injection trajectories

due to limited migration of transplanted muscle precursor cells (myoblasts) and their fusion

only with damaged host fibers [148, 333, 334]. Several approaches have been developed to

resolve these problems, among them, the blockade of myostatin and homologous proteins

in mdx mice or in normal human myoblasts by follistatin up-regulation or by dnActRIIB

expression. These approaches increased the extent of muscle repair and improved the

success of myoblast transplantation (measured by the number of dystrophin positive fibers

present in mdx mouse muscles) [275, 298, 335].

The aim of the present study was to investigate whether systemic administration of

ActRIIB/Fc improves the transplantation of human myoblasts.

MA TERIAL AND METHODS

Isolation of human myoblasts

Primary myoblast cultures were derived from a muscle biopsy of the Quadriceps

femoris of a human cadaveric donor aged 13 months following informed consent of the

family and approval by the Human Ethic Committee of the Research Center Hospital of

Laval University (CRCHUL). The muscle samples were dissociated with collagenase and

trypsin as previously described [289] and cultured in MB-1 growth medium (Hyclone,

South Logan, UT, USA) with 15% fetal bovine serum (FBS), 1% of penicillin-streptomycin

(Gibco, Burlington, Ontario, Canada) and 10 ng/ml of basic Fibroblast Growth Factor

(Strathmann Biotec AG, Hamburg, Germany) in a humidified atmosphere with 5% CO2 at

37°. Desmin labeling and a cell viability test with Trypan blue were done before using the

myoblasts for in vitro and in vivo experiments.

Expression and purification of ActRIIB/Fc

148

The ActRIIB/Fc is a fusion protein containing the extracellular domain of ActRIIB

linked to a murine Fc domain. The methods for expression and purification of ActRIIB/Fc

fusion protein have been previously described [276, 336].

Cell differentiation assay

Myoblast differentiation was evaluated by counting the percentage of nuclei inside

myotubes, i.e., syncytia with three or more nuclei. For this test, myoblasts were cultured in

MB-1 for 24 h, and the proliferation medium was replaced for 72 h with a fusion medium

(Dulbecco's modified Eagle medium, St. Louis, MO, Canada) containing only 2% FBS in

the presence or absence of ActRIIB/Fc (500 ng/ml) and of human recombinant myostatin

(500 ng/ml). Myotubes were visualized by myosin heavy chain (MyHC) immunodetection.

The cells were fixed with 95% ethanol, washed twice with phosphate-buffered saline (PBS)

for 10 min and blocked with 10% FBS in PBS for 1 h. The samples were incubated 2 h at

room temperature with a mouse anti-MyHC mAb (MF20, DSHB, Iowa City, IA) (1:100)

and then for 1 h with an anti-mouse Ig Alexa 546-conjugated secondary antibody

(Invitrogen inc., Burlington, ON, Canada) diluted 1:100. Finally, the cells were washed

with PBS and mounted with PBS/glycerol. 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)

staining was done with PBS to label the nuclei. The number of nuclei in the myotubes was

counted and normalized with the total number of nuclei in the culture well as a measure of

terminal differentiation.

Quantitative RT-PCR

Quantitative RT-PCR (Q-RT-PCR) was used to examine the mRNA expression

levels of myogenic regulator factors (MRFs) (MyoD, Myf5, MRF4 and Myogenin) in

normal myoblasts incubated or not with ActRIIB/Fc (500 ng/ml) and in presence or

absence of recombinant myostatin (500 ng/ml). The mRNA was extracted using an RNeasy

Plus kit (Qiagen, Mississauga, ON Canada). The cDNA templates for Q-RT-PCR were

synthesized by an inverse transcriptase with 1 ug RNA in superscript II Rnase H-RT

reaction (Invitrogen inc.). Q-RT-PCR was carried out in a Light Cycler 480 (Roche

Diagnostics, Mississauga, ON, Canada) with SYBR Green light Cycler Fast Start DNA

Master Plus (Roche Diagnostics) as a detector. All target gene expressions were normalized

149

to GAPDH levels. The primer pairs were designed with GeneTools logiciels (Biotools Inc.,

Madrid, Spain) and are displayed in Table 1.

Animals

All experiments were performed in two-month-old Rag'/mdx mice produced in our

animal facilities by crossing mdx/mdx mice (a DMD model due to a mutation leading to

dystrophin deficiency) with Rag'" mice (an immunodeficient mouse that accepts human

grafts). The mice were maintained under pathogen-free conditions. All the experiments

with mice were conducted in accordance with the Laboratory Animal Care and use Ethics

Committee of Laval University.

Cell transplantation and ActRIIB/Fc treatment

Half million human myoblasts resuspended in 10 pi of HB S S were transplanted at

day 0 in both Tibialis anterior (TAs) of 12 mice using a glass capillary along 12 the

transversal axis trajectories. All mice were sacrificed 30 days after the transplantation. Two

experiments were done to evaluate the effect of ActRIIB/Fc on the myoblast transplantation

success. In each experiment, two group of mice (n=3) was treated or not with ActRIIB/Fc

(i.p., 10 mg/kg). In the second experiment, to induce cycles of muscle degeneration and

regeneration, mice were forced to swim for 10 min on days 0, 7, 14 and 28 post­

transplantation. For this swimming, mice were placed inside a Plexiglass box filled with

warm water (28°C). All contacts with box bottom and top were avoided. All mice were

killed 30 days after the myoblast transplantation for muscle analysis. Thus, the four groups

of mice are the following: Group iA(noSwim/noActRIIB/Fc>: mice were injected on days 0 and 7

post-transplantation with sterile PBS and not forced to swim; Group lB(no Ac c .

mice were injected on days 0 and 7 post-transplantation with ActRIIB/Fc and not forced to

swim; Group 2A(Swim/noActRIIB/Fc): mice were injected on days -5, 0, 7, 14 and 28 post­

transplantation with sterile PBS and were forced to swim; Group 2B( W1 Act w : mice

were injected on days -5, 0, 7, 14 and 28 post-transplantation with ActRIIB/Fc and were

forced to swim.

Muscle Morphometry

For measurement of muscle weights, individual TA from both sides of the animal

was dissected and the average weight was used for each group. The muscles were mounted

150

in embedding medium and snap-frozen in liquid nitrogen. Serial 12 urn cross-sections were

obtained in a cryostat at -25°C. Sections were then processed for histological examination

by haematoxylin and eosin-phloxine staining (H&E), and by immunohistochemistry with

an anti-human dystrophin antibody (7F7, MRIC Biochemistry Group, Wrexham, UK) and

with anti-lamin A/C (Vector laboratory, USA) to visualise human nuclei as previously

described [298]. Morphometric measurements (i.e. single fiber area, total number of

nucleus lamin A/C, number of nuclei lamin A/C positive per fibers, total number of centro-

nucleated fibers) were made using the Image J software (rsbweb.nih.gov/ij).

ST A TISTICAL ANAL YSIS

The experimental values are presented as means + SD. Statistical analyses were

performed by analysis of variance (one-way ANOVA) with Fisher's PLSD test and

Tukey's test for multiple comparisons post-hoc in the StatView statistical package

(StatView 5, SAS Institute Inc. Cary, NC). Differences were considered statistically

significant at P<0.05.

RESULTS

ActRIIB/Fc promotes the differentiation of human myoblasts even in the presence

of recombinant myostatin

The activation of satellite cells in skeletal muscle leads to their proliferation as

myoblasts and to their differentiation and fusion with existing muscle fibers, which is

essential for muscle hypertrophy. Several members of the TGF-P family inhibit myoblast

differentiation. The effect of ActRIIB/Fc, which binds to several members of this family,

was thus evaluated on the in vitro myogenic differentiation of human myoblasts in the

presence or absence of recombinant myostatin. When myoblasts were transferred to a

differentiation medium in the absence of myostatin, the presence of ActRIIB/Fc for 3 days

did not significantly increase the number of myotubes (Figure la) or the fusion index

(Figure lb). The presence of myostatin alone in the differentiation medium significantly

decreased the number of myotubes, with the fusion index being reduced by about 5-fold to

8%. However, this reduction in the number of myotubes and the fusion index by myostatin

was completely blocked by the addition of ActRIIB/Fc to the cells.

151

Expression of MyoD family mRNA in ActRIIB/Fc treated myoblasts

To analyze further the effect of myostatin and ActRIIB on myoblast differentiation

in these cultures, we carried out Q-RT-PCR analyses of Myf5, myogenin, MRF4 and

MyoD. As shown in Figure 2a, myostatin and ActRIIB had opposite effects on MyoD

expression, with myostatin causing a decrease and ActRIIB/Fc causing an increase in

expression levels. In cells treated with both myostatin and ActRIIB/Fc, the two molecules

appeared to neutralize each other in their effects on MyoD expression. Similar results were

obtained with myogenin (Figure 2c); however, the ActRIIB/Fc and/or rMSTN treatment

did not change the expression of Myf5 and MRF4 (Figures. 2b and d).

ActRIIB/Fc long-term treatment increases the mouse body weight

Next, we examined the effect of ActRIIB/Fc following transplantation of myoblasts

in vivo. All mice were weighed in the days 0 and 30 post-transplantation and the results are

plotted in figures 3 a and b. A two week treatment with ActRIIB/Fc did not affect the

percentage increase in the mouse body weight of Group 1 B(noSwim/ActRIIB/Fc 2wk) versus

Group i A(noSwim/noActRnB/Fc) (Figure 3a). However, a five week treatment with ActRIIB/Fc

combined with force swimming significantly increased the weight of Group 2B(Sw im/ActRIIB/FC 5wlc) c o m p a r e d w j m G r o u p 2A(Swim/noActRIIB/Fc) ( F j g u r e 3 ^ j ^ ^ ± Q m Q m

percentage increase in body weight over that time period compared to controls mice was

40% (Figure 4).

ActRIIB/Fc long-term treatment accentuate the increase of the muscle weight

The TA muscles of all experimental mice were dissected, trimmed of excess

connective tissues and weighed to determine the effect of ActRIIB/Fc treatment on muscle

mass (Figure 3c). The effect of ActRIIB/Fc long-term treatment was evident in the weight

of the TA muscle, which was significantly increased in Group 2B(Swim/ActRI1B/Fc 5wk). This

increase was 71% when compared with the TA weight of Group 2A(Swim/noActRIIB/Fc) and

85% when compared with the mice of Group 1 A(n°swim/noActRnB/FC) H o w e v e r t h e T A w e i g h t

of Group iB(noSwim/ActR,IB/Fc 2wk> was increased by only 22% compared to the TA of its

control Group i A(noSwim/noActRIIB/Fc>, which did not reach statistical significance. There are

152

no differences in muscle weights of mice in the control groups, namely, Group 2A(Swim/noActRnB/Fc) v e r s u s Q r ( ) u p j A(noSwim/noActRIIB/Fc)

When TA muscle weights were expressed relative to body mass, significant increases with ActRIIB/Fc treatment were observed only for Group 2B(Swim/ActR,IB/Fc 5wk)

compared to Group 2 A ( S w , m / n o A c t R I I B / F c ) and to G r o u p iA<™swi,n/noActRiiB/Fc) ( F i g u r e 3 d ) ^

magnitude of the effects was blunted after normalization to body weights, which was

expected given that ActRIIB/Fc has been shown previously to cause increases in muscle

mass throughout the body [276] and given that skeletal muscle accounts about one-third of

total body weight.

ActRIIB/Fc treatment improved success of human myoblast transplantation in

mice

Following their transplantation, human myoblasts fused with the existing mouse

muscle fibers leading to the expression of human dystrophin in the resulting hybrid fibers.

To evaluate the success of the myoblast transplantation, human dystrophin was thus

detected by immunohistochemistry in the 4 groups of mice. In Group iB(noSwim/ActR1IB/Fc2vvk),

the number of dystrophin-positive myofibers present in muscle cross-sections was more

than double (135 ± 26) that observed in Group 1A(n°sw,m/noActwiB/Fc)(59± 23) (Figure 5a). A

very significant increase of the number of dystrophin positive fibers was also observed in

the second experiment that involved swimming. Specifically, the TA muscle of Group

2g( wim/ActRiiB/Fc 5wk) c o n t a j n e d ]g5 dystrophin positive fibers per muscle cross-section,

which represented an increase of 77% compared to Group 2A(Swim/noActRIIB/Fc). Swimming

alone also seemed to increase the success of transplantation, as the number of dystrophin

positive fiber in mice in Group 2A(Swim/noActRIIB/Fc) was more than double that seen in mice

in Group 1 A0>°Swim/n°A«RiiB/Fc) ActRlIB/Fc and forced swimming appeared to have an

additive effect, leading to a tripling of dystrophin positive fibers in Group 2B(Swim/ActRIIB/Fc

5wk) compared to Group 1 p p * * * * * * w t c ) t

ActRIIB/Fc treatment changed the total number of human nuclei per muscle

cross-section

153

To confirm that the increased muscle mass and number of dystrophin positive fibers

resulted in part from fusion of the transplanted myoblasts to myofibers, we counted the

number of human nuclei in the myofibers using an antibody directed against human lamin

A/C. As shown in Figure 5b, mice in Group 2A(Swim/ActRI,B/Fc 5wk) had about twice as many

human nuclei per muscle cross-section compared to mice in the two control groups, Group i A (noSwim/noActRIIB/Fc) j ( ^ r o u n y A ( S w i m / n o A c t R U B / F c

ActRIIB/Fc treatment increased the number of lamin A/C nuclei in individual

dystrophin positive fiber

To verify the effect of ActRIIB/Fc on the fusion of human myoblasts with mouse

myofibers, the number of lamin A/C nuclei was quantified in each individual muscle fiber

expressing human dystrophin. All transplanted TAs of mice contained a mixed population

of fibers incorporating one or more human nuclei. In the experimental groups of mice that

received ActRIIB/Fc, i.e., Group 1 B(noSwim/ActRI,B/Fc 2wk> and Group 2B(Swim/Ac,R1IB/Fc 5wk), the

percentage of fibers with only one human nucleus was lower than in their respective control

groups that did not receive ActRIIB/Fc, i.e. Group iA(n°Swim/noActRiiB/FO m d G r o u p

2A(swim/noActRnB/Fc) ( F i g u r e s 6 a m d b ) Moreover, the percentage of fibers with more than 3

human nuclei was higher in muscles of ActRIIB/Fc treated mice compared to muscles of

untreated mice.

ActRIIB/Fc treatment induced dystrophin positive fibers hypertrophy

We then investigated whether the inhibition of signaling of myostatin and other

TGF-P family members with ActRIIB/Fc was sufficient to trigger hypertrophy of the

dystrophin positive fibers. As shown in Figure 6c, significant hypertrophy was observed in

the hybrid muscle fibers of both ActRIIB/Fc treated groups. Specifically, Group 2A(noSwim/ActRIIB/Fc 2wk) ^ & 1 Q % h y p e r t r o p h y r d a t i v e t o G r o u p ! ^noSwim/noAc.RIIB/Fc^ ^

Group 2B(Swim/ActRIIB/Fc 5wk) had a 350% hypertrophy compared with Group 2A(Swim/

noActRHB/Fc) Swimming did not by itself induce a significant hypertrophy of the dystrophin

positive muscle fibers since Group 2A(Swim/noActRIIB/Fc) was indeed not significantly different from Group 1 A(n°Swim/noActRIIB/Fc)

154

ActRIIB/Fc treatment does not affect the percentage of centrally nucleated fibers

Finally, we compared the percentage of centrally-nucleated fibers in the various

groups of mice. ActRIIB/Fc treatment in the first experiment did not significantly increase

the number of centro-nucleated fibers (Figure 7). However, swimming by itself increased

the percentage of centrally nucleated fibers in Group 2A(Swim/noActRIIB/Fc) compared to Group 1A(noSwim/noActRIIB/Fc) S i m i l a r l y > m u s d e s from G r o u p ^Swim/ActRI lB/Fc Swk) c o n t a i n e d m o r e

centro-nucleated fibers than those of either Group iA(n°swim/noActRiiB/FO o r G r o u p

i r>(noSwim/ActRIIB/Fc 2wk)

DISCUSSION

Several studies have already demonstrated an increase of body and/or muscle

growth in different mouse disease models after ActRIIB/Fc treatment [337-339]. Our study

confirms this effect of activin receptor blockade in a model of Duchenne muscular

dystrophy. The increased skeletal muscle mass observed was due to hypertrophy and is

comparable to prior studies of myostatin inhibition studies in mdx mice [272, 326].

Hypertrophy was even observed in our study in the dystrophin positive fibers resulting in

part from the transplantation of normal human myoblasts into Rag^'/rndx mice. Souza et al.

demonstrated that depletion of circulating BMP-9 and BMP-10 by ActRIIB/Fc may

indirectly contribute to the increase in muscle mass by maintaining a higher number of

myogenic stem cells (satellite cells) in the skeletal muscle [330]. In our studies, we found

the proportion of centrally nucleated fibers, an indicator of regenerated fibers, to be

unchanged in untreated and ActRIIB/Fc-treated TAs. Thus, our observations suggest that

blocking this signalling pathway did not alter regeneration in TAs of mdx mice [339].

However, when the ActRIIB/Fc treatment was combined to exercise, the number of

centrally nucleated fibers increased significantly. Moreover, forced swimming alone

appears to be inducing sufficient fiber damage to cause increased regeneration.

A major finding of our study is that ActRIIB/Fc improves the success of human

myoblast transplantation. Our in vitro study indicated that ActRIIB/Fc increased the

differentiation of human myoblasts through an up-regulation of the regulatory genes

responsible for myogenesis, such as myogenin and MyoD, leading to myoblast fusion and

155

myotube maturation [192]. Despite its murine origin, the soluble form of the ActRIIB

competed with the natural human receptors for ligand in the TGF-P family, which includes

myostatin, activin-A and BMP9/10 [330]. This is explained by the exceptional conservation

of the ActRIIB extracellular domain sequence, with only one amino acid difference

between mouse and human [340].

Following human myoblast transplantation, the mice treated with ActRIIB/Fc

presented more dystrophin-positive myofibers and human nuclei than their respective

control mice. This increase of human nuclei was more significant in Group 2B(Sw,m/ActRIIB/Fc

5wk). This enhanced success of myoblast transplantation may be due to an up-regulation

myogenic gene expression and to increased proliferation, differentiation and/or fusion of

the transplanted myoblasts with damaged fibers. The effect of ActRIIB/Fc on enhancing

incorporation of transplanted myoblasts was observed in both experimental paradigms, i.e.

with or without forced swimming. Thus, the ActRIIB/Fc treatment during the first two

weeks after myoblast transplantation was sufficient to produce a beneficial effect on graft

success, but exercise combined with a long-term ActRIIB/Fc treatment further enhanced

myoblast transplantation success and fiber hypertrophy. Swimming is a physiological

method to induce partial muscle fiber damage, and our results confirm that myoblasts are

able to repair damaged myofibers, giving rise to more hybrid fibers [157].

In summary, inhibition of myostatin and other negative regulators of skeletal muscle

growth by ActRIIB/Fc is a potential therapy for the treatment of diseases affecting skeletal

muscle, such as muscular dystrophies. Acceleron Pharma has indeed recently initiated a

phase 2 clinical trial with ActRIIB/Fc (under the name ACE-031) in patients with DMD:

(http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01099761 ?term=dmd+ace031 &rank= 1 ). Our

study suggests that combining myostatin inhibition and muscle exercise with myoblast

transplantation may be an effective therapeutic strategy for delivering normal copies of the

dystrophin gene and restoring muscle function to patients with DMD.

ACKNOWLEDGMENTS

We think the AFM "association française contre les myopathies". Work in S-JL's

laboratory was supported by grants from the National Institutes of Health (R01AR060636)

156

and the Jain Foundation. Under a licensing agreement between MetaMorphix, Inc. (MMI),

Pfizer, Inc., and the Johns Hopkins University, S.-J.L. is entitled to a share of royalty

received by the University on sales of products related to myostatin. S.J.L. and the

University own MMI stock, which is subject to certain restrictions under University policy.

S-J.L., who is the scientific founder of MMI, is a consultant to MMI on research areas

related to the study described in this paper. The terms of these arrangements are being

managed by the University in accordance with its conflict of interest policies.

157

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160

TABLE

Gene Symbol Description GenBank

Regio n

Size (Pb)

T an n. (° Q

Primer sequences

S'-O' F/R

MY0D1 Homo sapiens myogenic differentiation 1 (M YOD I) NM_002478

1152-1324 173 63

CGAACCCCAACCCGATATACCA/ ACTTCAGTTCTCCCGCCTCTC

MYF5 Homo sapiens myogenic factor 5 (MYF5) NM_005593

609-839 231 65

CCCCACCTCCAACTGCTCTGA/C TGGCAACTGGAGAGAGAGAAG C

MYOG Homo sapiens myogenic factor 4 (myogenin) NM_002479

1237-1408

172 63 AGCAGCGTGAGGAGCAAGCA/A CTGCGTTGGACACCTGTTCTAC

MRF4 Homo sapiens myogenic factor 6 (herculin) (MYF6) NM_002469 733-

948 216 62

TAGCCTTCGATGCCTTTCTTCC/C CCTTTCAGCAACrrTTCGGTCT

G6P0

Homo sapiens glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), nuclear gene encoding mitochondrial protein

NM_000402 2490-2610

121 65 GATGTCCCCTGTCCCACCAACT CTG/GCAGGGCATTGAGGTTGG GAG

Table 1: Primer pair design

161

FIGURE LEGEND

Figure 1 ActRIIB/Fc promotes the differentiation of human myoblasts even in

presence of recombinant myostatin

Myoblasts treated or not with ActRIIB/Fc at 500 ng/ml, were differentiated in myotubes for

3 days in the presence or absence of recombinant myostatin (rMSTN) at 500 ng/ml in the

differentiation medium (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) with 2% serum),

(a) Myotubes were stained in red with anti-myosin heavy chain (MyHC) and nucleus were

stained in bleu with 4',6-diamidino-2-phenylindole. The fusion is significantly reduced by

rMSTN but this effect is blocked by ActRIIB/Fc. Scale bar - 0.2 mm. (b) The same effects

are observed when the fusion index was calculated. Means + SD from three independent

experiments are illustrated. *P < 0.05.

Figure 2 Expression of MyoD family mRNA in ActRIIB/Fc treated myoblasts

The total RNA was extracted from control and ActRIIB/Fc treated myoblasts incubated

during 2 days without or with recombinant myostatin (500 ng/ml) in the culture medium.

The mRNA expression of MyoD (a), Myf5 (b), myogenin (c) and MRF4 (d) was quantified

by Q-RT-PCR. ActRIIB/Fc significantly increased the expression of MyoD and myogenin.

The data presented are means + SD (n = 3), *P O.05.

Figure 3 Effect of ActRIIB/Fc on body and muscle weights of Rag /mdx mice.

(a) Means and SD (n=6) of whole body weights (in grams) of control Rag'/mdx (Group

1A) mice and ActRIIB/Fc treated Rag'/rndx (Group IB) mice in the no swimming group at

the time of transplantation and 1 month post-transplantation, (b) Means and SD (n=6) of

whole body weights (in grams) of control Rag''/mdx (Group 2A) mice and ActRIIB/Fc

treated Rag'/rndx (Group 2B) mice in the weekly swimming groups at the time of

transplantation and 1 month post-transplantation, (c) Means and SD (n=6) of TA muscle

weights (in mg) of Rag'/rndx mice treated or not with ActRIIB/Fc, and forced or not to

swim, (d) The ratio of muscle weight to body weight of each group of mice.* P < 0,05.

162

Figure 4 Increased muscling in mice treated with ActRIIB/Fc. The mouse of group 2A

was not treated with ActRIIB/Fc but was forced to swim during 5 weeks. The mouse of

group 2B was injected with ActRIIB/Fc and forced to swim during 5 weeks. The muscles

are clearly hypertrophied in the mouse that received the ActRIIB/Fc.

Figure 5 Increased success of human myoblast transplantation in mice treated with

ActRIIB/Fc. (a) Graphical representation of the mean number (+SD, N=6) of dystrophin-

positive myofibers per cross-section of TA transplanted with human myoblasts in Rag' '

/mdx mice treated or not with ActRIIB/Fc and forced or not to swim, (b) The mean numbers

(+SD, N=6) of lamin A/C positive nuclei per cross-section of TA muscles transplanted with

human myoblasts and treated or not with ActRIIB/Fc and forced or not to swim. * P<0,05.

Figure 6 ActRIIB/Fc treatments increased the number of lamin A/C nuclei in

individual dystrophin positive fiber and induced hypertrophy of the dystrophin

positive fibers (a) Repartition of dystrophin positive fibers based on the number of lamin

A/C nuclei inside their cross-section in the no swimming groups treated or not with

ActRIIB/Fc (2 injections/week), (b) Repartition of dystrophin positive fibers based on the

number of lamin A/C nuclei inside their cross-section in the weekly swimming groups

treated or not with ActRIIB/Fc (5 injections/week), (c) Cross-sectional area of human-

dystrophin positive myofibers, measured in the TAs of Rag''/mdx mice treated or not with

ActRIIB/Fc and forced or not to swim. The means are represented (+ SD, N=6). * P<0,05

Figure 7 ActRIIB/Fc treatment does not affect the percentage of centrally nucleated

fibers

Percentage of regenerating fibers based on the presence of a central nucleus in group 1A

(noSwim/no ActRIIB/Fc), group IB (noSwim/ActRIIB/Fc 2 wk), group2A

(Swim/noActRIIB/Fc) and group 2B (Swim/ActRIIB/Fc 5 wk). Swimming increased the

regeneration. The means are represented (+ SD, N=6). * P<0,05.

163

i

Control myoblasts

ctRIIB/Fc myoblasts

DMEM2% DMEM2% + rMSTN

□ control myoblasts ■ ActRIIB/Fc myoblasts

DMEM2% DMEM2%+rMSTN

Figure 1

164

MyoD

■ w

s #s '7.

1 <

Myf5

c o 'S £ a

Myogenin MRF4

c o

î <

D control myoblasts D myoblasts *- rMSTN

■ ActRI IB Te myoblasts ■ A«tRllH/Fc myoMwts ♦ rMSTN

Figure 2

165

t x

M

X! ©

30

25

20

15

10

5

0

No swimming 40

^ 30 w

J= 61) « 20

■o ■■O" Group 1A gq

(no Swim/no ActRI IB/Fc) B Group IB

(no Swim/ActRIIB/Fc 2wk)

10

Weekly swimming

+ 40%

• •$• • Group 2A (Swim/no ActRIIB/Fc)

M Group 2B (Swim/ActRIIB/Fc 5 wk)

D0 D30 D0 D30

D Group 1A (no Swim/no ActRIIB/Fc) E Group IB (no Swim/ActRIIB/Fc 2wk) B Group 2 A (Swim/no ActRIIB/Fc) ■ Group 2B (Swim/ActRIIB/Fc 5 wk)

Figure 3

166

Weekly Group 2B swimming (Swim/ActRira/Fc 5wk)

group

Group 2A (Swim/noActRIIB/Fc)

Figure 4

167

FigureS

□ Group IA (no Swim/no ActRIIB/Fc) D Group IB(rK> Swirn/ActRIIB/Fc 2wk) E3 Group 2A (Swim/no ActRIIB/Fc) ■ Group 2B (Swim/ActRIIB/Fc 5 wk)

168

a M

70

SO 40 30

2(1

10

(1

No Swimming

D Group IA trioSwim/no AciKIIBTcI

□ Group IB (no Swim AciRIIH I e 2wfc)

Weekly Swimming Q Group 2A

(Swim/no ActRI I Bf«) a Group 2B

(Swim/AeiRllB-'Fc 5 wk)

I 2 Jor nucleus nuclei - nuclei nucleus nuclei

QGroup IA (no Swim/no AetRIIBFcj 1 Group IB (no Swim/ActRllB/F* 2wfc) 13 Group 2A (Swim/no AclRIIE'Fc) ■ Group 2B (SwinvArtRIIBTc 5 wk)

Figure 6

169

D Group 1A (no Swim/no ActRIIB/Fc) □ Group 1B (no Swim/ActRIIB/Fc 2wk) □ Group 2A (Swim/no ActRIIB/Fc) ■ Group 2B (Swim/ActRIIB/Fc 5 wk)

Figure 7

170

Chap i t r e VI I I : Discussion / Conclusion

VIII. 1. Discussion :

La thérapie cellulaire est susceptible d'améliorer le pronostic de malades atteints de

la DMD. Tel que décrit dans les chapitres précédents, plusieurs sources de cellules

progénitrices adultes pourraient être utilisées : des myoblastes provenant de muscles

squelettiques, des cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse, des cellules

souches mésenchymateuses, etc.

Malgré cette diversité, la transplantation de myoblastes dans des muscles

dystrophiques représente toujours une avenue intéressante afin de ré-exprimer la

dystrophine dans les fibres musculaires des patients DMD.

Des résultats positifs chez des souris dystrophiques ont été obtenus suite à la

transplantation de myoblastes murins et humains, et ont encouragé l'équipe Tremblay à

s'investir dans la transplantation chez les primates, dont le système immunitaire et la taille

du biceps sont comparables à l'humain. Jusqu'à 75% des fibres dans tout le biceps de singe

sont d'origine hybride après 1 mois de la transplantation [341]. Ces fibres hybrides sont

encore présentes un an après la greffe. Ce qui prouve que les myoblastes transplantés

peuvent fusionner efficacement avec les fibres du muscle de l'hôte chez les souris mais

aussi chez les primates.

Mais ces études expérimentales ont révélé aussi des limites de la transplantation de

myoblastes comme le rejet immunitaire, la mort précoce des myoblastes et leur faible

potentiel migratoire. Parmi d'autres approches, l'équipe Tremblay a montré que la

combinaison de l'inhibition de la myostatine et des autres ligands de la superfamille des

TGF-P à la transplantation de myoblastes murins a permis d'en améliorer le succès et ceci

en utilisant deux méthodes différentes, à savoir, l'expression d'une forme tronquée non

fonctionnelle du récepteur spécifique de la myostatine (ActRIIB), et aussi la surexpression

d'une protéine antagoniste de la myostatine (la follistatine). Cette amélioration du succès de

greffe est accompagnée par une hypertrophie musculaire avec augmentation des fonctions

musculaires [275, 335, 342].

Le même objectif est poursuivi dans la présente thèse, mais avec des méthodes

différentes d'inhibition de la myostatine et des autres ligands de la superfamille des TGF-(3.

171

VIII. 1.1. L'inhibition de la signalisation de la myostatine par l'expression du

dnActRIIB augmente le succès de transplantation des myoblastes humains :

La méthode décrite dans le chapitre V est basée sur les études expérimentales déjà

publiées de l'équipe Tremblay [335], mais avec une approche différente. Pour s'approcher

plus du cas humain, des myoblastes humains provenant d'un donneur sain, ont été modifiés

génétiquement par un vecteur lentiviral afin d'exprimer la forme tronquée du récepteur

dnActRIIB, qui va jouer le rôle d'un dominant négatif en séquestrant la myostatine mature,

sans que cette dernière ne soit capable d'induire son effet.

Pour prévenir tout rejet de greffe des myoblastes humains par les hôtes murines, des

souris dystrophiques immunodéfïcientes (mdxAX&g'') ont été utilisées pour ces expériences.

Une augmentation du nombre des fibres exprimant la dystrophine humaine a été

observée dans les muscles transplantés avec des myoblastes humaines exprimant le

dnActRIIB (+70%), par rapport aux muscles transplantés avec des myoblastes normaux.

Cette amélioration du succès de greffe est expliquée par la levée de l'inhibition de la

myostatine sur la prolifération et la fusion de ces myoblastes. Cela a été prouvé par des

tests in vitro de prolifération et de fusion, puisque les myoblastes exprimant le dnActRIIB

ont proliféré et fusionné plus que les myoblastes normaux, même en présence de la

myostatine exogène dans le milieu de culture. Ces changements phénotypiques ont été

accompagnés par des changements au niveau de l'expression des MRF.

VIII. 1.1.1. Avantages :

Cette approche de thérapie génique ex-vivo démontre la faisabilité de modifier

génétiquement des myoblastes humains et de les transplanter par la suite dans des muscles

dystrophiques, en préservant leurs caractéristiques de fusion et de prolifération. Dans le cas

d'une auto transplantation, transplantation des myoblastes modifiés du patient, dans des

muscles du même patient, ce dernier n'aurait pas besoin d'être sous immunosuppression.

L'inhibition de la signalisation de la myostatine au niveau des myoblastes à

transplanter procure à ces derniers un avantage prolifératif par rapport aux cellules satellites

de l'hôte.

172

Le vecteur lentiviral possède aussi une grande capacité d'infection des cellules

humaines, ceci en fait donc un vecteur de choix pour la transduction de myoblastes. Cependant,

lorsqu'un vecteur viral est injecté directement dans un modèle animal ou chez un patient,

les particules virales sont dispersées au sein de cet organisme. Ces dernières peuvent être

reconnues par le système immunitaire et ainsi déclencher une réponse immunitaire contre

les protéines virales de la capside ou de l'enveloppe. Par contre, dans le cas d'une thérapie

ex vivo, utilisées dans mes expériences, les cellules sont génétiquement modifiées in vitro

évitant ainsi tout contact entre l'organisme et le virus. De plus, elles peuvent être testées in

vitro avant toute transplantation chez le patient DMD.

VIII. 1.1.2. Limites:

Comme pour la thérapie cellulaire, la thérapie génique ex-vivo est aussi confrontée

aux problèmes de migration et de dispersion des cellules greffées ainsi qu'à leur mort

précoce. La transplantation cellulaire dans de petits muscles et dans des muscles difficiles

d'accès est également compliquée.

L'infection des cellules greffées par un vecteur viral peut aussi engendrer des

problèmes de tumorigénicité. En effet, le transgène délivré par le vecteur viral peut

s'insérer dans le génome et selon sa zone d'insertion, il peut activer un oncogene ou mener

à une mutagénèse d'insertion. Ce phénomène est encore plus important lorsqu'on utilise un

lentivirus puisqu'il est intégratif.

VIII. 1.2. Le losartan augmente le succès de la greffe des myoblastes :

Dans le cas des maladies musculaires, le processus de régénération est inhibé à des

degrés divers. Chez les patients DMD, une augmentation du TGF-P 1 dans les muscles est

observée inhibant la régénération et entraînant la fibrose, un épaississement du tissu

conjonctif qui rend celui-ci fibreux. Le losartan, un antagoniste des récepteurs de

l'angiotensine II (type ATI), bloque l'activation de cette cytokine, ce qui permet de

restaurer le processus de régénération, de réduire la fibrose et d'améliorer la fonction

musculaire. Ces recherches suggèrent que le losartan pourrait être utilisé pour ralentir la

173

progression de la faiblesse musculaire dans la dystrophie musculaire de Duchenne et dans

d'autres maladies musculaires.

Le chapitre VI de cette présente thèse démontre l'efficacité de la combinaison de

cette thérapie pharmacologique avec la thérapie cellulaire dans le cas de la DMD. Des

myoblastes humains normaux ont été transplantés dans des souris dystrophiques

immunodéficientes, traitées au losartan, par voie orale.

La détection de la dystrophine humaine par immunohistochimie a démontré la

présence de plus de fibres hybrides au niveau des souris traitées que dans les souris

contrôles. Afin d'expliquer cette amélioration du succès de greffe, des marquages

immunohistochimiques et radioactifs ont été réalisés sur les coupes des muscles et sur les

myoblastes humains, respectivement.

Le traitement au losartan des souris in vivo a augmenté la survie des myoblastes

transplantés, en diminuant l'activation des macrophages et l'expression du collagène de

type 1, marqueur de la fibrose. De plus, l'expression de Myf5, un facteur de détermination

myogénique, et de la Myogénine, un facteur de la differentiation myogénique, sont

augmentés au niveau des muscles traités au losartan.

Ces effets positifs du losartan sur la myogenèse et l'inflammation musculaire sont

dûs à l'inhibition de l'expression du TGF-P 1, confirmé par 3 observations :

• la diminution de la phosphorylation de Smad2, la voie de signalisation essentielle

du TGF-p.

• la diminution de l'expression du périostine, une protéine induite par le TGF-p au

cours de la régénérescence musculaire

• la diminution de l'expression du TSP-1, un anti-angiogénique responsable du

clivage de la forme latente du TGF-P 1 en une forme active.

Mes expériences in vitro ont démontré que le losartan augmente la prolifération

(+30%) et la differentiation (+20%) des myoblastes humains et leurs confère une protection

contre le stress oxydative.

174

VIII. 1.2.1. Avantages :

Cette thérapie pharmacologique n'a pas eu recours à des particules virales.

Couramment utilisé pour le traitement de l'hypertension, le losartan est un médicament

bien connu, bien toléré dont les effets secondaires sont bien maîtrisés ce qui permettrait de

procéder rapidement à des essais cliniques chez les humains et d'en déterminer l'efficacité

pour les patients atteints de dystrophie musculaire.

Le traitement par voie orale assure une bonne dispersion du médicament dans tout le

corps touchant ainsi tous les muscles. En plus du succès de greffe des myoblastes humains,

des effets positifs sur l'histologie des tissus musculaires et sur la réponse inflammatoire et

immunitaire.

VIII. 1.2.2. Limites:

Bien que l'inhibition du TGF-P augmente la prolifération et la fusion des

myoblastes, d'autres problèmes persistent toujours dans le domaine de la thérapie

cellulaire, c'est pourquoi son application à l'homme est encore limitée. Ces problèmes

immunitaires liés à toute greffe restent importants en thérapie cellulaire. Il faut que le

donneur et le receveur aient des antigènes d'histocompatibilités majeurs les plus semblables

possible pour augmenter les chances de réussite de la greffe. Seules les autogreffes

permettent d'éviter le rejet.

VIII. 1.3. L'administration du récepteur soluble de l'activine de type lib améliore

la transplantation des myoblastes humains chez des souris dystrophiques :

Le chapitre VII représente une méthode qui vise à traiter les souris mais par une

protéine soluble, et non avec un médicament.

La partie extracellulaire du récepteur de l'activine est injectée aux souris par voie

intra péritonéale, afin de capturer la myostatine circulante ainsi que d'autres ligands à

affinité et empêcher leur signalisation. La transplantation de myoblastes humains dans ces

souris a obtenu plus de succès en exprimant la dystrophine humaine dans plus de fibres

murins (+220%). J'ai aussi pu constater une augmentation des noyaux humains dans les

175

muscles Tibialis antérieurs des souris traitées par rapport aux souris non traitées

témoignant ainsi de l'effet positif de l'injection de l'ActRIIB/Fc sur la survie des

myoblastes. De plus, la présence d'un plus grand nombre de noyaux humains au sein d'une

même fibre hybride comparée à celle observée chez les souris non traitées, indique qu'il y a

eu une augmentation de la fusion des myoblastes entre eux et avec les fibres préexistantes.

L'injection de l'ActRIIB/Fc a aussi augmenté la masse corporelle et la masse

musculaire des souris traitées. Cet effet a été déjà décrit dans plusieurs autres études [337,

338].

VIII. 1.3.1 Avantages :

Le récepteur ActRIIB'Fc permet l'inhibition de plusieurs régulateurs ayant des

effets négatifs sur la croissance musculaire, entre autre celui de la myostatine. Cet agent

permet des effets plus importants sur la masse musculaire.

La stimulation de la croissance des fibres musculaires préexistantes ou récemment

régénérées par le blocage de ces régulateurs permettrait d'augmenter la masse musculaire

atrophiée des patients DMD sans induire une prolifération des cellules souches, insensibles

pour ces facteurs au stade adulte. Donc cette méthode peut être utilisée sans risque à long

terme afin d'améliorer ou au moins préserver l'histologie du tissus musculaire

dystrophique.

En plus de ces effets positifs, la combinaison de cette méthode d'inhibition de la

myostatine avec la thérapie cellulaire a permis d'augmenter le succès de greffe.

Ces conséquences, stimulation de la croissances musculaires et augmentation du

succès de greffe, sont deux propriétés indispensables pour une médecine régénératrice du

muscle dystrophique.

Pour ces raisons, le laboratoire pharmaceutique Acceleron Pharma a développé une

protéine mimant le récepteur de la myostatine capable de la capturer la myostatine active

dans le muscle (ACE031). Cette approche a été étudiée dans un essai clinique de phase I

sur des sujets sains et est présentement en essais phase Ha et lib sur les patients Duchenne.

VIII. 1.3.2 Limites:

Bien que l'inhibition de plusieurs régulateurs négatifs de la croissance musculaire

par une seule protéine soit un avantage, cette approche peut peut-être induire des effets

176

secondaires plus importants à long terme. En effet, le rôle des BMPs et des activines et

leurs voies de signalisations ne sont pas encore très bien connus.

VIL 2. Conclusion générale :

L'inhibition des facteurs de la superfamille des TGF-P constitue une bonne

approche pour améliorer le succès de la thérapie cellulaire de la DMD.

Il n'existe cependant pas actuellememnt de moyens efficaces pour bloquer

fiablement la myostatine et les autres ligands de la superfamille des TGF-p. Malgré des

résultats très prometteurs chez les animaux (surtout chez la souris), l'inhibition de ces

facteurs chez l'homme n'a pas encore réussi. À part les essais cliniques sur les patients

DMD, d'autres méthodes pour bloquer ces ligands peuvent être tentées dont quelques-unes

qui sont déjà en cours d'essai au sein de notre laboratoire. Par exemple, j 'ai récemment

démontré une augmentation du succès des greffes de myoblastes, en injectant dans les

muscles dytrophiques transplantés un AAV codant pour un propeptide de la myostatine,

muté au niveau de son cite de clivage (article en cours de préparation).

Il faut bien comprendre que le blocage de la myostatine et des autres ligands de la

superfamille des TGF-P est une thérapie non spécifique puisqu'il n'y a pas de changements

au niveau des causes pathogéniques, c'est-à-dire l'absence de la dystrophine. Mais la

combinaison de cette thérapie avec la thérapie cellulaire pourrait avoir des effets additifs.

En effet, à un stage avancé de la DMD, la seule restauration de la dystrophine par la greffe

de myoblastes normaux, ne serait pas suffisamment efficace pour augmenter la masse

musculaire et sa force. Le but de combiner la greffe de myoblastes et le blocage de la

myostatine ainsi que les autres ligands de la superfamille des TGF-P est d'une part de

reconstituer le muscle dystrophique en stimulant une croissance musculaire du muscle qui a

perdu en masse et d'inhiber la fibrose et d'autre part, de corriger la cause initiale de la

maladie en rétablissant l'expression de dystrophine, c'est donc une vrai thérapie

regenerative.

177

Pour que cette thérapie cellulaire soit optimum, il faut aussi résoudre d'autres

problématiques, en rajoutant par exemple, des agents anti-apoptoliques pour prévenir la

mort des myoblastes. Il faudra aussi contrôler le rejet immunitaire spécifique, il semble

entre autres que la dystrophine elle-même soit considérée comme un antigène du non-soi

chez le patient DMD. En conséquence, même si la dystrophine serait introduite via une

thérapie génique ex vivo dans leurs muscles, il faudrait vraisemblablement que le patient

soit sous traitement immunosuppresseur ou qu'une tolérence spécifique sera développé

pour cet antigène.

Cette thèse ne doit pas être considérée comme un produit fini, visant à répondre à

une question intéressant la recherche, mais plutôt comme un cheminement de recherche

allant de la compréhension de l'effet de l'inhibition de la myostatine et des autres ligands

de la superfamille des TGF-P au développement d'une thérapie applicable chez les patients

dystrophiques.

178

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